KR20160063650A - 우피 분해용 효소 농축액 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 우피 분해용 효소 농축액 제조 방법에 관한 것으로서, (a) 초기 배지를 제조하는 단계; (b) 상기 초기 배지에 균주 접종 및 미생물 제1발효 단계; (c) 기질 첨가 단계; (d) 미생물 제2발효 단계; 및 (e) 발효액 분리 및 농축 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이에 의해, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001을 이용한 발효 초기 배지 제조, 균주 접종 및 발효, 기길 첨가, 발효, 발효액 분리 및 농축을 거쳐 제조된 우피 분해용 효소는 우피 분해제로서 탁월한 효과를 나타내며, 우피의 젤라틴 및 케라틴 성분을 완전히 분해하여 아미노산으로 전환하는 탁월한 효과를 나타낸다.

Description

우피 분해용 효소 농축액 제조 방법{Enzyme Concentrate Manufacturing Method For Cowhide Decomposition}
본 발명은 우피 분해용 효소 농축액 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquifacience) MZ001를 이용한 단백질 분해효소 제조 방법으로, 우피를 아미노산으로 빠르게 분해하는 고 활성 단백질 분해효소를 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001로부터 제조하는 방법에 관한 것이다.
단백질 분해효소는 단백질과 펩타이드결합을 가수 분해하는 효소로서 단백질분해 효소라고도 하며, 동식물의 조직이나 세포, 미생물에 널리 존재한다. 대부분은 분자량 수만인 단순 단백질인데, 당이나 금속이온을 수반하는 복합 단백질인 경우도 있다.
이러한 단백질 분해효소는 분해 양식에 의하여 엑소펩타이다아제(exopeptidase)와 엔도펩타이다아제(endopeptidase)로 나뉠 수 있다. 엑소펩타이다아제는 펩타이드사슬의 말단에만 작용하여 아미노산을 차례로 유리시키며, 로이신아미노펩타아다아제나 카복실펩타아다아제가 대표적이다. 엔도펩타아다아제는 말단보다는 오히려 내부에 작용하여 여러 가지 크기의 펩타이드를 유리시키며, 펩신, 트립신, 키모트립신 등 수많은 예가 있다. 또, 촉매작용하는 필수아미노산 잔기(殘基)나 조건에 의하여 세린효소, 싸이올효소, 금속효소, 산성효소의 4종으로 분류된다. 프로테아제는 생물에 의하여 불가결한 단백질의 재료인 아미노산을 다른 단백질 분해에 의하여 섭취할 때에 필요하며, 또 단백질 화학에 있어서 단백질의 아미노산 배열 결정에 중요한 역할을 한다.
단백질 분해에 관련된 종래 기술로는 대한민국 등록특허공보 등록번호 제10-1278617호(2013.06.25. 공고)가 있었다.
본 발명의 목적은 우피 가죽을 아미노산으로 빠르게 분해하는 고 활성 단백질 분해효소를 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001로부터 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, (a) 초기 배지를 제조하는 단계; (b) 상기 초기 배지에 균주 접종 및 미생물 제1발효 단계; (c) 기질 첨가 단계; (d) 미생물 제2발효 단계; 및 (e) 발효액 분리 및 농축 단계; 를 포함하는 우피 분해용 효소 농축액 제조 방법에 관한 것이다.
여기서, 상기 (a) 단계에서, 초기 배지의 조성은, 포도당 5 ~ 20 g/L; 당밀 1 ~10 g/L; 펩톤 5 ~ 20 g/L; NH4Cl 1 ~ 5 g/L; K2HPO4 1 ~ 2 g/L; 스킴밀크 5 ~ 20 g/L 으로 마련될 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계에서, 상기 균주 접종은 배양 온도 37도에서 바실러스 리체니포미스 MZ001를 접종량 1 ~ 3 중량부로 접종하고, 상기 미생물 제1발효는 용존산소농도 10 ~ 40%, 교반속도 100 ~ 500rpm, 배양 시간은 5 ~ 10 시간의 상태에서 진행될 수 있다.
