CN111304268A - 一种酶转化法制备α-低聚半乳糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶转化法制备α‑低聚半乳糖的方法，属于生物化学合成领域。具体为配制浓度为30‑70wt%的半乳糖溶液，糖化初期加入液体α‑半乳糖苷酶10‑20U/g半乳糖干基，控制糖化温度为45‑65℃，每糖化10‑24h补加液体α‑半乳糖苷酶5‑10U/g半乳糖干基，补加2‑3次糖化8~100h，得到糖化液；糖化液经脱色、过滤、膜过滤、色谱分离、浓缩，制备得到α‑低聚半乳糖。本发明控制在糖化反应温度为45‑65℃，改善了糖化反应过程中半乳糖析出的问题，而且通过分批次加入液体α‑半乳糖苷酶，保证反应酶活力，刺激低聚半乳糖转化，促进α‑低聚半乳糖的生成。

Description

一种酶转化法制备α-低聚半乳糖的方法
技术领域
本发明属于生物化学合成领域，具体涉及一种酶转化法制备α-低聚半乳糖的方法。
背景技术
α-低聚半乳糖是（α-Galactooligosaccharides，α-GOS）是一类含有α-半乳糖苷键的低分子量的可溶性低聚糖，具有重要的生理保护功能。能够促进双歧杆菌增殖，改善肠内菌群结构；低热量或零热量，低龋齿性；改善排泄，防止便秘和腹泻；抑制有害物质产生，保护肝脏功能；降低血压、胆固醇和血脂；提高免疫能力；促进肠内营养物质生成和吸收。是现在国际上备受关注的一种有益的完善营养的食品添加剂。
天然α-低聚半乳糖广泛分布于豆科植物中，多见于种子、根、芽等组织中，主要包括三类：第一类是在蔗糖的葡萄糖残基侧以α-1，6糖苷键分别结合一个或多个半乳糖分子结构，如棉籽糖、水苏糖等；第二类是葡萄糖连接一个或多个半乳糖形成蜜二糖和甘露三糖；第三类是松醇和肌醇连接一个或多半乳糖形成的低聚糖。由于α-低聚半乳糖具有的低热值以及耐热、耐酸和难消化等特性，能显著促进双歧杆菌的增殖，因此被作为一种新型的功能性食品基料，在食品加工中被广泛利用。
目前，有关低聚半乳糖的生产主要是β-低聚半乳糖，关于α-低聚半乳糖的生产及研究较少，主要通过以下几种途径：天然原料提取、天然多糖水解、酶催化转化和化学合成。如中国专利文献CN103131744A中公开一种高纯植物源低聚半乳糖的制备方法，其由以下方法制备：（1）糖液制备：选择富含棉籽糖属功能性低聚糖的植物为原料，将原料加水热浸提后压榨得糖液，或是选择豆制品生产过程中产生的大豆废水浓缩备用；（2）发酵：糖液中添加果酒酵母进行发酵；（3）除杂；（4）脱色；（5）脱盐；（6）浓缩及喷雾干燥。该方法由于以富含棉籽糖属功能性低聚糖的植物为原料，原料中α-低聚半乳糖含量较低，糖液制备过程需多次压榨，耗水量大，操作工艺复杂，发酵过程引入大量无机盐类，如果进行工业化生产，离子交换负担很重，成本较高。此外，CN101974583A公开了一种合成α-低聚半乳糖的制备方法，其特征在于以乳糖为原料，利用β-半乳糖苷酶水解乳糖，制备得到半乳糖，作为酶反应的底物。由来源于微生物的α-半乳糖苷酶来催化合成反应，该方法采用酶转化法合成α-低聚半乳糖，具有原料充足，方便，易得，无毒性，生产成本低等特点，但糖化液中α-低聚半乳糖含量较低，而且反应温度低半乳糖易析出，降低了半乳糖向α-低聚半乳糖的转化，虽然升高温度可改善半乳糖析出的情况，但温度高对酶活能够造成一定的影响，也会造成半乳糖的转化率降低，因此，如果进行工业化生产，既会造成原料的大量浪费，也会加重分离提纯的负担。
发明内容
针对现有技术中酶转化合成法转化率低，糖化液中α-低聚半乳糖含量低的问题，本发明提供了一种酶转化法制备α-低聚半乳糖的方法，通过升高温度和控制酶的加入次数促进α-低聚半乳糖的生成，从而提高α-低聚半乳糖的含量，提高整体糖化转化率。
本发明通过以下技术方案实现：
一种酶转化法制备α-低聚半乳糖的方法，包括以下步骤：
（1）配制浓度为30-70wt%的半乳糖溶液，糖化初期加入液体α-半乳糖苷酶10-20U/g半乳糖干基，控制糖化温度为45-65℃，每糖化10-24h补加液体α-半乳糖苷酶5-10U/g半乳糖干基，补加2-3次糖化8~100h，得到糖化液；
（2）将步骤（1）得到的糖化液经脱色、过滤、膜过滤、色谱分离、浓缩，制备得到α-低聚半乳糖。
优选地，步骤（1）中所述的半乳糖溶液浓度为40wt%-65wt%。
