CN110243888A - 一种电化学指纹图谱检测燕窝的方法 - Google Patents

一种电化学指纹图谱检测燕窝的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种电化学指纹图谱检测燕窝的方法,它是采用B‑Z振荡反应检测,具体操作步骤如下:(1)燕窝水解液制备;(2)B‑Z电化学振荡指纹图谱;(3)分析电化学指纹图谱。本发明电化学指纹图谱检测燕窝的方法,采用BrO3 ‑Ce2+‑H+‑丙二酸振荡体系进行燕窝鉴定无需进行复杂的前处理,便可获得特征信息,是一种准确、简便、低成本的鉴别方法,具有良好的应用前景。

Description

一种电化学指纹图谱检测燕窝的方法
技术领域
本发明具体涉及一种电化学指纹图谱检测燕窝的方法。
背景技术
燕窝又称燕菜,多产自印度尼西亚、泰国、马来群岛、澳大利亚及我国海南大洲岛,是金丝燕吐出像丝一样的胶状物,具有很高的营养价值、和抗病毒、抗炎药用价值。燕窝一般由水、脂质、唾液酸、蛋白质、糖类化合物、氨基酸、纤维、无机物质等组成,但不同种类、来源的燕窝,其组成及特征不尽相同。随着燕窝产品市场日益扩大,利润丰厚,掺伪等现象日趋严重,其营养成分、药理功效、掺伪及鉴别方法已成为当前研究热点。目前,燕窝的鉴别研究主要有图谱鉴别、DNA鉴别、核磁共振鉴别、显微鉴别,但不管是哪一种方法均存在缺陷和不足。
化学振荡种类繁多,目前研究最广泛的是以溴酸盐为代表的化学振荡,称为BZ类振荡反应。经典BZ类振荡基本通式是BrO3 --Org–M+-H+,其中Org为有机底物,M+为金属离子催化剂,通常是Ce4+/Ce3+、Mn3+/Mn2+、Fe(Phen)3 3+/Fe(Phen)3 2+等。中药电化学振荡指纹图谱是以待测中药为振荡底物,在化学振荡器“BrO3 --M+-H+-丙二酸”体系中,通过调整振荡体系中各种物质的浓度,使其呈现出特征振荡波形,这种振荡波形是振荡体系中所有物质共同作用的结果。如果固定振荡体系中各组分的浓度,而只改变底物的种类和浓度,所获得的振荡波形无疑就是该中药的特征波形。
目前还没有利用电化学振荡反应,测定燕窝的电化学指纹图谱的研究,更没有利用其指纹图谱特征参数鉴别燕窝的报道。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种电化学指纹图谱检测燕窝的方法,它是采用B-Z振荡反应鉴别,具体操作步骤如下:
1)待测样品水解液制备:取待测样品,烘干,粉碎过筛,加H2SO4溶液水解,过滤,取滤液即得;
2)B-Z电化学振荡指纹图谱:取待测样品水解液,与H+溶液、HOOCCH2COOH溶液和Ce4 +溶液混匀,搅拌条件下加入BrO3 -溶液,同时用二电极体系测试混合溶液,记录电化学指纹图谱;
3)分析电化学指纹图谱。
进一步地,步骤1)所述烘干至恒重,所述硫酸溶液浓度为0.5-3.0mol/L,优选1.0mol/L。
进一步地,步骤1)所述待测样品与硫酸溶液的质量体积比为0.028~0.448g:1mL,优选0.1120g:1mL。
进一步地,步骤1)所述水解温度40℃,时间4~16h,优选8h。
进一步地,步骤2)所述混合溶液中[H+]0.25-1.25mol·L-1,[HOOCCH2COOH]0.15-0.75mol·L-1,[Ce4+]0.002-0.006mol·L-1,[BrO3 -]0.150-0.350mol·L-1,优选:[H+]0.75mol·L-1,[HOOCCH2COOH]0.45mol·L-1,[Ce4+]0.004mol·L-1,[BrO3 -]0.250mol·L-1
进一步地,步骤2)所述混合溶液温度控制在33-37℃,优选35℃。
进一步地,步骤2)所述H+来自H2SO4,Ce4+来自(NH4)4Ce(SO4)4,BrO3 -来自KBrO3
进一步地,步骤2)所述搅拌速度为500-1400r/min,优选500r/min。
进一步地,步骤2)所述二电极体系是以甘汞为参比电极,Pt黑电极为工作电极。
进一步地,步骤(3)所述指纹图谱中诱导时间t0 60s判定待测样品为燕窝。
