CN100523212C - 三肽的生产方法 - Google Patents

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Abstract

一种通过酶法高收率、容易且稳定地生产可用作降压药、抗紧张药等的三肽Val Pro Pro、Ile Pro Pro的方法，该生产方法包括以下步骤：用蛋白酶切割含乳酪蛋白的材料，产生选自含序列Val Pro Pro且在该序列外不含Pro的肽、含序列Ile Pro Pro且在该序列外不含Pro的肽以及它们的混合物的中间体肽，用肽酶切割上述中间体肽，产生三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro中的至少一种。

Description

三肽的生产方法
技术领域
本发明涉及可以有效生产三肽Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro的三肽生产方法。
背景技术
一直以来，已知具有特定序列的各种肽具有各种各样的生理活性。作为这样的肽的实例，可以举出三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro。这些三肽可以在乳酸菌发酵乳中发现，已知这些三肽具有强的血管紧张肽转化酶(下文称为ACE)抑制活性，对自发性高血压大鼠(SHR)有强降压作用，此外，对高血压患者有降压效果(J.Dairy Sci.1995，78：777-783；J.Dairy Sci.1995，78：1253-1257；Am.J.Clin.Nutr.1996，64：767-771)。而且，据报道，三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro有抗紧张作用(特开平11-100328号公报)。
关于三肽Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro的生产方法，已报道了通过乳酸菌发酵法高效率生产的实例(特开平11-98978号公报)。但是，在进行乳酸菌发酵的情况下，由于在乳酸发酵中伴有pH下降，因此发酵在中途停止，残留有许多未分解的酪蛋白。而且，在通过乳酸菌发酵获得的培养液中，由于生成许多乳酸，因而在加工成各种产品形态时会产生障碍。例如，在加工为干粉时，由于有共存的乳酸而使得难以制成粉末，因而必须除去酸。
因此，考虑到通过酶法进行生产。与上述乳酸发酵法相比，预期使用酶法的优点是：可提高肽的收率，使生产步骤稳定，节省生产工序和劳动力，并且不伴有乳酸生成等。然而，在三肽Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro的生产中，在通过酶法切割蛋白质时，在Xaa Pro或ProXaa(Xaa表示任何氨基酸)之类含Pro氨基酸的序列的部位，肽酶的分解反应性变得极低。从而在通过酶法生产三肽Val Pro Pro和/或Ile ProPro时，难以切割序列Pro Xaa，因而不可能将其收率提高至高于乳酸发酵法的收率。例如，在特开平11-100328号公报中，作为获得三肽Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro的方法，例举了对乳酪蛋白进行蛋白酶处理并且用羧肽酶进行处理的方法，但没有记载具体的处理方法，实施例中只记载了乳酸发酵法等其它方法。
作为通过蛋白酶和肽酶联合分解蛋白质来生产除三肽Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro以外的有用的肽的方法，也提到了通过γ-玉米醇溶蛋白获得具有ACE抑制活性的三肽Leu Pro Pro的方法(日本专利2873327号)、通过β-酪蛋白获得肽Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Xaa Asn的方法(特开平6-128287号公报)等。但是，这些方法由于收率和稳定性不够，不能作为工业上有用的生产方法，因而未被实际使用。
发明的公开
本发明的目的是提供能够高收率、稳定且容易地获得可用作降压药、抗紧张药等的三肽Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro的在工业生产上有用的三肽生产方法。
按照本发明，提供用蛋白酶和肽酶切割含乳酪蛋白的材料获得三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro中至少一种的三肽生产方法，所述方法包括以下步骤：用蛋白酶切割乳酪蛋白，产生选自含序列Val Pro Pro且在该序列以外不含Pro的肽、含有序列Ile Pro Pro且在该序列以外不含Pro的肽以及它们的混合物的中间体肽，用肽酶切割上述中间体肽，产生三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro中的至少一种。
发明的优选实施方案
在本发明的三肽生产方法中，用特定的蛋白酶和肽酶切割含乳酪蛋白的材料，可获得三肽Val Pro Pro和/或Ile Pro Pro。
上述含乳酪蛋白材料可以根据三肽含量、原料价格、工业化容易程度等的考虑来选择，例如，可以举出动物乳、脱脂乳、脱脂奶粉、乳酪蛋白及其加工制品等大量含有β-酪蛋白和κ-酪蛋白等乳酪蛋白的材料。
在乳酪蛋白中，含有氨基酸序列Val Pro Pro和Ile Pro Pro的乳酪蛋白特别是有β-酪蛋白和K-酪蛋白，因此上述含乳酪蛋白材料最好是含有这些酪蛋白的材料。
在普通的乳酪蛋白中，含有25-30％(重量)的β-酪蛋白、10-15％(重量)的K-酪蛋白，即含有更多的β-酪蛋白。因而，在本发明的生产方法中，可以用β-酪蛋白作为主要的底物来源。
上述特定的蛋白酶是通过切割乳酪蛋白产生特定中间体肽的蛋白酶。
