CN105296459B - 磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶的制备方法及在食用油脂加工中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性核‑壳型离子液体固定化脂肪酶的制备方法，首先采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子：再使用制备的Fe3O4纳米粒子作为磁核，合成核‑壳结构的Fe3O4@MCM‑41介孔复合材料；将该磁性载体进行离子液体功能化修饰，最后采用离子液体修饰后的介孔核‑壳型磁性纳米微球载体进行脂肪酶的固定化。本发明将磁性载体采用离子液体进行修饰，提高了脂肪酶对载体的适应性，同时增加了脂肪酶的负载量，提高了脂肪酶的活性和稳定性；制备的磁性固定化酶可用于粘度较大的油脂酯‑酯交换反应体系，在食用油加工产业中能用于制备改性油脂。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪酶催化剂，尤其是涉及一种磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶的制备方法，本发明还涉及所制备的该脂肪酶在食用油脂加工中的应用。
背景技术
脂肪酶是具有生物催化功能的生物大分子，与化学催化剂相比，具有反应条件温和、催化效率高、专一性强、副反应少等优点，广泛应用于医药、化工、食品、轻工和环境保护等行业。然而，游离脂肪酶操作稳定性差、易失活、不易重复使用，难以实现生产过程连续化和自动化，而且反应后难以从反应体系中分离。虽然游离脂肪酶催化技术比较成熟，但真正的工业化应用还是受到了很大的限制。
酶的固定化是解决游离酶存在问题的主要方法之一，固定化脂肪酶不仅保持了酶的催化活性，而且具有稳定性好、能重复使用、易从反应系统中分离、便于运输和储存、有利于生产的连续化和自动化等优点。脂肪酶的固定方法有很多种，如交联法、包埋法、共价结合法和物理吸附法等。其中，交联法是利用多功能交联试剂与酶分子之间以共价键连接，从而生成固定化酶。包埋法是将载体和酶溶液混合，加入引发剂，使其产生聚合反应，通过物理作用，在载体的网格中限定酶，从而实现酶的固定化。载体偶联法是载体表面的活性功能基团和酶分子的非必需基团形成化学共价键，从而实现不可逆结合的酶固定方法，也被称之为共价结合法。采用这种方法可以牢固地连接载体和脂肪酶，所制得的固定化酶稳定性和重复使用性较好。但是，这种方法存在有化学反应，会损失一定的活性。
与上述方法相比，物理吸附法的特殊优势在于其很好地保存了脂肪酶的空间构象，相比游离脂肪酶，固定化酶的催化活性和专一性不会有显著下降。此外，物理吸附法还具有制备方法简易等优点。然而，物理吸附法制得的固定化脂肪酶结合牢固度比化学键合法差，催化剂稳定性不高。因此，如何提高物理吸附法制备固定化酶的稳定性受到了人们的重视。
载体的选择是物理吸附法制备固定化酶的关键。近年来出现的介孔分子筛材料是一种多孔型固体材料，它具有蜂窝状的孔道，孔道尺寸为2～50 nm。大多数介孔材料的孔道都是规则有序排列的，具有层状、六方对称排列和立方对称等结构，孔道尺寸也较为统一，有利于脂肪酶的负载。相对于微孔分子筛，介孔材料较大的孔径使其表面活性基团有较好的可接近性，孔内可负载大体积基团，适用于体积大小范围较宽的客体分子；此外，介孔材料还具有较高的比表面积，理论负载量较高；介孔分子筛在酶催化反应过程中有较好的化学惰性，不会影响催化反应中脂肪酶活性的发挥，同时也不会污染反应体系，在作为固定化酶载体方面有较好的前景。然而，当此类介孔固定化酶在应用于高粘度物料体系（如油脂酯酯交换反应体系）时，在反应结束催化剂分离的过程中，过滤速率十分缓慢，在一定程度上制约了生产效率的提高。
近年来，磁性纳米粒子在各种固载化催化剂的制备中受到重视，以磁性材料为载体制备的固体催化剂在完成催化反应后均可在外界磁场的参与下快速分离和回收，从而简化了催化剂分离工艺，大幅度提高了工业生产效率。同时，利用外部磁场可以控制磁性固定化酶的运动方式和方向，可替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。郭晨等将离子液体([CnC(S)Im]Cl)负载于Fe3O4磁性纳米粒子，制成磁性离子液体复合材料固定化酶体系，引入了离子液体微环境，提高了酶活性及稳定性；固定化酶成品在催化油酸与正丁醇的酯化反应中，催化活性为游离酶的1.1~1.2倍,重复使用5次后，仍能保持92%的活性。（郭晨，高红帅，江洋洋，刘春朝，刘会州. 一种利用磁性离子液体复合材料固定化酶的方法[P]. 中国专利：CN102250868A,2011-11-23）。
然而，磁性纳米粒子容易因磁吸引力而发生团聚，不易在反应体系中分散，阻碍了脂肪酶催化活性的发挥。应用新兴的“磁性粒子的包覆技术”将SiO2介孔材料包覆于磁性纳米粒子表面，可制备“核-壳型磁性纳米微球”。该磁性复合材料很好的继承了磁性纳米粒子可磁分离的优势，同时具有介孔材料高比表面积和易分散等诸多优点。尽管如此，在SiO2介孔材料的表面及孔道内壁具有许多硅羟基，这些硅羟基之间的氢键与静电场力会干扰酶的负载和催化反应时物料的传质，继而降低了固定化酶的催化活性。针对这些问题，不少研究者在脂肪酶负载之前，先对载体进行了功能化修饰，以提高脂肪酶对载体的适应性。Abdullah等用三氨丙基乙氧基硅烷对介孔材料进行了修饰，然后进行褶皱假丝酵母脂肪酶的负载，成品固定化酶的脂肪酶负载量提高了10%。该固定化酶在香茅醇与月桂酸的酯化反应中表现出良好的催化活性（酯化率超过98%），并在循环利用4次后，其活性仍能达到90%以上（Abdullah A Z, Sulaiman N S, Kamaruddin A H. Biocatalytic esterification ofcitronellol with lauric acid by immobilized lipase on aminopropyl-graftedmesoporous SBA-15[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 44(2-3):263–270）。