CN105671007B - 高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点 - Google Patents

高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一株高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点。本发明提供了一株生产嘧啶核苷的枯草芽孢杆菌突变株和一个氨甲酰磷酸合成酶的编码基因，明确了一个与氨甲酰磷酸合成酶受终产物反馈抑制相关的关键调控位点，可以为以后嘧啶核苷高产菌株的选育提供参考。所提供的枯草芽孢杆菌突变株，通过发酵法生产核苷嘧啶尿苷产量可达15±1g/L，并且对不同嘧啶核苷结构类似物的耐受性显著提高。

Description

高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点
技术领域：
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一株高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点。
背景技术：
嘧啶核苷包括尿苷和胞苷，是一切生物体的重要组成成分，它们用途广泛，尤其是作为抗病毒抗肿瘤药物的中间体，在医药领域占有重要地位。嘧啶核苷的生产方法有化学合成法，水解RNA法和微生物发酵法，综合几种方法的优缺点，微生物发酵法因其周期短、易控制、产率高、污染小等优点，具有大规模工业化的潜力，因此日益受到人们的重视。
嘧啶核苷生产菌株的选育始于20世纪60年代，国内外有关嘧啶核苷高产菌株的选育基本上都是诱变结合结构类似物抗性菌株筛选的方法，其中以日本武田化学公司的研究最为突出。
武田公司在高产尿苷菌种选育的过程中先以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，经过NTG诱变，选育出一株尿嘧啶缺陷型菌株No.122，该菌株在提供50mg/L尿嘧啶情况下，能够积累乳清酸8.58g/L(50mM)乳清酸和7.78g/L(27mM)乳清酸核苷；在No.122的基础上，再次经过NTG诱变，在含有300mg/L 6-氮杂尿嘧啶的培养基中筛选到菌株No.258，此菌株积累尿苷10g/L，尿嘧啶7g/L。继续NTG诱变，在含有5g/L的6-氮杂尿嘧啶培养基中筛选到菌株No.508，该菌株积累尿苷46g/L，尿嘧啶6g/L。最后，为了降低副产物尿嘧啶的积累量，继续进行诱变，筛选到一株尿苷磷酸化酶几乎活性丧失的菌株No.556，能够积累尿苷55g/L，尿嘧啶积累量＜1g/L，通过对培养条件及培养基成分的优化，在6000L发酵罐中稳定积累尿苷65g/L。
他们对高产胞苷菌种的选育同样基于No.122菌株。首先通过NTG诱变后，筛选出一株一株胞苷脱氨酶缺失菌株No.229，积累胞苷0.2g/L，尿苷1g/L，此菌株在50mg/L 5-氟胞苷的存在下即失去生长能力。因此，继续诱变后，获得一株能耐受500mg/L 5-氟胞苷的菌株No.344，该菌株积累胞苷10.4g/L。经酶活性验证实验得知，此菌株与No.122菌株相比，氨甲酰磷酸合成酶和CTP合成酶的活性均提高了十倍以上。经过对该菌株的进一步诱变处理，筛选出能够耐受12g/L 3-脱 杂氮尿嘧啶菌株No.428，能够积累胞苷14.2g/L，该菌基本上解除了CTP合成酶所受的反馈调节作用。之后，通过同源重组在No.428中引入了突变，获得了不受反馈抑制的氨甲酰磷酸合成酶菌株No.515，使胞苷产量达到18.8g/L。再经过NTG诱变，获得了一株高丝氨酸脱氢酶缺失菌株No.615，该菌株能积累胞苷23.5g/L，最后通过对碳源葡萄糖浓度的调整优化，该菌株在60吨发酵罐中能够积累胞苷30.2g/L，并且产量稳定。
而日本武田公司虽然在嘧啶核苷高产菌株的选育方法取得了丰硕成果，其选育的菌种产苷能力也在国际上遥遥领先，但是受当时技术条件限制，他们并没有指出与嘧啶核苷高产息息相关的氨甲酰磷酸合成酶关键调控位点。