优选地，步骤（1）中所述的糖化时间为24-100h，糖化pH为 3.5~7.0。
优选地，步骤（1）中所述的α-半乳糖苷酶是由黑曲霉产生的。
优选地，步骤（1）中所述的液体α-半乳糖苷酶的酶活为3000U/mL。
优选地，步骤（2）中所述的脱色为使用直径为10~30目的颗粒活性炭柱，颗粒活性炭柱温度为 70~80℃，糖化液流速为2~3BV，脱色时间为0.5~1.0h。
优选地，步骤（2）中所述的过滤使用膜分子量在1w~10w Da的超滤膜，在运行压力0.1~1.0MPa，温度为30~50℃。
优选地，步骤（2）中所述色谱分离条件为：运行压力0.1~1.0MPa，温度为30~50℃。
优选地，步骤（2）中所述浓缩为真空浓缩，其运行压力为0.1~1.0MPa，温度为65℃。
有益效果
（1）本发明以酶转化制备高纯度α-低聚半乳糖，该方法与天然原料提取方法相比，操作工艺简单、无毒性、生产成本低，与现有酶法合成相比，本方法制备液体低聚半乳糖中α-低聚半乳糖的质量百分比大，产品纯度高；
（2）本发明控制在糖化反应温度为45-65℃，改善了糖化反应过程中半乳糖析出的问题，而且通过分批次加入液体α-半乳糖苷酶，保证反应酶活力，刺激低聚半乳糖转化，促进α-低聚半乳糖的生成；
（3）本发明采用的制备方法工艺简单，操作方便，在精制过程中，利用超滤工艺取代了目前常用的离子交换工艺，减少了损失，提高了α-低聚半乳糖产率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但本发明所保护范围不限于此。
下列实施例中的液体α-半乳糖苷酶是由黑曲霉产生的，酶活为3000U/mL。
实施例1
（1）称取10kg半乳糖，加去离子水配制成浓度为40wt%的半乳糖溶液；在配制完成的半乳糖溶液中加入液体α-半乳糖苷酶进行糖化反应，加酶量为10U/g干基，糖化温度为45℃，糖化pH为3.5，每糖化10h补加液体α-半乳糖苷酶10U/g干基，补加两次，糖化100h，糖化后低聚半乳糖含量为52.32%；
（2）将步骤（1）得到的糖化液通过直径为20目的颗粒活性炭进行脱色，温度为75℃，流速为3BV；脱色后的糖化液用分子量为10w Da超滤膜进行超滤，运行压力为0.4MPa，温度为40℃，去除糖液中的杂质及酶分子；
（3）将步骤（2）得到的液体低聚半乳糖经条件为运行压力0.6MPa，温度为40℃的色谱分离后，液体低聚半乳糖中低聚半乳糖质量百分比为58.64%，再经真空浓缩得到液体低聚半乳糖产品，其固形物的质量百分比为75%。
实施例2
（1）称取10kg半乳糖，加去离子水配制成浓度为50wt%的半乳糖溶液；在配制完成的半乳糖溶液中加入液体α-半乳糖苷酶进行糖化反应，加酶量为20U/g干基，糖化温度为60℃，糖化pH为4.5，每糖化24h补加液体α-半乳糖苷酶5U/g干基，补加三次，糖化96h，糖化后低聚半乳糖含量55.32%；
（2）将步骤（1）得到的糖化液通过直径为30目的颗粒活性炭进行脱色，温度为80℃，流速为2BV；脱色后的糖化液用分子量为5w Da超滤膜进行超滤，运行压力为0.6MPa，温度为40℃，去除糖液中的杂质及酶分子；
（3）将步骤（2）得到的液体低聚半乳糖经条件为运行压力0.6MPa，温度为50℃的色谱分离后，液体低聚半乳糖中低聚半乳糖质量百分比为57.95%，再经真空浓缩得到液体低聚半乳糖产品，其固形物的质量百分比为75%。
实施例3
（1）称取10kg半乳糖，加去离子水配制成浓度为65wt%的半乳糖溶液；在配制完成的半乳糖溶液中加入液体α-半乳糖苷酶进行糖化反应，加酶量为15U/g干基，糖化温度为65℃，糖化pH为5.5，每糖化20h补加液体α-半乳糖苷酶8U/g干基，补加三次，糖化72h，糖化后低聚半乳糖含量57.54%；
（2）将步骤（1）得到的糖化液通过直径为30目的颗粒活性炭进行脱色，温度为78℃，流速为2BV；脱色后的糖化液用分子量为1w Da超滤膜进行超滤，运行压力为0.8MPa，温度为45℃，去除糖液中的杂质及酶分子；
（3）将步骤（2）得到的液体低聚半乳糖经条件为运行压力0.6MPa，温度为50℃的色谱分离后，液体低聚半乳糖中低聚半乳糖质量百分比为59.45%，再经真空浓缩得到液体低聚半乳糖产品，其固形物的质量百分比为75%。