然而，在较为复杂的油脂酯酯交换反应体系中，就载体修饰剂而言，可影响固定化脂肪酶活性的因素有很多，如官能团种类、烷基链长度等，想要找出一种合适的修饰剂十分困难。经过反复探索发现，离子液体作为一种结构和性能可控性较高的化合物，通过对其阴阳离子的组合设计，可制备拥有较多物理以及化学特性（如可调节的极性、两亲性、混溶性等）的功能化离子液体。通过离子液体对载体的修饰，可以在一定程度上提高生物酶的适应性。若用合适的离子液体对载体进行修饰后，再进行脂肪酶的负载可预期较好的负载效果。李强等使用离子液体[DMIIM][DMP]对秸秆进行了修饰，改变了秸秆内部结构，增大了比表面积，使生物酶的吸附点位增加，继而得到多孔结构的载体，然后进行纤维素酶的固载。成品固定化纤维素酶吸附量最高达到1800mg/g，固定化酶的表观活性为45IU。该固定化酶可催化纤维素降解，重复使用5次后，该载体固定化酶活性达到40%左右（李强，季更生，李斌，屠洁，孟春凤. 一种用离子液体和修饰剂处理后的秸秆制备纤维素酶固定化载体的方法[P].中国专利：CN103667243A,2014-03-26）。然而，秸秆载体的化学惰性较低，在较为复杂的反应环境中其稳定性不足，重复使用性较差。
随着近年来食品工业的快速发展，功能性油脂和特殊使用性能的油脂制品需求量越来越大（如人造奶油、起酥油、煎炸油和结构脂等）。油脂酯酯交换和油脂氢化是食用油脂加工的重要化学反应。然而，由于氢化油脂中的反式脂肪酸会显著增加食用者罹患心脑血管疾病的风险，它的使用逐渐受到了限制。油脂酯酯交换不产生反式脂肪酸，不丧失必需脂肪酸，而且能改善油脂的食用性能，生产出的油脂制品具有起酥性、可塑性、延展性和风味好的特点。此外，通过油脂酯酯交换，结合新脂肪酸，以改变脂肪酸的位置分布，从而赋予其熔化、消化、吸收和代谢功能，增加了其在食品营养和治疗方面的食用功能。油脂酯-酯交换反应中的催化剂在其中发挥着关键作用，所以研究开发新型油脂酯酯交换固定化酶催化剂，对于食用油脂加工具有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术所存在的缺陷，提供一种比表面积大、与产物分离速度快、脂肪酶负载量大、催化活性和稳定性较高的磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶的制备方法，本发明还提供所制备的该脂肪酶在食用油脂加工中的应用。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶的制备方法包括下述步骤：
第一步，Fe3O4@MCM-41核壳型复合材料的制备
将Fe3O4纳米粒子、无水乙醇及蒸馏水一起加入到烧杯中，常温下进行超声分散，机械搅拌条件下向混合溶液中滴加氨水，混合均匀后加入十六烷基三甲基溴化铵溶液，继续搅拌均匀，然后缓慢滴加正硅酸乙酯于反应体系中并继续反应；当反应完成后，使用磁铁对产品进行磁分离，所得复合材料用无水乙醇洗涤、真空干燥；然后将其在550℃条件下置于马弗炉中煅烧6h，得到核-壳型复合材料Fe3O4@MCM-41；
第二步，载体的离子液体功能化修饰
取一定量的甲基咪唑和等摩尔的三氯丙基三乙氧基硅烷放入三口烧瓶中，氮气保护，95℃温度下搅拌使之充分反应，然后将一定量第一步制备的核-壳型复合材料加入其中，并加入一定量的乙醇为溶剂，氮气保护下回流，反应结束后对产品进行磁分离；最后用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，真空干燥后，得到离子液体修饰后的磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41；
第三步，固定化酶的制备
将一定量的游离脂肪酶分散于磷酸缓冲溶液中，然后加入上述离子液体修饰后的磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41，在20~35℃温度下搅拌均匀，使得脂肪酶充分吸附于该载体上。脂肪酶固载完成后，通过磁分离方法分离固定化脂肪酶，再用磷酸缓冲溶液洗涤数次，冷冻干燥后，得到磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶成品。
第一步中所用的十六烷基三甲基溴化铵溶液的溶剂为蒸馏水与无水乙醇按体积比2:1配制而成。
本发明制备的磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶在食用油脂加工中作为酯酯交换催化剂应用。
本发明的优点在于采用离子液体修饰后的介孔核-壳型磁性纳米微球载体进行脂肪酶的固定化，载体稳定性好，制备的磁性固定化酶可用于粘度较大的油脂酯-酯交换反应体系，在食用油加工产业中能用于制备改性油脂。
其优点具体体现在以下几点：
1、离子液体具有绿色环保特性 ，且结构可设计。磁性载体采用离子液体进行修饰，提高了脂肪酶对载体的适应性，同时增加了脂肪酶的负载量，提高了脂肪酶的活性和稳定性；
2、制备过程中，在对磁性载体进行修饰和对脂肪酶进行固载时，保留了大量介孔孔道结构和较高的比表面积，提高了催化活性位点的分散度，从而增加了催化效率，提高了操作稳定性；
3、通过物理吸附法将脂肪酶负载于孔道结构中，提高了催化剂稳定性的同时也很好地保持了脂肪酶的空间构象，使固定化酶的催化活性和专一性有较好的体现；
4、在催化反应中，可使用变换外界磁场的方法来增加催化剂与物料的接触传质速率与均匀度；
5、对反应容器无腐蚀性，对环境无污染；
6、本发明制备的固定化脂肪酶可采用外界磁场干预的方法从反应产物中快速的分离，比均相反应工艺有较大优势，提高了生产效率。与非磁性固定化酶相比，该固定化酶更容易分离，在某些环境（如高粘度底物体系）中其优势更大。
附图说明
图1是本发明中磁性MCM-41离子液体固定化酶的制备流程图。
图2是本发明中Fe3O4@MCM-41复合材料与磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的透射电镜图。
图3是本发明中Fe3O4@MCM-41复合材料与磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的氮气吸附和脱附曲线。
