CN108220374A - 大豆活性肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了大豆活性肽的制备方法，其具体步骤为：向大豆分离蛋白中加入蒸馏水，热处理，冷却至室温，调节其pH，依次加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解，灭酶，离心上清液即为酶解液；将酶解液中加入β‑环糊精进行脱腥，滤掉β‑环糊精；将脱腥酶解液用超滤膜进行超滤，滤液冻干；用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，取离心上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，检测收集液在214nm处的吸光值A214，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得大豆活性肽。有益效果为：本发明活性肽的制备方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的活性肽的抗氧化活性高、无腥苦味。

Description

大豆活性肽的制备方法

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，特别涉及大豆活性肽的制备方法。

背景技术

大豆分离蛋白（SoyProteinIsolate，简称为SPI）以低温脱脂豆粕为原料，采用碱溶酸沉工艺除去脱脂豆粕中的非蛋白质组分，从而得到蛋白质含量在90%以上粉末状大豆制品。SPI含有20余种氨基酸，并含有大量多种人体所需要的必需氨基酸，是在理论上可完全替代动物蛋白的植物蛋白，但是，一方面由于SPI提取过程中的碱提酸沉，使得SPI中的蛋白质变性造成SPI溶解度较低、分散性较差，特别是在SPI的等电点区域pH4~5内的低溶解度限制了SPI在酸性饮料中的应用，且SPI的低溶解性制约了SPI的乳化性、凝胶性、发泡性、保水性等功能理化性质，同时对食品工业中添加SPI食品的稳定性、风味有直接的影响，因此提高SPI的溶解性对现代食品的研究开发与产品的深加工有着重要意义；另一方面，机体对SPI的消化与吸收利用率不如牛奶、鸡蛋等动物蛋白含量高的食品，限制了SPI在食品工业中的添加和使用范围。SPI的改性方法包括物理改性、化学改性以及酶法改性，其中酶法改性条件温和简单、操作简单、改性后副产物少、产率高、安全性好，得到的产物为大豆多肽和一些游离氨基酸，不仅是人体极易吸收消化的蛋白，而且更适合食品加工领域中的应用。大豆多肽作为生物活性肽的一种，具有生物活性肽的抗氧化、抗疲劳、抗菌、促进能量代谢等生理活性，同时也有疏水性多肽的苦味。酶法改性使得掩藏在蛋白质内部的疏水性氨基酸侧链释放，从而与味觉细胞产生苦味。大豆多肽的苦味直接影响了食品的风味，在一定程度上阻碍了大豆多肽在食品中的应用，因此，降低、掩盖及祛除大豆多肽苦味受到了广泛的关注，现阶段对大豆肽苦味的研究依旧是令人瞩目的学科领域。

现有技术如授权公告号为CN 103146788 B的中国发明专利，公开了一种大豆肽的酶法制备方法，通过创造性的采用蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为酶原来酶解大豆分离蛋白，水解效率高，并在制备工艺中采用了超滤技术，使得到的酶解产物大豆肽分离的更加彻底，收率高，整个工艺过程条件温和，对环境友好。但是该制备方法得到的大豆肽有苦味，大大限制了其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的活性肽的抗氧化活性高、无腥苦味的大豆活性肽的制备方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

大豆活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、脱腥、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

预处理：按料液比为1:15-25（g/mL）向大豆分离蛋白中加入蒸馏水，混合均匀，然后在95-110℃下热处理5-10min，冷却至室温，即得大豆分离蛋白混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.02-0.03mM牛磺酸和0.01-0.03mM氨基脲，牛磺酸和氨基脲能够协助加热破坏维持蛋白质高级结构的次级键和二硫键，可使球蛋白分子的致密结构展开，同时能解离蛋白的亚基，增加酶和酶切位点的接近机会，提高酶的活性，进而提高活性肽的得率，此外，牛磺酸和氨基脲的存在能够提高蛋白中β-折叠结构提高蛋白对酶的敏感性，最终可使酶解产物水解度大大提高，该步骤通过预处理改变蛋白质的空间结构，蛋白结构变得稀疏，柔化蛋白质刚性结构，使部分弱键断裂，内部非极性基团暴露到分子表面，增大了酶的接触位点，有助酶发挥作用，提高酶水解蛋白质的效率，同时还能去除与目标产物无关的物质，如油脂、小分子水溶性物质、微量元素等，进而提高酶解液的纯度；

