CN106148465B - 一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽及其制备方法和应用，所述制备方法具体包括如下步骤：S1：将鲎血浆于70～100℃条件下恒温水浴2～4小时，然后将鲎血浆抽滤并用水洗涤，备用；S2：使用蛋白酶水解步骤S1所得鲎血浆，然后将鲎血浆水解液离心分离得上清液备用；S3：将步骤S2所得上清液过SephadexG‑50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽。本发明以鲎血浆为原料，水解得到的鲎血浆蛋白水解肽具有较高的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力，并且鲎血浆蛋白水解肽无毒，可将其制备成美容养颜、延缓衰老的保健品；本发明实现了鲎血浆的再利用，提升了鲎血浆蛋白的使用价值。

Description

一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽及其制备方法和应用。
背景技术
人的身体在代谢正常的情况下自由基处在不断产生和不断消除的动态平衡中，但是由于外界环境的影响，如太阳光的辐射，吸入污染的气体，吸烟等情况下，这种动态平衡极易被破坏，当平衡破坏后，过多的自由基积累不仅会造成身体正常组织的损害，还有可能引起一些严重的疾病如肿瘤、心脏病和老年痴呆等。为了防止或减轻自由基造成的损害，需要合适的自由基清除剂来去除身体里多余的自由基，保障人们身体健康。
现有的自由基清除剂存在半衰期短、给药不方便、易引起过敏反应的缺点，有些自由基清除剂只对部分自由基的清除有效，并且现有的自由基清除剂还存在毒性大、价格昂贵等弊端。因此，寻找高效、稳定、低毒、实用的自由基清除剂一直是国内外学者孜孜以求的目标。
鲎血资源珍贵，蛋白含量高，含有人体所必须的8种必须氨基酸以及多种微量元素，存在着多种具有抗菌抗内毒素的小分子活性多肽。我国对鲎血的利用研究，主要是提取鲎血中的变形细胞，然后从变形细胞中分离具有抗菌抗内毒素活性的小分子活性肽并生产鲎试剂，国内外正着手以鲎血内源性多肽为先导化合物开发新的抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物，但是鲎血分离变形细胞后剩余的鲎血浆由于铜含量超出人类食用标准，鲎血浆一般作为废物被丢弃，这就造成了极大的浪费。截至目前，对鲎血浆蛋白水解肽的直接研究国内尚未见报道，随着人们对肽类食品和药品的需要，特别是一些病人和特殊人群，如患消化道疾病、低过敏性患者、老年人、运动员等，研究鲎血水解肽及其制备方法的意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽的制备方法，该方法制备得到的鲎血浆蛋白水解肽具有较高的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力，并实现了鲎血浆的充分利用。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的鲎血浆蛋白水解肽。
本发明的另一目的在于提供上述鲎血浆蛋白水解肽的应用。
一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：
S1：将鲎血浆于70～100℃条件下恒温水浴2～4小时，然后将鲎血浆抽滤并用水洗涤，备用；
S2：使用蛋白酶水解步骤S1所得鲎血浆，然后将鲎血浆水解液离心分离得上清液备用；
S3：将步骤S2所得上清液过SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽。
鲎血浆蛋白是铜蓝蛋白，其中铜含量高达144.21ug/mL，依据国家标准GB5009.13中规定水产类食品含铜量要小于等于50mg/kg，所以鲎血浆是不能直接食用的，只有经过降铜后鲎血浆才能被人食用。鲎血浆蛋白经过热处理后会变性，易于被蛋白酶水解成肽。发明人在对鲎血浆蛋白进行水解处理时发现，一定温度下的水浴一方面能够使鲎血浆蛋白变性成沉淀析出，另一方面还可以脱去鲎血浆蛋白中的铜离子，从而降低鲎血浆蛋白的铜含量。S1步骤中水浴温度的高低会直接影响到鲎血浆蛋白的水解率和所得水解肽中的铜含量。发明人经过众多尝试之后发现当步骤S1中恒温水浴的温度为70～100℃时，鲎血浆蛋白具有较高的水解率和较低的铜含量。
优选地，步骤S1中恒温水浴的温度为90℃。
优选地，步骤S1中恒温水浴的时间为3小时。