图4是本发明中Fe3O4纳米粒子、Fe3O4@MCM-41复合材料、IL-Fe3O4@MCM-41与磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的X射线衍射图。
图5是本发明中Fe3O4纳米粒子、Fe3O4@MCM-41复合材料、IL-Fe3O4@MCM-41与磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的磁性能曲线。
图6是本发明中Fe3O4@MCM-41复合材料、IL-Fe3O4@MCM-41与磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的红外吸收光谱图。
具体实施方式
如图1所示，本发明所述的磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶的制备方法包括下述步骤：
第一步，Fe3O4@MCM-41核壳型复合材料的制备
首先采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子：
将FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水加入到三口圆底烧瓶中，机械搅拌使其完全溶解并均匀混合后，缓慢加入适量氨水，调节溶液pH为10，混合溶液中很快生成大量黑色沉淀--Fe3O4纳米粒子，继续搅拌反应1h后将溶液转移至烧杯中，用蒸馏水、无水乙醇、柠檬酸三钠溶液分别洗涤，随后对Fe3O4纳米粒子在外加磁场作用下进行磁分离，并在60℃条件下进行真空干燥，研磨后置于离心管中存放备用；
使用上述制备的Fe3O4纳米粒子作为磁核，合成核-壳结构的Fe3O4@MCM-41介孔复合材料：
将Fe3O4纳米粒子、无水乙醇及蒸馏水一起加入到烧杯中，常温下进行超声分散30min，机械搅拌条件下向混合溶液中滴加氨水，30min后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液(溶质为CTAB，溶剂为蒸馏水与无水乙醇，V/ V=2:1)，继续搅拌1h，然后缓慢滴加正硅酸乙酯（TEOS）于反应体系中并继续反应24h；当反应完成后，使用磁铁对产品进行磁分离，所得复合材料用无水乙醇洗涤, 在60℃条件下真空干燥；然后将其在550℃条件下置于马弗炉中煅烧6h，得到核-壳型复合材料Fe3O4@MCM-41；
第二步，载体的离子液体功能化修饰
取一定量的甲基咪唑和等摩尔的三氯丙基三乙氧基硅烷放入三口烧瓶中，氮气保护，95℃温度下搅拌反应26h，得到1-甲基-3-丙基乙氧基硅烷基-咪唑盐酸盐；然后将一定量的 Fe3O4@MCM-41核-壳型复合材料加入其中，并加入一定量的乙醇为溶剂，氮气保护，90℃温度下回流24h后，对产品进行磁分离；最后用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，40℃下真空干燥后，得到离子液体修饰后的磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41；
第三步，固定化酶的制备
将一定量的游离脂肪酶分散于磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）中，然后加入上述离子液体修饰后的磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41，在20~35℃温度下搅拌12h，使得脂肪酶充分吸附于该载体上；脂肪酶固载完成后，通过磁分离方法分离固定化脂肪酶，再用磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）洗涤数次，冷冻干燥12h后，得到磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶成品(简称固定化酶)。
对本发明制备的上述磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶成品进行表征和确认：
图2为Fe3O4@MCM-41（a、b）和固定化脂肪酶（c、d）的透射电镜图。如图2所示，磁性材料Fe3O4@MCM-41（a、b）的平均粒径约为228nm，分散良好且具有明显的核-壳结构，内层深色为Fe3O4纳米粒子核。磁性核为载体材料提供了磁性能，Fe3O4的平均粒径约为150nm。在Fe3O4外层均匀包覆了厚度约39nm的MCM-41壳。磁性Fe3O4纳米粒子外层包覆的介孔SiO2为载体材料提供了较大的比表面积及均匀的孔道结构，有利于脂肪酶的吸附和分散。固定化脂肪酶（c、d）的透射电镜图同样显示了核-壳基本结构，说明磁性载体材料Fe3O4@MCM-41具有稳定的结构，酶的固定化过程没有破坏载体结构。
图3为Fe3O4@MCM-41(a)和固定酶(b)的N2吸附-脱附等温线。如图3所示，Fe3O4@MCM-41(a)和固定化酶(b)的N2吸附-脱附等温线为Langmuir Ⅳ型等温线，说明材料为介孔材料。Fe3O4@MCM-41的N2吸附-脱附等温线在相对压力为0.1-0.4的范围内吸附量有明显增加，原因可能是N2分子在介孔内表面为多层吸附。经BET计算，Fe3O4@MCM-41的比表面积为205m2/g，孔径为3.6nm，孔体积为0.13cm3/g，孔径分布均匀，载体具有较大的比表面积，有利于负载活性组分。固定化酶样品的比表面积下降为23 m2/g，孔体积下降为0.04cm3/g，表明脂肪酶被有效地固载到了载体材料上。尽管该固定化酶比表面积在固载化后有所下降，但仍保持了较大比表面积，有利于酶催化反应。