上述特定的中间体肽是选自含有序列Val Pro Pro且在该序列以外不含Pro的肽、含有序列Ile Pro Pro且在该序列以外不含Pro的肽以及它们的混合物的肽。也就是说，是含有序列Val Pro Pro但在该序列以外不含Pro的肽和/或含有序列Ile Pro Pro但在该序列以外不含Pro的肽。具体例子有β-酪蛋白序列中所含的肽Gln Asn Ile Pro Pro Leu ThrGln Thr或者从这种肽中逐次除去一个氨基末端或羧基末端的氨基酸直至Ile Pro Pro而获得的肽(下述序列标识号1-15)中的至少一种、或者β-酪蛋白序列中所含的肽Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln或者从这种肽中逐次除去一个氨基末端或羧基末端的氨基酸直至Val Pro Pro而获得的肽(下述序列标识号16-27)中的至少一种。
Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr(序列标识号1)
    Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr(序列标识号2)
        Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr(序列标识号3)
Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln(序列标识号4)
    Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln(序列标识号5)
        Ile Pro Pro Leu Thr Gln(序列标识号6)
Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr(序列标识号7)
    Asn Ile Pro Pro Leu Thr(序列标识号8)
        Ile Pro Pro Leu Thr(序列标识号9)
Gln Asn Ile Pro Pro Leu(序列标识号10)
    Asn Ile Pro Pro Leu(序列标识号11)
        Ile Pro Pro Leu(序列标识号12)
Gln Asn Ile Pro Pro(序列标识号13)
    Asn Ile Pro Pro(序列标识号14)
        Ile Pro Pro(序列标识号15)
Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln(序列标识号16)
    Val Val Pro Pro Phe Leu Gln(序列标识号17)
        Val Pro Pro Phe Leu Gln(序列标识号18)
Val Val ValPro Pro Phe Leu(序列标识号19)
    Val Val Pro Pro Phe Leu(序列标识号20)
        Val Pro Pro Phe Leu(序列标识号21)
Val Val Val Pro Pro Phe(序列标识号22)
    Val Val Pro Pro Phe(序列标识号23)
        Val Pro Pro Phe(序列标识号24)
Val Val Val Pro Pro(序列标识号25)
    Val Val Pro Pro(序列标识号26)
        Val Pro Pro(序列标识号27)
上述蛋白酶的例子有木瓜蛋白酶、蛋白酶A(天野制药(株)生产)、蛋白酶M(天野制药(株)生产)、蛋白酶P(天野制药(株)生产)或它们的组合。
作为上述肽酶，可以使用不能直接分解酪蛋白、但可以切割通过前述蛋白酶生成的前述中间体肽而产生三肽Val Pro Pro和/或Ile ProPro的各种肽酶。例如，可以举出氨肽酶、羧肽酶等外肽酶；寡肽酶等内肽酶或它们的混合物。
作为上述肽酶，特别优选包括切割序列ValPro Pro Xaa和/或IlePro Pro Xaa中Pro与Xaa之间键合的羧肽酶和/或内肽酶。更具体地讲，优选可以切割乳酪蛋白所含序列Ile Pro Pro Leu和/或Val Pro ProPhe中的Pro Leu和/或Pro Phe键合的肽酶，更优选使用对这些键合具有特异性的肽酶。
上述肽酶可以根据同时使用的上述蛋白酶的底物特异性等进行适当的选择。例如，根据蛋白酶的底物特异性，可以仅使用氨肽酶或羧肽酶的任一种，但一般优选组合使用氨肽酶等从N末端切割肽的肽酶、羧肽酶等从C末端切割肽的肽酶和/或寡肽酶。具体地说，在使用木瓜蛋白酶、蛋白酶A(天野制药(株)生产)、蛋白酶M(天野制药(株)生产)、蛋白酶P(天野制药(株)生产)或它们的混合物作为蛋白酶的情况下，优选一起使用氨肽酶、羧肽酶和/或寡肽酶作为肽酶。
上述氨肽酶的例子有来源于灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的氨肽酶I(由Sigma Chemical Co.生产)、来源于解蛋白气单胞菌(Aeromonas proteolytica)的氨肽酶(由Sigma Chemical Co.生产)、来源于猪肾细胞质的亮氨酸氨肽酶和来源于猪肾内质网(小胞体)的亮氨酸氨肽酶等。
上述羧肽酶的例子有羧肽酶Y(由Sigma Chemical Co.生产)、羧肽酶A(由Sigma Chemical Co.生产)、羧肽酶B(由Sigma Chemical Co.生产)、组织蛋白酶G(由Sigma Chemical Co.生产)等。
作为上述肽酶，除上述例举的肽酶以外，还可以使用来源于乳酸菌、大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草杆菌(bacillus subtilis)等微生物或动物组织或植物的酶。例如，可以使用来源于乳酸菌瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的肽酶。
例如通过在由离心分离法等从乳酸菌瑞士乳杆菌的培养液中收集细菌细胞之后，通过超声波处理等细胞磨碎处理使细菌细胞破碎，进行离心分离以除去沉淀，回收上清液作为酶粗提液，用DEAE-sepharose(由Pharmacia Co.生产)等吸附分离柱对粗提取液进行分级分离，可以获得来源于瑞士乳杆菌的肽酶。