B.subtilis有两种氨甲酰磷酸合成酶(EC 6.3.5.5，carbamoyl phosphatesynthetase，CPSase)：一是pyrAA/pyrAB基因编码，催化UMP从头合成途径的第一步反应；二是carA/carB基因编码，参与精氨酸生物合成。虽然，这两种氨甲酰磷酸合成酶都催化谷氨酰胺与CO2反应，消耗2分子ATP生成氨甲酰磷酸。但是，B.subtilis的两个氨甲酰磷酸合成酶生理功能不同，它们的表达和酶活性调节机制也完全不同。
pyrAA/pyrAB位于pyr操纵子的第5和6位，编码与UMP合成相关的氨甲酰磷酸合成酶。其中pyrAA基因长度为1095bp，编码氨甲酰磷酸合成酶的小亚基，催化谷氨酰胺的ε-氨基转移到大亚基。pyrAB基因长度为3216bp，编码氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，催化MgATP、CO2与NH3合成氨甲酰磷酸。pyrAA/pyrAB属于pyr操纵子，其表达也受PRPP激活，受UMP、UDP和UTP的反馈阻遏。pyrAA/pyrAB编码的氨甲酰磷酸合成酶还是一个变构酶，其酶活受UMP反馈抑制，受PRPP激活，并需要Mg2+的存在。
嘧啶核苷高产菌株选育的难点在于解除终产物的反馈阻遏和反馈抑制作用，特别是反馈抑制作用的解除，虽然研究人员已经揭示了嘧啶核苷合成代谢具体的调控机制，并从分子层面上阐述了嘧啶操纵子受终产物阻遏的机理，但是对于受终产物反馈抑制的氨甲酰磷酸合成酶具体的调控位点却并不清楚。
随着分子生物学在微生物育种中的应用，有关研究人员也尝试利用PCR法引入点突变的方法解除氨甲酰磷酸合成酶所受的反馈抑制，但是由于氨甲酰磷酸合成酶结构和功能的研究并不是太深入，PCR引入点突变的方法在解除氨甲酰磷酸 合成酶所受反馈抑制中的应用受到限制，已经报道的位点对反馈抑制作用的解除效果并不是太明显。
本发明提供了一株通过诱变选育出来的具有工业化应用潜力的枯草芽孢杆菌，可以用于发酵法生产嘧啶核苷的相关研究；对菌株的相关基因测序并经过序列比对后，明确了与氨甲酰磷酸合成酶受终产物反馈抑制相关的关键调控位点，可以为以后嘧啶核苷高产菌株的选育提供参考。
发明内容：
本发明解决上述问题的技术方案之一：是提供一枯草芽孢杆菌突变株。
所述枯草芽孢杆菌突变株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A260。该菌株已于2015年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.11775。
所述枯草芽孢杆菌A260是以一株积累嘧啶核苷的枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过常压室温等离子诱变和嘧啶核苷结构类似物抗性菌株筛选而选育出来的，具体步骤如下：以产嘧啶核苷的枯草芽孢TD131为出发菌株，进行常压室温等离子诱变，然后在含300mg/L2-硫尿嘧啶基本培养基上筛选出菌株T823，接着以T823为出发菌株，通过常压室温等离子诱变后，在含有100mg/L 6-氮杂尿嘧啶基本培养基上筛选出菌株A260。
对突变株A260的嘧啶核苷操纵子进行测序，并与出发菌株TD131进行序列对比，发现突变株A260的氨甲酰磷酸合成酶的编码基因发生突变，突变位点在大亚基(调控位点所在亚基，由pyrAB基因编码)上，A260中pyrAB基因第2846、2847和2848位碱基缺失，最终导致氨甲酰磷酸合成酶大亚基的949位的谷氨酸缺失(E949*)，而该菌株菌嘧啶核苷操纵子其它基因未发现突变。
原始pyrAB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
原始氨甲酰磷酸合成酶大亚基氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；
突变pyrAB基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
氨甲酰磷酸合成酶大亚基突变体氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；
本发明中核苷酸的位置编号对应序列表SEQ ID No.1所述核苷酸序列；
本发明中氨基酸的位置编号对应序列表SEQ ID No.3所述氨基酸序列。
