CN104297191B - 利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，属于生物发酵检测技术领域。本发明利用紫外分光光度计作为检测工具构建鸟苷紫外指纹图谱，从而构建紫外指纹图谱与鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现鸟苷产量的在线检测，其具体步骤分为模型建立、模型验证和模型应用。本发明为鸟苷产量测定提供一套高效、准确、快速的新方法，该方法操作简单、快速，将有力的推动鸟苷发酵检测技术的创新。

Description

利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法

技术领域

本发明属于生物发酵检测领域，具体涉及利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法。

背景技术

生物发酵过程是一个实时、非线性、多变量输入输出和随机性的动态过程，发酵过程中发酵液组成复杂，组分和含量具有时变性，发酵过程中随着发酵液性状改变，其紫外吸收光谱也会呈现相应的变动，将不同时期，发酵液的紫外吸收光谱汇集到一块，形成的紫外光谱，称之为鸟苷发酵液紫外光谱指纹图谱。这种指纹图谱与目前用于中药鉴定紫外光谱指纹图谱不同之处是：它不仅反映各时期某一点上发酵液的紫外吸收特征，同时可以反映整个生物发酵中发酵液代谢流的动态过程。通过研究鸟苷发酵中引起发酵液紫外吸收变化的重要参数，如菌体生长量、氮源消耗量、鸟苷的生成量等，可以帮助解读紫外光谱指纹图谱，前期研究了鸟苷发酵前、中、后、末不同阶段发酵液紫外吸收情况，建立了不同发酵阶段鸟苷发酵液的紫外吸收特征图谱。

鸟苷发酵过程的检测控制，常规方法发酵过程中第一个取样是12h，以后每间隔6h取样，36h后，每隔3h取样，特别是发酵终了，取样更频繁，随需要随取样化验，化验项目包括pH、OD、残糖、鸟苷、杂菌等，操作复杂。

本发明基于前期构建鸟苷紫外指纹图谱，构建与其与主要参数鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现在线检测鸟苷产量，实现通过指纹图谱检测鸟苷产量，为鸟苷检测提供一种新方法。目前此方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供基于前期构建鸟苷紫外指纹图谱，构建与其与主要参数鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现在线检测鸟苷产量，实现通过指纹图谱检测鸟苷产量，为鸟苷检测提供一种新方法。

本发明采用的技术方案如下：

利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法是利用紫外分光光度计作为检测工具构建鸟苷紫外指纹图谱，从而构建紫外指纹图谱与鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现鸟苷产量的在线检测，具体操作包括下列步骤：

步骤(1)，模型建立：

A、鸟苷发酵：

1)菌种活化

取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，36-38℃恒温静置培养12-14h；

2)种子培养

接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有种子培养基的摇瓶中，纱布封口，置于往复式摇床上，36-37℃振荡培养12-18h，得到种子液；

3)鸟苷发酵

将上述种子液以10％的接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，置于往复式摇床上，36-37℃，培养72h，获得发酵液；

B、取步骤(1)经过充分混匀的发酵液，用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品；设置紫外分光光度计采集条件为：对待测发酵液样品进行紫外光谱扫描，其波长扫描范围为210-300nm，采样间隔1nm，光谱带宽0.1nm，扫描速度为1nm/s，其参比为蒸馏水，测定在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

C、纸层析法测定鸟苷产量：将发酵液沸水浴4-6min，离心取上层清液，上清液点样，纸层析测定；

D、根据测得的鸟苷产量与紫外吸光度，得到鸟苷产量与紫外吸光度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀之间的函数关系为：

c＝15.7653*A₂₅₀-26.5632*A₂₆₀+59.2183*A₂₈₀-55.0967*A₂₉₀

其中，c为鸟苷产量，A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₉₀分别为此时发酵液在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

步骤(2)，模型验证：

按步骤(1)的A步骤分别进行2-5次发酵，取其不同时间段的发酵液用蒸馏水稀释500倍后按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，分别测定相应波长吸光值，根据所建模型预测鸟苷产量，并与实际产量进行比较分析；预测值与实际值相对误差的绝对值平均小于5％；其中，实际产量采用步骤(1)的C步骤进行测定；