图4为Fe3O4（a）、Fe3O4@MCM-41（b）、IL-Fe3O4@MCM-41（c）和固定化酶（d）的X射线衍射图。Fe3O4纳米粒子（a）在30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57.0°、62.6°有六处衍射峰，分别对应(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)六个晶面，这些衍射峰表明磁性的纳米粒子为Fe3O4纳米粒子（JCPDS database file, No.79-0418）。Fe3O4@MCM-41（b）、IL-Fe3O4@MCM-41（c）和固定酶（d）的X射线衍射图中同样出现了Fe3O4衍射峰，说明酶的固定化并没有破坏Fe3O4纳米粒子的晶体结构。
在室温条件下使用MicroSense-EV9振动样品磁强计对Fe3O4纳米粒子、Fe3O4@MCM-41、IL-Fe3O4@MCM-41和固定化酶的磁性能进行了测试。图5为Fe3O4（a）、Fe3O4@MCM-41(b)、IL-Fe3O4@MCM-41（c）和固定酶(d)的磁性能曲线。如图5所示，所有样品的磁化曲线表现为零剩磁与矫顽力，说明磁性材料均为超顺磁性。由于非磁性介孔材料MCM-41的影响，Fe3O4@MCM-41的饱和磁化强度（28.4 eum/g）小于Fe3O4纳米粒子的饱和磁化强度（47.7 eum/g）。同样因非磁性离子液体和游离酶的影响，IL-Fe3O4@MCM-41的饱和磁化强度（24.3 eum/g）和固定化酶的饱和磁化强度（16.6 eum/g）均有下降。但固定化酶仍然具有较强的磁响应性能，能通过外加磁场快速有效的从反应体系中分离出来。
从Fe3O4@MCM-41(a), IL-Fe3O4@MCM-41(b)和固定化酶（c）的红外吸收光谱图（图6）可以看出，Fe3O4@MCM-41在3432 cm-1处的宽吸收峰为材料表面羟基的特征吸收峰，Fe3O4@MCM-41、IL-Fe3O4@MCM-41和固定酶在564cm-1出现的吸收峰可以合理归属为Fe3O4中Fe-O键的伸缩振动，在1088 cm-1、810 cm-1和465 cm-1三处检测到了明显的特征吸收峰可归属为Si-O-Si结构的特征振动吸收峰。IL-Fe3O4@MCM-41(b)在1564 cm-1和1461 cm-1的两个吸收峰为咪唑环的振动吸收，饱和C-H键的伸缩振动吸收峰则出现在2946 cm-1，3150 cm-1的吸收峰归属于咪唑环中C=C的红外振动吸收峰，说明离子液体成功连接到磁性核-壳载体Fe3O4@MCM-41上。固定化酶在1658cm-1的吸收峰为酰胺的特征吸收峰，且在1564 cm-1和1461cm-1以及2946 cm-1和3150 cm-1处同样有咪唑环、饱和C-H键和C=C的振动红外吸收，说明脂肪酶成功固载到了Fe3O4@MCM-41载体材料上。
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。
实施例1
（1）Fe3O4纳米粒子的制备
Fe3O4纳米粒子的制备采用化学共沉淀法。称取8.1g FeCl3·6H2O、3.9g FeSO4·7H2O及150ml蒸馏水加入到250ml的三口圆底烧瓶中，机械搅拌使其完全溶解并均匀混合后，缓慢加入适量氨水，调节溶液pH为10，混合溶液中很快生成大量Fe3O4纳米粒子（黑色沉淀），继续搅拌反应1h后将溶液转移至250ml烧杯中，用蒸馏水、无水乙醇、0.3mol/L的柠檬酸三钠溶液分别洗涤3次，随后对Fe3O4纳米粒子在外加磁场作用下进行磁分离，并在60℃条件下进行真空干燥，研磨后置于离心管中存放备用；
(2)Fe3O4@MCM-41复合材料的制备
将上述制备的Fe3O4纳米粒子作为磁核，合成核-壳结构Fe3O4@MCM-41介孔复合材料。
将0.5g Fe3O4纳米粒子、60ml无水乙醇及120ml蒸馏水一起加入到250ml烧杯中，常温下超声分散30min，机械搅拌条件下向混合溶液中滴加1.2ml氨水，30min后加入10ml的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液(含有0.42g CTAB，溶剂为蒸馏水与无水乙醇，V/ V=2:1)，继续搅拌1h，然后缓慢滴加1.05ml正硅酸乙酯（TEOS）于反应体系中并继续反应24h；当反应完成后，使用磁铁对产品进行磁分离，所得复合材料用无水乙醇洗涤3次，在60℃条件下真空干燥；然后将其在550℃条件下置于马弗炉中煅烧6h，得到核-壳型复合材料Fe3O4@MCM-41；
（3）载体的离子液体功能化修饰
将15 mmol甲基咪唑和15 mmol的三氯丙基三乙氧基硅烷放入250ml三口烧瓶中，氮气保护，95℃下搅拌反应26h，得到1-甲基-3-丙基乙氧基硅烷基-咪唑盐酸盐；然后将1.0g的Fe3O4@MCM-41复合材料加入其中，并加入100ml的乙醇为溶剂，氮气保护下，90℃温度下回流24h，反应结束后对产品进行磁分离；再用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，40℃温度下真空干燥后，得到离子液体修饰后的磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41；
（4）固定化酶的制备
将2.0g的游离脂肪酶分散于30ml的磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）中，然后加入1.0g离子液体修饰后的磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41，混合物在25℃温度下搅拌12h，使得脂肪酶充分吸附于该载体上。脂肪酶固载完成后，通过磁分离方法分离固定化脂肪酶，再用磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）洗涤数次，冷冻干燥12h后，得到1#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶。
（5）1#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的催化性能测试
通过棕榈硬脂与米糠油的酯酯交换反应对上述制备的磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化酶进行活性测试。