进一步地,所述指纹图谱中振荡周期tp 100~130s、振荡寿命td2200~3000s、最高电位Emax 1.00~1.10v、振停电位Emin 0.90~0.99v判定为燕窝。
进一步地,所述方法中用燕窝真品作为参照物,按照步骤(1)制备,步骤(2)检测,得到的指纹图谱与待测样品指纹图谱的诱导时间、振荡周期、振荡寿命、最高电位和振停电位一致,图谱轮廓相同则判定待测样品与参照物为同种燕窝。
本发明电化学指纹图谱检测燕窝的方法,采用BrO3 --Ce2+-H+-丙二酸振荡体系进行燕窝鉴定无需进行复杂的前处理,便可获得特征信息,是一种准确、简便、低成本的鉴别方法,具有良好的应用前景。
经试验证明:通过本发明方法得到的电化学指纹图谱中,诱导时间t0、振荡周期tp、振荡寿命td、最高电位Emax、振停电位Emin及图谱轮廓,可以有效鉴别黄燕、白燕、血燕、海藻酸钠和鱼胶。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1电化学指纹图谱及其特征参数
图2温度对燕窝振荡图谱形态的影响
图3搅拌速度对燕窝振荡图谱特征参数的影响
图4不同种类燕窝及伪品指纹图谱(黄燕(a)、白燕(b)、血燕(c)、鱼胶(d)、海藻酸钠(e))
具体实施方式
实施例1本发明电化学指纹图谱鉴别燕窝
1)样品水解液制备
取待测样品烘干至恒重,研磨,过120目筛。玻璃试管中分别加入0.1120g样品粉末与5mL 1.0mol/L硫酸,置于烘箱中40℃下水解8小时,过滤,取滤液得到样品水解液;
2)B-Z电化学振荡指纹图谱
取步骤1)5mL样品水解液,5mL 2.0mol/L H2SO4、10mL 1.8mol/L HOOCCH2COOH、10mL 0.016mol/L(NH4)4Ce(SO4)4,置于150mL玻璃反应容器内,摇匀,盖好带注射孔和电极的反应器盖。在35℃,搅拌速度500r/min条件下,加入10mL 1.0mol/L KBrO3,此时混合溶液中[H+]=0.75mol·L-1
[Ce4+]=0.004mol·L-1、[HOOCCH2COOH]=0.45mol·L-1、[BrO3 -]=0.250mol·L-1,同时用二电极体系(以甘汞为参比电极,Pt黑电极为工作电极)测试混合溶液,记录待测样品电化学指纹图谱;
3)待测样品电化学指纹图谱中诱导时间t0 60s、振荡周期tp 100~130s、振荡寿命td 2200~3000s、最高电位Emax 1.00~1.10v、振停电位Emin0.90~0.99v,判定为燕窝。
实施例2本发明电化学指纹图谱鉴别燕窝
1)参照物水解液制备
取燕窝真品烘干至恒重,研磨,过120目筛。玻璃试管中分别加入0.1120g燕窝粉与5mL 1.0mol/L硫酸,置于烘箱中40℃下水解8小时,过滤,取滤液得到燕窝水解液;
2)样品水解液制备
取待测样品烘干至恒重,研磨,过120目筛。玻璃试管中分别加入0.1120g样品粉末与5mL 1.0mol/L硫酸,置于烘箱中40℃下水解8小时,过滤,取滤液得到样品水解液;
3)B-Z电化学振荡指纹图谱
将步骤1)5mL燕窝水解液、5mL 2.0mol/L H2SO4、10mL 1.8mol/L HOOCCH2COOH、10mL 0.016mol/L(NH4)4Ce(SO4)4,置于150mL玻璃反应容器内,摇匀,盖好带注射孔和电极的反应器盖。在35℃,搅拌速度500r/min条件下,加入10mL 1.0mol/L KBrO3,此时混合溶液中[H+]=0.75mol·L-1、[Ce4+]=0.004mol·L-1、[HOOCCH2COOH]=0.45mol·L-1、[BrO3 -]=0.250mol·L-1,同时用二电极体系(以甘汞为参比电极,Pt黑电极为工作电极)测试混合溶液,记录参照物电化学指纹图谱;
取步骤2)5mL样品水解液,5mL 2.0mol/L H2SO4、10mL 1.8mol/L HOOCCH2COOH、10mL 0.016mol/L(NH4)4Ce(SO4)4,置于150mL玻璃反应容器内,摇匀,盖好带注射孔和电极的反应器盖。在35℃,搅拌速度500r/min条件下,加入10mL 1.0mol/L KBrO3,此时混合溶液中[H+]=0.75mol·L-1、[Ce4+]=0.004mol·L-1、[HOOCCH2COOH]=0.45mol·L-1、[BrO3 -]=0.250mol·L-1,同时用二电极体系(以甘汞为参比电极,Pt黑电极为工作电极)测试混合溶液,记录待测样品电化学指纹图谱;