步骤(3)模型应用：

按步骤(1)建立的模型，取待测发酵液用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品，备用；按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，以蒸馏水为参比，依次扫描待测发酵液样品的紫外光谱，并测定相应波长的吸光值，利用建 立模型预测鸟苷产量，获得该发酵液中的鸟苷产量。

本发明技术方案中，步骤(1)模型建立中所述的种子培养时，接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中。

本发明技术方案中，进一步优选的是步骤(1)模型建立中种子培养时，纱布封口的纱布层数为8层。

本发明技术方案中，步骤(1)模型建立中种子培养时，往复式摇床的冲程76mm，速度为108r/min。

本发明技术方案中，步骤(1)模型建立中鸟苷发酵时，将上述种子液以10％的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中。

本发明技术方案中，步骤(1)模型建立中鸟苷发酵时，往复式摇床的冲程为76mm，速度为108r/min。

本发明技术方案中，进一步优选的是步骤(1)中纸层析法测定鸟苷产量中离心的速度为3000r/min，离心的时间为5min。

本发明技术方案中，进一步优选的是步骤(1)中纸层析法测定鸟苷产量中上清液点样量为10μL。

本发明技术方案中，进一步优选的是步骤(1)中纸层析法测定鸟苷产量中纸层析测定的展开剂为异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1。

所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)中纸层析法测定鸟苷产量中纸层析测定的展开剂为异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1。

本发明技术方案中，进一步优选的是所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于，利用紫外分光光度计作为检测工具构建鸟苷紫外指纹图谱，从而构建紫外指纹图谱与鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现鸟苷产量的在线检测，具体操作包括下列步骤：

步骤(1)，模型建立：

A、鸟苷发酵：

1)菌种活化

取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，37℃恒温静置培养13h；

2)种子培养

接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36.5℃ 振荡培养16h，得到种子液；

3)鸟苷发酵

将上述种子液以10％的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36.5℃，培养72h，获得发酵液；

B、取步骤(1)经过充分混匀的发酵液，用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品；设置紫外分光光度计采集条件为：对待测发酵液样品进行紫外光谱扫描，其波长扫描范围为210-300nm，采样间隔1nm，光谱带宽0.1nm，扫描速度为1nm/s，其参比为蒸馏水，测定在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

C、纸层析法测定鸟苷产量：将发酵液沸水浴5min，离心取上层清液，离心的速度为3000r/min，离心的时间为5min，上清液点样10μL，纸层析测定，展开剂为异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1；

D、根据测得的鸟苷产量与紫外吸光度，得到鸟苷产量与紫外吸光度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀之间的函数关系为：

c＝15.7653*A₂₅₀-26.5632*A₂₆₀+59.2183*A₂₈₀-55.0967*A₂₉₀

其中，c为鸟苷产量，A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₉₀分别为此时发酵液在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

步骤(2)，模型验证：

按步骤(1)的A步骤分别进行4次发酵，取其不同时间段的发酵液用蒸馏水稀释500倍后按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，分别测定相应波长吸光值，根据所建模型预测鸟苷产量，并与实际产量进行比较分析；预测值与实际值相对误差的绝对值平均小于5％；其中，实际产量采用步骤(1)的C步骤进行测定；

步骤(3)模型应用：

按步骤(1)建立的模型，取待测发酵液用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品，备用；按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，以蒸馏水为参比，依次扫描待测发酵液样品的紫外光谱，并测定相应波长的吸光值，利用建立模型预测鸟苷产量，获得该发酵液中的鸟苷产量。