称取2.4g棕榈硬脂与1.6g米糠油，将其加入50mL圆底烧瓶中，60℃条件下磁力搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。取出2.0g混合油样作为对照物进行组成测定，剩余混合油样中加入0.6g上述固定酶催化剂成品，55℃条件下，放入摇床中振荡反应24h。待反应结束后，加入适量正己烷进行萃取，然后磁分离除去固定化酶，旋蒸除去正己烷后，得到酯酯交换产品。对照样品与酯酯交换产品在2℃-4℃条件下存放12h后，进行熔点测定。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的54.2℃下降为反应后的49.1℃。
实施例2
Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@MCM-41复合材料的制备同实施例1。
载体的功能化修饰：将20 mmol甲基咪唑和20mmol的三氯丙基三乙氧基硅烷加入250mL的三口烧瓶中，氮气保护下，95℃下搅拌反应26h。然后，将1.0g Fe3O4@MCM-41复合材料加入到上述体系中，并加入100mL乙醇为溶剂，氮气保护，90℃温度下回流24h。反应结束后将产品磁分离，用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，40℃真空干燥后，得到离子液体修饰载体IL-Fe3O4@MCM-41；
脂肪酶的固定化：将2.0g游离脂肪酶分散于30mL的磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）中，然后加入1.0g上述离子液体修饰磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41，混合物在20℃温度下搅拌12h，使得脂肪酶充分吸附于载体之上。脂肪酶的固载完成后，通过磁分离方法分离固定化酶，再用磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）洗涤数次，冷冻干燥12h后，得到2#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶。
2#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的催化性能测试方法如实施例1。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的54.2℃下降为反应后的45.9℃。
实施例3
Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@MCM-41复合材料的制备同实施例1。
载体的功能化修饰：将25 mmol甲基咪唑和25mmol的三氯丙基三乙氧基硅烷加入250mL的三口烧瓶中，氮气保护下，95℃下搅拌反应26h。然后，将1.0g Fe3O4@MCM-41复合材料加入到上述体系中，并加入100mL乙醇为溶剂，氮气保护，90℃温度下回流24h。反应结束后将产品磁分离，用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，40℃真空干燥后，得到离子液体修饰载体IL-Fe3O4@MCM-41；
脂肪酶的固定化：将2.0g游离脂肪酶分散于30mL的磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）中，然后加入2.0g上述离子液体修饰磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41，混合物在20℃温度下搅拌12h，使得脂肪酶充分吸附于载体之上。脂肪酶的固载完成后，通过磁分离方法分离固定化酶，再用磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）洗涤数次，冷冻干燥12h后，得到3#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶。
3#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的催化性能测试方法如实施例1。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的54.2℃下降为反应后的46.0℃。
实施例4
Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@MCM-41复合材料的制备同实施例1。
载体的功能化修饰：将20 mmol甲基咪唑和20mmol的三氯丙基三乙氧基硅烷加入250mL的三口烧瓶中，氮气保护下，95℃下搅拌反应26h。然后，将1.0g Fe3O4@MCM-41复合材料加入到上述体系中，并加入100mL乙醇为溶剂，氮气保护，90℃温度下回流24h。反应结束后将产品磁分离，再用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，40℃真空干燥后，得到离子液体修饰载体IL-Fe3O4@MCM-41；
脂肪酶的固定化：将2.0g游离脂肪酶分散于30mL的磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）中，然后加入1.0g上述离子液体修饰磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41，混合物在25℃温度下搅拌12h，使得脂肪酶充分吸附于载体之上。脂肪酶的固载完成后，通过磁分离方法分离固定化酶，再用磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）洗涤数次，冷冻干燥12h后，得到4#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶。
4#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的催化性能测试方法如实施例1。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的54.2℃下降为反应后的44.5℃。
