CN101974432A - 一种鸟苷生产菌株的高通量筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸟苷生产菌株的高通量筛选方法，步骤为：①将待筛选的鸟苷生产菌接入含有培养基的微孔板Ⅰ中，振荡培养；②将微孔板Ⅰ离心，去除菌体，得上清液；③将微孔板Ⅰ上层的上清液稀释后依次转移至微孔板Ⅱ中，用全波段酶标仪测定吸光值，筛选出鸟苷生产菌株。该方法综合微孔板培养、酶标仪快速检测以及连续加样器和排枪的作用，可达到每人200样/日以上的处理量，为鸟苷生产菌株的筛选提供了简便、高效的筛选方法。

Description

一种鸟苷生产菌株的高通量筛选方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种产鸟苷(Guanosine)的微生物菌株的选育方法。

背景技术

鸟嘌呤核苷guanosine，又名鸟苷，其商品名称为GR，又名9-13-D-呋喃核糖基鸟嘌呤。其用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体，可用于合成食品增鲜剂5’-鸟苷酸二钠、呈味核苷酸二钠和核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造三磷酸鸟苷钠等药物的主要原料。有人在选育鸟苷生产菌时，选育了抗鸟嘌呤或鸟嘌呤结构类似物的突变株，发现丧失GMP还原酶的菌株主要积累鸟苷。日本的渡边等将鸟苷生物合成途径中的关键酶PRPP转酰胺酶基因克隆到载体质粒中，然后将该重组质粒导入到枯草芽胞杆菌中，结果鸟苷的产量提高了4倍。三井等采用体外诱变的方法构建出SAMP合成酶缺失株，该工程菌株于34℃发酵70h，其鸟苷产量为19.0g/L。Nogami等人证明GMP还原酶阴性菌的鸟苷产量比阳性菌要高，并发现腺嘌呤或腺苷抑制IMP到GMP途径中酶的活性，据此以枯草芽胞杆菌NO102为出发菌，得到抗腺嘌呤，腺苷突变株NT1017(8-AGr+Ade-+His-+AARs+GMPred-)，可在发酵液中积累5.4g/L鸟苷。Momose等研究发现8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂黄嘌呤都抑制菌体的生长，而这种抑制可以被鸟苷所解除，据此得到的抗这两种嘌呤类似物的突变株能够解除其对GMP合成途径的抑制，从而提高鸟苷的产量。Komatsu等根据同样的原理筛选了腺嘌呤缺陷，抗8-氮杂黄嘌呤，GMP还原酶阴性的突变株，并进一步筛选到核苷水解酶部分缺失的GR2176可积累鸟苷10.3g/L。但传统微生物菌株的筛选方法是一项繁重的工作，其工作量大、筛选周期长，而且往往劳而无功，得不到目标菌种，筛选的盲目性很大。

发明内容

针对上述缺点，本发明要解决的技术问题是为工业化大生产提供一种方便快捷的鸟苷生产菌株的高通量筛选方法。所谓“高通量”是指大量样品的快速筛选，即高通量筛选(high throughputscreening，HTS)，是在微孔板上以自动化操作系统执行实验过程，通过灵敏快速的检测仪器采集实验数据及用计算机对实验数据进行分析处理。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种鸟苷生产菌株的高通量筛选方法，步骤为：①将待筛选的鸟苷生产菌接入含有培养基的微孔板Ⅰ中，振荡培养；②将微孔板Ⅰ离心，去除菌体，得上清液；③将微孔板Ⅰ上层的上清液稀释后依次转移至微孔板Ⅱ中，用全波段酶标仪测定吸光值，筛选出鸟苷生产菌株。微孔板是一类在生物工程领域常用的实验器皿，近年来已经成功地被用做自动搜索活性成分的可靠平台，主要用于PCR扩增、酶标仪检测、biolog鉴定系统等。常用规格有48孔板、96孔板、384孔板等。