本发明模型构建的原理与具体过程如下：

1.数学模型的构建

假设某溶液中只含有一种物质，此种物质在波长λ₁处的摩尔吸光系数为其在λ₁处的吸光度为其浓度为c₁。

则由比尔吸收定律可知：

令因式中为定值，所以b₁也为定值。则

假设某溶液中含有两种物质，物质一在波长λ₁处的摩尔吸光系数为在波长λ₂处的摩尔吸光系数为浓度为c₁。物质二在波长λ₁处的摩尔吸光系数为在波长λ₂处的摩尔吸光系数为浓度为c₂。其混合液在λ₁处的吸光度为在λ₂处的吸光度为

则由比尔吸收定律可知：

解方程组可得：

其中

令

因为式中为定值，所以也为定值。则

同理，可以推导出当发酵液中含有n种物质时，第i种物质的含量与的关系如下：

式中：i＝1，2...n；

c_i为第i种物质的浓度。

为混合溶液在波长λ_i处的吸光度。

为常数。

由上式可知，只要知道的值，就可以由计算出第i种物质的浓度c_i。

2.模型的简化

由上述可知，此模型的一般表达式为：

式中：i＝1，2...n；

n为发酵液中含有物质种类的数量；

ci为发酵液中第i种物质的浓度；

为混合溶液在波长λ_i处的吸光度；

为未知参数。

上式中n值的确定是关键。发酵液中所含有的成份很多，种类和数量无法知晓。但是发酵液的成份可以大致归为三类：培养基、鸟苷和其他对紫外有吸收的杂质，显然杂质的种类不止一种，因此n的取值应大于等于3。把0，12，24，40，56，72h的紫外吸光度和产量代入模型中可以得到一个含有6个方程的方程组，求解中为减小实验误差造成的影响，必须满足方程为超定方程，因此n应小于等于5。可以证明n值越大，所得到的模型越精确，但求解过程也越复杂，同时应用起来也越麻烦。综合考虑，实验组决定把n取为4。

人们经常通过溶液的A₂₅₀/A₂₆₀，A₂₈₀/A₂₆₀，A₂₉₀/A₂₆₀来确定溶液中核酸的种类，且吸光 度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀的变化在整个发酵过程中与鸟苷产量的变化关系密切，因此本申请采用A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀来建立模型。

利用此模型本实验组只想得到鸟苷的产量，因此把所得方程化简为

其中：t为发酵时间

c^t为th的发酵液中鸟苷的含量。

分别为th的发酵液在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度。

3.系数的求解

由发酵0、12、24、40、56和72h的发酵液的紫外吸收光谱获得A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀的值，由纸层析得到鸟苷的产量c，带入上式可得到一个方程组。

令

则方程组化简为：

Y＝X*B

运用matlab数学软件和最小二乘法原理，进行线性模型求解可得b₂₅₀、b₂₆₀、b₂₈₀和b₂₉₀的值。具体算法为：

B＝(X′*X)^-1*X′*Y

4.模型的建立

本实验组把发酵0、6、12、18、24、40、48、56、64和72h的发酵液的紫外吸光度和对应的鸟苷产量都代入模型，应用matlab数学软件，以最小二乘原理进行求解，重新获得参数值，见表1：

表1 公式中的参数

参数	b250	b260	b280	b290
					参数求解值	15.765	-26.5632	59.2183	-55.0967

因此得到鸟苷产量与紫外吸光度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀之间的关系模型为：

c＝15.7653*A₂₅₀-26.5632*A₂₆₀+59.2183*A₂₈₀-55.0967*A₂₉₀

5.模型的检验

为了检验修正后的模型，重新进行了一次发酵，前2h每隔6h取1mL发酵液进行紫外吸收光谱的绘制和鸟苷产量的测定。24h后每隔8h取1mL发酵液进行紫外吸收光谱的绘制和鸟苷产量的测定。然后把用模型计算出的鸟苷产量与实际所获得的产量相比较，结果如表2。