(4)待测样品电化学指纹图谱中诱导时间t0 60s、振荡周期tp 100~130s、振荡寿命td 2200~3000s、最高电位Emax 1.00~1.10v、振停电位Emin0.90~0.99v,判定为燕窝,进一步比对,指纹图谱中待测样品与参照物的诱导时间、振荡周期、振荡寿命、最高电位和振停电位一致,图谱轮廓相同则为与参照物同品种燕窝。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果:
试验例1
1材料与方法
1.1仪器与试剂
OrigaFlex500型化学工作站(法国欧力加);232型甘汞参比电极,DJS-1C型铂黑电导电极(上海精密科学仪器有限公司);150mL玻璃反应器;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南矛华仪器有限公司)。
1.2实验药品与试剂
2.0mol/L硫酸;1.8mol/L丙二酸;1.0mol/L溴酸钾;0.016mol/L硫酸铈铵;1.0moL/L硫酸。所有试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。
1.2测定方法
1.2.1燕窝前处理
燕窝原料烘干至恒重,研磨,过120目筛。玻璃试管中分别加入0.1120g燕窝粉与5mL 1.0mol/L硫酸,置于烘箱中40℃下水解12小时,过滤得到燕窝水解液。
1.2.2B-Z震荡反应
按[H+]=0.75mol·L-1、[Ce4+]=0.004mol·L-1、[HOOCCH2COOH]=0.45mol·L-1、[BrO3 -]=0.250mol·L-1浓度将5mL燕窝水液、5mL 2.0mol/L H2SO4、10mL 1.8mol/LHOOCCH2COOH、10mL 0.016mol/L(NH4)4Ce(SO4)4,置于150mL玻璃反应容器内,摇匀,盖好带注射孔和电极的反应器盖。在35℃,搅拌速度500r/min条件下,加入10mL 1.0mol/L KBrO3,同时以甘汞为参比电极,Pt黑电极为工作电极,用电化学工作站记录电化学振荡体系的电位(E)随时间(t)的变化曲线。
1.3电化学指纹图谱
利用燕窝水解液作为化学振荡反应的有机底物,通过调整振荡体系中各种物质的浓度,使其与振荡体系中的物质发生氧化还原反应,呈现出特征波形。每一种中药的振荡曲线都具有指纹特征,将其称为燕窝电化学指纹图谱。典型的振荡曲线如图1所示,可分为3个部分:诱导曲线、振荡曲线、停振曲线。
选取了5个典型的参数对图谱进行评价。(1)诱导时间t0,从加入溴酸钾开始到振荡开始的时间。(2)振荡周期tp,完成一次振荡循环所需要的时间,振荡寿命除以峰数。(3)振荡寿命td,从振荡开始到振荡结束的时间。(4)最高电位Emax,诱导曲线的电位最高值。(5)停振电位Emin,体系振荡刚好停止时所对应的电位。利用这些特征参数可以用来定性定量鉴别和评价中药。
1.4方法稳定性及特异性
优化条件下重复测定同一燕窝样品3次,绘制电化学指纹图谱,考察测量方法的稳定性。优化条件下重复测定燕窝样品及伪品,绘制电化学指纹图谱,考察测量方法的特异性。
2结果与讨论
2.1振荡反应测定条件的优化
2.1.1振荡反应温度的确定
以优化条件下经行前处理所得燕窝水解液为振荡底物,在燕窝加入量0.1120g、搅拌速度500r/min条件下,测定不同温度下燕窝水解液的B-Z电化学振荡指纹图谱,结果见图2和表1。
由图2可见,在33~38℃时,均可得到稳定的振荡图谱。温度对诱导时间(t0)、最高电位(Emax)及停振电位(Emin)影响不大,而对振荡周期(tp)、振荡寿命(td)影响较大。随温度的升高,振荡周期、振荡寿命都明显减小,这归因于温度升高则体系振荡反应的活化能降低,反应的速率加快,在振荡期各反应的速率明显变快,使振荡周期和振荡寿命都明显缩小。温度过高容易导致振荡的周期过小,不易观察,而温度过低则振荡寿命过长,增加检测时间。结合震荡图谱的形态,实验确定最佳测定反应温度为35℃,在以后测试过程中严格控制。
