CN108192938A - 一种东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法 - Google Patents

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徐红萍
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Abstract

一种东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法,它是选用东海乌参作为原料,通过酸、碱和EDTA的浸泡,去除重金属和杂蛋白,获得胶原蛋白;在超声波辅助下,采用胶原蛋白酶酶解,获得胶原蛋白肽,所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品;所述的膜分离为超滤:将胶原蛋白肽加入超滤系统,用超滤膜进行超滤;所述的凝胶过滤采用G‑25凝胶分离,超滤后的胶原蛋白肽用蒸馏水进行溶解,离心,取上清液,过0.45μm微孔滤膜,取胶原蛋白肽溶液1.5ml过Sephadex G‑25柱,用蒸馏水为洗脱液,平衡和洗脱;它具有原料来源广,成本低,制备工艺简单,方便人们食用等特点。

Description

一种东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法,属于胶原蛋白抗菌肽的生物制品技术领域。
背景技术
东海乌参(学名:白肛海地瓜Acaudina leucoprocta),盛产于东海海区,其体壁中含有丰富的胶原蛋白,具有极高的营养价值与药用价值。然而,由于其分子量很大,不利于肠胃和皮肤的吸收。
与胶原蛋白相比,胶原蛋白肽不仅有胶原蛋白的营养特性,而且还具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等生物活性。东海乌参胶原蛋白主要为I型胶原蛋白,其结构稳定,肌纤维丝排列紧密,利用传统的商品酶酶解技术制备胶原蛋白肽,收率较低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足,而提供一种原料来源广,成本低,制备工艺简单,可靠性好,收率高,能够进一步延伸开发制成各种制剂,方便人们食用的东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的,一种东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法,它是选用东海乌参作为原料,通过酸、碱和EDTA的浸泡,去除重金属和杂蛋白,获得胶原蛋白;在超声波辅助下,采用胶原蛋白酶酶解,获得胶原蛋白肽,所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。
作为优选:所述的膜分离为超滤:将胶原蛋白肽加入超滤系统,用超滤膜进行超滤;
所述的凝胶过滤采用G-25凝胶分离,超滤后的胶原蛋白肽用蒸馏水进行溶解,离心,取上清液,过0.45μm微孔滤膜,取胶原蛋白肽溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90 cm ×115cm(ID)),用蒸馏水为洗脱液,平衡和洗脱;
所述的反相高效液相色谱( RT- HPLC)技术分离纯化是在如下色谱条件进行:
1) 胶原蛋白肽的前处理:将胶原蛋白肽用0.06%TFA的水溶解到0.6ml,离心(12000-14000 RPM,离心10分钟)取上清;
2)系统: Agilent 1260 HPLC;
3)柱子: Zorbax SB-C18 4.6 X 250 5 um;
4)进样体积:80-10ul;
5)缓冲液和平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈;
6) 梯度: 0%–0 % B洗脱4分钟,0%–8% B洗脱25分钟,8% -100%B洗脱1分钟,100% -100%B洗脱5分钟;
7)流速: 1.0 ml/min;
8)检测: 280 nm /214nm。
作为优选:所述的酸、碱和EDTA的浸泡是:将东海乌参清洗、打浆以及研磨细化处理后,先用EDTA浸泡液进行浸泡3—4天,然后过滤后加入乙酸进行提取1-3天,离心后合并上清液,加入添加剂静置20—40分钟后12000—14000r/min离心8—5分钟得到沉淀物,经盐析并透析后冻干得到东海乌参胶原蛋白
所述的胶原蛋白酶酶解是:在东海乌参胶原蛋白中,依次分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶中的至少两种,并且分别在超声波辅助催化下分别酶解3—5h和1—3h;升温至110—20℃灭酶35—45分钟,得到酶解液;