实施例5
Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@MCM-41复合材料的制备同实施例1。
载体的功能化修饰：将20 mmol甲基咪唑和20mmol的三氯丙基三乙氧基硅烷加入250mL的三口烧瓶中，氮气保护下，95℃温度下搅拌反应26h。然后，将1.0g Fe3O4@MCM-41复合材料加入到上述体系中，并加入100mL乙醇为溶剂，氮气保护，90℃温度下回流24h。反应结束后将产品磁分离，用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，40℃真空干燥后，得到离子液体修饰载体IL-Fe3O4@MCM-41；
脂肪酶的固定化：将2.0g游离脂肪酶分散于30mL的磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）中，然后加入1.0g上述离子液体修饰磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41，混合物在30℃温度下搅拌12h，使得脂肪酶充分吸附于载体之上。脂肪酶的固载完成后，通过磁分离方法分离固定化酶，再用磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）洗涤数次，冷冻干燥12h后，得到5#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶。
5#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的催化性能测试方法如实施例1。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的54.2℃下降为反应后的46.2℃。
实施例6
Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@MCM-41复合材料的制备同实施例1。
载体的功能化修饰：将20 mmol甲基咪唑和20mmol的三氯丙基三乙氧基硅烷加入250mL的三口烧瓶中，氮气保护下，95℃温度下搅拌反应26h。然后，将1.0g Fe3O4@MCM-41复合材料加入到上述体系中，并加入100mL乙醇为溶剂，氮气保护，90℃温度下回流24h。反应结束后将产品磁分离，用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，40℃真空干燥后，得到离子液体修饰载体IL-Fe3O4@MCM-41；
脂肪酶的固定化：将2.0g游离脂肪酶分散于30mL的磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）中，然后加入1.0g上述离子液体修饰磁性复合载体IL-Fe3O4@MCM-41，混合物在35℃温度下搅拌12h，使得脂肪酶充分吸附于载体之上。脂肪酶的固载完成后，通过磁分离方法分离固定化酶，再用磷酸缓冲溶液（0.2mol/L，pH=7.0）洗涤数次，冷冻干燥12h后，得到6#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶。
6#磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的催化性能测试方法如实施例1。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的54.2℃下降为反应后的47.3℃。
熔点是油脂的一项重要的物理特性，对油脂的口感有很大的影响，接近人体体温且熔程较短的半固体油脂具有更好的口感。未经酯酯交换的两种固液物理混合油脂存放后会出现分层，而且口感较差。棕榈硬脂的熔点为57.5℃，将棕榈硬脂与米糠油按60:40的比例进行混合后，该混合油样的熔点为54.2℃。本发明对磁性Fe3O4@MCM-41离子液体固定化脂肪酶的制备条件进行了一系列的优化，考察了不同条件下制备的固定化酶的催化性能。上述实施例1~实施例6的实验结果表明，将各种固定化酶应用于棕榈硬脂与米糠油的酯酯交换反应时，反应后油样的熔点较反应前均有所下降。载体修饰过程中，随着离子液体前驱体加入量的增加，对应固定化酶的催化性能也逐渐提升。4#固定化酶催化剂用于酯酯交换反应时，其催化效果最好，熔点下降较多，表明离子液体的存在有利于脂肪酶的负载。固定化温度是固定化酶制备过程的重要因素，在最优离子液体前驱体加入量下，在一定范围内升高脂肪酶固载温度超过35℃，对应的固定化酶成品活性逐渐降低，因此适宜固载化温度为25℃。
本发明制备的固定化脂肪酶的重复利用
称取2.4g棕榈硬脂与1.6g米糠油，将混合油脂加入50mL圆底烧瓶中，60℃条件下磁力搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。取出2.0g混合油样作为对照物进行组成测定。剩余混合油样中加入0.6g 4#固定化脂肪酶催化剂成品，55℃条件下，放入摇床中振荡反应24h。待反应结束后，加入适量正己烷进行萃取，然后磁分离除去固定化酶，旋蒸除去正己烷后，得到酯酯交换产品。对照样品与酯交换产品在2℃-4℃条件下存放12h后，然后进行熔点测定。分离回收的固定化酶用缓冲溶液（0.2mol/L的磷酸缓冲溶液，pH=7.0）与正丁醇各洗涤3次，经冷冻干燥后，投入下次反应（反应条件与首次相同，当固定化酶回收量不足时，用平行反应补足）。如此进行重复使用测试4次，以熔点降低来表示催化剂活性，固定化酶的重复利用结果如下表1。
表1
从表1可看出，本发明中固定化酶在棕榈硬脂与米糠油的酯酯交换反应中经4次重复利用后活性仍保持在84%以上，说明本发明制备的固定化酶催化剂的稳定性较高，可以在间歇反应装置中连续使用。
本发明制备的固定化酶催化剂在棕榈硬脂与米糠油的酯酯交换反应中的应用