表2 模型检验

由表2表明：发酵前期相对误差较大，但是绝对误差很小，大都小于0.5g/L。发酵中期和后期，除少数点的相对误差较大外。大部分相对误差和绝对误差都比较小，相对误差的绝对值平均后小于5％。说明所获得的模型对不同批次的鸟苷分批发酵过程之间也适用，具有较强的适用性。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：(1)本发明基于前期构建鸟苷紫外指纹图谱，构建与其与主要参数鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现在线检测鸟苷产量，实现通过指纹图谱检测鸟苷产量，为鸟苷检测提供一种新方法；(2)紫外光谱法方便快捷，并易于实现发酵过程的在线检测控制鸟苷发酵过程，具有一定应用前景；(3)本发明为鸟苷产量测定提供一套高效、准确、快速的新方法，将有力的推动鸟苷发酵检测技术的创新。

附图说明

图1是本发明实施例3鸟苷标品、最初及最终发酵液的紫外吸收谱图；

图2是本发明实施例3鸟苷产量随时间的变化图；

图3是本发明实施例3中0、12、24h发酵液的紫外吸收谱图；

图4是本发明实施例3中24、40、56、72h发酵液的紫外吸收谱图；

图5是本发明实施例3中6、18、32、48和64h发酵液紫外吸收谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述。

本发明实施例采用的材料、仪器、试剂和培养基的具体说明如下：

1.1材料

鸟苷产生菌(Bacillus subtilis) (保存于河南科技学院发酵工程实验室)

1.2仪器

1.3主要试剂

1.4培养基

(1)斜面和平板培养基(质量百分数)

葡萄糖0.5，酵母膏1，蛋白胨1，L-谷氨酸钠0.5，NaCl 0.5，琼脂2.0，余量为去离子水，pH 7.0；灭菌条件：121℃，20min。

(2)种子培养基(质量百分数)

葡萄糖2，酵母膏1，蛋白胨1，玉米浆1，L-谷氨酸钠0.25，NaCl 0.25，尿素0.2，余量为去离子水，pH 7.0。灭菌条件：118℃，20min。

(3)发酵培养基(质量百分数)

葡萄糖12，酵母粉1.6，L-谷氨酸钠1，(NH₄)₂SO₄1.5，KH₂PO₄0.2，MgSO₄0.4，CaCO₃2，豆饼水解液5ml/100ml，余量为去离子水，pH 7.0。灭菌条件：除CaCO₃外，其余的为115℃，15min。CaCO₃的灭菌条件为121℃，20min，接种前加入。

实施例1

利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，利用紫外分光光度计作为检测工具构建鸟苷紫外指纹图谱，从而构建紫外指纹图谱与鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现鸟苷产量的在线检测，具体操作包括下列步骤：

步骤(1)，模型建立：

A、鸟苷发酵：

1)菌种活化

取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，36℃恒温静置培养12h；

2)种子培养

接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36℃振荡培养12h，得到种子液；

3)鸟苷发酵

将上述种子液以10％的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36℃，培养72h，获得发酵液；

B、取步骤(1)经过充分混匀的发酵液，用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品；设置紫外分光光度计采集条件为：对待测发酵液样品进行紫外光谱扫描，其波长扫描范围为210-300nm，采样间隔1nm，光谱带宽0.1nm，扫描速度为1nm/s，其参比为蒸馏水，测定在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

C、纸层析法测定鸟苷产量：将发酵液沸水浴4min，离心取上层清液，离心的速度为3000r/min，离心的时间为5min，上清液点样10μL，纸层析测定，展开剂为异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1；

D、根据测得的鸟苷产量与紫外吸光度，得到鸟苷产量与紫外吸光度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀之间的函数关系为：

c＝15.7653*A₂₅₀-26.5632*A₂₆₀+59.2183*A₂₈₀-55.0967*A₂₉₀

其中，c为鸟苷产量，A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₉₀分别为此时发酵液在250nm，260nm，280nm，290nm 处的吸光度；

步骤(2)，模型验证：

按步骤(1)的A步骤分别进行2次发酵，取其不同时间段的发酵液用蒸馏水稀释500倍后按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，分别测定相应波长吸光值，根据所建模型预测鸟苷产量，并与实际产量进行比较分析；预测值与实际值相对误差的绝对值平均小于5％；其中，实际产量采用步骤(1)的C步骤进行测定；