进一步：在上述鸟苷生产菌株的高通量筛选方法中，步骤①中所述的振荡培养条件为：30～40℃，转速200～300rpm，振荡培养24～48h。步骤②的离心条件为：使用酶标板离心机，5000～10000rpm，10～30min。所述培养基组成及重量配比为，淀粉双酶糖50±5、酵母粉26±6、磷酸二氢钾4±2、硫酸铵10±2、硫酸镁1±0.5、碳酸钙10±2、酵母膏14±3、氯化钠1±0.4、腺嘌呤1.2±0.1、鸟嘌呤1.2±0.1、链霉素1.8±0.1，用去离子水配制后灭菌，4±1℃保存备用。

为进一步选出更优良的鸟苷生产菌株，本发明还提供了由上述方法所得鸟苷生产菌株的复筛步骤，即将上述鸟苷生产菌株在摇瓶(或摇管)培养，30～40℃，摇床振荡培养24～48h，发酵液离心得上清液，纸层析(异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1)，在260nm处测紫外吸收值(A₂₆₀)，从而得出最优良的几株鸟苷生产菌，所述纸层析的层析液重量比为，异丙醇∶氨水∶水等于7∶2∶1。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果是：综合微孔板培养、酶标仪快速检测以及连续加样器和排枪的作用，可达到每人200样/日以上的处理量，为高鸟苷菌株的筛选提供了简便、高效的筛选方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的内容作进一步详述，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定，制备过程中各个原材料的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。

实施例

将鸟苷生产菌株培养至对数生长期，离心收集菌体制成菌悬液(约10⁸个)，加入化学诱变剂亚硝基胍NTG，浓度为3mg/ml，NTG溶液与菌悬液制成浓度为0.6mg/ml，在37℃下处理30min，用磷酸钾溶液(0.1mol/L，pH7.0)离心洗涤3次，离心后用不同稀释度涂布平板，置35℃培养，共获得480个单菌落，单菌落就是单个细菌形成的菌落。

将单菌落接入含有液体培养基的96孔板中，37℃，转速200rpm，振荡培养36h。

使用酶标板离心机离心，得上清液。将96孔板中每孔的上清液稀释10倍后，同体积依次转移至另一96孔板中，用全波段酶标仪测定吸光值，得到能将产苷能力提高10％以上的16株鸟苷生产菌株，整个筛选工作为时2天。

再将由上述高通量筛选方法得出的16株鸟苷生产菌株放在摇瓶培养，37℃，摇床振荡培养48h，发酵液离心得上清液，纸层析(异丙醇∶氨水∶水＝7∶2∶1)，在260nm处测紫外吸收值(A₂₆₀)，得到最优良的鸟苷生产菌株3株。测定工作为时3天。

上述整个工艺流程共计5天。

Claims (6)

1.一种鸟苷生产菌株的高通量筛选方法，步骤为：

①将待筛选的鸟苷生产菌接入含有培养基的微孔板Ⅰ中，振荡培养；

②将微孔板Ⅰ离心，去除菌体，得上清液；

③将微孔板Ⅰ上层的上清液稀释后依次转移至微孔板Ⅱ中，用全波段酶标仪测定吸光值，筛选出鸟苷生产菌株。

2.根据权利要求1所述的鸟苷生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于：步骤①中所述的振荡培养条件为：30～40℃，转速200～300rpm，振荡培养24～48h。

3.根据权利要求2所述的鸟苷生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于：步骤②的离心条件为：使用酶标板离心机，5000～10000rpm，10～30min。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的鸟苷生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于：所述培养基组成及重量配比为，淀粉双酶糖50±5、酵母粉26±6、磷酸二氢钾4±2、硫酸铵10±2、硫酸镁1±0.5、碳酸钙10±2、酵母膏14±3、氯化钠1±0.4、腺嘌呤1.2±0.1、鸟嘌呤1.2±0.1、链霉素1.8±0.1，用去离子水配制后灭菌，4±1℃保存备用。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的鸟苷生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于：它还包括复筛步骤，将步骤③所得的鸟苷生产菌株在摇瓶或摇管培养，30～40℃，摇床振荡培养24～48h，发酵液离心得上清液，用纸层析在260nm处测紫外吸收值A₂₆₀。

6.根据权利要求5所述的鸟苷生产菌株的高通量筛选方法，其特征在于：所述纸层析的层析液重量比为，异丙醇∶氨水∶水等于7∶2∶1。