CN112113815A

CN112113815A - 一种基于b-z振荡体系的大米产地溯源方法

Info

Publication number: CN112113815A
Application number: CN202011043734.XA
Authority: CN
Inventors: 沙敏; 房雪婷; 李良翠; 刘唱; 张正勇; 刘军
Original assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Current assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2020-12-22

Abstract

本发明公开一种基于B‑Z振荡体系的大米产地溯源方法，属于食品鉴别技术领域。本发明利用大米干扰丙二酸参与的B‑Z化学振荡反应，通过严格控制振荡反应条件，得到具有明显指纹特征的电化学指纹图谱，为不同产地大米的鉴别提供了实验依据。相比其他鉴别大米的化学方法，该方法只要求将大米处理成粉末，而不需要其他繁琐、复杂、耗材的前处理。同时，电化学指纹图谱除了可以反映大米成分种类、含量的差异，还可以体现成分化学性质的差异，鉴别准确率高于80％，效果较好，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法

技术领域

本发明属于食品鉴别技术领域，特别涉及一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法。

背景技术

稻米是我国人民的主要食物，为人体提供碳水化合物、蛋白质、脂肪及膳食纤维等主要营养成分以及大量人体必需的微量元素，其质量与地理起源密切相关。地理标志大米因口感好、品质佳深受消费者的欢迎，然而，其产量低、种类繁多、价格各异，导致制假售假现象严重，扰乱市场秩序，损害消费者利益，而且对消费者的健康造成了潜在危险。面对国产大米存在产品质量难控、市场竞争混乱等现象，亟待改善大米难辨识的现状。

目前，国内外鉴别地理标志大米常用的方法主要包括电子信息编码技术、生物与化学技术、智能感官仿生技术和化学成分群集表征技术等。但这些方法均存在一定缺陷，如电子信息编码技术存在张冠李戴、乱贴追溯码的可能；化学鉴别检测项目繁多、检测过程繁琐耗时、检测设备昂贵，需进行大量的数据分析和标准物质收集，且人为伪造特异性的化学指标会给化学鉴别方法造成严重的干扰；生物学鉴别需要剧烈的加工条件和极端的贮藏条件，同时需要大量样本以建立DNA数据库；智能感官仿生技术影响鉴别结果的干扰性因素较多；化学成分群集表征技术仅适用于基质成分较复杂的样本的质量评价。

近年来，拉曼光谱、增强拉曼光谱、核磁共振氢谱、二维核磁共振谱、质谱等指纹图谱技术与模式识别技术相结合在大米产地鉴别分析上已经取得了一定的研究进展，但这些方法均是基于检测稳态或平衡态大米的物理和化学信号，侧重表征大米成分的种类和含量信息，无法体现大米成分的化学性质差异，非线性化学指纹图谱技术的提出旨在克服这一问题，其是基于电化学工作站实时跟踪非平衡态的反应过程获取动力学指纹图谱，依据远离平衡条件的化学反应原理建立的鉴别与评价样本的新技术但电化学指纹图谱技术的提出仅十余年，其在大米鉴别上的应用研究较少，普遍采用的是两种B-Z(Belousov-Zhabotinski)振荡反应体系，丙酮参与的体系需要借助样品中的耗散物参与反应，诱导期普遍较长，不利于快速检测分析，且需在封闭体系中进行，对反应密封性要求苛刻。

在大米分析鉴别中，待测物往往来源复杂、种类繁多、生产工艺各异、组成复杂，仅仅凭借其中一种或几种成分指标来判定其种类、真伪或评估其质量，缺乏科学严谨性，结果较不可靠，也往往为假冒伪劣产品进入市场提供可乘之机。故有必要从不同角度建立样本指纹图谱技术，通过多种方法互补，获取更多的指纹图谱信息，构建较为完善的大米指纹图谱体系，为大米产地溯源保护研究提供科学合理的技术选择及数据支持。

发明内容

针对现有大米溯源技术存在的不足，本发明提供了一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法，包括以下步骤：

