CN109593810A

CN109593810A - 马尾藻活性多肽的提取方法

Info

Publication number: CN109593810A
Application number: CN201811607857.4A
Authority: CN
Inventors: 周建波
Original assignee: Lanxi Silent Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Lanxi Silent Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-04-09

Abstract

本发明提供马尾藻活性多肽的提取方法，属于生物技术领域，包括，使含活性多肽的马尾藻细胞破碎，通过蛋白酶水解细胞内溶物，纯化和干燥由离心水解液产生的精制液；上述干燥所得活性多肽的平均分子量为500~5000Da，其中还包括重量百分比1~3%的海藻多糖和0.5~1.5%的藻胶酸。本发明提供的马尾藻活性多肽的提取方法工艺简化，可操作性提升，设备投入减少，能耗低，效率高，不破坏有效成分；活性多肽的纯度和生物活性高，粘度和凝胶性能降低，在水剂类产品中配伍性增强，消除了引起鱼腥味的物质，可用于食品、保健品、化妆品领域。

Description

马尾藻活性多肽的提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及马尾藻活性多肽的提取方法。

背景技术

马尾藻(Sargassum)是褐藻中的一类海藻，属褐藻口，鹿角菜目，马尾藻科，大多为多年生大型藻类，主要生长在低潮带石沼中或潮下带2～3米水深处的岩石上，大多数为暖水性物种，广泛分布于暖水和温水海域，在我国南北海域均有分布，其中广东、广西马尾藻的产量较高，另外在海南岛和涠洲岛海域也有很高的产量。马尾藻藻体褐色，藻体分固着器、茎、叶和气囊四部分，高达1米。固着器盘状，上生圆柱状的主干。主干单生，偶有双生的现象。茎呈现兰棱形，叶子多是披针形，裹多生在末端小枝上，幼期为纺锤形或倒卵形，顶端有针状突起，成熟时为球形或亚圆球形，顶端圆滑或具尖细的突起。马尾藻中含有丰富膳食纤维，褐藻淀粉，矿物质和维生素及优质的高饱和脂肪酸和合理的必需氨基酸组成，其中必需氨基酸的含量远高于海带、紫菜，其余成分与海带、紫菜接近，可作为保健食品和药物的优质原料。我国古代书籍早有记录马尾藻的药用价值，民间传统也常采用马尾藻作为食物或是中草药治疗。《神农本草经》作为我国中药学著作最早记录了马尾藻可用于治疗甲状腺肿。1578年，李时珍撰写的《本草纲目》陈述了马尾藻能够软坚散结、清热化痰、化水利尿。中国现代药典和中药临床实践表明，羊栖菜和海蒿子能用于治疗瘰疬、睾丸肿痛、水肿、动脉硬化、皮肤病、高血压、急性食管炎、慢性支气管炎等。

现有技术如授权公告号为CN102228125B的中国发明专利，公开了海藻活性肽的制备方法，它以食品级海藻酸钠为原料，通过复合酶耦合催化水解，再经过失活、脱色以及过滤处理后得到海藻多肽提取液，然后将该提取液分别通过分子量为1000Da和300Da的纳滤膜进行纯化、浓缩处理，得到海藻活性肽产品，经灭菌真空干燥后得到海藻活性肽成品。该制备方法原料利用率高、产品纯度高还无需添加脱盐、真空浓缩等工艺，在简化生产工艺的同时也降低了生产成本，但是该制备方法直接对食品级海藻酸钠进行催化水解，不能合理利用藻类成分物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简化、设备投入减少、能耗低、效率高，产品纯度和生物活性高、粘度和凝胶性能降低、在水剂类产品中配伍性增强、消除了鱼腥味的马尾藻活性多肽的提取方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