酶解：将大豆分离蛋白混合液的pH调节至9.0-10.0，按加酶量为3-4%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在45-55℃的条件下酶解2-4h，再按加酶量为2-3%（w/w）加入风味蛋白酶和风味蛋白酶重量0.03-0.04%的酪氨酸，混合均匀后在45-55℃的条件下酶解3-5h，然后置于沸水中灭酶8-15min，再在4000-6000r/min的条件下离心15-25min，上清液即为酶解液，上述酪氨酸中含有0.4-0.5%的右旋酪氨酸，该酪氨酸能协助酶快速将疏水性氨基酸从蛋白质或肽的末端切除或包裹起来，且使得酶解产物中的亲水性基团暴露出来，进而快速溶于水中，避免酶解产物积累而对酶产生竞争性抑制性，使得酶解过程中能够一直保持较高的酶解速率进行酶解，同时可避免游离的肽段又重新聚合，提高酶解效率，且可避免大豆分离蛋白过分水解而产生苦味，提高活性肽的口感，该步骤中变性后的大豆蛋白主要为不溶性蛋白，在不溶性底物蛋白的酶水解中，酶吸附在不溶性蛋白表面，首先水解稀疏结合的不溶性蛋白上的聚合肽，然后再慢慢水解中心的肽键，酶解彻底，明显提高酶解液中活性肽的含量，且该步骤采用双酶分步水解大豆粕，效果优于单酶水解，提高水解效率和活性肽的抗氧化活性；

脱腥：将酶解液中加入0.5-1wt%的β-环糊精，在20-30℃下搅拌80-100min进行脱腥，经0.2-0.3μm微滤膜，滤掉β-环糊精即可得脱腥酶解液，β-环糊精（β-CD）是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉产生的一组环状低聚糖，具有“内疏水、外亲水”特殊分子结构，使得CD能作为“宿主”包络不同“客体”化合物，达到脱腥的目的；

超滤：将脱腥酶解液用8-12kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用5-8kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在14000-16000r/min的条件下离心8-15min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.4-0.6mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得大豆活性肽，该活性肽的肽链末端带有甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等，具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH能力，抗油脂氧化能力和还原力，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明活性肽的制备方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的活性肽的抗氧化活性高、无腥苦味，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力；2）本发明预处理步骤可使球蛋白分子的致密结构展开，解离蛋白的亚基，增加酶和酶切位点的接近机会，提高酶的活性，提高活性肽的得率，且能提高蛋白中β-折叠结构提高蛋白对酶的敏感性，最终提高酶解产物的水解度；3）本发明采用双酶分步水解大豆粕，效果优于单酶水解，提高水解效率和活性肽的抗氧化活性，且可避免大豆分离蛋白过分水解而产生苦味，提高活性肽的口感；4）本发明制得的活性肽具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH·能力，抗油脂氧化能力和还原力，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

大豆活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、脱腥、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

1）预处理：按料液比为1:25（g/mL）向大豆分离蛋白中加入蒸馏水，混合均匀，然后在95℃下热处理10min，冷却至室温，即得大豆分离蛋白混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.02mM牛磺酸和0.03mM氨基脲，牛磺酸和氨基脲能够协助加热破坏维持蛋白质高级结构的次级键和二硫键，可使球蛋白分子的致密结构展开，同时能解离蛋白的亚基，增加酶和酶切位点的接近机会，提高酶的活性，进而提高活性肽的得率，此外，牛磺酸和氨基脲的存在能够提高蛋白中β-折叠结构提高蛋白对酶的敏感性，最终可使酶解产物水解度大大提高，该步骤通过预处理改变蛋白质的空间结构，蛋白结构变得稀疏，柔化蛋白质刚性结构，使部分弱键断裂，内部非极性基团暴露到分子表面，增大了酶的接触位点，有助酶发挥作用，提高酶水解蛋白质的效率，同时还能去除与目标产物无关的物质，如油脂、小分子水溶性物质、微量元素等，进而提高酶解液的纯度；

2）酶解：将大豆分离蛋白混合液的pH调节至9.0，按加酶量为4%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在45℃的条件下酶解4h，再按加酶量为2%（w/w）加入风味蛋白酶和风味蛋白酶重量0.04%的酪氨酸，混合均匀后在45-5℃的条件下酶解5h，然后置于沸水中灭酶8min，再在6000r/min的条件下离心15min，上清液即为酶解液，上述酪氨酸中含有0.5%的右旋酪氨酸，该酪氨酸能协助酶快速将疏水性氨基酸从蛋白质或肽的末端切除或包裹起来，且使得酶解产物中的亲水性基团暴露出来，进而快速溶于水中，避免酶解产物积累而对酶产生竞争性抑制性，使得酶解过程中能够一直保持较高的酶解速率进行酶解，同时可避免游离的肽段又重新聚合，提高酶解效率，且可避免大豆分离蛋白过分水解而产生苦味，提高活性肽的口感，该步骤中变性后的大豆蛋白主要为不溶性蛋白，在不溶性底物蛋白的酶水解中，酶吸附在不溶性蛋白表面，首先水解稀疏结合的不溶性蛋白上的聚合肽，然后再慢慢水解中心的肽键，酶解彻底，明显提高酶解液中活性肽的含量，且该步骤采用双酶分步水解大豆粕，效果优于单酶水解，提高水解效率和活性肽的抗氧化活性；

3）脱腥：将酶解液中加入0.5wt%的β-环糊精，在30℃下搅拌80min进行脱腥，经0.3μm微滤膜，滤掉β-环糊精即可得脱腥酶解液，β-环糊精（β-CD）是环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉产生的一组环状低聚糖，具有“内疏水、外亲水”特殊分子结构，使得CD能作为“宿主”包络不同“客体”化合物，达到脱腥的目的；