步骤1，将不同产地的大米样品采用B-Z振荡体系进行反应，记录反应过程中反应溶液的电势变化，根据电势随时间的变化，得到标准电化学指纹图谱；

步骤2，将未知产地的大米样品采用同样的B-Z振荡体系进行反应，记录反应过程中反应溶液的电势变化，根据电势随时间的变化，得到电化学指纹图谱；

步骤3，将步骤2得到的电化学指纹图谱与步骤1得到的标准电化学指纹图谱进行对比，即可判断大米样品的产地；

所述B-Z振荡体系为H⁺-Ce⁴⁺-CH₂(COOH)₂-BrO₃ ^-。

上述B-Z振荡体系的反应条件为：将0.5-2.0g大米样品与55.0mL 1.0mol/L硫酸溶液、3-6mL 1.0mol/L丙二酸的硫酸溶液、0-2mL 1.0mmol/L溴化钠溶液和3-6mL 0.01mol/L的硫酸铈铵的硫酸溶液混合后在35-50℃条件下进行反应，反应进行8-12min后加入2-5mL0.8mol/L溴酸钠溶液。

上述B-Z振荡体系的反应条件为：将0.5g大米样品与55.0mL 1.0mol/L硫酸溶液、4mL 1.0mol/L丙二酸的硫酸溶液、0.5mL 1.0mmol/L溴化钠溶液和6mL0.01mol/L的硫酸铈铵的硫酸溶液混合后在40℃条件下进行反应，反应进行8min后加入4mL 0.8mol/L溴酸钠溶液。

上述大米样品是将大米粉碎后经100目筛筛分，得到的米粉。

上述方法是采用银-氯化银电极和铂丝电极以0.05s的采样间隔记录反应溶液的电势随时间的变化。

采用上述方案后，本发明利用大米干扰丙二酸参与的B-Z化学振荡反应，通过严格控制振荡反应条件，得到具有明显指纹特征的电化学指纹图谱，为不同产地大米的鉴别提供了实验依据。相比其他鉴别大米的化学方法，该方法只要求将大米处理成粉末，而不需要其他繁琐、复杂、耗材的前处理。同时，电化学指纹图谱除了可以反映大米成分种类、含量的差异，还可以体现成分化学性质的差异，鉴别准确率高于80％，效果较好，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是不同大米用量的电化学指纹图谱；

图2是不同反应温度的电化学指纹图谱；

图3是不同预混匀时间的电化学指纹图谱；

图4是5次重复试验的电化学指纹图谱；

图5是3种大米(响水大米、建三江大米、方正大米)的电化学指纹图谱。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

本发明以3种来自黑龙江省的地理标志大米作为范本，从非平衡态体系角度其进行鉴别研究，探究适宜的反应条件，结合模式识别方法考察最佳反应条件下的电化学指纹图谱对大米产地溯源的可行性，对化学成分群集表征技术鉴别分析食品的理论依据进行一定的补充。

实施例1

本实施例1所采用的3种地理标志大米分别为黑龙江省牡丹江市宁安市的响水大米、黑龙江省农垦总局建三江分局的建三江大米和黑龙江省方正县的方正大米。大米为2018年间种植，为了保证样品的代表性，在地理标志大米种植区域内分散采样，响水、建三江和方正大米分别在20个采样点采集样品，每份大米采集约2kg样品。

一、方法

1.供试品及溶液制备

将水稻进行晾晒、脱粒、挑选、砻谷和碾米等加工，每份水稻砻谷2次，碾米1次。称取加工后的每份米100g，加入到粉碎机中，粉碎1.5分钟，经100目筛筛分，所得米粉置于冰柜中冷藏储存，使用前置于干燥器中平衡至室温。

用超纯水稀释浓硫酸至1.0mol/L，用稀释后的硫酸溶液分别配制1.0mol/L的丙二酸溶液和0.01mol/L的硫酸铈铵溶液。用超纯水配制0.8mol/L的溴酸钠溶液和1.0mmol/L的溴化钠溶液。配制质量分数为3％的硫酸溶液和饱和氯化钾溶液。