马尾藻活性多肽的提取方法，该方法中包括，

使含活性多肽的马尾藻细胞破碎，

通过蛋白酶水解细胞内溶物，

纯化和干燥由离心水解液产生的精制液；上述干燥所得活性多肽的平均分子量为500～5000Da。从马尾藻中提取的活性多肽将蛋白质吸收上升到可以直接吸收的程度，可用于降血压血脂、抗凝血、抗肿瘤、促进细胞分化、抗氧化作用等多方面的研究，具有食品、保健品、化妆品等多个领域的用途。

作为优选，破碎马尾藻细胞是将活体马尾藻在-50～-20℃下冷冻1～2h后实现粉碎的。以活体马尾藻为原料，比起海藻干粉为原料，能增加最终产品的活性，且在冷冻前处理过程中，马尾藻细胞中的水会结晶膨大，有效增加马尾藻细胞壁上的孔隙，增加细胞壁的通透性，有利于破壁获得可溶性蛋白质，并增加所得可溶性蛋白质的含量。

作为优选，破碎马尾藻细胞是通过超声波处理实现的；上述超声波频率为20～40KHz，温度为20～40℃，时间为5～30min，重复破碎2～5次。经低温冷冻过的马尾藻细胞壁变得松弛，再利用超声波产生的空化作用、机械作用加速了细胞壁的破碎，促进细胞内溶物的溶出，不用加入和使用果胶酶破壁，具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等优点。

作为优选，水解细胞内溶物前，需对破碎后产生的马尾藻浆液进行高压研磨处理；上述高压压力为0.5～2MPa，研磨后浆液细度达到250～400目。高压下对浆液进行研磨，能使浆液中的蛋白质进一步发生变性和淀粉α化，降低了淀粉产生的凝胶性能，并且能彻底克服和钝化海藻中引起鱼腥味等不良作用的物质，得到脱腥的目的，比起现有技术中采用β-环糊精包裹的技术更简单易行，也有利于实际生产。

作为优选，水解细胞内溶物采用红曲霉和蛋白酶复合作用；上述蛋白酶的加酶量为2000～8000U/g，红曲霉添加量为水解底物重量的1～3％。选择红曲霉用于酶解马尾藻，会延长酶解有效时间，使藻泥酶解更充分，多酶酶解条件下，有利于提高提取率和水解度。

进一步优选，蛋白酶选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或两种。

进一步优选，水解温度为20～60℃，时间为60～240min。

作为优选，纯化是使精制液通过分子量为5000Da和500Da的纳滤膜实现的。经过纳滤膜过滤后，可以简化传统工艺中的脱盐、分离、纯化和浓缩步骤，提高工艺的可操作性，减少设备投入，使得最终产品纯度较高，分子量小，生物活性高，更易于被机体吸收利用。

进一步优选，精制液是水解液在80～100℃下灭酶5～10min后，再在2000～3500r/min条件下离心5～15min后，所得上清液。

作为优选，干燥采用真空冷冻干燥，温度为-50～-10℃，压力为40～100Pa，时间为12～24h。在真空低温环境下干燥，不使活性多肽产生变性，而微生物之类失去生物活力，所得产物复水性好，得到了脱氧保护，保存时间延长。

本发明中还公开一种上述马尾藻活性多肽的提取方法制得的活性多肽，该活性多肽中包括重量百分比1～3％的海藻多糖和0.5～1.5％的藻胶酸。所得海藻活性肽在经过提取、精制后，有效降低了产品的粘度，增强了产品在水剂类产品的配伍性，扩大了适用范围，其中所含海藻多糖和藻胶酸具有可增强生命活力和免疫力、消炎、清除自由基等功效。

本发明的有益效果为：

1)本发明中以活体马尾藻为原料，比起海藻干粉为原料，能增加最终产品的活性，且产品的粘度降低，增强了其在水剂类产品的配伍性，扩大了适用范围，具有可增强生命活力和免疫力、消炎、清除自由基、降血压血脂、抗凝血、抗肿瘤、促进细胞分化、抗氧化作用等功效，在食品、保健品、化妆品等多个领域具有实用用途；