优选地，步骤S2中的蛋白酶为胰蛋白酶、胰酶或木瓜蛋白酶中的一种或几种；更为优选地，步骤S2中的蛋白酶为胰蛋白酶。
优选地，所述蛋白酶的浓度为2～4%，更为优选地，所述蛋白酶的浓度为3%。
优选地，步骤S2中，水解体系的pH为7.0～9.0；更为优选地，所述pH为8.0。
上述制备方法制备得到的具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽，该鲎血浆蛋白水解肽具有较高的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力，对DPPH自由基的清除的IC50值为6.2ug/mL，总抗氧化能力FRAP值为81.5umol/L。
上述具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽在制备具有抗氧化活性制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供的方法制备得到的鲎血浆蛋白水解肽具有较高的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力，并且鲎血浆蛋白水解肽对自由基的清除率随样品浓度增加而升高，当浓度增加到一定条件时，自由基清除率的升高水平趋于平缓；鲎血浆蛋白水解肽对DPPH自由基的清除的IC50值为6.2ug/mL，总抗氧化能力FRAP值为81.5umol/L。
（2）本发明提供的方法实现了鲎血浆的充分利用，制备得到的抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽无毒，可制备成美容养颜、延缓衰老的保健品以提升鲎血浆蛋白的使用价值，并且还可以提高人们的生命质量。
（3）本发明提供的鲎血浆蛋白水解肽的制备方法工艺简单，易于大规模生产，具有较大的推广应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，所有本发明提供的实施例中，提供的原材料均可从市面采购获得。
实施例1
（1）将鲎血在90℃水浴锅里热处理3小时，抽滤，用蒸馏水冲洗变性蛋白；
（2）用胰蛋白酶酶法水解步骤（1）中的变性蛋白获得水解肽，离心、取上清液备用；
（3）上清液过SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽，冷冻干燥得到水解肽粉。
实施例2
（1）将鲎血在100℃水浴锅里热处理3小时，抽滤，用蒸馏水冲洗变性蛋白；
（2）用胰酶酶法水解步骤（1）中的变性蛋白获得水解肽，离心、取上清液备用；
（3）上清液过SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽，冷冻干燥得到水解肽粉。
实施例3
（1）将鲎血在90℃水浴锅里热处理4小时，抽滤，用蒸馏水冲洗变性蛋白；
（2）用胰酶与木瓜蛋白酶的混合酶水解步骤（1）中的变性蛋白获得水解肽，离心、取上清液备用；
（3）上清液过SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽，冷冻干燥得到水解肽粉。
对照例1
（1）鲎血在60℃水浴锅里热处理2小时，抽滤，用蒸馏水冲洗变性蛋白；
（2）用胰蛋白酶酶法水解步骤（1）中的变性蛋白获得水解肽，离心、取上清液备用；
（3）上清液过SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽，冷冻干燥得到水解肽粉。
对照例2
（1）将鲎血在110℃水浴锅里热处理3小时，抽滤，用蒸馏水冲洗变性蛋白三次；
（2）用胰蛋白酶酶法水解步骤（1）中的变性蛋白获得水解肽，离心、取上清液备用；
（3）上清液过SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽，冷冻干燥得到水解肽粉。
试验例1 鲎血浆蛋白水解肽的抗氧化活性实验
（1）DPPH自由基清除能力的测定
DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波长517nm处有强烈吸收；在有自由基清除剂存在时，DPPH的孤对电子被配对，从而使其褪色，褪色程度与其接受电子呈定量关系，因而可用比色法进行定量分析抗氧化剂对DPPH自由基清除作用大小。清除50% DPPH自由基时样品浓度称为抗氧化剂的IC50值，IC50值越小抗氧化性越好。DPPH自由基清除能力的测定的步骤具体如下：