2.电极活化及检验

将玻碳电极用3.0μm的氧化铝悬糊在麂皮上进行抛光处理，再依次用3％H₂SO₄、乙醇、水超声清洗各1分钟。铂丝电极依次用3％H₂SO₄、乙醇、水超声清洗各1分钟；银-氯化银电极依次经乙酸乙酯、乙醇和去离子水清洗。

使用循环伏安法进行电极活化，参比电极用银-氯化银电极，工作电极用玻碳电极，铂丝电极作对电极。将电极放入3％H₂SO₄溶液中，电化学分析仪测试参数设置如下，InitE：0，High E：1，Low E：0，Final E：1，Initial Scan Polarity：Positive，Scan Rate：0.1，Sweep Segments：10，Sample Interval：0.001，Quiet Time：2，Sensitivity：1.e-006。重复运行直至循环伏安曲线重合程度较好为止，一般需要重复运行4次。

电极检验使用二电极体系，参比电极是银-氯化银电极，工作电极为铂丝电极，以0.1s的采样间隔记录两个电极在饱和氯化钾溶液中的开路电压值，以电势随时间的变化为评价指标，当3分钟内的电势波动小于5mV时判定电极状态完好，否则要重新进行活化。

3.B-Z振荡反应指纹图谱采集

以优化后的最佳反应条件为例，其余反应仅是反应物用量或反应温度的差异。调节水浴温度至40℃，待温度恒定后，向反应器中加入0.5g米粉、55.0mL硫酸溶液、4.0mL丙二酸溶液、0.5mL溴化钠溶液和6.0mL硫酸铈铵溶液，启动电磁搅拌装置并开始计时，在450r/min恒速搅拌下使样品充分溶解且温度稳定，8分钟时加入4.0mL溴酸钠溶液，同时用银-氯化银电极和铂丝电极以0.05s的采样间隔记录反应器中溶液的电势随时间的变化，记录18分钟后停止采集，保存图谱，每个谱图的数据点有21600个。

4.数据处理

为了从原始谱图数据中去除干扰的和无关的信息，在数据分析之前应对原始数据做一些预处理。本实施例中，拉曼光谱数据依次用wden小波函数进行去噪处理，用mapminmax函数进行归一化。用相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)分析考察方法的重复性。最后，基于支持向量机(support vector machine，SVM)对样本地理来源进行鉴别，所有数据处理和模型构建均基于Minitab和Matlab进行。

支持向量机是Cortes和Vapnik于1995年首先提出的，是建立在统计学习理论的VC维理论和结构风险最小原理基础上的，根据有限的样本信息在模型的复杂性和学习能力之间寻求最佳折衷，以期获得最好的推广能力。它在解决小样本、非线性以及高维模式识别问题中表现出特有的优势。

二、实验结果

1.空白振荡反应条件优化

目前，常用的振荡反应体系有H⁺-Mn²⁺-CH₃COCH₃-BrO₃ ^-和H⁺-Ce⁴⁺-CH₂(COOH)₂-BrO₃ ^-，考虑到反应的安全性、可重复性等，本实施例选用H⁺-Ce⁴⁺-CH₂(COOH)₂-BrO₃ ^-振荡反应体系，其被各界广泛认同的反应机理是1972年由Field，Koros和Noyes三位化学家共同建立的FKN动力学模型，该模型包含了超过二十个基元反应。为获得空白B-Z振荡反应的最佳反应条件，对影响反应的四个因素(溴化钠溶液、丙二酸溶液、硫酸铈铵溶液和溴酸钠溶液的浓度)分别设置了4个水平(如表1)，采用L₁₆(4⁴)正交表进行实验，得到16个电化学指纹图谱。由于电化学分析比较灵敏，3分钟内电势波动在5mV内认为是在正常值范围，因此空白振荡反应的振幅(ΔE)要足够大，这样由仪器导致的误差可控制在较低水平下。同时，本发明的目的是为大米产地溯源提供技术支持，为了适应快速检测的要求，希望振荡反应的诱导时间(t)越短越好。为了获取丰富的数据，希望振荡的周期(T)较小，这样在一定的时间内的谱峰数足够多。基于这三个要求，对每个实验所得图谱的振幅(以第5个振荡波的振幅计算)、诱导时间和振荡周期(以第4和5个峰的峰顶间隔时间计算)进行分析，结果如表1。