여기서, 상기 (c) 단계는, 털이 제거된 우피(牛皮)를 가로 세로 크기 1cm 이하로 절단하여 3 중량부를 12 시간 동안 온수에서 팽윤시킨 후 우피 조각만을 꺼내어 모두 배양기 내로 첨가하는 단계이다.
또한, 상기 (d) 단계에서, 상기 미생물 제2발효는 미생물 반응기 운전 온도를 30도로 유지하며, 배양 시간은 10 ~ 20 시간의 상태에서 진행될 수 있다.
한편, 상기 (e) 단계는, 발효액을 4,000 ~ 10,000rpm으로 원심분리 하여 상등액을 50 ~ 70도에서 열처리 후 30분 ~ 2시간 동안 감압 농축을 통하여 처음 상등액 부피의 1/2 내지 1/6 까지 농축하는 단계로 마련될 수 있다.
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001을 이용한 발효 초기 배지 제조, 균주 접종 및 발효, 기길 첨가, 발효, 발효액 분리 및 농축을 거쳐 제조된 우피 분해용 효소는 우피 분해제로서 탁월한 효과를 나타내며, 우피의 젤라틴 및 케라틴 성분을 완전히 분해하여 아미노산으로 전환하는 탁월한 효과를 나타낸다.
도 1 은 본 발명에 따른 우피 분해용 효소 농축액 제조 방법의 흐름도이며,
도 2 는 우피 분해 전의 상태를 나타낸 도면이며,
도 3 은 본 발명에 따른 우피 분해용 효소 농축액에 의한 우피 분해 후의 상태를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세히 설명하기로 한다.
이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어는 사전적인 의미로 한정 해석되어서는 아니되며, 발명자는 자신의 발명을 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절히 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합되는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예 및 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 표현하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 존재할 수 있음을 이해하여야 한다.
도 1 은 본 발명에 따른 우피 분해용 효소 농축액 제조 방법의 흐름도이다.
도 1 을 참조하면, 본 발명에 따른 우피 분해용 효소 농축액 제조 방법은, 초기 배지를 제조하는 단계(S10), 상기 초기 배지에 균주 접종 및 미생물 제1발효 단계(S20), 기질 첨가 단계(S30), 미생물 제2발효 단계(S40) 및 발효액 분리 및 농축 단계(S50)를 포함한다.
(a) 단계 : 초기 배지 제조 단계(S10)
초기 배지를 제조하는 단계이다. 여기서, 초기 배지는, 포도당 5 ~ 20 g/L; 당밀 1 ~10 g/L; 펩톤 5 ~ 20 g/L; NH4Cl 1 ~ 5 g/L; K2HPO4 1 ~ 2 g/L; 스킴밀크 5 ~ 20 g/L 의 조성을 포함하는 배지 용액으로 제조될 수 있다.
(b) 단계 : 균주 접종 및 미생물 제1발효 단계(S20)
상기 (a) 단계로부터 제조된 배치 용액에 균주를 접종하고 미생물 제1발효를 진행하는 단계이다. 여기서, 상기 균주 접종은 멸균된 배지를 냉각하여 균의 배양 온도 37도에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001를 1 ~ 3 중량부로 접종함으로써 이루어질 수 있으며, 미생물 제1발효는 10 ~ 40% 용존산소농도를 유지하고 100 ~ 500rpm 범위 내에서 교반 속도를 조절 할 수 있다. 모든 운전 조건이 설정된 후 배양 시간은 5 ~ 10 시간 유지된 상태에서 진행될 수 있다.
(c) 단계 : 기질 첨가 단계(S30)
상기 (b) 단계로부터 균주 접종 및 미생물 제1발효가 완료된 용액에 기질을 첨가하는 단계이다. 여기서, 기질은 털이 제거된 가로 세로 크기가 1cm이하의 우피를 10 ~ 20 시간 온수에서 팽윤시킨 우피 조각으로 마련될 수 있으며, 기질은 1 ~ 5 중량부가 첨가 될 수 있다.