本发明解决上述问题的技术方案之二：是提供一种氨甲酰磷酸合成酶的大亚基编码基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明解决上述问题的技术方案之三：是提供一种嘧啶核苷的发酵生产方法，具体为：以A260为生产菌株，接种量为10％，培养温度为34-36℃，pH 6.7-7.0，溶氧控制在20-30％，残糖控制在0.5-1％，发酵周期48h，发酵完成后，发酵液中尿苷浓度可达15±1g/L，是出发菌株TD131尿苷产量(4.1±0.5g/L)的3.66倍。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉5，玉米浆20，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾5.2，硫酸镁5，硫酸铵5，柠檬酸钠10，谷氨酸钠10，氯化钙1，硫酸锰0.02，硫酸锌0.02，pH 6.7～7.0，玉米浆单独灭菌，钙盐单独灭菌，镁锰锌盐配成混合溶液一起灭菌，葡萄糖配成80％溶液单独灭菌，其余组分一起灭菌，灭菌条件玉米浆为0.1MPa，20min，其余为0.075MPa，15min。
有益效果：
1、本发明提供了一株生产嘧啶核苷的枯草芽孢杆菌突变株和一个氨甲酰磷酸合成酶的编码基因，明确了一个与氨甲酰磷酸合成酶受终产物反馈抑制相关的关键调控位点，可以为以后嘧啶核苷高产菌株的选育提供参考。
2、本发明提供了一株生产嘧啶核苷的枯草芽孢杆菌突变株，通过发酵法生产核苷嘧啶尿苷产量可达15±1g/L，是出发菌株TD131尿苷产量(4.1±0.5g/L)的3.66倍。
3、本发明所提供的生产嘧啶核苷的枯草芽孢杆菌突变株与出发菌株TD131相比，对不同嘧啶核苷结构类似物的耐受性显著提高：2-硫尿嘧啶、6-氮杂尿嘧啶和5-氟尿嘧啶对TD131的临界100％致死浓度分别为150mg/L、100mg/L和80μg/L；2-硫尿嘧啶、6-氮杂尿嘧啶和5-氟尿嘧啶对A260的临界100％致死浓度则分别提高到3.5g/L、3g/L和160mg/L。对2-硫尿嘧啶的耐受能力提高了大约23.3倍；对6-氮杂尿嘧啶的耐受性分别提高了大约30；对5-氟尿嘧啶的耐受能力提高了大约200倍。
附图说明：
图1 96微孔板筛选结果
图2摇瓶筛选结果
图3 5L罐发酵过程中菌体的生长状况
图4 5L罐发酵过程中葡萄糖的消耗
图5 5L罐发酵过程中尿苷的积累量
具体实施方式：
实施例1.枯草芽孢杆菌A260的筛选
本发明将初始菌株TD131经常压室温等离子诱变-结构类似物抗性筛选-高通量筛选-摇瓶复筛，获得菌株A260，具体过程如下：
1.出发菌株：B.subtilis TD131
2.常压室温等离子诱变
(1)菌体培养方法：保菌管接LB平板，三区划线，37℃培养12h；从平板上挑单菌落接LB摇管，37℃，200rpm，培养12h；摇管转接LB摇瓶，接种量为1％，37℃，200rpm，培养4-6h。
(2)菌悬液的制备方法：离心收集培养好的菌体，无菌生理盐水洗涤2-3次后，再用无菌生理盐水适量稀释制成OD600值在0.6-0.8的菌悬液，取10μL菌悬液涂在载片上待处理。
(3)ARTP诱变：ARTP处理参数为：载片处于气流端口2mm处；功率为120W；气流量为10SLM；作用时间为25s。
3.结构类似物抗性突变株的筛选
将经过ARTP诱变处理后的菌悬液涂布在含有一定浓度结构类似物的基本培养基平板上，37℃培养24h后，菌落较大的菌株为可能的目标突变菌株。
4.高通量筛选嘧啶核苷高产菌
从结构类似物抗性平板上挑取大菌落点接到已做好标记的LB平板上，并转接入已灭菌并盛有400微升无菌LB培养基的深孔中，LB平板37℃过夜培养后，4℃保藏，作为进一步的筛选用。平板36℃，200rpm，培养10h后，以10％的接种量，一一转接种到盛有400微升孔板发酵培养基的无菌新孔板中，36℃3200rmp，培养30h。培养结束后，离心发酵样品，将上清稀释100倍后，分别取200微升到酶标板中，用酶标仪检测样品在270nm下的吸光值OD270，将OD270较高菌株进行保藏，进行进一步的摇瓶复筛。图1为微孔板筛选结果
5.摇瓶复筛
(1)培养基：
活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5， NaCl 2.5，琼脂20，pH 6.7～7.0，0.1MPa，20min。