表1正交试验结果表

实验	V<sub>A</sub>(mL)	V<sub>B</sub>(mL)	V<sub>C</sub>(mL)	V<sub>D</sub>(mL)	ΔE(V)	t(s)	T(s)
								1	0	3	2	3	0.0683	350	48
2	0	4	3	4	0.0714	270	42
								3	0	5	4	5	0.0765	240	34
4	0	6	5	6	0.0846	195	26
								5	0.5	3	3	5	0.0551	285	29
6	0.5	4	2	6	0.0643	208	32
								7	0.5	5	5	3	0.0918	310	37
8	0.5	6	4	4	0.0938	224	36
								9	1	3	4	6	0.0547	294	23
10	1	4	5	5	0.0681	276	25
								11	1	5	2	4	0.0894	218	44
12	1	6	3	3	0.1003	249	47
								13	2	3	5	4	0.0627	375	27
14	2	4	4	3	0.0849	335	40
								15	2	5	3	6	0.0771	197	30
16	2	6	2	5	0.0927	186	42

注：A为NaBr，B为(NH₄)₄Ce(SO₄)₄，C为NaBrO₃，D为CH₂(COOH)₂。

运用Minitab软件中的“DOE——田口设计——田口设计分析”对上表中的数据进行分析，分别计算ΔE,t和T在各因素各水平下的均值(k_i)，根据各水平下的均值计算极差值(R)，再根据极差值排秩明晰影响各指标值的主要因素，分析结果见表2。硫酸铈铵的浓度对ΔE和t的影响最大，增加其用量，振幅变大，诱导时间变短，T变化不大，整体看最适宜的用量为6mL。丙二酸的用量对振幅和诱导时间的影响较大，随着其用量的增加，ΔE变小，t缩短，最佳用量的确定难以兼顾这两个因素，T受丙二酸的影响最大，随着其用量的增加而变小，这是因为丙二酸参与并影响了Br^-的再生过程，增加其用量后，Br^-的再生速度也加快了，所以振荡周期缩短，综合考虑，最佳的用量为4mL。溴酸钠的用量对ΔE的影响可忽略，对T的影响较大，随着用量的增加周期缩短，对t有一定的影响，随着用量的增加诱导时间变长，最佳的用量为4mL。溴化钠的量对ΔE影响不大，t和T值最小对应的量均为0.5mL。综上，欲在较短时间内获取数据尽可能丰富的谱图，分析时优先考虑ΔE，其次考虑t和T。最佳反应条件为：溴化钠0.5mL，硫酸铈铵6mL，溴酸钠4mL，丙二酸4mL。根据这一最佳条件进行测试，所得指纹图谱的ΔE为0.0889V，t为219s，T为34s，均优于表1中的平均水平，与预期结果相符合。

表2正交试验分析结果表

注：k_i表示各因素各水平试验结果的平均值，R为各水平的极差。

2.大米参与的振荡反应条件优化

化学振荡反应涉及众多基元反应，其中任一基元反应发生变化，如反应速度、氧化还原反应过程中的电子转移数目、反应物以及生成物的活度等，都可对整个化学振荡反应产生影响，导致E-t曲线发生改变。大米电化学指纹图谱是在一定的振荡体系中加入大米，依靠大米复杂化学成分中某些还原性物质改变了初始反应底物以及其他共存的物质，对基元反应产生影响。依据这一原理，当向振荡体系中加入不同产地的大米时，由于其成分和含量的差别，引起诱导反应和振荡反应机理的改变，获得特征振荡曲线，依据这些变化就可以对样品进行鉴别以及质量评价。

