JP2010248134A - ペプチド組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】 大豆蛋白質のプロテアーゼで処理による処理液（分解液）中の、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した、溶液におけるエタノール溶解分の成分を明らかにし、さらには、その有益性を明らかにすることを目的とする。
【解決手段】 大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されたペプチド組成物が、アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性と、ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有するもので、それらは、薬効性組成物とし、健康食品や医薬の原料として利用され、大豆の用途を大とするものである。
【選択図】 図１

Description

この発明は、大豆蛋白質から調製された、特定の機能を有するペプチド組成物に関するものであって、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）によるペプチド調製技術に属するものである。

大豆は、植物性蛋白質の供給源として広く知られ、かつ広汎に利用されている。
この大豆蛋白質をより有効に利用するために、蛋白質を分離し、さらには、酵素によって分解し、有用なアミノ酸やペプチドを得ることが幅広く行われてきている。

例えば、特開２００５−１３９１５８号公報（特許文献１）においては、大豆醗酵物を蛋白質分解酵素で処理し、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する、生体内での血圧降下作用を有し、毒性が極めて低い、新規なヘキサペプチドが得られたことが報告されている。

また、特開２００６−２２３１３８号公報（特許文献２）においては、全脂大豆の水溶液を、蛋白質分解酵素を用いて加水分解した後、セルロース系ろ過助剤を添加して不水溶性物質を分離除去することによって、苦みや大豆臭がなく、低分子のペプチドが多い組成物で、消化吸収能力の衰えた老人や、病人の栄養補給用飲料や、激しい運動後に適用されるスポーツドリンクに効果的に使用される組成物が得られることが報告されている。

また、特開２００６−２６５１３９号公報（特許文献３）においては、大豆中の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白質を基質にして、蛋白質分解酵素を用いて分解することによって得られた特定のトリペプチドが、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下剤としての医薬や、血圧を降下させ、高血圧の予防や改善に適した特定保健用食品に用いられる、との報告がなされている。

さらに、国際公開番号ＷＯ２００５／００１１０６号公報（特許文献４）では、このような大豆蛋白質の開発状況下において、大豆蛋白質の構造に示唆されて行った試験により、大豆蛋白質からグルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドが得られることを見出し、それらの取得方法についての報告がなされている。

特開２００５−１３９１５８号公報 特開２００６−２２３１３８号公報 特開２００６−２６５１３９号公報 国際公開番号ＷＯ２００５／００１１０６号公報

前記特許文献４において開示された、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドの取得方法は、大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を沈殿として除去し、残りの溶液（分解液）にエタノールを添加して沈殿画分を得たのち、前記沈殿画分を乾燥するというものである。

発明者等は、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドから形成されている、前記エタノール不溶解分の取得の際に、検討の対象から外されている、エタノール溶解分に、低分子のペプチドなどで有益な成分が存在するのでないかと推定し、エタノール溶解分の成分を明らかにし、さらには、その有益性を明らかにすることを目的として研究を行った。

その結果、本願の発明者等は、前記エタノール溶解分が特定の生理活性を有することを見出した。
さらには、前記生理活性は、疎水性アミノ酸の豊富な、未分解の高分子画分を除去した大豆蛋白質のプロテアーゼ処理液、特に、その分画物であるペプチド組成物により奏されることを見出して、この発明を完成させたのである。

すなわち、この発明の請求項１に記載のペプチド組成物は、
大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製された生成物であって、
アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性と、ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有すること
を特徴とするものである。

また、この発明の請求項２に記載の発明は、
請求項１に記載のペプチド組成物において、
前記生成物は、
抗酸化活性およびラジカル捕捉活性をも有すること
を特徴とするものである。

また、この発明の請求項３に記載の発明は、
請求項１又は２に記載のペプチド組成物において、
前記プロテアーゼ処理は、
アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで行う加水分解処理であること
を特徴とするものである。

また、この発明の請求項４に記載の発明は、
請求項１又は２に記載のペプチド組成物において、
前記未分解の高分子画分の沈殿除去は、
酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加により行われること
を特徴とするものである。

また、この発明の請求項５に記載の発明は、
請求項１又は２に記載のペプチド組成物において、
前記生成物は、
その調製において、１％酢酸水溶液に不溶な物質が除去されていること
を特徴とするものである。

また、この発明の請求項６に記載の発明は、
請求項１又は２に記載のペプチド組成物において、
前記生成物は、
その調製において、ゲルろ過による分画により取得されていること
を特徴とするものである。

