CN114717285A - 一种酶解法提取大豆抗氧化肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法提取大豆抗氧化肽的方法，主要以大豆分离蛋白为原料，用碱性蛋白酶为蛋白酶，在5％(w/v)的蛋白浓度、原料质量12％(w/w)的酶浓度、适宜的温度及pH条件下，进行水解反应，得到酶解液离心取上清液，所得肽溶液用超滤离心管进行分离纯化，收集<3KD大豆肽进行冷冻干燥，制得大豆肽粉。本发明获得的大豆抗氧化肽DPPH清除率及ABTS清除率分别达到94％、80％，且经过稳定性试验发现其在酸性条件下的抗氧化活性稳定。本发明在食品领域有广泛应用前景。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种酶解法提取大豆抗氧化肽的方法。
背景技术：
研究显示，当机体氧自由基过量时会对机体造成一系列的氧化损伤，尤其是当机体处于衰老、生病或疲劳状态时，自由基的平衡状态就可能被破坏，对机体造成一系列氧化性损伤，严重时甚至可能会引发或加重细胞、组织乃至全身机体的生理紊乱与病理变化，导致机体产生各种疾病如糖尿病、阿尔茨海默病、心脏病和癌症等。
合成的抗氧化剂(特丁基对苯二酚、没食子酸丙酯、羟基茴香醚丁酯)能有效控制食品营养物质的氧化。此外，饮食中摄入抗氧化剂可以降低患有与氧化应激有关的慢性疾病的风险。然而，化学合成的抗氧化剂成本高且具有潜在毒性。随着消费者对高营养、高功能蛋白质需求的增加，研究的重点从传统原料蛋白转向植物蛋白。天然抗氧化肽的主要来源是植物蛋白，具有环保、无毒、可持续等优点。
大豆分离蛋白(SPI)来源于豆粕，含超过90％蛋白质且有大量必需氨基酸。最近研究表明，对SPI进行发酵和酶解，不但提高了其溶解性，降低了其过敏性，还提高了其营养价值和功能特性，水解得到的大豆生物活性肽有多种功能，可以应用于保健食品和化妆品或者医疗中，能取得很好的经济收益。
体外酶解在商业上应用的非常广泛，是生产大豆肽的常用方法，可以更好
发明内容：
本发明的目的在于提供一种酶解法提取大豆抗氧化肽的方法，本方法通过碱性蛋白酶酶解SPI，具有高水解度，其DPPH和ABTS清除率分别高达94％、80％。具有抗氧化功效，有较高的经济价值。
本发明是通过如下技术手段来实现的：
①取一定量的SPI与纯净水混合混匀，使得大豆分离蛋白的浓度为5％，在90℃水浴锅中进行预处理10min，然后迅速降温至酶解反应温度，用1.0mol·L-1NaOH调pH至酶的最适值后加酶，控制pH、温度和水解时间进行水解，得到酶解液。
②将酶解液放入沸水浴灭酶10min，添加6.0mol·L-1 HCl调pH值至大豆分离蛋白等电点处，即4.0-4.5之间，未水解的蛋白质会凝聚，经冷却、6000r·min-1离心10min，离心分离后未水解的蛋白质和其它杂质沉在底部，取上清液放在-20℃下备用。
③用超滤离心管对收集的酶解液进行分离纯化，得到3-10KD多肽液，<3KD多肽液与未超滤的酶解液，放入-20℃冷冻，待全部液体凝固后放入冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，得到大豆抗氧化肽。
本发明的方法有以下的优点：
1.本方法采用酶解制备大豆抗氧化肽，反应过程温和可控，没有副产物生成，对于环境无污染同时对人体无害。
2.本方法工艺简单，在纯水体系中进行反应，使用设备少，成本低，适和在工业化大规模条件下生产，原料利用率高，排放少，使用的是天然化合物，符合国家绿色、环保、低碳、可持续、低耗能的发展理念。
3、本方法获得的大豆抗氧化肽不仅具有优良的抗氧化活性，还具有营养功效，在产品中可以当营养成分及功效成分，在食品领域有重要作用。
附图说明：
为了使本发明的目的和特点更加清楚，下面将结合附图对本发明进一步的详细描述。图1从左到右依次是温度、pH模拟胃肠道消化对<3KD大豆肽稳定性影响。
具体实施方式：
实例1
取一定量的SPI与纯净水混合混匀，使得大豆分离蛋白的浓度为5.273％，在90℃水浴锅中进行预处理10min，然后迅速降温至酶解反应温度51℃，用1.0mol·L-1NaOH调pH至12后添加12.343％的碱性蛋白酶，控制pH、温度和水解时间为3h进行水解，得到酶解液。将酶解液放入沸水浴灭酶10min，添加6.0mol·L-1 HCl调pH值至大豆分离蛋白等电点处，即4.0-4.5之间，未水解的蛋白质会凝聚，经冷却、6000r·min-1离心10min，离心分离后未水解的蛋白质和其它杂质沉在底部，取上清液放在-20℃下进行冷冻干燥，最终获得大豆粗肽粉。
实例2
取一定量的SPI与纯净水混合混匀，使得大豆分离蛋白的浓度为5.273％，在90℃水浴锅中进行预处理10min，然后迅速降温至酶解反应温度51℃，用1.0mol·L-1NaOH调pH至12后添加12.343％的碱性蛋白酶，控制pH、温度和水解时间为3h进行水解，得到酶解液。将酶解液放入沸水浴灭酶10min，添加6.0mol·L-1 HCl调pH值至大豆分离蛋白等电点处，即4.0～4.5之间，未水解的蛋白质会凝聚，经冷却、6000r·min-1离心10min，离心分离后未水解的蛋白质和其它杂质沉在底部，取上清液用3KD与10KD超滤离心管进行分离纯化，得到3-10KD的大豆肽进行冷冻干燥，最终获得3-10KD大豆肽粉。
实例3