称取一定质量的棕榈硬脂与米糠油，将混合油脂加入50mL圆底烧瓶中，60℃条件下磁力搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。取出一半混合油样作为对照物进行组成测定。剩余混合油样中加入一定量的固定酶催化剂，在55℃条件下，放入摇床中振荡反应24h。待反应结束后，加入适量正己烷进行萃取，然后磁分离除去固定化酶，旋蒸除去正己烷后，得到酯酯交换产品。对照样品与酯交换产品在2℃-4℃条件下存放12h后，进行熔点测定（GB/T 12766-2008 动物油脂熔点测定[S]）。
实施例7
称取2.0g棕榈硬脂与2.0g米糠油（50:50），将混合油脂加入50mL圆底烧瓶中，60℃条件下磁力搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。取出2g混合油样作为对照物进行组成测定。剩余混合油样中加入0.6g 4#固定酶催化剂，55℃条件下，放入摇床中振荡反应24h。待反应结束后，加入适量正己烷进行萃取，然后磁分离除去固定化酶，旋蒸除去正己烷后，得到酯酯交换产品。对照样品与酯酯交换产品在2℃-4℃条件下存放12h后，然后进行熔点测定。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的51.9℃下降为反应后的43.6℃。其它油脂结构分析也证明两种油脂之间发生了酯酯交换反应（见表2，表3和表4）
实施例8
称取1.6g棕榈硬脂与2.4g米糠油（40:60），将混合油脂加入50mL圆底烧瓶中，60℃条件下磁力搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。取出2g混合油样作为对照物进行组成测定。剩余混合油样中加入0.6g 4#固定酶催化剂，55℃条件下，放入摇床中振荡反应24h。待反应结束后，加入适量正己烷进行萃取，然后磁分离除去固定化酶，旋蒸除去正己烷后，得到酯酯交换产品。对照样品与酯酯交换产品在2℃-4℃条件下存放12h后，然后进行熔点测定。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的50.0℃下降为反应后的41.7℃。其它油脂结构分析也证明两种油脂之间发生了酯酯交换反应（见表2，表3和表4）
实施例9
称取 1.2g棕榈硬脂与2.8g米糠油（30:70），将混合油脂加入50mL圆底烧瓶中，60℃条件下磁力搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。取出2g混合油样作为对照物进行组成测定。剩余混合油样中加入0.6g 4#固定酶催化剂，55℃条件下，放入摇床中振荡反应24h。待反应结束后，加入适量正己烷进行萃取，然后磁分离除去固定化酶，旋蒸除去正己烷后，得到酯酯交换产品。对照样品与酯酯交换产品在2℃-4℃条件下存放12h后，然后进行熔点测定。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的47.8℃下降为反应后的36.0℃。其它油脂结构分析也证明两种油脂之间发生了酯酯交换反应（见表2，表3和表4）
实施例10
称取0.8g棕榈硬脂与3.2g米糠油（20:80），将混合油脂加入50mL圆底烧瓶中，60℃条件下磁力搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。取出2g混合油样作为对照物进行组成测定。剩余混合油样中加入0.6g 4#固定酶催化剂，55℃条件下，放入摇床中振荡反应24h。待反应结束后，加入适量正己烷进行萃取，然后磁分离除去固定化酶，旋蒸除去正己烷后，得到酯酯交换产品。对照样品与酯酯交换产品在2℃-4℃条件下存放12h后，然后进行熔点测定。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的46.1℃下降为反应后的29.0℃。其它油脂结构分析也证明两种油脂之间发生了酯酯交换反应（见表2，表3和表4）
与酯酯交换反应前相比，不同比例的棕榈硬脂与米糠油混合油脂酯酯交换反应后产品熔点均有明显的下降。这是由于固定酶催化油脂酯-酯交换反应过程中发生了脂肪酸重排，油脂的甘三酯组成发生了变化。酯酯交换反应后高熔点的三饱和脂肪酸甘油酯（PPP）的含量明显下降，而低熔点的单饱和脂肪酸甘油酯（PLO）和多不饱和脂肪酸甘油酯（OLO）的含量明显升高，因此产品的熔点明显降低。
米糠油具有均衡的脂肪酸组成，含有丰富的VE、植物甾醇和谷维素等天然生物活性成分。棕榈硬酯是棕榈油经分提的高熔点部分，含有丰富的棕榈酸。表1为棕榈硬脂、米糠油以及二者不同质量比例混合油脂酯-酯交换反应前后的总脂肪酸组成以及碘值(IV)的测定结果。棕榈硬脂中含有83.9%的棕榈酸，同时含有少量的油酸。米糠油主要含有39.4%的亚油酸、35.4%的油酸、21.0%的棕榈酸和少量的硬脂酸和亚麻酸，其中饱和脂肪酸含量为23.2%。米糠油中不饱和脂肪酸含量占了较大的比重，达到76.9%。
表2为米糠油、棕榈硬脂及二者不同比例混合油脂酯-酯交换反应前后总脂肪
酸组成及碘值的测定结果。
表2
从表2可以看出，不同质量比的棕榈硬脂和米糠油混合样品在酯-酯交换反应前后的总脂肪酸的组成及脂肪酸的相对含量没有明显变化，说明酶催化油脂酯-酯交换对油脂甘三酯分子上脂肪酸的种类和饱和程度不产生影响。通过调整棕榈硬脂和米糠油的比例可以改变混合油脂中脂肪酸组成（如表2所示），随着棕榈硬脂比例的增大，混合油脂中饱和脂肪酸（SFA）的百分含量不断增大，不饱和脂肪酸（USFA）相对百分含量相应的逐渐降低。碘值是衡量油脂不饱和程度的重要指标，米糠油的碘值为104.2，棕榈硬脂的碘值为19.3。随着棕榈硬脂比例的增大，混合油脂的碘值逐渐降低。不同质量比的棕榈硬脂与米糠油酯交换前后样品的碘值没有明显的变化，说明酶催化油脂酯交换不改变油脂中的不饱和脂肪酸。
油脂的酯-酯交换反应为油脂甘三酯分子间或分子内脂肪酸位置的重排，通过油脂Sn-2位脂肪酸组成的分析可以有效的判断油脂酯-酯交换反应的程度。不同质量比的棕榈硬脂和米糠油酯-酯交换反应前后油脂样品Sn-2位脂肪酸的组成见表3。由表3可知，棕榈硬脂Sn-2位中棕榈酸的含量为83.9%，油酸含量为9.2%，硬脂酸和亚油酸含量分别为4.1%和1.9%。米糠油Sn-2位中含有51.8%的亚油酸、38.9%的油酸、5.6%的棕榈酸和少量的亚麻酸（3.1%）与硬脂酸（0.5%）。