可以使来源于乳酸菌瑞士乳杆菌的肽酶在不与其它肽酶组合的情况下作用于前述中间体肽而高收率地获得三肽Ile Pro Pro和/或ValPro Pro，但也可以与其它氨肽酶和/或羧肽酶等肽酶一起使用。
对于使前述蛋白酶和前述肽酶与上述含乳酪蛋白材料接触的顺序没有特别的限定，只要是用前述蛋白酶切割上述含乳酪蛋白材料得到中间体肽，再用前述肽酶切割该中间体肽从而得到所需的三肽即可。例如，可以举出方法(a)：在使前述蛋白酶与上述含乳酪蛋白材料接触而获得上述中间体肽之后，使前述肽酶与之接触从而对中间体肽进行所需的切割；或者方法(b)：使前述蛋白酶和前述肽酶同时接触上述含乳酪蛋白材料，分别进行所需的切割。
在进行前述方法(a)时，前述蛋白酶相对于前述含乳酪蛋白材料的添加比例优选为1/100-1/10000。另外，用前述蛋白酶切割前述乳酪蛋白产生上述中间体肽的条件，可以举出一般为在pH5-9、温度为20-40℃，优选在所述酶的最适pH和最适温度下进行3-24小时的条件。
在上述方法(a)中，在获得上述中间体肽之后、使之接触上述蛋白酶之前，根据需要可以进行使蛋白酶失活、除去未分解的蛋白质、将中间体肽浓缩、除去溶剂等各种操作。
通常通过在60-100℃进行加热处理，可以使上述蛋白酶失活。通过进行这样的失活，可以有效地进行后续的肽酶切割。
前述未分解蛋白质的除去，可以通过例如以5000-20000转/分钟离心分离3-10分钟除去沉淀来进行。
前述中间体肽的浓缩可以使用疏水性树脂等来进行。作为疏水性树脂，例如可以使用结合有丙腈等含氰基的基团、苯基或碳原子数为1-18的烷基等的硅树脂(silca resin)，具体地说，可以使用商品名为“Amberlite XAD-7”、“Amberlite XAD-2”(都由Organo Corporation生产)、Sep-Pak柱(由Waters Corporation生产)的疏水性树脂等。这些疏水性树脂在通过柱法或分批法吸附中间体肽后，例如可以通过使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、乙腈等极性溶剂等的溶剂进行洗脱，浓缩中间体肽。
前述溶剂的除去可以通过减压浓缩处理等来进行。
在前述方法(a)中，使前述肽酶与前述中间体肽接触进行所需切割的条件，可以举出通常为pH4.0-7.0、优选4.5-6.5、温度25-50℃、优选30-45℃的条件。而且，在使用多种酶作为肽酶时，也可以按照所用的各种酶分成多份，分别在各种酶的最适条件下进行反应。
在前述方法(b)中，使前述蛋白酶和前述肽酶与上述含乳酪蛋白材料同时接触时的所需切割条件，优选pH4.5-7.0、温度25-50℃。
在本发明的生产方法中，经前述蛋白酶和前述肽酶切割后的反应混合物，通常为在三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro的基础上还含有其它肽成分的混合物。这种反应混合物可以原样作为产品，或者可以通过浓缩纯化三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro后作为产品。另外，可以将三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro以加成了盐酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐等工业上可接受的盐的三肽形式制成产品。
通过本发明的生产方法获得的含有三肽的产品可以原样、或者与其它食用或药用材料混合，根据需要以液体、粉末、颗粒、片剂等形式，制成具有降压作用和抗紧张作用的酸奶、乳饮料等乳制品、普通饮料食品、特殊保健食品、健康食品、药品等。
本发明的三肽生产方法，通过酶处理法可以高收率、稳定且容易地生产可用作降压药、抗紧张药等的三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro，在工业上的价值极高。
实施例
以下通过实验例和实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实验例和实施例。
实验例1-1至1-21(对于由中间体肽生成三肽Ile Pro Pro和Val Pro Pro的肽酶制剂的选择和最适反应条件的研究)
化学合成了氨基酸序列中含有Ile Pro Pro和Val Pro Pro、其它部位无Pro的表1所示肽，所述肽是基于β酪蛋白的氨基酸序列的合成肽。这些合成肽全部是通过自动肽合成仪PPSM-8(岛津制作所)合成的。
然后，研究市售的各种肽酶制剂对表1所示合成肽的酶反应性。首先，就实验例1-1至1-4、1-10至1-12、1-16和1-21而言，将合成肽溶于100mM磷酸缓冲液pH5.3中直至达到10μg/ml，在其它实验例中，将合成肽溶于50mM磷酸缓冲液pH8.0中直至达到10μg/ml。向其中加入表1所示各种肽酶制剂使之达到0.01μg/ml，并在37℃反应3小时。在酶反应之后，通过反相高效液体色谱(HPLC)进行分析，分析了在洗脱时间11.0分钟检测到的来自三肽Val Pro Pro的峰和在13.7分钟检测到的来自三肽Ile Pro Pro的峰。分别收集所检测峰的部分，用自动肽分析仪PPSQ-10(岛津制作所)进行氨基酸序列分析，证实了分别收集的峰中的肽的氨基酸序列是Ile Pro Pro或Val Pro Pro。以下显示HPLC分析条件。
泵：L6200 Intelligent泵、L6000泵(均由日立制作所制造)
检测器：L4000UV检测器(由日立制作所制造)
柱：Microbondasphere 5μC18(Φ3.9×150mm)(由WatersCorporation制造)
洗脱液：A液：0.1％(重量)三氟乙酸(TFA)水溶液
        B液：含0.1％(重量)TFA的乙腈
洗脱条件：从B液0％(A液100％)至B液40％(A液60％)的线性浓度梯度洗脱(40分钟)
流速：1ml/分钟
表1
 