步骤(3)模型应用：

按步骤(1)建立的模型，取待测发酵液用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品，备用；按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，以蒸馏水为参比，依次扫描待测发酵液样品的紫外光谱，并测定相应波长的吸光值，利用建立模型预测鸟苷产量，获得该发酵液中的鸟苷产量。

实施例2

利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，利用紫外分光光度计作为检测工具构建鸟苷紫外指纹图谱，从而构建紫外指纹图谱与鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现鸟苷产量的在线检测，具体操作包括下列步骤：

步骤(1)，模型建立：

A、鸟苷发酵：

1)菌种活化

取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，38℃恒温静置培养14h；

2)种子培养

接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，37℃振荡培养18h，得到种子液；

3)鸟苷发酵

将上述种子液以10％的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，37℃，培养72h，获得发酵液；

B、取步骤(1)经过充分混匀的发酵液，用蒸馏水稀释500倍，得到待测发 酵液样品；设置紫外分光光度计采集条件为：对待测发酵液样品进行紫外光谱扫描，其波长扫描范围为210-300nm，采样间隔1nm，光谱带宽0.1nm，扫描速度为1nm/s，其参比为蒸馏水，测定在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

C、纸层析法测定鸟苷产量：将发酵液沸水浴6min，离心取上层清液，离心的速度为3000r/min，离心的时间为5min，上清液点样10μL，纸层析测定，展开剂为异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1；

D、根据测得的鸟苷产量与紫外吸光度，得到鸟苷产量与紫外吸光度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀之间的函数关系为：

c＝15.7653*A₂₅₀-26.5632*A₂₆₀+59.2183*A₂₈₀-55.0967*A₂₉₀

其中，c为鸟苷产量，A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₉₀分别为此时发酵液在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

步骤(2)，模型验证：

按步骤(1)的A步骤分别进行5次发酵，取其不同时间段的发酵液用蒸馏水稀释500倍后按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，分别测定相应波长吸光值，根据所建模型预测鸟苷产量，并与实际产量进行比较分析；预测值与实际值相对误差的绝对值平均小于5％；其中，实际产量采用步骤(1)的C步骤进行测定；

步骤(3)模型应用：

按步骤(1)建立的模型，取待测发酵液用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品，备用；按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，以蒸馏水为参比，依次扫描待测发酵液样品的紫外光谱，并测定相应波长的吸光值，利用建立模型预测鸟苷产量，获得该发酵液中的鸟苷产量。

实施例3

利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，利用紫外分光光度计作为检测工具构建鸟苷紫外指纹图谱，从而构建紫外指纹图谱与鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现鸟苷产量的在线检测，具体操作包括下列步骤：

步骤(1)，模型建立：

A、鸟苷发酵：

1)菌种活化

取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，37℃恒温静置培养13h；

2)种子培养

接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36.5℃振荡培养16h，得到种子液；

3)鸟苷发酵

将上述种子液以10％的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36.5℃，培养72h，获得发酵液；

B、取步骤(1)经过充分混匀的发酵液，用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品；设置紫外分光光度计采集条件为：对待测发酵液样品进行紫外光谱扫描，其波长扫描范围为210-300nm，采样间隔1nm，光谱带宽0.1nm，扫描速度为1nm/s，其参比为蒸馏水，测定在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；鸟苷标品、最初及最终发酵液的紫外吸收谱图如图1所示。图1中鸟苷标准品的波峰为253nm，最初发酵液的波峰为272nm，最终发酵液获得的波峰为253nm。由此可以推断最终发酵液获得的发酵产物是鸟苷。

C、纸层析法测定鸟苷产量：将发酵液沸水浴5min，离心取上层清液，离心的速度为3000r/min，离心的时间为5min，上清液点样10μL，纸层析测定，展开剂为异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1；其结果如图2所示；图2表明，0-18h为发酵前期，发酵液中鸟苷产量很低，在1.1g/L以下。18-56h为发酵中期，鸟苷产量开始急剧上升。56-72h为发酵后期，发酵液中鸟苷产量开始趋于稳定。