4）超滤：将脱腥酶解液用8kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用8kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

5）分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在14000r/min的条件下离心15min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.4mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得大豆活性肽，该活性肽的肽链末端带有甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等，具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH能力，抗油脂氧化能力和还原力，且具有一定的增强机体免疫功能的作用，可应用于食品、医药、保健品领域。

实施例2：

大豆活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、脱腥、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

1）预处理：按料液比为1:15（g/mL）向大豆分离蛋白中加入蒸馏水，混合均匀，然后在110℃下热处理5min，冷却至室温，即得大豆分离蛋白混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.03mM牛磺酸和0.01mM氨基脲；

2）酶解：将大豆分离蛋白混合液的pH调节至10.0，按加酶量为3%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在55℃的条件下酶解2h，再按加酶量为3%（w/w）加入风味蛋白酶和风味蛋白酶重量0.03%的酪氨酸，混合均匀后在55℃的条件下酶解3h，然后置于沸水中灭酶15min，再在4000r/min的条件下离心25min，上清液即为酶解液，上述酪氨酸中含有0.4%的右旋酪氨酸；

3）脱腥：将酶解液中加入1wt%的β-环糊精，在20℃下搅拌100min进行脱腥，经0.2μm微滤膜，滤掉β-环糊精即可得脱腥酶解液；

4）超滤：将脱腥酶解液用12kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用5kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

5）分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在16000r/min的条件下离心8min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.6mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得大豆活性肽。

实施例3：

大豆活性肽的制备方法，包括预处理、酶解、脱腥、超滤、分离纯化，其具体步骤为：

1）预处理：按料液比为1:20（g/mL）向大豆粕粉中加入蒸馏水，混合均匀，然后在100℃下热处理8min，冷却至室温，即得大豆粕混合液，备用，上述蒸馏水中含有0.025mM牛磺酸和0.02mM氨基脲；

2）酶解：将大豆分离蛋白混合液的pH调节至9.5，按加酶量为3.5%（w/w）加入碱性蛋白酶，混合均匀后在50℃的条件下酶解3h，再按加酶量为2.5%（w/w）加入风味蛋白酶和风味蛋白酶重量0.035%的酪氨酸，混合均匀后在50℃的条件下酶解4h，然后置于沸水中灭酶12min，再在5000r/min的条件下离心20min，上清液即为酶解液，上述酪氨酸中含有0.45%的右旋酪氨酸；

3）脱腥：将酶解液中加入0.8wt%的β-环糊精，在25℃下搅拌90min进行脱腥，经0.25μm微滤膜，滤掉β-环糊精即可得脱腥酶解液；

4）超滤：将脱腥酶解液用10kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液继续用6kDa截断分子量的超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

5）分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，在15000r/min的条件下离心12min，取上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，流速为0.5mL/min，自动部分收集器定时收集4ml/管，检测每管收集液在214nm处的吸光值A214，测定各管收集液的抗氧化活力，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得大豆活性肽。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.大豆活性肽的制备方法，其特征在于：所述制备方法的具体步骤为：

1）预处理：向大豆分离蛋白中加入蒸馏水，热处理，冷却至室温，即得大豆分离蛋白混合液，备用；

2）酶解：将大豆分离蛋白混合液的pH调节，加入碱性蛋白酶进行酶解，再加入风味蛋白酶和酪氨酸进行酶解，灭酶，离心，上清液即为酶解液；

3）脱腥：将酶解液中加入β-环糊精进行脱腥，滤掉β-环糊精即得脱腥酶解液；

4）超滤：将脱腥酶解液用超滤膜进行超滤，滤液冻干，备用；

5）分离纯化：用双蒸水平衡层析柱，将经过超滤处理的冷冻样品用双蒸水溶解，离心上清液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，收集液在214nm处的吸光值A214，收集抗氧化活性较高的组分，冷冻干燥即得大豆活性肽。

2.根据权利要求1所述的大豆活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1中蒸馏水中含有0.02-0.03mM牛磺酸和0.01-0.03mM氨基脲。

3.根据权利要求1所述的大豆活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2中碱性蛋白酶的加酶量为3-4%（w/w），酶解温度为45-55℃、时间为2-4h。

4.根据权利要求1所述的大豆活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2中风味蛋白酶的加酶量为2-3%（w/w），酶解温度为45-55℃、时间为3-5h。

5.根据权利要求1所述的大豆活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2中酪氨酸的添加量为风味蛋白酶重量的0.03-0.04%。

6.根据权利要求1所述的大豆活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2中酪氨酸中含有0.4-0.5%的右旋酪氨酸。

7.根据权利要求1所述的大豆活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3中β-环糊精的添加量为0.5-1wt%，脱腥温度为20-30℃、时间为80-100min。

8.根据权利要求1所述的大豆活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤5中洗脱液的流速为0.4-0.6mL/min。