种子培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉5，蛋白胨10，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾5.2，硫酸镁1，柠檬酸钠1，pH 6.7～7.0，0.075MPa，15min。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，酵母粉5，蛋白胨10，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾5.2，硫酸镁1，柠檬酸钠1，pH 6.7～7.0，0.075MPa，15min。葡萄糖分消。
(2)培养方法：
斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。
种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养6h。
发酵培养：吸取3mL种子液接种于装有27mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养30h。
(3)分析方法：
pH测定：采用pH 6.4-8.0精密pH试纸测定。
生物量测定：发酵过程中，将发酵液适当稀释后用分光光度计测定600nm处的吸光度值OD600，来表征菌体生长情况。
残糖测定：室温下将发酵液于13000r/min离心2min，取上清液10μL加入至990μL去离子水中充分混匀，然后取25μL采用SBA-40E系列生物传感分析仪测定其残糖量，所测值即为发酵液中的残糖量，单位为g/L。
嘧啶核苷浓度测定：取离心后的发酵液上清液100μL加入到900μL去离子水中，以1g/L标准样品为参比并作相同的稀释处理，全部样品经过0.45μm滤膜过滤后采用HPLC测定发酵液中嘧啶核苷产量。采用的色谱柱为Phenomenex Gemini 5u C18110A 150*4.6mm，柱温30℃，流动相为乙腈：水＝2：98，流速1mL/min，每个样品进样10μL，分析时间12min。
图2为摇瓶筛选的结果。
6.5L发酵罐的发酵验证.
实施例2突变株A260发酵生产尿苷嘧啶
(1)本实施例所用培养基：
活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5， NaCl 2.5，琼脂20，pH 6.7～7.0，0.1MPa，20min。
种子培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉5，蛋白胨10，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾5.2，硫酸镁1，柠檬酸钠1，pH 6.7～7.0，0.075MPa，15min。葡萄糖单独灭菌。
5L发酵罐发酵培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉5，玉米浆20，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾5.2，硫酸镁5，硫酸铵5，柠檬酸钠10，谷氨酸钠10，氯化钙1，硫酸锰0.02，硫酸锌0.02，pH 6.7～7.0，玉米浆单独灭菌，钙盐单独灭菌，镁锰锌盐配成混合溶液一起灭菌，葡萄糖配成80％溶液单独灭菌，其余组分一起灭菌，灭菌条件玉米浆为0.1MPa，20min，其余为0.075MPa，15min。
(2)培养方法：
斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。
种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有100mL种子培养基的1L三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养6h。
发酵培养：发酵罐定容3L，接种量为10％，培养温度为36℃，pH 7.0，溶氧控制在20-30％左右，残糖控制在1％左右，发酵周期为48h。
(3)分析方法：
pH测定：采用pH 6.4-8.0精密pH试纸和发酵罐pH电极测定。
生物量测定：发酵过程中，将发酵液适当稀释后用分光光度计测定600nm处的吸光度值OD600，来表征菌体生长情况。