将所述的酶解液在零下30—零下10℃温度下冷冻干燥5—10h,直接得到胶原蛋白肽。
作为优选:所述的胶原蛋白酶酶解是:在东海乌参胶原蛋白中,先加入东海乌参胶原蛋白重量的1—3%胃蛋白酶,在超声波辅助催化下酶解3—4h,再加入东海乌参胶原蛋白重量的0.5—2%丝氨酸蛋白酶,在超声波辅助催化下酶解1—2h;
将所述的酶解液先在零下10℃温度下预冷30—50分钟,再在零下30冷冻干燥5—10h,直接得到胶原蛋白肽;
所述的EDTA浸泡液为0.25—0.35M、pH7.6—7.9;所述的乙酸含量为0.6—1M;
所述的添加剂由5—7重量份食盐、5—10重量份果糖、4—8重量份盐酸硫铵素、10—16重量份谷氨酰胺以及10—14重量份丝氨酸组成,添加剂的加入量为上清液重量的11—14%。
本发明以产量巨大,营养价值高,但开发利用率低的东海乌参为原料,通过分离获得胶原蛋白,采用胶原蛋白酶解,辅助超声波技术,采用现代分离纯化技术及分析测试技术,得到具有抗菌活性的胶原蛋白肽;本发明改善东海乌参开发利用率极低的现状,促进海洋生物医药的发展;本发明还可以进一步制备可供口服的东海乌参胶原蛋白粉,并对特定的微生物具有抗菌活性。
本发明属于一种改进技术,它具有原料来源广,成本低,制备工艺简单,可靠性好,收率高,能够进一步延伸开发制成各种制剂,方便人们食用等特点。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍:本发明所述的一种东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法,它是选用东海乌参作为原料,通过酸、碱和EDTA的浸泡,去除重金属和杂蛋白,获得胶原蛋白;在超声波辅助下,采用胶原蛋白酶酶解,获得胶原蛋白肽,所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。
作为一种实施例:本发明所述的膜分离为超滤:将胶原蛋白肽加入超滤系统,用超滤膜进行超滤;
所述的凝胶过滤采用G-25凝胶分离,超滤后的胶原蛋白肽用蒸馏水进行溶解,离心,取上清液,过0.45μm微孔滤膜,取胶原蛋白肽溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90 cm ×115cm(ID)),用蒸馏水为洗脱液,平衡和洗脱;
所述的反相高效液相色谱( RT- HPLC)技术分离纯化是在如下色谱条件进行:
1) 胶原蛋白肽的前处理:将胶原蛋白肽用0.06%TFA的水溶解到0.6ml,离心(12000-14000 RPM,离心10分钟)取上清;
2)系统: Agilent 1260 HPLC;
3)柱子: Zorbax SB-C18 4.6 X 250 5 um;
4)进样体积:80-10ul;
5)缓冲液和平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈;
6) 梯度: 0%–0 % B洗脱4分钟,0%–8% B洗脱25分钟,8% -100%B洗脱1分钟,100% -100%B洗脱5分钟;
7)流速: 1.0 ml/min;
8)检测: 280 nm /214nm。
作为一种实施例:所述的酸、碱和EDTA的浸泡是:将东海乌参清洗、打浆以及研磨细化处理后,先用EDTA浸泡液进行浸泡3—4天,然后过滤后加入乙酸进行提取1-3天,离心后合并上清液,加入添加剂静置20—40分钟后12000—14000r/min离心8—5分钟得到沉淀物,经盐析并透析后冻干得到东海乌参胶原蛋白
所述的胶原蛋白酶酶解是:在东海乌参胶原蛋白中,依次分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶中的至少两种,并且分别在超声波辅助催化下分别酶解3—5h和1—3h;升温至110—20℃灭酶35—45分钟,得到酶解液;
将所述的酶解液在零下30—零下10℃温度下冷冻干燥5—10h,直接得到胶原蛋白肽。
作为进一步实施例:本发明所述的胶原蛋白酶酶解是:在东海乌参胶原蛋白中,先加入东海乌参胶原蛋白重量的1—3%胃蛋白酶,在超声波辅助催化下酶解3—4h,再加入东海乌参胶原蛋白重量的0.5—2%丝氨酸蛋白酶,在超声波辅助催化下酶解1—2h;
将所述的酶解液先在零下10℃温度下预冷30—50分钟,再在零下30冷冻干燥5—10h,直接得到胶原蛋白肽;
所述的EDTA浸泡液为0.25—0.35M、pH7.6—7.9;所述的乙酸含量为0.6—1M;
所述的添加剂由5—7重量份食盐、5—10重量份果糖、4—8重量份盐酸硫铵素、10—16重量份谷氨酰胺以及10—14重量份丝氨酸组成,添加剂的加入量为上清液重量的11—14%。
本发明的其它实施例,可以在上述多个实施例的基础上,通过任一数值替换以及常规技术手段的简单替换,能够获得无数个实施例,且本领域技术人员在了解本发明的基础上,能够方便地实施本发明。