实验例 合成肽的序列 氨肽酶 羧肽酶 是否产生IPP或VPP峰
1-1 Asn Ile Pro Pro Leu A Y IPP
1-2 Asn Ile Pro Pro Leu LC Y IPP
1-3 Asn Ile Pro Pro Leu LM Y IPP
1-4 Asn Ile Pro Pro Leu I Y IPP
1-5 Asn Ile Pro Pro Leu A B -
1-6 Asn Ile Pro Pro Leu LC B -
1-7 Asn Ile Pro Pro Leu LM B -
1-8 Asn Ile Pro Pro Leu I B -
1-9 Asn Ile Pro Pro Leu A A -
1-10 Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr - Y IPP
1-11 Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr I Y IPP
1-12 Val Pro Pro Phe - Y VPP
1-13 Val Pro Pro Phe - B -
1-14 Val Pro Pro Phe - A -
1-15 Val Pro Pro Phe - G -
1-16 Val Pro Pro Phe Leu Gln - Y VPP
1-17 Val Val Pro Pro A - VPP
1-18 Val Val Pro Pro LC - VPP
1-19 Val Val Pro Pro LM - VPP
1-20 Val Val Pro Pro I - VPP
1-21 Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln I Y VPP
另外，表1中酶的字母缩略词分别表示以下酶。
<氨肽酶>
A：氨肽酶(由Sigma Chemical Co.生产)
LC：亮氨酸氨肽酶，胞质溶胶(来源于猪肾细胞质的氨肽酶，由Sigma Chemical Co.生产)
LM：亮氨酸氨肽酶，微粒体(来源于猪肾内质网的氨肽酶，由SigmaChemical Co.生产)
I：氨肽酶I(由Sigma Chemical Co.生产)
<羧肽酶>
Y：羧肽酶Y(由Sigma Chemical Co.生产)
B：羧肽酶B(由Sigma Chemical Co.生产)
A：羧肽酶A(由Sigma Chemical Co.生产)
G：组织蛋白酶G(由Sigma Chemical Co.生产)
从表1可确认每种氨肽酶都能够切除氨基末端的氨基酸直至Pro残基的氨基酸1残基的面前的序列。并且可以确认当作为羧肽酶的羧肽酶Y在pH5.3作用时，可特别有效地切割Pro Pro Leu的Pro Leu键合以及Pro Pro Phe的Pro Phe键合。
当使用更长的肽Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr和Val Val ValPro Pro Phe Leu Gln，用氨肽酶和羧肽酶Y进行酶处理时(实验例1-11和1-21)，可确认产生了三肽Ile Pro Pro或Val Pro Pro。亦即，能够断定，通过使氨肽酶和羧肽酶共同作用于具有酪蛋白序列的肽，可以产生三肽Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro，其中所述酪蛋白序列其内部序列中含有序列Ile Pro Pro或Val Pro Pro、此外不含Pro。
实验例2(通过蛋白酶产生中间体肽)
用自动肽合成仪PPSQ-10，化学合成酪蛋白序列中含有Ile Pro Pro和Val Pro Pro序列的28氨基酸组成的合成肽。合成肽的序列如下。Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro ValVal Val Pro Pro PheLeu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys(序列标识号28)
用市售的各种蛋白酶制剂作用于这种合成肽，研究产生短链肽的蛋白酶，所述短链肽在肽的氨基酸序列中含有序列Ile Pro Pro或ValPro Pro、在其它部位不含Pro残基。
反应是向上述合成肽10μg/ml(100mM磷酸缓冲液pH6.1)中添加各种酶至0.1μg/ml，并在37℃反应5小时，获得反应液。通过反相高效液体色谱(HPLC)分析反应液，分别收集检测到的肽峰，用自动肽分析仪PPSQ-10分析氨基酸序列。
结果，确认了当使用木瓜蛋白酶(由Sigma Chemical Co.生产)时，反应液中生成了含序列Val Pro Pro的肽ValPro Pro Phe Leu以及含序列Ile Pro Pro的肽Asn Ile Pro Pro Leu Thr和Ile Pro Por Leu Thr。
实验例3(通过肽酶处理中间体肽的反应)
通过将实验例2中用木瓜蛋白酶作为蛋白酶获得的反应液在100℃加热处理5分钟，使蛋白酶失活。之后，添加氨肽酶A(由SigmaChemical Co.生产)至0.1μg/ml，在37℃反应3小时。反应结束后，加入1N盐酸调至pH5.3，在添加羧肽酶Y至0.1μg/ml后，在37℃反应10小时。将所得反应液在与实验例1相同的条件下经反相高效液体色谱(HPLC)分析。结果，由于检测到认为是三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro的肽峰，因而分别收集所检出的峰，用自动肽分析仪PPSQ-10进行氨基酸序列分析，证实是三肽Ile Pro Pro和Val Pro Pro。
实验例4(对从中间体肽产生三肽Ile Pro Pro和Val Pro Pro的乳 酸菌肽酶的筛选)
通过下述方法，从乳酸菌瑞士乳杆菌所含的各种肽酶中筛选可用于本发明方法的肽酶。
(瑞士乳杆菌酶的提取和分级分离)
在含有9％(重量)脱脂奶粉的乳培养基中，接种乳酸菌瑞士乳杆菌CM4菌株(工业技术院生命工学工业技术研究所(日本茨城县つくば市东1丁目1番3号)，保藏号：FERM BP-6060，保藏日：1997年8月15日)(以下称为CM4菌株)，在37℃培养24小时。这种CM4菌株按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，以上述保藏号进行了登记注册，这种菌株由于被授予专利，完全解除了对第三者不能获得的限制。将这种培养物以5％(重量)接种到500ml新的9％(重量)的乳培养物中，维持pH6.5，同时在37℃进行pH静置(スタツト)培养。从静置培养开始5小时后，添加柠檬酸钠至最终浓度为2％(重量)，在室温下搅拌30分钟。确定培养液澄清后，用5000g进行10分钟的离心分离，回收细菌细胞。用50mM磷酸缓冲液、150mMNaCl pH6.8洗涤2次，然后悬浮于20ml 50mM Tris-HCl pH8.0中，用超声波破碎机(5203型，由メ-カ-大
Figure C00818295D0014114233QIETU
制作所制造)破碎细胞。以15000g离心分离10分钟，除去沉淀，将上清液作为粗提液回收。使5ml粗提液通过预先用三羟甲基氨基甲烷缓冲液平衡了的1ml DEAE-sepharose柱(由Pharmacia Corporation生产)，用5ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤柱子后，通过依次用含50mM、100mM、150mM、200mM、300mM和500mM NaCl的3ml Tirs缓冲液洗涤来进行分级分离，获得表2中所示的6个部分(部分1-6)。
(中间体肽的切割)
化学合成中间体肽Val Pro Pro Phe Leu。将该合成肽溶于100mM磷酸缓冲液(pH6.1)中至10μg/ml。将该溶液与上述部分1-6中任一部分以9:1的体积比混合，于37℃反应30分钟。反应结束后，反应液经反相高效液体色谱(HPLC)分析，证实产生了三肽Val Pro Pro。通过将在HPLC洗脱时间11.0分钟检测到的来自于三肽Val Pro Pro的肽峰的峰高(mm)与洗脱液量(ml)相乘，计算出以相对单位计的三肽Val Pro Pro的生成量。结果示于表2中。
表2
 