大米用量不仅影响电化学指纹图谱的形状和信息参数，而且只在一定量的范围内，才可产生完整的电化学指纹图谱，故测定指纹图谱时用量须适当。分别向体系中加入米粉0.5g、1.0g、1.5g、2.0g，测定相应的指纹图谱，如图1所示。随着底物的加入以及用量的增加，其化学成分对振荡反应的抑制作用增强，体系诱导期变长、振荡幅度变小。振幅过小，不利于特征信息的快速获取以及对谱图的分析。底物量大，体系中大量的不溶性物质对电极产生随机性的干扰较大，使得反应的稳定性降低，电位变化异常，谱图规整度下降。当用量为0.5g，不仅底物需求量少，而且图谱稳定，利于分析，所以选择0.5g为最佳的大米加入量。

体系起始能量的变化对振荡反应有着较大的影响，因此选择一个适合的温度条件，对反应时间的控制、图谱稳定性和重现性的保证，均有着重要的意义。精确称量0.5g大米粉末，分别在35、40、45和50℃测定其电化学指纹图谱，如图2所示。当温度为35℃时，诱导时间和振荡周期均较长。当温度为40℃时，出现最大振幅。在45和50℃时，振荡反应波动较大，不利于图谱的分析研究。经反复摸索后，实验体系最佳测定温度为40℃。

样品在溶液中预混匀时间会影响浸出成分的浓度，从而影响振荡反应。在对电极进行活化及检验过程中，发现电极在饱和氯化钾溶液中需要浸泡8min方可达到稳定的状态。以65mL去离子水空白试验研究溶液温度由室温稳定至40℃耗时约6min。在此基础上，设定样品的预混匀时间分别为8、10和12min，所得谱图如图3所示，3张谱图的特征参数值相差不大，为了缩短试验耗时，采用8min，即在8min时加入4.0mL溴酸钠溶液引发振荡反应。

取同一大米粉末，在上述最佳实验条件下，平行测定5次，电化学指纹图谱如图4所示，振幅、诱导时间、周期和全谱的RSD值分别为3.3％，0.2％，2.1％和1.7％，表明方法重现性良好。该条件下的谱图与空白振荡反应相比，振幅下降约0.005V，诱导时间延长约3s，振荡周期缩短约8s，说明大米的加入，对振荡反应产生了显著的影响。为了探究可能的影响物质，将0.5g大米在65mL浓度为1.0mol/L的硫酸溶液中40℃下搅拌浸泡8分钟，过滤，水溶液用20mL乙酸乙酯提取3次，合并，依次经饱和食盐水和无水硫酸钠干燥，0.22μm滤膜过滤，去除溶剂，剩余物经GC-MS分析。含有的可能影响振荡反应的物质如图5所示。

3.大米产地溯源

如果固定振荡体系中各物质的浓度，而只改变大米的种类，所获得的振荡波形无疑就是该大米的特征波形。分别以建三江、方正和响水大米为底物，采用上述最佳反应条件，得到各大米的典型振荡指纹图谱，如图5。综观三种大米的振荡指纹图谱，在加入溴酸钠后，体系电势迅速上升，经此诱导期，体系呈周期性变化，3种大米均呈现高度类似的振荡行为。振荡峰形态较尖且细长，振荡峰较圆整对称，随时间周期基本不变。由于采集的样本批次间有差异及所采用的分析方法本身有一定误差，最终3种大米60个样本振荡指纹图谱的各参数值范围相互重叠，经层次聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)均不能很好的区分。