分别准确量取2.0 mL水解肽溶液，加入10 mL比色管中，各加入浓度为0.2μmol/LDPPH溶液2.0 mL，室温下暗处反应30min后，在517nm处测定其吸光度，根据公式[(A对照-A样品)/A对照]×100%计算清除率，其中A对照为未加样品的DPPH自由基吸光度，即DPPH自由基溶液＋溶剂；A样品为加入样品反应平衡后的吸光度，即DPPH自由基溶液+样品溶液。
（2）总抗氧化能力测定
FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Fe3+-TPTZ产生蓝紫色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定吸光度，即可作为样品中的总抗氧化能力的指标。总抗氧化能力用FRAP值即Fe2+当量数表示，FRAP值越大，抗氧化活性越强。
采用FRAP法，用移液枪取5个梯度的水解肽溶液0.1 mL于24孔板中，梯度浓度分别为1mg/ mL、0.5mg/ mL、0.25mg/ mL、0.125mg/ mL、0.0625mg/ mL，加入0.9 mL预热至37℃的三价铁还原抗氧化能力工作液（FRAP工作液），充分混匀后防放置10min，在波长593nm处测量吸光度。以无水乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白对照。根据反应后测定的吸光度计算相应的FeSO4浓度（μmol/L），定义为FRAP值。
（3）血蛋白水解率
取鲎血2.5mL，加入10%TCA2.5mL，混匀静置10min，4000转/分离心15min，上清液加3mL双缩脲试剂，混匀静置10min，2000转/分离心10min。上清液在540nm测OD1值。测定的OD1值带入标准曲线的回归方程求得含量N1。
取鲎血2.5mL，加3.0mL双缩脲试剂，混匀静置10min，2000转/分离心10min。上清液在540nm测OD0值。由标准蛋白回归方程换算成含量N0。
取水解液2.5mL，加入10%TCA2.5mL，混匀静置10min，4000转/分离心15min，上清液加3.0mL双缩脲试剂，混匀静置10min。2000转/分离心10min。上清液在540nm测OD2值。由标准蛋白回归方程换算成蛋白质含量N2。
水解率=(N2-N1)/(N0-N1)
（4）Cu含量
按国家标准GB/T5009.13-1996：食品中的铜的测定方法测定。
称取已前处理过的鲎样品1.000mg，平行3份，与于钢衬消解内罐，加入 5mL 硝酸，1ml过氧化氢，微热样品至溶解，静置过夜，次日再加入 5 mL硝酸和1 ml过氧化氢，把钢衬消解内罐放入不锈钢外罐中，旋紧罐盖，置于 130 ℃烘箱，恒温消解2 h。自然冷却到室温，取出内罐，将消化液转移到 50 ml容量瓶，用水定容到刻度。用Z-5000原子吸收分光光度计测定Cu含量，仪器的工作条件：波长 327nm, 灯电流 2.0mA，空气流量6.5L/min,乙炔流量1.0L/min。
实施例1～3制备得到的鲎血浆蛋白水解肽及对照例1～2的抗氧化性能如下表1。
表1 实施例1～3及对照例1～2制备得到的鲎血浆蛋白水解肽的抗氧化性能
Figure DEST_PATH_IMAGE002
由上表1可知，实施例1～3用不同的方法水解鲎血蛋白，得到的水解肽都有一定的抗氧化性；综合抗氧化性能最好的是实施例1。各实施例中，血蛋白水解率依次为：实施例1〉实施例2〉实施例3，这表明酶解最为完全的是实施例1，胰蛋白酶的水解效率最高。对照例1和对照例2尽管水解率和抗氧化都不错，但实验测得其Cu含量超过食品标准，得到的水解肽失去使用价值。

Claims (3)

1.一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
S1：将鲎血浆于90℃条件下恒温水浴3小时，然后将鲎血浆抽滤并用水洗涤，备用；
S2：使用蛋白酶水解步骤S1所得鲎血浆，然后将鲎血浆水解液离心分离得上清液备用，其中水解体系的pH为7～9；
其中，蛋白酶为胰蛋白酶，且浓度为3％；
S3：将步骤S2所得上清液过SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽。
2.权利要求1所述制备方法制备得到的具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽。
3.权利要求2所述具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽在制备具有抗氧化活性制剂中的应用。
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