(d) 단계 : 미생물 제2발효 단계(S40)
상기 (c) 단계로부터 기질이 첨가된 용액을 2차적으로 미생물 발효시키는 단계이다. 여기서, 미생물 반응기 운전 온도를 30도로 낮추어 운전 하며, 배양 시간은 10 ~ 20 시간 동안 유지 될 수 있다.
(e) 단계 : 발효액 분리 및 농축 단계(S50)
상기 (d) 단계로부터 획득된 발효액을 분리 및 농축하여 최종 효소 농축액을 제조하는 단계이다. 이 단계는 (d) 단계로부터 얻어진 발효액을 4,000 ~ 10,000rpm으로 원심분리 하여 상등액을 50 ~ 70도에서 열처리 후 30분 ~ 2시간 동안 감압 농축을 통하여 처음 상등액 부피의 1/2 내지 1/6 까지 농축하는 단계이다.
지금까지 살펴본 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 우피 분해용 효소 제조 방법은 우피 분해용 효소 농축액 형태로 제조할 수 있다.
이 결과, 본 발명에 따른 방법으로 제조되는 우피 분해용 효소 농축액은 우피 분해제로서 탁월한 효과를 나타내며, 우피의 젤라틴 및 케라틴 성분을 완전히 분해하여 아미노산으로 전환하는 탁월한 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조되는 우피 분해용 효소는 우피를 완전히 아미노산으로 전환시킴으로서 아미노산이 활용 가능한 전반적 농업, 축산, 화장품, 및 건강 식품분야에 사용될 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.
여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.
우피 분해용 효소 농축액 제조 및 우피 분해
실시예 1
가. 균주 분리 및 동정
본 발명에 사용된 균주는 단백질분해활성뿐만 아니라 우피 분해활성이 있는 균주를 안산 폐가죽공장 인근 토양에서 분리하였으며, 16S rRNA 염기서열에 대한 NCBI BLAST 검색결과 기존에 알려진 Bacillus속 미생물의 염기서열과 99% 이상 일치하며 계통적으로 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주에 가장 가까운 것으로 나타났으며, 본 실시예에서 사용된 균주를 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquifacience) MZ001로 정의한다.
나. 단백질 분해효소 생산배지 및 배양방법
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001 균주로부터 분비되는 단백질 분해효소의 생산을 위해 다음과 같은 조성의 초기 배지를 사용하였다. 포도당 10 g/L, 당밀 5 g/L, 펩톤 10 g/L, NH4Cl 3 g/L, K2HPO4 1.5 g/L, 스킴밀크 10 g/L, 미생물반응기(3L, 2L 배양부피)에서의 회분식 배양에서 배양온도는 37℃, pH는 NaOH 및 HCl을 이용하여 6.8로 조정하였으며, 용존산소 농도 30% 유지, 교반속도 300 rpm으로 고정시킨 후 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001를 2 중량부로 접종 후 8시간 배양하였다.
이후, 새로운 기질로 털이 제거된 우피를 가로 세로 크기가 1cm 이하로 절단하여 3 중량부를 12 시간 온수에서 팽윤시킨 후 우피 조각만을 꺼내어 모두 배양기 내로 첨가하였다.
우피가 첨가된 미생물 반응기의 내부 온도를 30도로 낮추어 12 시간 운전 하였다.
다. 단백질 분해 효소 정제(조효소액 제조)
상기 미생물반응기에서 제조된 효소액이 들어 있는 발효액을 7,000 rpm에서 원심분리 하여 상등액을 분리한 후 60도 오븐에서 1시간 열처리 하였다. 열처리된 효소액은 감압 농축기을 이용하여 처음 량의 1/4 부피로 농축 하였다.
라. 단백질 분해 효소를 이용한 우피 분해
200ml 병에 우피 150g를 넣고 60도 온수로 200ml가 되게 채운 후 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001로부터 제조 후 농축된 우피 분해효소 2ml를 첨가 한다. 우피 분해효소가 첨가된 우피는 60도 오븐에서 10시간 동안 정치해 둔다.