D、根据测得的鸟苷产量与紫外吸光度，得到鸟苷产量与紫外吸光度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀之间的函数关系为：

c＝15.7653*A₂₅₀-26.5632*A₂₆₀+59.2183*A₂₈₀-55.0967*A₂₉₀

其中，c为鸟苷产量，A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₉₀分别为此时发酵液在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；0、6、12、18、24、32、40、48、56、64和72h的发酵液的紫外吸光度谱图如 图3-5所示。

步骤(2)，模型验证：

按步骤(1)的A步骤分别进行4次发酵，取其不同时间段的发酵液用蒸馏水稀释500倍后按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，分别测定相应波长吸光值，根据所建模型预测鸟苷产量，并与实际产量进行比较分析；预测值与实际值相对误差的绝对值平均小于5％；其中，实际产量采用步骤(1)的C步骤进行测定；

步骤(3)模型应用：

按步骤(1)建立的模型，取待测发酵液用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品，备用；按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，以蒸馏水为参比，依次扫描待测发酵液样品的紫外光谱，并测定相应波长的吸光值，利用建立模型预测鸟苷产量，获得该发酵液中的鸟苷产量。其计算结果与实际结果对比如表3所示。

表3修正后模型的检验

发酵时间(h)	A250，	A260	A280，	A290	鸟苷产量(g/L)	鸟苷产量计算值(g/L)
							0	0.219	0.252	0.255	0.216	0	-0.0416
6	0.328	0.345	0.312	0.256	0.203784	0.378
							12	0.247	0.249	0.232	0.2	0.29112	-0.0009
18	1.026	0.992	0.885	0.719	1.717608	2.6181
							24	1.255	1.203	1.044	0.811	3.49344	4.9703
32	1.329	1.256	1.081	0.83	5.48276	5.8733
							40	1.49	1.416	1.218	0.943	5.841808	6.0484
48	1.767	1.681	1.455	1.124	8.267808	7.4383
							56	1.669	1.57	1.356	1.049	7.481784	7.1115
64	2.088	2.007	1.756	1.38	7.889352	7.5593
							72	1.946	1.846	1.584	1.212	8.675376	8.668

上表表明：发酵前期相对误差较大，但是绝对误差很小，大都小于0.5g/L。发酵中期和后期，除少数点的相对误差较大外。大部分相对误差和绝对误差都比较小，相对误差的绝对值平均后小于5％。说明所获得的模型对不同批次的鸟苷分批发酵过程之间也适用，具有较强的适用性。

本发明申请文件中所有的“*”均为乘号，即“×”。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于，利用紫外分光光度计作为检测工具构建鸟苷紫外指纹图谱，从而构建紫外指纹图谱与鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现鸟苷产量的在线检测，具体操作包括下列步骤：

步骤(1)，模型建立：

A、鸟苷发酵：

1)菌种活化

取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，36-38℃恒温静置培养12-14h；

2)种子培养

接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有种子培养基的摇瓶中，纱布封口，置于往复式摇床上，36-37℃振荡培养12-18h，得到种子液；

3)鸟苷发酵

将上述种子液以10％的接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，置于往复式摇床上，36-37℃，培养72h，获得发酵液；

B、取步骤(1)经过充分混匀的发酵液，用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品；设置紫外分光光度计采集条件为：对待测发酵液样品进行紫外光谱扫描，其波长扫描范围为210-300nm，采样间隔1nm，光谱带宽0.1nm，扫描速度为1nm/s，其参比为蒸馏水，测定在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

C、纸层析法测定鸟苷产量：将发酵液沸水浴4-6min，离心取上层清液，上清液点样，纸层析测定；

D、根据测得的鸟苷产量与紫外吸光度，得到鸟苷产量与紫外吸光度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀之间的函数关系为：

c＝15.7653*A₂₅₀-26.5632*A₂₆₀+59.2183*A₂₈₀-55.0967*A₂₉₀

其中，c为鸟苷产量，A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₉₀分别为此时发酵液在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