部分 缓冲液中的NaCl浓度(mM) 体积(ml) VPP生成量(相对量)
(洗涤液) 0 5 0
1 50 3 0
2 100 3 6.5
3 150 3 12
 
4 200 3 45
5 300 3 12
6 500 3 0
结果，在对用部分2-5进行反应后的溶液的分析中，鉴定出具有产生三肽Val-Pro-Pro的肽酶活性的肽峰。在这些部分中，含有与从肽Val Pro Pro Phe Leu产生三肽Val Pro Pro的反应相关的内肽酶，特别是在部分4中，含有约0.01μg内肽酶。
然后，在肽酶活性最强的部分4中，用化学合成的其它各种合成中间体肽作为底物，进行与上述相同的反应，反应液经HPLC分析，证实产生了三肽Ile Pro Pro或Val Pro Pro。结果，证实从肽Val Pro ProPhe Leu和Val Pro Pro Phe Leu Gln产生了三肽ValPro Pro。而且，证实从肽Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr和Ile Pro Pro Leu Thr产生了三肽IlePro Pro。结果示于表3中。
表3
 
底物肽 生成的肽
Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu(序列标识号29) -
Val Pro Pro Phe Leu Gln Val Pro Pro
Val Pro Pro Phe Leu Val Pro Pro
Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Ile Pro Pro
Ile Pro Pro Leu Thr Ile Pro Pro
实验例5(通过蛋白酶与来源于瑞士乳杆菌的肽酶组合产生三肽 Ile Pro Pro和Val Pro Pro)
向由在实验例2中所用的28个氨基酸构成的合成肽10μg/ml(100mM磷酸缓冲液、pH6.1)中，添加表4所示食品加工用的市售蛋白酶分别至0.1μg/ml，于37℃反应5小时。反应结束后，将反应液于100℃加热5分钟使蛋白酶失活，然后与在实验例4中获得的部分4反应，经HPLC分析，分析三肽Ile Pro Pro或Val Pro Pro的产生。表4显示了各反应液中是否有三肽生成。
表4
 
