CN107488693A - 马尾藻活性多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了马尾藻活性多肽的制备方法,具体为:将马尾藻粉加入氢氧化钠溶液,超声波处理,离心;离心液加入乙醇,静置,用PBS溶液溶解沉淀;将马尾藻蛋白水溶液中加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解,灭酶,冷却,离心;将酶解液中加入β‑环糊精脱腥,微滤;将脱腥后的酶解液超滤,纳滤,冷冻干燥即得马尾藻活性多肽。有益效果为:本发明提供的马尾藻活性多肽的制备方法,活性蛋白肽得率高、加工周期短、能耗低、生产成本低、适用于工业化生产;该方法得到的活性多肽能与钙、锌、铁等离子结合,促进了它们的吸收,具有促进骨骼和牙齿发育,预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。

Description

马尾藻活性多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域,尤其是涉及马尾藻活性多肽的制备方法。
背景技术
马尾藻(Sargassum)是褐藻中的一类海藻,属褐藻口,鹿角菜目,马尾藻科,大多为多年生大型藻类,主要生长在低潮带石沼中或潮下带2-3米水深处的岩石上,大多数为暖水性物种,广泛分布于暖水和温水海域,在我国南北海域均有分布,其中广东、广西马尾藻的产量较高,另外在海南岛和涠洲岛海域也有很高的产量。马尾藻藻体褐色,藻体分固着器、茎、叶和气囊四部分,髙达1米社。固着器盘状,上生圆柱状的主干。主干单生,偶有双生的现象。茎呈现兰棱形,叶子多是披针形,裹多生在末端小枝上,幼期为纺锤形或倒卵形,顶端有针状突起,成熟时为球形或亚圆球形,顶端圆滑或具尖细的突起。马尾藻中含有丰富膳食纤维,褐藻淀粉,矿物质和维生素及优质的高饱和脂肪酸和合理的必需氨基酸组成,其中必需氨基酸的含量远高于海带、紫菜,其余成分与海带、紫菜接近,可作为保健食品和药物的优质原料。我国古代书籍早有记录马尾藻的药用价值,民间传统也常采用马尾藻作为食物或是中草药治疗。《神农本草经》作为我国中药学著作最早记录了马尾藻可用于治疗甲状腺肿。1578年,李时珍撰写的《本草纲目》陈述了马尾藻能够软坚散结、清热化痰、化水利尿。中国现代药典和中药临床实践表明,羊栖菜和海蒿子能用于治疗瘰疬、睾丸肿痛、水肿、动脉硬化、皮肤病、高血压、急性食管炎、慢性支气管炎等。
现有技术如授权公告号为CN 102228125 B的中国发明专利,公开了海藻活性肽的制备方法,它以食品级海藻酸钠为原料,通过复合酶耦合催化水解,对酶加量、pH值、水解温度和水解时间等关键工艺参数进行控制,保证酶水解效率;水解液进行失活、脱色以及过滤处理后得到海藻多肽提取液;将该提取液分别通过分子量为1000Da和300Da的纳滤膜进行纯化、浓缩处理,得到分子量在300~1000Da范围内的海藻活性肽产品,经灭菌真空干燥后得到海藻活性肽成品。该制备方法原料利用率高、产品纯度高还无需添加脱盐、真空浓缩等工艺,在简化生产工艺的同时也降低了生产成本,但是该制备方法直接对食品级海藻酸钠进行催化水解,不能合理利用藻类成分物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性蛋白肽得率高、加工周期短、能耗低、生产成本低、适用于工业化生产的马尾藻活性多肽的制备方法。
本发明针对上述技术中提到的问题,采取的技术方案为:马尾藻活性多肽的制备方法,包括细胞破碎、蛋白提取、蛋白酶解、脱腥、纯化分离,具体包括以下步骤:
细胞破碎:将马尾藻粉按1:35-40料液比加入浓度为3-5%的氢氧化钠溶液,混合均匀,在温度为45-50℃、功率为240-260W的超声波处理25-30min,调节pH至中性,然后经3~5℃、7000~9000rpm的低温离心机离心18~22min,备用,该步骤结合氢氧化钠与超声波进行细胞破壁,不影响蛋白质的活性,能够大大缩短细胞破壁的时间,提高工作效果,可大批量化破碎藻细胞,适用于工业化生产;
蛋白提取:于3-5℃环境中,离心液加入浓度为90-95%的乙醇,加入量为离心液体积的4-5倍,持续搅拌1-2min,静置4-5h,离心,去上清液,去除沉淀残余表面酒精,收集沉淀,用0.09-0.11mol/L、pH为6-7的PBS溶液溶解沉淀,该步骤中利用乙醇可使蛋白质沉淀的机理,加入大量的乙醇,使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出,该方法蛋白质沉淀效果好,蛋白质中残留的乙醇溶液可在自然状态下挥发出去,不需要进一步处理,节约能耗,降低生产成本;
蛋白酶解:将马尾藻蛋白按1:4-6料液比加水混匀,调节pH至7-8,加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶,酶低比为4-5%和3-4%,在50-55℃下酶解3-5h,灭酶,冷却,离心,上清液即为酶解液,该步骤采用双酶酶解法制备马尾藻活性多肽,利用两种蛋白酶作用的专一性,使原料蛋白质充分水解成活性多肽,提高马尾藻蛋白质的转化率,使蛋白质尽可能的降解为活性多肽,且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点;
脱腥:将酶解液中加入0.5-1wt%的β-环糊精,在20-30℃下搅拌80-100min进行脱腥,经0.2-0.3μm微滤膜,滤掉β-环糊精即可得脱腥的酶解液,β-环糊精(β-CD)是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉产生的一组环状低聚糖,具有“内疏水、外亲水”特殊分子结构,使得CD能作为“宿主”包络不同“客体”化合物,达到脱腥的目的;