도 2 는 우피 분해 전의 상태를 나타낸 도면이며, 도 3 은 본 발명에 따른 우피 분해용 효소 농축액에 의한 우피 분해 후의 상태를 나타낸 도면이다.
표 1는 우피 분해 액의 아미노산 함량을 나타낸다. 아미노산 분석 결과 총 아미노산 함량이 25.28% 이다.
이로서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001로부터 제조 후 농축된 우피 분해효소를 이용한 우피로부터 아미노산 제조가 확연히 이루어짐을 알 수 있다.
아미노산 농축액의 아미노산 분석 결과
구분 아미노산
종류 함량(%)
실시예 ASP 1.08
THR 0.70
SER 1.26
GLU 2.48
GLY 5.36
ALA 2.68
VAL 0.82
ILE 0.52
LEU 1.08
TYR 0.24
PHE 0.72
LYS 1.26
HIS 0.28
ARG 2.86
PRO 3.46
MET 0.30
CYS 0.18
합계 25.28
전술한 바와 같이, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 MZ001을 이용한 발효 초기 배지 제조, 균주 접종 및 발효, 기길 첨가, 발효, 발효액 분리 및 농축을 거쳐 제조된 우피 분해용 효소는 우피 분해제로서 탁월한 효과를 나타내며, 우피의 젤라틴 및 케라틴 성분을 완전히 분해하여 아미노산으로 전환하는 탁월한 효과를 나타낸다.
이상, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명의 기술적 사상은 이러한 것에 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해, 본 발명의 기술적 사상과 하기 될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형 실시가 가능할 것이다.

Claims (6)

  1. (a) 초기 배지를 제조하는 단계;
    (b) 상기 초기 배지에 균주 접종 및 미생물 제1발효 단계;
    (c) 기질 첨가 단계;
    (d) 미생물 제2발효 단계; 및
    (e) 발효액 분리 및 농축 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는
    우피 분해용 효소 농축액 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서, 초기 배지의 조성은, 포도당 5 ~ 20 g/L; 당밀 1 ~10 g/L; 펩톤 5 ~ 20 g/L; NH4Cl 1 ~ 5 g/L; K2HPO4 1 ~ 2 g/L; 스킴밀크 5 ~ 20 g/L 인 것을 특징으로 하는
    우피 분해용 효소 농축액 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서, 상기 균주 접종은 배양 온도 37도에서 바실러스 리체니포미스 MZ001를 접종량 1 ~ 3 중량부로 접종하고, 상기 미생물 제1발효는 용존산소농도 10 ~ 40%, 교반속도 100 ~ 500rpm, 배양 시간은 5 ~ 10 시간의 상태에서 진행되는 것을 특징으로 하는
    우피 분해용 효소 농축액 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계는, 털이 제거된 우피(牛皮)를 가로 세로 크기 1cm 이하로 절단하여 3 중량부를 12 시간 동안 온수에서 팽윤시킨 후 우피 조각만을 꺼내어 모두 배양기 내로 첨가하는 단계인 것을 특징으로 하는
    우피 분해용 효소 농축액 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서, 상기 미생물 제2발효는 미생물 반응기 운전 온도를 30도로 유지하며, 배양 시간은 10 ~ 20 시간의 상태에서 진행되는 것을 특징으로 하는
    우피 분해용 효소 농축액 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (e) 단계는, 발효액을 4,000 ~ 10,000rpm으로 원심분리 하여 상등액을 50 ~ 70도에서 열처리 후 30분 ~ 2시간 동안 감압 농축을 통하여 처음 상등액 부피의 1/2 내지 1/6 까지 농축하는 단계인 것을 특징으로 하는
    우피 분해용 효소 농축액 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110157636A (zh) * 2019-04-01 2019-08-23 成都市农林科学院 一种地衣芽孢杆菌、筛选方法、应用及含有该地衣芽孢杆菌的饲料

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