酶名称 起源 是否有三肽Ile-Pro-ProVal-Pro-Pro生成
胰蛋白酶(I型)<sup>1)</sup> 牛胰 无
XXIII型<sup>1)</sup> 米曲霉(Aspergillus oryzae) 无
胃蛋白酶<sup>1)</sup> 猪胃粘膜 无
枯草杆菌蛋白酶Carlsberg<sup>1)</sup> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 无
枯草杆菌蛋白酶BPN’<sup>1)</sup> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 无
V8蛋白酶<sup>1)</sup> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 无
木瓜蛋白酶<sup>1)</sup> 番木瓜胶乳 有
蛋白酶A<sup>2)</sup> 米曲霉 有
蛋白酶M<sup>2)</sup> 米曲霉 有
蛋白酶N<sup>2)</sup> 枯草杆菌 无
蛋白酶p<sup>2)</sup> 蜂蜜曲霉(Aspergillis melleus) 有
蛋白酶S<sup>2)</sup> 芽孢杆菌(Bacillus sp.) 无
Nucleicin<sup>3)</sup> 枯草杆菌 无
定向酶(Orientase)ONS<sup>3)</sup> 米曲霉 无
定向酶10NL<sup>3)</sup> 枯草杆菌 无
定向酶90N<sup>3)</sup> 枯草杆菌 无
1)由Sigma Chemical Co.生产
2)由天野制药(株式会社)生产
3)由阪急共荣物产(株式会社)生产
结果，在用木瓜蛋白酶以及蛋白酶A(来源于米曲霉，由天野制药(株式会社)生产)、蛋白酶M(来源于米曲霉，由天野制药(株式会社)生产)、蛋白酶P(来源于蜂蜜曲霉，由天野制药(株式会社)生产)作为蛋白酶作用时，证实通过与实验例4中获得的部分4进行两步反应，产生了三肽Ile Pro Pro和Val Pro Pro。使用其它蛋白酶时，没有鉴定出三肽Ile Pro Pro和Val Pro Pro的产生。
实施例1
(从酪蛋白产生三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro-1)
将50mg酪蛋白(Sunlact S，由太阳化学(株式会社)生产)溶于10ml50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，添加0.2mg木瓜蛋白酶(由SigmaChemical Co.生产)，于37℃反应12小时。将反应后的反应液在100℃热处理3分钟后，骤冷，使酶失活。使10ml反应后的反应液通过Sep-pakC18柱(Waters Corporation)，然后用5ml 30％(体积)乙腈洗脱出吸附的肽。从洗脱的肽部分蒸馏出乙腈后，将肽部分溶于1ml 50mM Tris-HCl(pH8.0)中，加入浓度分别为0.1μg/ml的氨肽酶I(由天野制药(株式会社)生产)、羧肽酶Y(由天野制药(株式会社)生产)，于37℃反应12小时。通过以下的HPLC法，定量分析反应液中所含有的三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro。
(通过HPLC的Val Pro Pro和Ile Pro Pro的定量法)
将样品在HPLC洗脱液(0.3M NaCl、0.05％(重量)TFA水溶液)中依次稀释，用合成肽作为标准，通过测定相应于三肽Ile Pro Pro和ValPro Pro的峰高，进行定量分析。定量分析用的HPLC分析条件如下所示。
所用的仪器：日立L4000UV检测器(215nm)
                L6200智能泵
                L5030柱加热炉(35℃)
分离条件：流速：0.5ml/分钟
洗脱液：0.3M NaCl、0.05％(重量)TFA水溶液
柱：Asahipak GS 320(Φ3.9×600mm)(昭和电工(株式会社)制造)
结果，发现在反应结束后的反应液中，相对于每50mg酪蛋白，有50μg三肽Val Pro Pro和50μg三肽Ile Pro Pro。在酪蛋白中，Val ProPro和Ile Pro Pro的序列主要在β酪蛋白中各存在1个，设从这些序列以100％的效率产生三肽Ile Pro Pro和Val Pro Pro，则其理论值是每1g酪蛋白产生约4mg三肽，因此，根据以下计算公式，相对于这种理论值的本实验的收率总共为25％。
收率＝(实测值/理论值)×100(％)
Val Pro Pro＝0.05mg/(4mg×50mg/1000mg)×100(％)＝25％
Ile Pro Pro＝0.05mg/(4mg×50mg/1000mg)×100(％)＝25％
实施例2
(从酪蛋白产生三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro-2)
将50mg酪蛋白(Sunlact S，由太阳化学(株式会社)生产)溶于10ml50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，添加0.2mg木瓜蛋白酶(由SigmaChemical Co.生产)，于37℃反应12小时。将反应后的反应液在100℃热处理3分钟后，骤冷，使酶失活。使10ml反应后的反应液通过Sep-pakC18柱(Waters Corporation)，然后用5ml 30％(体积)乙腈洗脱出吸附的肽。从洗脱的肽部分蒸馏出乙腈后，添加1ml在实验例4中获得的瑞士乳杆菌的提纯酶部分(部分4)，于37℃反应12小时。在反应后的反应液中，相对于每50mg酪蛋白有50μg三肽Val Pro Pro(收率25％)和195μg三肽Ile Pro Pro(收率97.5％)。
实施例3
(从酪蛋白产生三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro-3)
将50mg酪蛋白(Sunlact S，由太阳化学(株式会社)生产)溶于10ml50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，添加0.2mg木瓜蛋白酶(由SigmaChemical Co.生产)，于37℃反应12小时。将反应后的反应液于100℃加热处理3分钟后骤冷，使酶失活。添加1ml在实验例4中获得的瑞士乳杆菌的提纯酶部分(部分4)，于37℃反应12小时。在反应后的反应液中，相对于每50mg酪蛋白含有50μg三肽Val Pro Pro(收率25％)和50μg三肽Ile Pro Pro(收率25％)。
实施例4-6
(从酪蛋白产生三肽ValPro Pro和Ile Pro Pro-4)
将150mg酪蛋白(Sunlact S，由太阳化学(株式会社)生产)溶于30ml 50mM磷酸缓冲液(pH6.5)中后，分为每份10ml。向其中分别添加0.2mg的蛋白酶A(实施例4)、蛋白酶M(实施例5)或蛋白酶P(实施例6)(均为商品名，由天野制药(株式会社)生产)，于37℃反应12小时。将反应后的反应液于100℃加热处理3分钟后骤冷，使酶失活。添加1ml在实验例4中获得的瑞士乳杆菌的提纯酶部分(部分4)，于37℃反应12小时。在反应后的反应液中，相对于每50mg酪蛋白所含有的三肽Val Pro Pro和三肽Ile Pro Pro的比率，在实施例4中分别为40μg(收率20％)和45μg(收率22.5％)，在实施例5中分别为37μg(收率18.5％)和50μg(收率25％)，在实施例6中分别为42μg(收率21％)和45μg(收率22.5％)。
<110>Calpis Co.，Ltd.
<120>生产三肽的方法
<130>4616
<150>JP11-321084
<151>1999-11-t1
<160>29
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr
1             5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr
1             5
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr
1             5
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln
1             5
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln
1              5
<210>6
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Ile Pro Pro Leu Thr Gln
1             5
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr
1             5
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Asn Ile Pro Pro Leu Thr
1          5
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Ile Pro Pro Leu Thr
1             5
<210>10
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Gln Asn Ile Pro Pro Leu
1             5
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Asn Ile Pro Pro Leu
1             5
<210>12
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Ile Pro Pro Leu
1
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13
Gln Asn Ile Pro Pro
1             5
<210>14
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<400>14
Asn Ile Pro Pro
1
<210>15
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>15
Ile Pro Pro
1
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>16
Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln
1            5
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>17
Val Val Pro Pro Phe Leu Gln
1            5
<210>18
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>18
Val Pro Pro Phe Leu Gln
1             5
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<400>19
Val Val Val Pro Pro Phe Leu
1            5
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>20
Val Val Pro Pro Phe Leu
1             5
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>21
Val Pro Pro Phe Leu
1             5
<210>22
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
Val Val Val Pro Pro Phe
1        5
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>23
Val Val Pro Pro Phe
1             5
<210>24
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<400>24
Val Pro Pro Phe
1
<210>25
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>25
Val Val Val Pro Pro
1            5
<210>26
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<400>26
Val Val Pro Pro
1
<210>27
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>27
Val Pro Pro
1
<210>28
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<400>28
Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr ProVal Val Val Pro
1              5                 10              15
Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser Lys
            20                25
<210>29
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>29
Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu
1             5

Claims (7)