纯化分离:将脱腥后的酶解液通过截留分子量为3-5KDa的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质,然后通过截留分子量为200-300Da的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液,冷冻干燥即得马尾藻活性多肽,该活性物质含有一种活性多肽,其氨基酸序列为HSHAYYSVCGSHRGRCYCRCLRCRVLHPGKLCVCVNCSR,该活性多肽与钙、锌、铁等离子结合,由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液,从而避免了这些离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀,促进了它们的吸收,具有促进骨骼和牙齿发育,预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明提供的马尾藻活性多肽的制备方法,活性蛋白肽得率高、加工周期短、能耗低、生产成本低、适用于工业化生产;该制备方法采用的双酶酶解法可利用两种蛋白酶作用的专一性,使原料蛋白质充分水解成活性多肽,提高马尾藻蛋白质的转化率,使蛋白质尽可能的降解为活性多肽;该提取方法得到的活性多肽能与钙、锌、铁等离子结合,由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液,从而避免了这些离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀,促进了它们的吸收,具有促进骨骼和牙齿发育,预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明:
实施例1:
马尾藻活性多肽的制备方法,包括细胞破碎、蛋白提取、蛋白酶解、脱腥、纯化分离,具体包括以下步骤:
1)细胞破碎:将马尾藻粉按1:38料液比加入浓度为3.5%的氢氧化钠溶液,混合均匀,在温度为48℃、功率为240W的超声波处理30min,调节pH至中性,然后经4℃、7800rpm的低温离心机离心20min,备用,该步骤结合氢氧化钠与超声波进行细胞破壁,不影响蛋白质的活性,能够大大缩短细胞破壁的时间,提高工作效果,可大批量化破碎藻细胞,适用于工业化生产;
2)蛋白提取:于4℃环境中,离心液加入浓度为95%的乙醇,加入量为离心液体积的4倍,持续搅拌1min,静置5h,然后经4℃、7800rpm的低温离心机离心20min,去上清液,去除沉淀残余表面酒精,收集沉淀,用0.1mol/L、pH为6.5的PBS溶液溶解沉淀,该步骤中利用乙醇可使蛋白质沉淀的机理,加入大量的乙醇,使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出,该方法蛋白质沉淀效果好,蛋白质中残留的乙醇溶液可在自然状态下挥发出去,不需要进一步处理,节约能耗,降低生产成本;
3)蛋白酶解:将马尾藻蛋白按1:5料液比加水混匀,调节pH至7.5,加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶,酶低比为4%和3.5%,在52℃下酶解4h,95℃的水浴灭酶18min,冷却至室温,然后经4℃、7800rpm的低温离心机离心20min,上清液即为酶解液,该步骤采用双酶酶解法制备马尾藻活性多肽,利用两种蛋白酶作用的专一性,使原料蛋白质充分水解成活性多肽,提高马尾藻蛋白质的转化率,使蛋白质尽可能的降解为活性多肽,且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点;
4)脱腥:将酶解液中加入0.6wt%的β-环糊精,在25℃下搅拌90min进行脱腥,经0.2μm微滤膜,滤掉β-环糊精即可得脱腥的酶解液,β-环糊精(β-CD)是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉产生的一组环状低聚糖,具有“内疏水、外亲水”特殊分子结构,使得CD能作为“宿主”包络不同“客体”化合物,达到脱腥的目的;
5)纯化分离:将脱腥后的酶解液通过截留分子量为4KDa的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质,然后通过截留分子量为300Da的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液,冷冻干燥即得马尾藻活性多肽,该活性物质含有一种活性多肽,其氨基酸序列为HSHAYYSVCGSHRGRCYCRCLRCRVLHPGKLCVCVNCSR,该活性多肽与钙、锌、铁等离子结合,由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液,从而避免了这些离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀,促进了它们的吸收,具有促进骨骼和牙齿发育,预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。
实施例2:
马尾藻活性多肽的制备方法,具体包括以下步骤:
1)将马尾藻粉按1:38料液比加入浓度为5%的氢氧化钠溶液,混合均匀,在温度为48℃、功率为260W的超声波处理30min,调节pH至中性,低温离心机离心,备用,该步骤结合氢氧化钠与超声波进行细胞破壁,不影响蛋白质的活性,能够大大缩短细胞破壁的时间,提高工作效果,可大批量化破碎藻细胞,适用于工业化生产;
2)于5℃环境中,离心液加入浓度为93%的乙醇,加入量为离心液体积的5倍,持续搅拌1min,静置4.5h,离心,去上清液,去除沉淀残余表面酒精,收集沉淀,用0.11mol/L、pH为7的PBS溶液溶解沉淀,该步骤中利用乙醇可使蛋白质沉淀的机理,加入大量的乙醇,使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出,该方法蛋白质沉淀效果好,蛋白质中残留的乙醇溶液可在自然状态下挥发出去,不需要进一步处理,节约能耗,降低生产成本;
3)将马尾藻蛋白按1:6料液比加水混匀,调节pH至7.8,加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶,酶低比为5%和3%,在55℃下酶解4h,灭酶,冷却,离心,上清液即为酶解液,该步骤采用双酶酶解法制备马尾藻活性多肽,利用两种蛋白酶作用的专一性,使原料蛋白质充分水解成活性多肽,提高马尾藻蛋白质的转化率,使蛋白质尽可能的降解为活性多肽,且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点;