取一定量的SPI与纯净水混合混匀，使得大豆分离蛋白的浓度为5.273％，在90℃水浴锅中进行预处理10min，然后迅速降温至酶解反应温度51℃，用1.0mol·L-1NaOH调pH至12后添加12.343％的碱性蛋白酶，控制pH、温度和水解时间为3h进行水解，得到酶解液。将酶解液放入沸水浴灭酶10min，添加6.0mol·L-1 HCl调pH值至大豆分离蛋白等电点处，即4.0-4.5之间，未水解的蛋白质会凝聚，经冷却、6000r·min-1离心10min，离心分离后未水解的蛋白质和其它杂质沉在底部，取上清液用3KD超滤离心管进行分离纯化，得到<3KD的大豆肽进行冷冻干燥，最终获得<3KD大豆肽粉。
试验例
1、抗氧化活性测定
通过体外抗氧化实验，测定本发明大豆抗氧化肽对DPPH自由基和ABTS自由基的清除效果，从而验证其抗氧化能力。
试验材料：实施例1-3。
实验方法：①DPPH清除率测定
使用无水乙醇配制0.2mM DPPH溶液，避光保存。另外配制1mg/mL的样品。取2mL样品与2mL DPPH混合后摇匀，避光放置30min后在517nm处测定吸光值Ai。以2mL无水乙醇代替DPPH为Aj，A0为2mL无水乙醇代替样品，每个样品测三次。公式为：
DPPH自由基的清除率/％＝[1-((Ai-Aj))/A0]×100％
式中：A0－对照组吸光度；Ai－样品组吸光度；Aj－空白组吸光度。
②对ABTS自由基清除率的测定
取96mg ABTS，加超纯水25mL制备ABTS储备液(7.4mmol/L)，再取7mg K2S2O8加超纯水10mL，制备K2S2O8储备液(2.6mmol/L)。将ABTS与K2S2O8储备液混匀，避光12h，得到ABTS工作液。
取一定体积工作液，用PBS(0.2M pH 6.6)稀释，稀释后取2mL稀释液加0.2mLH20，使其在734nm处吸光值为0.7±0.02。样品配制为1mg/mL。
取上述稀释后的ABTS 2mL与0.2mL样品反应，避光反应6min，在734nm波长处测吸光度，做3次平行。
ABTS自由基清除率(％)＝(1-(A样-A对照)/A空白)100％
式中：A样：0.2mL样品+2mL ABTS；A空白：0.2mL H20+2mL ABTS；A对照：0.2mL样+2mL PBS
实验结果如表1所示
从表1中可以看出，经DPPH自由基、ABTS自由基清除能力，实例3中<3KD大豆肽的抗氧化活性明显高于实施例1中酶解液与实施例2中3-10KD大豆肽。表明本发明大豆抗氧化肽具有较好的抗氧化效果。
2、稳定性试验
不同温度、pH，体外模拟胃肠道消化对实施例3提取获得的<3KD的大豆肽进行处理。
实验结果如图1可知，实施例3获得的<3KD大豆肽在不同环境中抗氧化活性有所改变。结果表明，<3KD大豆肽在不同温度下具有稳定的抗氧化活性。在模拟人体胃肠道消化过程中，胃蛋白酶和胰酶进一步对大豆肽进行酶解，使得大豆肽抗氧化活性下降，但仍然具有较高抗氧化活性，说明大豆肽具有一定的耐肠胃消化能力，但环境的酸碱度对大豆肽抗氧化活性影响较大，在pH<6的环境中能保持稳定的抗氧化活性。
以上列举具体实施对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种酶解法提取大豆抗氧化肽的方法，其特征在于，所述酶法提取的大豆抗氧化肽主要是通过碱性蛋白酶对大豆分离蛋白(SPI)进行酶解，包括如下步骤：
①取一定量的SPI与纯净水混合混匀，使得SPI的浓度为5％，在90℃水浴锅中进行预处理10min，然后迅速降温至酶解反应温度，用1.0mol·L-1NaOH调pH至酶的最适值后加酶，控制pH、温度和水解时间进行水解，得到酶解液。
②将酶解液放入沸水浴灭酶10min，添加6.0mol·L-1HCl调pH值至大豆分离蛋白等电点处，即4.0～4.5之间，未水解的蛋白质会凝聚，经冷却、6000r·min-1离心10min，离心分离后未水解的蛋白质和其它杂质沉在底部，取上清液放在-20℃下备用。
③用超滤离心管对收集的酶解液进行分离纯化，得到3-10KD多肽液，<3KD多肽液与未超滤的酶解液，放入-20℃冷冻，待全部液体凝固后放入冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，得到大豆抗氧化肽。
2.根据权利要求1所述的酶解法提取大豆抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤①所述SPI的浓度为3％-7％。
3.根据权利要求1所述的酶解法提取大豆抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤①所述酶解过程溶液pH为7-12。
4.根据权利要求1所述的酶解法提取大豆抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤①所述蛋白酶为碱性蛋白酶，酶的添加量为酶与底物比([E]/[S]/％)为6％-12％。
5.根据权利要求1所述的酶解法提取大豆抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤①所述温度为45℃-65℃。
6.根据权利要求1所述的酶解法提取大豆抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤①所述酶解时间为1-6h。
7.根据权利要求1所述的酶解法提取大豆抗氧化肽的方法，其特征在于，步骤③所述超滤离心管为10KD和3KD。
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