1.三肽的生产方法，所述方法包括以下步骤：
提供蛋白酶和肽酶，所述蛋白酶作用于肽Leu Pro Gln Asn Ile ProPro Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu ValMet Gly Val Ser Lys时，产生选自含序列Val Pro Pro且在该序列外不含Pro的肽、含序列Ile Pro Pro且在该序列外不含Pro的肽以及它们的混合物的中间体肽，所述肽酶包括内肽酶、氨肽酶和羧肽酶中的至少一种，
用所述蛋白酶切割含乳酪蛋白的材料，产生选自含序列ValProPro且在该序列外不含Pro的肽、含序列Ile Pro Pro且在该序列外不含Pro的肽以及它们的混合物的中间体肽，用所述肽酶切割所述中间体肽，产生三肽Val Pro Pro和Ile Pro Pro中的至少一种。
2.权利要求1的生产方法，其中所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、蛋白酶A、蛋白酶M、蛋白酶P和它们的混合物。
3.权利要求1的生产方法，其中所述中间体肽选自序列标识号1-27和它们的混合物。
4.权利要求1的生产方法，其中所述羧肽酶切割序列Val Pro ProXaa和Ile Pro Pro Xaa的至少一种序列中Pro与Xaa之间键合，其中Xaa表示任意的氨基酸。
5.权利要求1的生产方法，其中所述内肽酶包含来源于乳酸菌瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)活细胞的内肽酶。
6.权利要求5的生产方法，其中所述乳酸菌瑞士乳杆菌是CM4菌株(工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号：FERM BP-6060)。
7.权利要求1的生产方法，其特征在于：用所述蛋白酶切割所述含乳酪蛋白材料产生所述中间体肽后，在用所述肽酶进行切割之前，通过疏水性树脂对所述中间体肽进行浓缩。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111919963A (zh) * 2020-07-10 2020-11-13 青岛农业大学 一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含ipp和vpp水解物的方法

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10105040A1 (de) 2001-02-05 2002-08-14 Tell Pharm Ag Hergiswil Tripeptid-Derivate für die Behandlung von postläsionalen Krankheiten des Nervensystems
DE10105041A1 (de) 2001-02-05 2002-08-14 Tell Pharm Ag Hergiswil Tripeptide und Tripeptid-Derivate für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten
DE10105038B4 (de) 2001-02-05 2005-07-07 Neurotell Ag Tripeptid-Derivate für die Behandlung von postläsionalen Krankheiten des Nervensystems
CA2523410A1 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Unilever Plc Hydrolysed casein product comprising tripeptides ipp and/or vpp
ES2277468B1 (es) * 2003-05-21 2008-07-01 Grupo Leche Pascual Peptidos bioactivos y derivados, procedimiento de produccion, cepas de enterococcus faecalis productoras de dichos peptidos bioactivos y sus aplicaciones.
KR101115560B1 (ko) * 2003-08-01 2012-03-13 칼피스가부시키가이샤 생체내 비분해성 펩티드, 안지오텐신 변환효소 저해제, 의약 및 기능성 식품
CA2547737A1 (en) * 2003-12-15 2005-06-30 Unilever Plc Peptides having an ace inhibiting effect
BRPI0513237A (pt) * 2004-07-12 2008-04-29 Dsm Assets B V hidrolisados de proteìna para diminuição de pressão sanguìnea
US7879804B2 (en) * 2004-12-22 2011-02-01 Dsm Ip Assets B.V. Blood pressure lowering peptides in a single enzymatic step
ES2321650T3 (es) * 2005-02-09 2009-06-09 Unilever N.V. Productos alimenticios que comprenden solidos lacteos hidrolizados con sabor mejorado.
ES2599859T3 (es) * 2005-02-24 2017-02-03 Dsm Ip Assets B.V. Proceso enzimático para producir I-P-P a partir de caseína kappa
DE602005018612D1 (de) * 2005-05-24 2010-02-11 Chr Hansen As Isolierte Dipeptide mit ACE-Inhibitionseffekt
AU2006273395B2 (en) * 2005-07-26 2012-10-04 Calpis Co., Ltd. Process for production of fermented milk and fermented milk beverage/food
WO2007055393A1 (en) * 2005-11-09 2007-05-18 Ajinomoto Co., Inc. Kokumi-imparting agent
US20100167979A1 (en) 2006-02-09 2010-07-01 Calpis Co. Ltd Rheumatoid arthritis-preventive agent for oral intake
DK1992352T3 (da) * 2006-02-14 2014-06-10 Calpis Co Ltd Middel til anvendelse i forbyggelsen af aterosklerosis
EP2222835A1 (en) * 2007-11-23 2010-09-01 DSM IP Assets B.V. Improved bioactive peptide production
TW201028171A (en) * 2008-12-15 2010-08-01 Calpis Co Ltd Peptides for inhibiting skin aging
FI20095146A (fi) 2009-02-18 2010-08-19 Valio Oy Menetelmä elintarvikevalmisteen maun parantamiseksi
AU2010337738B2 (en) * 2009-12-28 2013-09-19 Asahi Group Holdings, Ltd. Composition for improving brain function and method for improving brain function
JP2011136932A (ja) 2009-12-28 2011-07-14 Calpis Co Ltd 脳機能改善用組成物および脳機能を改善する方法
CN103108646B (zh) * 2010-09-16 2014-06-11 可尔必思株式会社 脑功能改善用组合物及改善脑功能的方法
US9523109B2 (en) * 2011-06-24 2016-12-20 Calpis Co., Ltd. Method for enzymatically preparing peptides for use in improvement of brain function
JP5718741B2 (ja) 2011-06-24 2015-05-13 カルピス株式会社 脳機能改善用ペプチドの酵素的製造方法
US20130156884A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-20 Triarco Industries Protease enzymes for increased protein digestion rate and absorption and methods of using the same
US9617300B2 (en) 2012-03-09 2017-04-11 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Dipeptidyl peptidase-IV inhibitor
CN103215332A (zh) * 2013-04-16 2013-07-24 陕西科技大学 一种分步酶解羊乳酪蛋白制备ace抑制肽的方法
CN107814844A (zh) * 2017-12-12 2018-03-20 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽vvppfl及其制备方法和应用
JPWO2022202985A1 (zh) * 2021-03-24 2022-09-29