残糖测定：室温下将发酵液于13000r/min离心2min，取上清液10μL加入至990μL去离子水中充分混匀，然后取25μL采用SBA-40E系列生物传感分析仪测定其残糖量，所测值即为发酵液中的残糖量，单位为g/L。
嘧啶核苷产量测定：取离心后的发酵液上清液100μL加入到900μL去离子水中，以1g/L标准样品为参比并作相同的稀释处理，全部样品经过0.45μm滤膜过滤后采用HPLC测定发酵液中嘧啶核苷产量。采用的色谱柱为Phenomenex Gemini 5u C18110A 150*4.6mm，柱温30℃，流动相为乙腈：水＝2：98，流速1mL/min，每个样品进样10μL，分析时间12min。
(4)发酵结果:
图1为A260在发酵过程中菌体的生长状况与出发菌株TD131的对比图， 图2为A260在发酵过程中葡萄糖的消耗与出发菌株TD131的对比图，从对比结果来看两株菌的生长和耗糖情况并没有太大差异。图3为A260在发酵过程中尿苷的积累量与出发菌株TD131的对比图，从对比结果来看，发酵48小时，A260的尿苷产量为15g/L3是出发菌株TD131尿苷产量(4.1g/L)的3.66倍。
实施例3突变株A260对不同结构类似物的耐受性检测
(1)检测方法：从保菌管中取10微升菌液接LB摇管，37℃，200rpm，培养10-12小时，离心收集培养好的菌体，无菌生理盐水洗涤2-3次后，在用无菌生理盐水梯度稀释十万倍，然后取100微升菌液分别涂布于含有不同浓度结构类似物基本培养基平板上，每个浓度三个平行，对照为基本培养基平板(不含结构类似物)。37℃培养24h后，对平板所长菌落数进行统计，菌落数的多少反映耐受性的高低。一定时间内能够在高浓度抗性平板上长出大量菌落说明此菌株对该结构类似物的耐受能力强。
基本培养基(g/L)：硫酸铵3，磷酸氢二钾1，水解酪素3，VB1、VB3、VB5、VB13、VH各0.1mg，MgSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O、MnSO4·7H2O各2mg，色氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸各0.1g，葡萄糖10，琼脂20，其中葡萄糖配制成800g/L的溶液，0.075MPa，15min灭菌，其余0.1MPa，20min灭菌。
(2)检测结果：
表1：两株菌对不同嘧啶核苷结构类似物的耐受性检测结果
从检测结果来看A260与出发菌株TD131相比，对2-硫尿嘧啶的耐受能力分别提高了大约23.3倍；对6-氮杂尿嘧啶的耐受性提高了大约30倍；对5-氟尿嘧啶的耐受能力提高了大约200倍。

Claims (4)

1.一种氨甲酰磷酸合成酶大亚基突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。
2.权利要求1所述突变体的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.一株枯草芽孢杆菌突变株，其特征在于，包含权利要求1所述的突变体，具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A260，保藏编号为CGMCC No.11775。
4.权利要求3所述突变株发酵生产嘧啶核苷的方法，其特征在于，具体为：接种量为10％，培养温度为34-36℃，pH 6.7-7.0，溶氧控制在20-30％，残糖控制在0.5-1％，发酵周期48h，发酵完成后，发酵液中尿苷浓度可达13.5±1g/L；
发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖50，酵母粉5，玉米浆20，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾5.2，硫酸镁5，硫酸铵5，柠檬酸钠10，谷氨酸钠10，氯化钙1，硫酸锰0.02，硫酸锌0.02，pH 6.7～7.0，玉米浆单独灭菌，钙盐单独灭菌，镁锰锌盐配成混合溶液一起灭菌，葡萄糖配成80％溶液单独灭菌，其余组分一起灭菌，灭菌条件玉米浆为0.1MPa，20min，其余为0.075MPa，15min。
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