模式识别技术可以有效的挖掘特征数据，揭示指纹图谱数据中的隐含信息，并能够实现海量数据的快速分析，进一步用SVM的方法进行鉴别区分。采用随机函数随机选取每种大米的15个样本作为训练集来训练模型，剩余的5个样本作为预测集样本验证所建模型的准确性。以RBF为核函数，惩罚参数C和核参数g的寻优使用网格搜索法，具体参数设置如下：C的变化范围限定为[2^-8，2⁸]，g的范围取[2^-8，2⁸]，进行5折交叉验证，C和g的步进值均为0.5，最后参数选择结果图中准确率离散化显示的步进值为4.5。为提高模型的效率，采用PCA分析，提取累计贡献率为85％及以上的主成分建模。为提高模型的可靠性，将随机运行10次的平均值作为模型的识别准确率。去噪和归一化的数据处理方法被用来提升模型的识别准确率，结果如表3。仅经过PCA处理的数据建模结果表明，当主成分贡献率超过98％时，预测集的识别准确率反而有下降趋势，说明部分数据为无用信息，并不需要全部用于建模分析。经过去噪结合PCA处理的数据建模结果相比仅经过PCA处理的数据而言，识别准确率没有明显改善，说明去噪处理对电化学分析所得的谱图没有太大作用，因此数据分析时可不进行去噪处理。数据经归一化结合PCA处理后的建模结果比其他两种数据处理方式要好，所有识别准确率均优于80％。与已有的快速检测技术相比，模型的识别率相差不大，且本文所研究的3种地理标志大米的产地较为邻近，说明本发明所采用的基于B-Z振荡体系鉴别大米产地的方法具有一定的潜在应用价值。

表3不同数据下的模型鉴别准确率结果

本研究以建三江、方正和响水三种产地大米为研究对象，利用大米干扰丙二酸参与的B-Z化学振荡反应，通过严格控制振荡反应条件，得到具有明显指纹特征的电化学指纹图谱，为不同产地大米的鉴别提供了实验依据。相比其他鉴别大米的化学方法，该方法只要求将大米处理成粉末，而不需要其他繁琐、复杂、耗材的前处理，对于这个快速发展的时代，该方法显得尤为与时俱进。尤其值得一提的是，电化学指纹图谱除了可以反映大米成分种类、含量的差异，还可以体现成分化学性质的差异，鉴别准确率高于80％，效果较好，具有广阔的应用前景。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内。

Claims

1.一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1，将不同产地的大米样品采用B-Z振荡体系进行反应，记录反应过程中反应溶液的电势变化，根据电势随时间的变化，构建标准电化学指纹图谱；

步骤3，将步骤2得到的电化学指纹图谱与步骤1的标准电化学指纹图谱进行对比，即可判断大米样品的产地；

所述B-Z振荡体系为H⁺-Ce⁴⁺-CH₂(COOH)₂-BrO₃ ^-。

2.如权利要求1所述的一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法，其特征在于：所述B-Z振荡体系的反应条件为：将0.5-2.0g大米样品与55.0mL 1.0mol/L硫酸溶液、3-6mL1.0mol/L丙二酸的硫酸溶液、0-2mL 1.0mmol/L溴化钠溶液和3-6mL 0.01mol/L的硫酸铈铵的硫酸溶液混合后在35-50℃条件下进行反应，反应进行8-12min后加入2-5mL 0.8mol/L溴酸钠溶液。

3.如权利要求2所述的一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法，其特征在于：所述B-Z振荡体系的反应条件为：将0.5g大米样品与55.0mL 1.0mol/L硫酸溶液、4mL 1.0mol/L丙二酸的硫酸溶液、0.5mL 1.0mmol/L溴化钠溶液和6mL 0.01mol/L的硫酸铈铵的硫酸溶液混合后在40℃条件下进行反应，反应进行8min后加入4mL 0.8mol/L溴酸钠溶液。

4.如权利要求2或3所述的一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法，其特征在于：所述大米样品是将大米粉碎后经100目筛筛分，得到的米粉。

5.如权利要求1所述的一种基于B-Z振荡体系的大米产地溯源方法，其特征在于：所述方法是采用银-氯化银电极和铂丝电极以0.05s的采样间隔记录反应溶液的电势随时间的变化。