Claims (4)

1.一种东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法,它是选用东海乌参作为原料,通过酸、碱和EDTA的浸泡,去除重金属和杂蛋白,获得胶原蛋白;在超声波辅助下,采用胶原蛋白酶酶解,获得胶原蛋白肽,其特征在于所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。
2.根据权利要求1所述的东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法,其特征在于:
所述的膜分离为超滤:将胶原蛋白肽加入超滤系统,用超滤膜进行超滤;
所述的凝胶过滤采用G-25凝胶分离,超滤后的胶原蛋白肽用蒸馏水进行溶解,离心,取上清液,过0.45μm微孔滤膜,取胶原蛋白肽溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90 cm ×115cm(ID)),用蒸馏水为洗脱液,平衡和洗脱;
所述的反相高效液相色谱( RT- HPLC)技术分离纯化是在如下色谱条件进行:
1) 胶原蛋白肽的前处理:将胶原蛋白肽用0.06%TFA的水溶解到0.6ml,离心(12000-14000 RPM,离心10分钟)取上清;
2)系统: Agilent 1260 HPLC;
3)柱子: Zorbax SB-C18 4.6 X 250 5 um;
4)进样体积:80-10ul;
5)缓冲液和平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈;
6) 梯度: 0%–0 % B洗脱4分钟,0%–8% B洗脱25分钟,8% -100%B洗脱1分钟,100% -100%B洗脱5分钟;
7)流速: 1.0 ml/min;
8)检测: 280 nm /214nm。
3.根据权利要求1所述的东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法,其特征在于:
所述的酸、碱和EDTA的浸泡是:将东海乌参清洗、打浆以及研磨细化处理后,先用EDTA浸泡液进行浸泡3—4天,然后过滤后加入乙酸进行提取1-3天,离心后合并上清液,加入添加剂静置20—40分钟后12000—14000r/min离心8—5分钟得到沉淀物,经盐析并透析后冻干得到东海乌参胶原蛋白
所述的胶原蛋白酶酶解是:在东海乌参胶原蛋白中,依次分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶中的至少两种,并且分别在超声波辅助催化下分别酶解3—5h和1—3h;升温至110—20℃灭酶35—45分钟,得到酶解液;
将所述的酶解液在零下30—零下10℃温度下冷冻干燥5—10h,直接得到胶原蛋白肽。
4.根据权利要求3所述的东海乌参胶原蛋白抗菌肽的制备方法,其特征在于:
所述的胶原蛋白酶酶解是:在东海乌参胶原蛋白中,先加入东海乌参胶原蛋白重量的1—3%胃蛋白酶,在超声波辅助催化下酶解3—4h,再加入东海乌参胶原蛋白重量的0.5—2%丝氨酸蛋白酶,在超声波辅助催化下酶解1—2h;
将所述的酶解液先在零下10℃温度下预冷30—50分钟,再在零下30冷冻干燥5—10h,直接得到胶原蛋白肽;
所述的EDTA浸泡液为0.25—0.35M、pH7.6—7.9;所述的乙酸含量为0.6—1M;
所述的添加剂由5—7重量份食盐、5—10重量份果糖、4—8重量份盐酸硫铵素、10—16重量份谷氨酰胺以及10—14重量份丝氨酸组成,添加剂的加入量为上清液重量的11—14%。
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童静静: "东海乌参蛋白肽的酶法制取及精制研究", 《中国优秀硕士论文全文数据库 工程科技I辑》 *

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