步骤(2)，模型验证：

按步骤(1)的A步骤分别进行2-5次发酵，取其不同时间段的发酵液用蒸馏水稀释500倍后按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，分别测定相应波长吸光度，根据所建模型预测鸟苷产量，并与实际产量进行比较分析；预测值与实际值相对误差的绝对值平均小于5％；其中，实际产量采用步骤(1)的C步骤进行测定；

步骤(3)模型应用：

按步骤(1)建立的模型，取待测发酵液用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品，备用；按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，以蒸馏水为参比，依次扫描待测发酵液样品的紫外光谱，并测定相应波长的吸光度，利用建立模型预测鸟苷产量，获得该发酵液中的鸟苷产量。

2.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)模型建立中所述的种子培养时，接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中。

3.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)模型建立中种子培养时，纱布封口的纱布层数为8层。

4.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)模型建立中种子培养时，往复式摇床的冲程76mm，速度为108r/min。

5.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)模型建立中鸟苷发酵时，将上述种子液以10％的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中。

6.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)模型建立中鸟苷发酵时，往复式摇床的冲程为76mm，速度为108r/min。

7.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)中纸层析法测定鸟苷产量中离心的速度为3000r/min，离心的时间为5min。

8.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)中纸层析法测定鸟苷产量中上清液点样量为10μL。

9.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于步骤(1)中纸层析法测定鸟苷产量中纸层析测定的展开剂为异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1。

10.根据权利要求1所述的利用鸟苷发酵液紫外指纹图谱检测鸟苷产量模型的构建方法，其特征在于，利用紫外分光光度计作为检测工具构建鸟苷紫外指纹图谱，从而构建紫外指纹图谱与鸟苷生成量关系的数学模型，通过模型实现鸟苷产量的在线检测，具体操作包括下列步骤：

步骤(1)，模型建立：

A、鸟苷发酵：

1)菌种活化

取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，37℃恒温静置培养13h；

2)种子培养

接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36.5℃振荡培养16h，得到种子液；

3)鸟苷发酵

将上述种子液以10％的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36.5℃，培养72h，获得发酵液；

B、取步骤(1)经过充分混匀的发酵液，用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品；设置紫外分光光度计采集条件为：对待测发酵液样品进行紫外光谱扫描，其波长扫描范围为210-300nm，采样间隔1nm，光谱带宽0.1nm，扫描速度为1nm/s，其参比为蒸馏水，测定在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

C、纸层析法测定鸟苷产量：将发酵液沸水浴5min，离心取上层清液，离心的速度为3000r/min，离心的时间为5min，上清液点样10μL，纸层析测定，展开剂为异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1；

D、根据测得的鸟苷产量与紫外吸光度，得到鸟苷产量与紫外吸光度A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀和A₂₉₀之间的函数关系为：

c＝15.7653*A₂₅₀-26.5632*A₂₆₀+59.2183*A₂₈₀-55.0967*A₂₉₀

其中，c为鸟苷产量，A₂₅₀、A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₉₀分别为此时发酵液在250nm，260nm，280nm，290nm处的吸光度；

步骤(2)，模型验证：

按步骤(1)的A步骤分别进行4次发酵，取其不同时间段的发酵液用蒸馏水稀释500倍后按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，分别测定相应波长吸光度，根据所建模型预测鸟苷产量，并与实际产量进行比较分析；预测值与实际值相对误差的绝对值平均小于5％；其中，实际产量采用步骤(1)的C步骤进行测定；

步骤(3)模型应用：

按步骤(1)建立的模型，取待测发酵液用蒸馏水稀释500倍，得到待测发酵液样品，备用；按步骤(1)的B步骤设置紫外光谱采集条件，以蒸馏水为参比，依次扫描待测发酵液样品的紫外光谱，并测定相应波长的吸光度，利用建立模型预测鸟苷产量，获得该发酵液中的鸟苷产量。