2)本发明对马尾藻的破碎处理，采用了低温冷冻和超声处理联用，有效增加细胞壁的通透性，有利于破壁获得可溶性蛋白质，并增加所得可溶性蛋白质的含量，不加入和使用果胶酶破壁，具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的优点；

3)本发明中对马尾藻浆液酶解多酶酶解前进行高压研磨处理，降低了浆液中淀粉产生的凝胶性能，并能彻底克服和钝化引起鱼腥味的物质，比起现有技术中采用β-环糊精包裹的技术更简单易行，也有利于实际生产；

4)本发明中使用纳滤膜过滤达到纯化目的，简化了传统工艺中的脱盐、分离、纯化和浓缩步骤，提高工艺的可操作性，减少设备投入，最终产品纯度较高，分子量小，生物活性高，更易于被机体吸收利用。

本发明采用了上述技术方案提供马尾藻活性多肽的提取方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述：

实施例1：

马尾藻活性多肽的提取方法，该方法中包括，

使含活性多肽的马尾藻细胞破碎，

通过蛋白酶水解细胞内溶物，

破碎马尾藻细胞是将活体马尾藻在-50℃下冷冻1h后实现粉碎的。以活体马尾藻为原料，比起海藻干粉为原料，能增加最终产品的活性，且在冷冻前处理过程中，马尾藻细胞中的水会结晶膨大，有效增加马尾藻细胞壁上的孔隙，增加细胞壁的通透性，有利于破壁获得可溶性蛋白质，并增加所得可溶性蛋白质的含量。

破碎马尾藻细胞是通过超声波处理实现的；上述超声波频率为20KHz，温度为25℃，时间为30min，重复破碎5次。经低温冷冻过的马尾藻细胞壁变得松弛，再利用超声波产生的空化作用、机械作用加速了细胞壁的破碎，促进细胞内溶物的溶出，不用加入和使用果胶酶破壁，具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等优点。

水解细胞内溶物前，需对破碎后产生的马尾藻浆液进行高压研磨处理；上述高压压力为0.5MPa，研磨后浆液细度达到250目。高压下对浆液进行研磨，能使浆液中的蛋白质进一步发生变性和淀粉α化，降低了淀粉产生的凝胶性能，并且能彻底克服和钝化海藻中引起鱼腥味等不良作用的物质，得到脱腥的目的，比起现有技术中采用β-环糊精包裹的技术更简单易行，也有利于实际生产。

水解细胞内溶物采用红曲霉和蛋白酶复合作用；上述蛋白酶的加酶量为2500U/g，红曲霉添加量为水解底物重量的1％。选择红曲霉用于酶解马尾藻，会延长酶解有效时间，使藻泥酶解更充分，多酶酶解条件下，有利于提高提取率和水解度。

蛋白酶为风味蛋白酶和胰蛋白酶以1:1比例混合。蛋白酶水解条件为：水解温度为25℃，时间为240min。

纯化是使精制液通过分子量为5000Da和500Da的纳滤膜实现的。经过纳滤膜过滤后，可以简化传统工艺中的脱盐、分离、纯化和浓缩步骤，提高工艺的可操作性，减少设备投入，使得最终产品纯度较高，分子量小，生物活性高，更易于被机体吸收利用。

精制液是水解液在80℃下灭酶10min后，再在2000r/min条件下离心15min后，所得上清液。

干燥采用真空冷冻干燥，温度为-50℃，压力为40Pa，时间为24h。在真空低温环境下干燥，不使活性多肽产生变性，而微生物之类失去生物活力，所得产物复水性好，得到了脱氧保护，保存时间延长。

上述马尾藻活性多肽的提取方法制得的活性多肽，该活性多肽中包括重量百分比1.3％的海藻多糖和0.6％的藻胶酸。所得海藻活性肽在经过提取、精制后，有效降低了产品的粘度，增强了产品在水剂类产品的配伍性，扩大了适用范围，其中所含海藻多糖和藻胶酸具有可增强生命活力和免疫力、消炎、清除自由基等功效。