表3也列出了米糠油、棕榈硬脂及二者不同比例混合油脂酯-酯交换反应前后Sn-2位脂肪酸组成的测定结果。
表3
与反应前相比，不同质量比的棕榈硬脂与米糠油酯酯交换反应后产品Sn-2位上脂肪酸的组成均发生了明显变化，这是因为酶催化油脂酯-酯交换反应使脂肪酸在甘油骨架上进行了重新的排列。对比同比例样品酯-酯交换反应前后Sn-2位上脂肪酸的组成，酯交换反应后产品Sn-2位上棕榈酸的含量明显提高，不饱和的亚油酸的含量明显下降。以棕榈硬脂与米糠油40:60的比例为例，酯酯交换反应后Sn-2位上脂肪酸组成中棕榈酸的百分含量由29.1%增长至46.3%，亚油酸由初始的33.9%降低为酯-酯交换反应后的23.7%，酯-酯交换产品Sn-2位上饱和脂肪酸相对含量增加约18.4%。这些结果说明该磁性离子液体固定化酶催化剂对油脂酯-酯交换反应有明显的催化效果，有效的改变了油脂甘三酯分子中脂肪酸的排布。
据报道，母乳脂肪中Sn-2位饱和脂肪酸含量为78.3%，油酸含量为12.8%，亚油酸与亚麻酸含量为9%。Sn-1,3位不饱和脂肪酸含量为53.9%。脂肪酸特定的位置分布有利于婴幼儿对脂肪的吸收与转化。从脂肪酸的分布来看，质量比为50:50的棕榈硬脂与米糠油酯交换反应产品的Sn-2位上饱和脂肪酸含量为56.9%，油酸含量为22.9%，亚油酸与亚麻酸含量为20.2%，计算可得Sn-1,3位上不饱和脂肪酸含量为44.9%，与母乳脂肪的脂肪酸分布接近。
不同质量比的棕榈硬脂与米糠油混合样品酯-酯交换反应前后的主要甘三酯组成分布如表4所示。由表4可知，米糠油中的主要甘三酯组成为：PLO（19.3%）、OLL（17.5%）、PLL（17.6%）、OLO（15.1%）、StPL（8.3%）、LLL（8.1%）和POO（6.8%）。棕榈硬脂中三饱和脂肪酸甘油酯（PPP）含量最高（88.5%），PPO（5.8%）和POO（1.2%）的含量较低。与反应前相比，酯交换反应后产品油脂中甘三酯组成发生了明显变化，三棕榈酸甘油酯含量明显下降，棕榈酸-亚油酸-油酸甘油酯含量升高。例如，质量比为40:60的混合油脂酯交换后PPP由48.7%减少至31.2%，OLL由6.7%减少至4.9%，PLO由7.1%增加至12.5%，PPL由2.0%增加至7.3%。其他比例混合油脂酯交换反应前后甘三酯变化情况类似，说明酶催化酯交换反应使甘三酯分子中脂肪酸发生了重排。
表4 为米糠油、棕榈硬脂、不同质量比的棕榈硬脂与米糠油混合油脂酯-酯
交换反应前后甘三酯组成（%）的测定结果。
表4
注：P-棕榈酸；St-硬脂酸；O-油酸；L-亚油酸；Ln-亚麻酸。
可以根据当量碳数（ECN）对酯-酯交换反应前后混合样品中的甘三酯进行归类。ECN与分子中含有的总碳原子个数和具有的双键个数有关，其中ECN=cn-2(db)，cn代表脂肪酸中的总碳原子的个数，db表示脂肪酸中含有的双键个数。米糠油中的多不饱和脂肪酸甘油酯含量较高，以C44和C46的种类较多，棕榈硬脂中含量较高的甘三酯则主要是C48。该固定化酶催化油脂酯-酯交换反应后，不同当量碳数的甘三酯组成发生了变化。与酯交换反应前相比，质量比为40:60的混合样品反应后C48的甘三酯含量明显下降，而C46的甘三酯含量明显增加，说明了通过该固定化酶催化酯-酯交换反应，油脂中脂肪酸在甘油骨架分子间和分子内发生了重排。
Claims (3)
1.一种磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
第一步，Fe3O4MCM-41核壳型复合材料的制备
将Fe3O4纳米粒子、无水乙醇及蒸馏水一起加入到烧杯中，常温下进行超声分散，机械搅拌条件下向混合溶液中滴加氨水，混合均匀后加入十六烷基三甲基溴化铵溶液，继续搅拌均匀，然后缓慢滴加正硅酸乙酯于反应体系中并继续反应；当反应完成后，使用磁铁对产品进行磁分离，所得复合材料用无水乙醇洗涤、真空干燥；然后将其在550℃条件下置于马弗炉中煅烧6h，得到核-壳型复合材料Fe3O4MCM-41；
第二步，载体的离子液体功能化修饰
取一定量的甲基咪唑和等摩尔的三氯丙基三乙氧基硅烷放入三口烧瓶中，氮气保护，95℃温度下搅拌使之充分反应，然后将一定量第一步制备的核-壳型复合材料加入其中，并加入一定量的乙醇为溶剂，氮气保护下回流，反应结束后对产品进行磁分离；最后用无水乙醇和乙醚分别洗涤数次，真空干燥后，得到离子液体修饰后的磁性复合载体IL-Fe3O4MCM-41；
第三步，固定化酶的制备
将一定量的游离脂肪酶分散于磷酸缓冲溶液中，然后加入上述离子液体修饰后的磁性复合载体IL-Fe3O4MCM-41，在20~35℃温度下搅拌均匀，使得脂肪酶充分吸附于该载体上；脂肪酶固载完成后，通过磁分离方法分离固定化脂肪酶，再用磷酸缓冲溶液洗涤数次，冷冻干燥后，得到磁性Fe3O4MCM-41离子液体固定化脂肪酶成品。
2.根据权利要求1所述的磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：第一步中所用的十六烷基三甲基溴化铵溶液的溶剂为蒸馏水与无水乙醇按体积比2:1配制而成。
3.权利要求1制备的磁性核-壳型离子液体固定化脂肪酶在食用油脂加工中作为酯酯交换催化剂应用。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Immobilization of Penicillin G Acylase on Magnetic Nanoparticles Modified by Ionice Liquids;ZHOU Huacong et al.;《Chinese Journal of Chemical Engineering》;20120215;摘要，方法部分，特别是图2；第147页2.2-2.4 * |
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|---|---|
| CN105296459A (zh) | 2016-02-03 |
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