また、この発明の請求項７に記載の発明は、
請求項１又は２に記載のペプチド組成物において、
前記生成物は、
その調製において、高速液体クロマトグラフィーによる分画により取得されていること
を特徴とするものである。

この発明にかかるペプチド組成物は、酸化ストレスによる赤血球変形能の低下の防止、高血圧の予防や改善に適したもので、血圧降下剤としての医薬や、血圧を降下させ、高血圧の予防や改善に適した特定保健用食品や健康食品の素材として有効なものである。
また、医薬の原料としても、有効に利用することができるものである。

さらに、この発明のペプチド組成物は、粉末状態でも、水又はエタノール溶液としても使用することができる。
したがって、前記のような効果を発現させるために、健康食品や医薬として利用する際に、効率的に、また効果的に活用することを可能とするものである。

さらにまた、この発明のペプチド組成物によれば、大豆を、さらに有効に活用することができるという優れた効果を奏するのである。

実施例１で得られたペプチド組成物の、ゲルろ過パターン図である。 実施例１で得られたペプチド組成物の、ゲルろ過により分画した画分の紫外吸収スペクトルの図である。 実施例１で得られたペプチド組成物の、画分の抗酸化活性の測定結果を示す図である。 実施例１で得られたペプチド組成物の、画分のラジカル捕捉活性の測定結果を示す図である。 実施例１で得られたペプチド組成物の、画分のＡＣＥ阻害活性の測定結果を示す図である。 実施例１で得られたペプチド組成物の、画分の赤血球変形能低下抑制作用の測定結果を示す図である。 実施例１で得られたペプチド組成物の、画分６〜１３のＨＰＬＣのチャート図である。

この発明にかかるペプチド組成物は、大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去して得られる、水溶液から調製されるものである。
前記プロテアーゼ処理は、アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで加水分解することが好ましい。
また、未分解高分子画分の除去は、水溶液のアルカリ状態を維持しながら行うことが好ましい。

前記水溶液は、前記の特許文献４で報告したように、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドを取得するために、エタノールを添加して、それらを不溶解物として取得した後の水溶液であってもよい。
この手段は、グルタミンとグルタミン酸の豊富な高分子量ポリペプチドを、事前に分離取得できるため、好ましい方法である。

この発明に用いる大豆蛋白原料としては、分離大豆蛋白質や脱脂豆乳が好ましいが、脱脂大豆でも用いることができる。
しかしながら、脱脂大豆の場合は、蛋白質以外の成分を多量に含むため、プロテアーゼによる分解度が悪い。
また、プロテアーゼによる酵素処理は、大豆蛋白原料に水を加えて攪拌し、ｐＨをアルカリ領域に調節したのち、プロテアーゼを加えることにより行う。
その際、蛋白質は、完全に溶解させる必要はなく（分解中に溶解する）、加える水の量は、蛋白原料の５〜２０倍、好ましくは９〜１０倍がよい。

この発明に用いるプロテアーゼとしては、アルカリ側に最適ｐＨを持ち、高温で安定であって、殆どのペプチド結合を分解できる、基質特異性の低いプロテアーゼが好ましい。
具体的には、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）由来の、アルカリプロテアーゼであるビオブラーゼなどを用いることができる。

大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理する際には、プロテアーゼ処理を、アルカリ域を保持しながら、基質特異性の低いプロテアーゼで加水分解することが好ましい。
通常、大豆蛋白をアルカリ域で酵素分解すると、加水分解が進むに連れて、ｐＨが低下し微酸性域に移行してしまう。

しかしながら、この発明においては、アルカリ域を保ちながら酵素分解することによって、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分の除去が容易に行なわれ、目的のペプチド組成物を得ることができる。
なお、微酸性域に移行したままで酵素分解を続けると、アミノ酸にまで加水分解され、この発明の目的を達成することが困難となる。

かかるアルカリ域としては、ｐＨ７．５〜１０、好ましくはｐＨ８〜９．５、より好ましくはｐＨ８．５〜９．０が適当である。
このｐＨ調節には、苛性ソーダ溶液などのアルカリ金属水酸化物を用いることもできるが、アンモニア溶液（例えば、５％水溶液）などの有機アルカリを用いることができる。

アンモニア溶液を用いると、高濃度を使用できるので、緩衝能が大きく、ｐＨ調節の頻度が少なくて済むことに加え、分解後の減圧濃縮によって分解液から容易に除去でき、中和による塩の生成を避けることができる。