实施例2：

马尾藻活性多肽的提取方法，具体包括以下步骤：

1)将活体马尾藻在-25℃下冷冻1h，然后在频率为35KHz、温度为38℃的条件下，超声处理10min，重复破碎3次，得到马尾藻浆液；

2)将马尾藻浆液置于压力为2MPa的环境下，进行研磨处理，研磨后浆液细度达到400目；

3)向研磨过的马尾藻浆液中加入红曲霉和蛋白酶，在温度为50℃的条件下，水解120min，上述蛋白酶的加酶量为7000U/g，红曲霉添加量为水解底物重量的2.8％，蛋白酶为菠萝蛋白酶和风味蛋白酶等比例混合；

4)将酶解所得水解液在80℃下灭酶10min后，再在2500r/min条件下离心10min后，所得上清液即为精制液，然后使精制液通过分子量为5000Da和500Da的纳滤膜，得到精提物；

5)将精提物在温度为-10℃、压力为100Pa的环境下，干燥12h，即得粉末状的马尾藻活性多肽。

本实施例中所得马尾藻活性多肽的平均分子量为500～5000Da，其中包括重量百分比1.8％的海藻多糖和0.83％的藻胶酸。

实施例3：

马尾藻活性多肽的提取方法，具体包括以下步骤：

1)将活体马尾藻在-30℃下冷冻1.5h，然后在频率为25KHz、温度为33℃的条件下，超声处理10min，重复破碎3次，得到马尾藻浆液；

2)将马尾藻浆液置于压力为1.3MPa的环境下，进行研磨处理，研磨后浆液细度达到350目；

3)向研磨过的马尾藻浆液中加入红曲霉和蛋白酶，在温度为35℃的条件下，水解150min，上述蛋白酶的加酶量为6500U/g，红曲霉添加量为水解底物重量的2.1％，蛋白酶为风味蛋白酶和胰蛋白酶等比例混合；

4)将酶解所得水解液在100℃下灭酶5min后，再在3500r/min条件下离心5min后，所得上清液即为精制液，然后使精制液通过分子量为5000Da和500Da的纳滤膜，得到精提物；

5)将精提物在温度为-20℃、压力为800Pa的环境下，干燥18h，即得粉末状的马尾藻活性多肽。

本实施例中所得马尾藻活性多肽的平均分子量为500～5000Da，其中包括重量百分比2.3％的海藻多糖和1.2％的藻胶酸。

对比例1：

马尾藻活性多肽的提取方法，其中在进行破碎马尾藻细胞的超声波处理前，不对活体马尾藻采用冷冻前处理，其他步骤与实施例3中一致，制得粉末状的马尾藻活性多肽。

对比例2：

马尾藻活性多肽的提取方法，其中在进行破碎马尾藻细胞时采用果胶酶酶解的方法，而不使用冷冻前处理和超声波处理，具体步骤如下：将活体马尾藻洗净后，粉碎至100目，加入蒸馏水配成浆液，然后加入3000U/g的果胶酶，在30℃下酶解90min，得到马尾藻浆液。

本对比例是在实施例3的基础上进行对比试验，其他步骤与实施例3中一致，制得粉末状的马尾藻活性多肽。

对比例3：

马尾藻活性多肽的提取方法，其中水解细胞内溶物步骤中，只添加蛋白酶进行水解，而不加入红曲霉，其他步骤与实施例3中一致，制得粉末状的马尾藻活性多肽。

试验例：

马尾藻活性多肽提取及体外活性测定

1)取实施例3和对比例1～3所制得的粉末状活性多肽，分别配制成1mg/mL的溶液，分别吸取2mL的水解液于烧杯中加蒸馏水5mL，向烧杯中加入5滴酚酞指示剂，混合后加中性甲醛溶液2.0ml再混合，用0.1mol/L NaOH滴定显微粉色。同时取同浓度但未水解的马尾藻浆液2mL做空白组。结果如下表1。