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999016461A1 (fr) * 1997-09-26 1999-04-08 Calpis Co., Ltd. Agents antistress et aliments fonctionnels

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3846560A (en) 1971-07-22 1974-11-05 Quaker Oats Co Process of making a base for protein beverages
US3876806A (en) 1971-10-14 1975-04-08 Quaker Oats Co Process for the preparation of acid soluble polypeptides and carbonated beverages containing same
US4107334A (en) 1976-10-13 1978-08-15 Pfizer Inc. Modified protein
CH636248A5 (fr) 1979-03-09 1983-05-31 Nestle Sa Procede de preparation d'un hydrolysat de proteines purifie.
JPS6023086B2 (ja) * 1982-09-04 1985-06-05 工業技術院長 アンジオテンシン転換酵素阻害剤
JPS60262561A (ja) 1984-06-08 1985-12-25 House Food Ind Co Ltd 大豆蛋白質水溶液の処理方法
US4585757A (en) 1984-07-27 1986-04-29 Texas Tech University Health Sciences Center Hypotensive active peptides
US4687840A (en) 1986-02-11 1987-08-18 Texas Tech University Health Sciences Center Hypotensive active peptides
DD300815A5 (de) 1989-07-07 1992-08-06 Nestle Sa Proteinhydrolyse
NL9000422A (nl) 1990-02-21 1991-09-16 Nl Zuivelonderzoek Inst Werkwijze voor de bereiding van een gefermenteerd melkprodukt.
EP0445606B1 (en) 1990-02-27 1997-01-22 The Agency of Industrial Science and Technology Novel oligopeptides, pharmaceutical composition and food containing the same, and use of oligopeptides
DE69127020T2 (de) 1990-05-18 1998-01-29 Iwase Cosfa Co Ltd Milchproteinhydrolysate und Zusammensetzungen zur Verwendung als Haar- und Hautbehandlungsmittel
JP2571734B2 (ja) 1991-08-23 1997-01-16 株式会社ヤクルト本社 乳酸菌飲料
US5486461A (en) 1991-11-08 1996-01-23 Novo Nordisk A/S Casein hydrolyzate and method for production of such casein hydrolyzate
JPH05244947A (ja) * 1992-03-04 1993-09-24 Mercian Corp 新規ポストプロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方法
JP3488722B2 (ja) 1992-03-04 2004-01-19 カルピス株式会社 カルシウム吸収促進活性剤及びその製造法
FI94088C (fi) 1992-03-13 1995-07-25 Valio Oy Menetelmä fenyylialaniinin poistamiseksi proteiinipitoisista koostumuksista
US5418218A (en) 1992-07-10 1995-05-23 The University Of Maryland At Baltimore Histidyl-proline diketopiperazine (cyclo his-pro) a cns-active pharmacologic agent
JP3483604B2 (ja) * 1992-12-03 2004-01-06 昭和産業株式会社 アミノ酸の製造方法
JPH07115969A (ja) * 1993-10-25 1995-05-09 Asahi Chem Ind Co Ltd 加水分解蛋白質の製造方法
US5656268A (en) 1995-04-21 1997-08-12 Sorodsky; Michael Biological product
US5618689A (en) 1995-05-25 1997-04-08 Nestec S.A. Enhanced procedures for preparing food hydrolysates
DK0946106T3 (da) 1996-12-23 2002-09-16 Dsm Nv Fremgangsmåde til fremstilling af et proteinhydrolysat
JP4204653B2 (ja) 1997-06-20 2009-01-07 リンテック株式会社 シート剥離装置および方法
JPH1116461A (ja) 1997-06-26 1999-01-22 Matsushita Electric Works Ltd 感熱スイッチ
JP3028411B2 (ja) * 1997-09-26 2000-04-04 カルピス株式会社 トリペプチド高生産性ラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸菌
JP2873327B2 (ja) * 1998-01-23 1999-03-24 工業技術院長 アンジオテンシン変換酵素阻害剤
US6221423B1 (en) 1998-04-13 2001-04-24 Protein Technologies Int'l Inc. Short-chained peptide material
WO2001068114A1 (en) 2000-03-10 2001-09-20 Monsanto Company Novel peptides with anti-hypertensive activity
AU2001245537A1 (en) 2000-03-10 2001-09-24 Monsanto Company Anti-hypertensive peptides
US6908633B2 (en) 2000-03-13 2005-06-21 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Protein hydrolyzates, process for producing the same and drinks and foods containing the protein hydrolyzates
US20030040475A1 (en) 2001-01-16 2003-02-27 Yasuhiro Toba Agents for improving lipid metabolism and reducing high blood pressure
US6815426B2 (en) 2001-02-16 2004-11-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Angiogenesis-inhibitory tripeptides, compositions and their methods of use
WO2002071854A1 (en) 2001-03-09 2002-09-19 Unilever N.V. Fermented milk product
US6589574B2 (en) 2001-03-19 2003-07-08 Council Of Scientific & Industrial Research Process for preparation of protein-hydrolysate from milk protein

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999016461A1 (fr) * 1997-09-26 1999-04-08 Calpis Co., Ltd. Agents antistress et aliments fonctionnels

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111919963A (zh) * 2020-07-10 2020-11-13 青岛农业大学 一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含ipp和vpp水解物的方法
CN111919963B (zh) * 2020-07-10 2021-06-01 青岛农业大学 一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含ipp和vpp水解物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1231279A4 (en) 2004-07-21
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