表1温度对燕窝振荡图谱特征参数的影响
由表1可知,燕窝振荡图谱信息中,振荡寿命是表征振荡反应的一个显著差异性指标,诱导时间、振荡周期差别不明显,可归因于我们对燕窝材料进行了预处理。下文我们将以这3项指标作为燕窝电化学指纹图谱的特征信息。
2.1.2搅拌速度的确定
搅拌速度的增加有利于燕窝化学成分的进一步浸出、扩散,促进活性成分参与振荡反应,诱导时间缩短,同时也影响振幅和周期。我们采用500、800、1100、1400r/min的,测定不同搅拌速度燕窝水解液的B-Z电化学振荡指纹图谱,对指纹图谱诱导时间、振荡周期、振荡寿命的特征信息进行比较分析,结果见图3。
由图3可知,搅拌速率只要能充分为振荡反应提供物质扩散条件,对诱导时间(缩短30s)、振荡周期、振荡寿命影响都不显著,只是略微减小。然而搅拌速度过高,溶液容易混入氧气,甚至产生气泡,溶解氧增加将导致体系振荡反应不稳定,指纹图谱出现杂峰,峰形难看。
2.1.3燕窝浓度的确定
白燕窝和血燕窝中都含有相对分子质量为20×103~90×103的5种糖蛋白,2-DE(双向凝胶电泳)则说明燕窝中蛋白质相对分子质量为28×103~57×103(PI为4.7~5.9)。燕窝中主要含有的氨基酸为丝氨酸、苏安酸、天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和缬氨酸,其中白燕窝含苯丙氨酸和酪氨酸较多。同一条件下燕窝加入量不同致使反应中氨基酸浓度的差异,这对振荡体系中氧化还原反应的促进及抑制作用会所差异。
实验以燕窝水解液为振荡底物测定了不同质量的电化学振荡指纹图谱,对指纹图谱诱导时间、振荡周期、振荡寿命的特征信息进行比较分析,结果见表2。
表2燕窝浓度对燕窝振荡图谱特征参数的影响
由表可知,当燕窝浓度为0.0007~0.0112g·mL-1(即质量为0.28~0.448g)时,诱导时间变化不明显,但是振荡周期和振荡寿命都随着燕窝浓度的增加而减小,这是因为燕窝浓度增加其有效成份增大,致使诱导期和振荡期的反应速率都加快,从而使诱导时间和振荡周期都减小。底物浓度过大易使振荡周期太小,不易观察,因此对燕窝进行鉴别,要严格控制燕窝的加入量,我们选择较佳燕窝原料加入浓度为0.0028g·mL-1
2.1.4燕窝前处理时间的确定
电化学指纹图谱振荡技术鉴别药材的优点之一是可以简化原料的预处理过程,由于燕窝质地坚硬,其中各活性成分的释放比普通中草药困难,我们采用水解法对燕窝进行预处理。
按前述方法,称取一定量的燕窝,加入1.0moL/L硫酸的硫酸,40℃分别处理一定的时间,考察水解反应时间对振荡指纹图谱的诱导时间、振荡周期、振荡寿命的影响,结果见表3,综合实验时间及特征参数易辨性,我们确定水解时间为8h。
表3燕窝原料在不同水解时间下的振荡图谱信息比较
2.2不同种类燕窝及伪品指纹图谱
电化学指纹图谱有很强的特征性,不同品种的燕窝或者伪品都有各自不同的图谱,如图4所示。
由图可见,海藻酸钠未出现振荡图谱,其他有机质材料出现形态各异振荡图谱。黄燕、白燕、血燕的指纹图谱诱导时间一致,振荡周期、振荡寿命、最高电位、振停电位有显著区别,但都在一定范围内(即诱导时间t0 60s、振荡周期tp 100~130s、振荡寿命td 2200~3000s、最高电位Emax 1.00~1.10v、振停电位Emin 0.90~0.99v),图谱轮廓相似,在特定时间出现底部接近直线的平头峰。此外,血燕后期振停电位有所抬升。鱼胶诱导时间明显增加至570s,图谱基本轮廓也有较大差别。具体参数见表4。
表4不同种类燕窝及伪品的振荡图谱特征参数
可见,在相同振荡体系和测试条件下,燕窝特征参数整体相似,但不同种类的燕窝因化学成分及其浓度不同,相应的电化学指纹图谱中的特征参数和振荡图谱还是存在差异。所以可依此评价燕窝的品质、产地和鉴别真伪。同时,与色谱指纹图谱相比,电化学指纹图谱能给出燕窝中化学成分的群集和协同配伍的信息。
2.3燕窝电化学指纹图谱的重现性