プロテアーゼ分解の温度は、分解過程における雑菌による汚染を避けるために、高い方が望ましい。
例えば、ビオブラーゼの場合、ｐＨ９で安定である温度４５〜５５℃を用いることが好適である。
分解時間としては、分解によるｐＨの低下が無くなるまで行うことが好ましい。
大豆蛋白原料に対して１／１００重量の酵素を用いた場合、１５〜２０時間とすることができる。

この酵素分解によって、大部分の蛋白質が、小さいペプチドにまで分解される。
しかしながら、大豆蛋白質中に存在する、疎水性アミノ酸に富む固い高次構造部分は、分解され難く、分子量の大きいポリペプチドとして残存する。
したがって、目的とするペプチド組成物と分別することができる。
すなわち、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を、沈殿として除去することができる。
この未分解高分子画分の沈殿除去は、酸性ｐＨ調節、さらにはエタノールの添加によって、より確実に行うことができる。
また、グルタミンとグルタミン酸の豊富な、高分子量ポリペプチドとペプチド組成物が分離取得できるため、好ましい方法である。

未分解の疎水性高分子ポリペプチドを、沈殿させる酸性ｐＨ調節は、大豆蛋白の等電点近傍にすることが好ましく、例えば、ｐＨ３．５〜５．５、好ましくはｐＨ４．０〜５．０が適当である。
沈殿の程度は、用いる蛋白原料（例えば、分離大豆蛋白、濃縮大豆蛋白、豆乳、脱脂大豆など）により異なる。
大豆蛋白の割合が低くなるほど、沈殿度が悪くなる。この場合は、さらに、エタノール添加して除去することが好ましい。

エタノール添加により沈殿物と溶液を分別する場合、未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させるエタノール濃度は、ｐＨによって異なる。
中性の場合は、酸性の場合より高いエタノール濃度を必要とする。
中和した分解液にエタノールを加える場合、５０％エタノール濃度までの、低い濃度で殆ど沈殿するので、エタノールの濃度は５０％以下とすることができる。
大豆蛋白の割合が高い分離大豆蛋白を用いる場合で、かつ等電点付近であれば、アルコールは殆ど必要としない。
等電点以外でも、大豆蛋白の割合の高い分離大豆蛋白を用いる場合、エタノール濃度は２０％〜５０％で、未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させることができる。

未分解の疎水性高分子ポリペプチドを除去した溶液に、さらにエタノールを加えると、高Ｇｌｘ含有ポリペプチドを沈殿させ、グルタミンとグルタミン酸の豊富な高分子量ポリペプチドとペプチド組成物が分離取得できる。
その際、ペプチド組成物のみを目的とする場合には、工程の増加とエタノールの量の増加による、ポリペプチドの純度が低下するため好ましい方法ではない。

このようにして得られたペプチド組成物は、ゲルろ過及び高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）で精製される。
ゲルろ過剤としては、Ｂｉｏ ＧｅｌＰ−１０やＰ−２などを用いることができる。

＜ペプチド組成物の調製１＞
分離大豆蛋白質（ＳＰＩ；不二製油（株）製「フジプローＲ」）１ｋｇに、脱イオン水を加えて９ｌとし、５％アンモニア溶液でpＨ９に調節したのち、ビオプラーゼ１０ｇを加え、攪拌しながら、恒温槽内において、温度５０℃で３時間インキュベートし、さらに、ビオプラーゼ１０ｇを加え、２０時間インキュベートした。
遠心分離して得られた上清と、沈殿物を精製した際の上清を、１．１ｌまで減圧濃縮したのち、同量のエタノールを加え３日間放置し、遠心分離により沈殿を除去した。
得られた上清に、再度エタノール１．３３ｌを加え、析出物をろ過し、減圧濃縮後凍結乾燥して、７０％エタノールに可溶な組成物である、この発明にかかるペプチド組成物３４４．３ｇを得た。

＜ペプチド組成物の精製分画＞
上記で得られたペプチド組成物４ｇに、１％酢酸１０ｍｌを加えて溶解したのち、遠心分離して得られた上清を、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−２カラム（３×３８ｃｍ）に供し、１％酢酸水溶液で展開し、分画した。
その際の、ゲルろ過パターンを、図１に示した。
また、画分６〜１３の紫外吸収スペクトルを、図２に示した。
画分６〜９には、Ｔｙｒ／Ｐｈｅが、画分１０〜１３にはＴｒｐが含まれていることが示された。