4)将酶解液中加入1wt%的β-环糊精,在24℃下搅拌85min进行脱腥,经0.2μm微滤膜,滤掉β-环糊精即可得脱腥的酶解液,β-环糊精(β-CD)是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉产生的一组环状低聚糖,具有“内疏水、外亲水”特殊分子结构,使得CD能作为“宿主”包络不同“客体”化合物,达到脱腥的目的;
5)将脱腥后的酶解液通过截留分子量为5KDa的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质,然后通过截留分子量为300Da的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液,冷冻干燥即得马尾藻活性多肽,该活性物质含有一种活性多肽,其氨基酸序列为HSHAYYSVCGSHRGRCYCRCLRCRVLHPGKLCVCVNCSR,该活性多肽与钙、锌、铁等离子结合,由小肠肠壁细胞吸收后再释放进入血液,从而避免了这些离子在小肠的中性和偏碱性环境中沉淀,促进了它们的吸收,具有促进骨骼和牙齿发育,预防和改善龋齿、佝偻病、骨质疏松等作用。
实施例3:
马尾藻活性多肽的制备方法:将马尾藻粉按1: 40料液比加入浓度为5%的氢氧化钠溶液,混合均匀,在温度为48℃、功率为250W的超声波处理26min,调节pH至中性,然后离心;于5℃环境中,在离心液加入浓度为93%的乙醇,加入量为离心液体积的5倍,持续搅拌2min,静置4h,离心,去上清液,去除沉淀残余表面酒精,用0.09 mol/L、pH为6.7的PBS溶液溶解沉淀;将马尾藻蛋白按1:4料液比加水混匀,调节pH至7.5,加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶,酶低比为4.5%和3.5%,在55℃下酶解4.5h,灭酶,冷却,离心,上清液即为酶解液;将酶解液中加入0.7wt%的β-环糊精,在26℃下搅拌95min进行脱腥,经0.3μm微滤膜;将脱腥后的酶解液通过截留分子量为4KDa的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质,然后通过截留分子量为300Da的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液,冷冻干燥即得马尾藻活性多肽。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 舟山富晟食品科技有限公司
<120> 马尾藻活性多肽的制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
His Ser His Ala Tyr Tyr Ser Val Cys Gly Ser His Arg Gly Arg Cys
1 5 10 15
Tyr Cys Arg Cys Leu Arg Cys Arg Val Leu His Pro Gly Lys Leu Cys
20 25 30
Val Cys Val Asn Cys Ser Arg
35

Claims (10)

1.马尾藻活性多肽的制备方法,包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤,其特征在于:所述纯化分离为:将脱腥后的酶解液经截留分子量为3-5KDa的超滤膜超滤,然后经截留分子量为200-300Da的纳滤膜纳滤,冷冻干燥即得马尾藻活性多肽。
2.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述超滤中马尾藻活性多肽的氨基酸序列为HSHAYYSVCGSHRGRCYCRCLRCRVLHPGKLCVCVNCSR。
3.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述细胞破碎中马尾藻粉与氢氧化钠溶液的料液比为1:35-40,氢氧化钠溶液的浓度为3-5%。
4.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述细胞破碎中超声波处理温度为45-50℃,功率为240-260W,时间为25-30min。
5.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述蛋白提取为:于3-5℃环境中,离心液加入乙醇,持续搅拌1-2min,静置4-5h,离心,去上清液,去除沉淀残余表面酒精,收集沉淀,用PBS溶液溶解沉淀。
6.根据权利要求5所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述蛋白提取中乙醇的浓度为90-95%,加入量为离心液体积的4-5倍。
7.根据权利要求5所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述蛋白提取中PBS溶液的溶度为0.09-0.11 mol/L、pH为6-7。
8.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述蛋白酶解中马尾藻蛋白与水的料液比为1:4-6。
9.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述蛋白酶解中加碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶低比为4-5%和3-4%,酶解pH为7-8,温度为50-55℃,时间为3-5h。
10.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的制备方法,其特征在于:所述脱腥中β-环糊精的添加量为0.5-1wt%,脱腥温度为20-30℃,时间为80-100min。
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