式中：V，样品耗用氢氧化钠标准溶液毫升数；V₀，空白耗用氢氧化钠标准溶液毫升数；N，氢氧化钠标准溶液摩尔浓度；14.008，1mL浓度为1.000mol/L氢氧化钠标准溶液相当于氮的质量(mg)。

2)活性多肽对铁还原能力(FRAP)的测定

取实施例3和对比例1～3所制得的粉末状活性多肽，分别配制成1mg/mL的溶液，向不同溶液中先加入3.6mL新鲜配制的FRAP溶液，静置10min后，于593nm处测定样品液对Fe³⁺的还原能力。FRAP溶液配制：醋酸盐缓冲液(pH3.6)0.3mol/L、TPTZ(溶于40mmol/LHCl)和FeCl₃三种溶液以10:1:1(v/v)混合。以结果如下表1。

表1马尾藻活性多肽提取及体外活性测定结果

	实施例3	对比例1	对比例2	对比例3	空白组
						水解度％	63.7	61.1	63.4	58.4	0
得率％	83.4	78.4	81.5	79.2	-
						吸光光度值	1.26	0.97	1.24	1.04	-

由上表可知，实施例3的水解度最高，且与对比例2的水解度差异不明显，而对比例1的水解度较上述两组稍差，说明冷冻前处理对细胞内溶物的活性有有益影响，对比例3的水解度最差，是由于酶解中制进行蛋白酶的酶解，说明红曲霉对水解度有很明显的增益作用；实施例3和对比例2的活性多肽得率都在80％以上，但对比例2中使用果胶酶的处理时间长，在实际生产中操作条件较难控制，而对比例1和3的得率较差，说明冷冻前处理和红曲霉与蛋白酶联合使用对产品得率有促进效果；实施例2和对比例3的吸光光度值差异不明显，说明产品的还原能力及抗氧化能力都较好，而对比例1最差，说明冷冻前处理对活性多肽的活性有保护作用。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：包括，

使含所述活性多肽的马尾藻细胞破碎，

通过蛋白酶水解细胞内溶物，

纯化和干燥由离心所述水解液产生的精制液；所述干燥所得活性多肽的平均分子量为500~5000Da。

2.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：所述破碎马尾藻细胞是将活体马尾藻在-50~-20℃下冷冻1~2h后实现粉碎的。

3.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：所述破碎马尾藻细胞是通过超声波处理实现的；所述超声波频率为20~40KHz，温度为20~40℃，时间为5~30min，重复破碎2~5次。

4.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：所述水解细胞内溶物前，需对破碎后产生的马尾藻浆液进行高压研磨处理；所述高压压力为0.5~2MPa，研磨后浆液细度达到250~400目。

5.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：所述水解细胞内溶物采用红曲霉和蛋白酶复合作用；所述蛋白酶的加酶量为2000~8000U/g，红曲霉添加量为水解底物重量的1~3%。

6.根据权利要求5所述的马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：所述水解温度为20~60℃，时间为60~240min。

7.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：所述纯化是使精制液通过分子量为5000Da和500Da的纳滤膜实现的。

8.根据权利要求7所述的马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：所述精制液是水解液在80~100℃下灭酶5~10min后，再在2000~3500r/min条件下离心5~15min后，所得上清液。

9.根据权利要求1所述的马尾藻活性多肽的提取方法，其特征在于：所述干燥采用真空冷冻干燥，温度为-50~-10℃，压力为40~100Pa，时间为12~24h。

10.如权利要求1~9任一项所述的马尾藻活性多肽的提取方法制得的活性多肽，其特征在于：所述活性多肽中包括重量百分比1~3%的海藻多糖和0.5~1.5%的藻胶酸。