在控制条件温度为35℃、转速为500r/min的条件下,以黄燕原料为有机底物,在优化条件下获得燕窝的电化学指纹图谱,测定3次考察图谱的重现性,结果见表5。
表5燕窝电化学指纹图谱的稳定性
由表可知,电化学指纹图谱中5个参数的RSD小于5%,说明对于同一来源的同种燕窝,因其化学成分及含量相同,所以在相同实验条件下,电化学指纹图谱具有良好的重现性。
燕窝粉末0.1120g,加入5mL 1.0mol/L H2SO4经40℃下水解8h后,倒入离子浓度分别是[H+]=0.75mol·L-1、[Ce4+]=0.004mol·L-1、[HOOCCH2COOH]=0.45mol·L-1、[BrO3 -]=0.250mol·L-1的体系内,在温度35℃、搅拌速度500r/min的测试条件下,可以得到稳定的电化学指纹图谱。同品种燕窝的电化学指纹图谱相同,不同种燕窝的电化学指纹图谱虽然不相同,但也存在相似之处,而伪品或掺伪品在特征参数和图谱轮廓上有较大差别。因此,可以利用其特征参数:诱导时间t0、振荡周期tp、振荡寿命td、最高电位Emax、振停电位Emin及图谱轮廓作为鉴别中燕窝的依据,从而对该样品进行评价。

Claims (10)

1.一种电化学指纹图谱检测燕窝的方法,其特征在于:它是采用B-Z振荡反应检测,具体操作步骤如下:
(1)待测样品水解液制备:取待测样品,烘干,粉碎过筛,加H2SO4溶液水解,过滤,取滤液即得;
(2)B-Z电化学振荡指纹图谱:取待测样品水解液,与H+溶液、HOOCCH2COOH溶液和Ce4+溶液混匀,搅拌条件下加入BrO3 -溶液,同时用二电极体系测试混合溶液,记录电化学指纹图谱;
(3)分析电化学指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤(1)所述烘干至恒重;所述H2SO4溶液浓度为0.5-3.0mol/L,优选1.0mol/L;所述待测样品与H2SO4溶液的质量体积比为0.028~0.448g:1mL,优选0.1120g:1mL。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤(1)所述水解温度40℃,时间4~16h,优选8h。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(2)所述混合溶液中H+浓度0.25-1.25mol·L-1,HOOCCH2COOH浓度0.15-0.75mol·L-1,Ce4+浓度0.002-0.006mol·L-1,BrO3 -浓度0.150-0.350mol·L-1,优选:H+浓度0.75mol·L-1,HOOCCH2COOH浓度0.45mol·L-1,Ce4+浓度0.004mol·L-1,BrO3 -浓度0.250mol·L-1
5.根据权利要求1所述检测方法,其特征在于:步骤(2)所述混合溶液温度控制在33-37℃,优选35℃。
6.根据权利要求1所述检测方法,其特征在于:步骤(2)所述H+来自H2SO4,Ce4+来自(NH4)4Ce(SO4)4,BrO3 -来自KBrO3
7.根据权利要求1所述检测方法,其特征在于,步骤(2)所述搅拌速度为500-1400r/min,优选500r/min;和/或,所述二电极体系是以甘汞为参比电极,Pt黑电极为工作电极。
8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,步骤(3)所述指纹图谱中诱导时间t060s判定待测样品为燕窝。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于,所述指纹图谱中振荡周期tp 100~130s、振荡寿命td 2200~3000s、最高电位Emax 1.00~1.10v、振停电位Emin0.90~0.99v判定为燕窝。
10.根据权利要求1~9所述的检测方法,其特征在于,所述方法中用燕窝真品作为参照物,按照步骤(1)制备,步骤(2)检测,得到的指纹图谱与待测样品的诱导时间、振荡周期、振荡寿命、最高电位和振停电位一致,图谱轮廓相同则判定待测样品与参照物为同种燕窝。
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