＜ペプチド組成物の特性評価＞
上記で得られ、収量の僅かな画分１４，１５を除いた各画分の特性を、以下の方法で測定し、抗酸化活性を図３に、ラジカル捕捉活性を図４に、ＡＣＥ阻害活性を図５に、赤血球変形能低下抑制作用を図６に示す。
それらの結果から明らかなように、各画分は、効果の程度に差異は認められるが、いずれも、抗酸化活性、ラジカル捕捉活性、及びＡＣＥ阻害活性を有し、特に画分７以降の画分がより高いＡＣＥ阻害活性を有していた。
また、その画分７以降の画分の赤血球変形能低下抑制作用については、画分７，９及び１３において顕著な効果が認められた。
この画分６〜１３のＨＰＬＣチャートを、図７に示し、それらのピーク成分のＡＣＥ阻害活性を測定し表１に示した。

＜特性評価方法＞
−抗酸化活性の測定方法−
上記で得られた各分離抽出物の抗酸化活性を、リノ−ル酸の酸化物がβ−カロチンを退色させる作用を利用したＭｉｌｌｅｒらの方法に準じ、以下の方法で測定した。
試料を分注した分光光度計用試験管セルに、リノ−ル酸−β−カロチン溶液を加えて攪拌し、温度５０℃の恒温槽で、２０分間反応させた場合のβ−カロチンの退色度を４７０ｎｍの吸光度によって求め、合成抗酸化剤ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）による吸光度の減少量を測定し、試料と同じ減少量を与えるＢＨＡの濃度によって、試料の抗酸化活性を表した。

−ラジカル捕捉活性測定法−
試料溶液に、等量のＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）溶液、ＭＥＳ緩衝液、２０％エタノールを加え、室温で２０分間反応させたのち、５２０ｎｍでの吸光度を測定した。
その活性は、同様にして行った、アスコルビン酸（ＡｓＡ）でＤＰＰＨラジカル捕捉活性の検量線を作成し、試料ｇ当たりのラジカル捕捉活性を、ＡｓＡ当量（μｍｏｌ／ｇ）で表した。

−ＡＣＥ阻害活性測定方法（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ変法）−
ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）と、合成基質ヒプリル−ヒスチジル−ロイシン（ペプチド研究所製）を用い、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法に準じて測定した。
すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し、２２５ｎｍの吸光度で測定した。
被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして、次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ_５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示した。

−赤血球変形能低下抑制作用測定法−
３．８％クエン酸ソーダ溶液を含む採血管に、採血した血液を２５００ｒｐｍ×１０分遠心分離して赤血球を沈殿させた後、洗浄し、ＨＥＰＥＳを加え、６．０％赤血球浮遊液を調製した。
この６．０％赤血球浮遊液にＨＥＰＥＳを加え、温度３７．０℃で予備インキュベートしたのち、ＡＡＰＨ溶液（酸化ストレス物質）、ＡＡＰＨ溶液と試料をそれぞれ添加し、温度３７．０℃で４５分インキュベートした。
その後、測定するまで氷冷し、測定は、温度２５．０℃で７分、再度インキュベートしてから行った。
なお、赤血球変形能は、従来の定量性と再現性に難点のある微細孔（ｎｕｃｌｅｉｐｏｒｅ）フィルターを用いた方法に代わるものとして、発明者が開発したフィルター特性が顕著に改善された、ニッケルメッシュ（ｎｉｃｋｅｌｍｅｓｈ）フィルターを用いる方法で測定した。

この発明のペプチド組成物は、前記のような優れた特性を有し、粉末ないし水、酢酸またはエタノールの無毒の溶媒溶液として供給可能な抗酸化性成分であって、大豆から容易に得られることができるため、健康食品産業や医薬業界で広く利用される可能性の高いものである。

Claims (7)

1. 大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製された生成物であって、
   アンギオテンシンI変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性と、ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有すること
   を特徴とするペプチド組成物。
2. 前記生成物は、
   抗酸化活性およびラジカル捕捉活性をも有すること
   を特徴とする請求項１に記載のペプチド組成物。
3. 前記プロテアーゼ処理は、
   アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで行う加水分解処理であること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド組成物。
4. 前記未分解の高分子画分の沈殿除去は、
   酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加により行われること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド組成物。
5. 前記生成物は、
   その調製において、１％酢酸水溶液に不溶な物質が除去されていること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド組成物。
6. 前記生成物は、
   その調製において、ゲルろ過による分画により取得されていること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド組成物。
7. 前記生成物は、
   その調製において、高速液体クロマトグラフィーによる分画により取得されていること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド組成物。