对比例1
一种以半乳糖为原料制备α-低聚半乳糖的方法，其制备方法同实施例2，不同之处在于采用一次加酶反应，加酶量为35U/g干基。
对比例2
一种以半乳糖为原料制备α-低聚半乳糖的方法，其制备方法同实施例2，不同之处在于糖化温度为40℃。
对比例3
一种以绿豆为原料经压榨、发酵制备α-低聚半乳糖，其制备方法为：加水重量为原料重量的5倍，80℃浸提1.5h，榨汁；取残渣，加1-2倍于残渣质量的水， 90℃浸提1.0h，榨汁，混合初榨和复榨所得糖液。按质量比为1000∶8∶0.4∶0.6的比例，将糖液、酵母膏、MgSO4·7H2O和KH2PO4混合，杀菌，冷却至常温后按1L∶1.5g的比例，向混合液中加入酵母，28-32℃恒温摇床培养8h，终止发酵，得发酵液。精制过程如实施例2，不同之处在于超滤过程改为离子交换，得到含量为57%的液体α-低聚半乳糖。
对实施例1、2、3和对比例1、2、3制备的α-低聚半乳糖的组分含量以及产率进行统计，以75%的α-低聚半乳糖糖液为例，其中的产量是指消耗一吨原料得到α-低聚半乳糖的质量，具体结果如表1。
表1 实施例1-3和对比例1-3制备的糖化液中α-低聚半乳糖组分含量及产率
Figure 351143DEST_PATH_IMAGE001
。
通过上表可以看出，实例1、2、3与对比例1、2、3相比，实施例1、2、3的产量分别为1.16t、1.24t、1.25t明显高于对比例1的0.72t和对比例2的0.74t以及对比例3的1.06t；对比例3反应后α-低聚半乳糖含量明显高出实施例1、2、3与对比例1、2，但对比例3制备工艺与实施例1、2、3以及对比例1、2相比，操作工艺复杂，用水量大，精制过程采用离子交换，增大了损失。实施例1、2、3与对比例2相比，提高了反应温度后α-低聚半乳糖的含量明显提高。而实施例1、2与实施例3所采用的分批补酶法的转化率明显高于对比例1所采用的一次加酶法，提高了糖化后α-低聚半乳糖的含量，提高了产率。

Claims (9)

1.一种酶转化法制备α-低聚半乳糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制浓度为30-70wt%的半乳糖溶液，糖化初期加入液体α-半乳糖苷酶10-20U/g半乳糖干基，控制糖化温度为45-65℃，每糖化10-24h补加液体α-半乳糖苷酶5-10U/g半乳糖干基，补加2-3次糖化8~100h，得到糖化液；
（2）将步骤（1）得到的糖化液经脱色、过滤、膜过滤、色谱分离、浓缩，制备得到α-低聚半乳糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的半乳糖溶液浓度为40-65wt%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的糖化时间为24-100h，糖化pH为 3.5~7.0。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的α-半乳糖苷酶是由黑曲霉产生的。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的液体α-半乳糖苷酶的酶活为3000U/mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的脱色为使用直径为10~30目的颗粒活性炭柱，颗粒活性炭柱温度为 70~80℃，糖化液流速为2~3BV，脱色时间为0.5~1.0h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的过滤使用膜分子量在1w~10w Da的超滤膜，在运行压力0.1~1.0MPa，温度为30~50℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述色谱分离条件为：运行压力0.1~1.0MPa，温度为30~50℃。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述浓缩为真空浓缩，其运行压力为0.1~1.0MPa，温度为65℃。
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