CN110846306B

CN110846306B - 一种双亲性酶固定化载体

Info

Publication number: CN110846306B
Application number: CN201911248071.2A
Authority: CN
Inventors: 朱珣之; 高婷; 黄犀; 罗会婷; 王仲伟; 汤诗杰
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Jiangsu Baishimei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-09
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2039-12-09
Also published as: CN110846306A

Abstract

本发明公开了一种双亲性酶固定化载体，该双亲性酶固定化载体由下述步骤制得：取天然植物纤维材料和聚偏氟乙烯，分别干燥备用；配制离子液体溶液；将天然植物纤维材料和聚偏氟乙烯加入离子液体溶液中，然后加入仿酶，加热搅拌处理或者气爆处理，再加入修饰剂搅拌均匀，洗涤、干燥、真空脱气，得到双亲性的载体；对所得载体依次进行生物处理及抗菌修饰，产物经洗涤、干燥、真空脱气，得到双亲性酶固定化载体。本发明的双亲性酶固定化载体兼具亲油和亲水的性能，载体性质稳定性好、酶吸附率高，而且，该酶固定化载体重复使用多次，仍能保持较高的酶活性。

Description

一种双亲性酶固定化载体

技术领域

本发明涉及一种双亲性酶固定化载体，属于油水双亲性材料技术领域。

背景技术

脂肪酶属于羧基酯水解酶类，是一类特殊的酯键催化酶，具有生物活性。在水相或有机相中脂肪酶可以催化水解、醇解、酯化、酯交换等多种类型的反应。脂肪酶的一个重要特性是它只能在异相系统，即在水不溶性的油脂—水界面上作用，对均匀分散的和水溶性底物无作用或作用缓慢。因此在油水界面或者油水双亲性材料中的活性好、稳定性好。

脂肪酶被广泛应用于制革、医药、食品加工等领域。但脂肪酶的蛋白质高级结构易受环境影响，并且存在分离、纯化、以及回收等诸多问题。通过将脂肪酶固定在载体材料上，在限定微区范围内，可大幅提高脂肪酶的催化性能。但是，由于酶的价格较昂贵，游离的脂肪酶一般易溶于水，在有机溶剂中也会聚集，本身性质极不稳定，在使用的过程中易丧失其自身活性且使用后游离酶不易分离，这在一定程度上极大的限制了脂肪酶在大规模工业生产中的应用。

与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶具有：(1)稳定性好、可重复使用、反应条件易于控制，生产成本低；(2)固定化脂肪酶容易与底物、产物分离，易于产品纯化；(3)固定化脂肪酶更适宜多酶反应体系。目前对于固定化脂肪酶的研究不仅在工业生产的连续化和自动化上有重要价值，而且在生物学的基本理论研究中，在临床医学和促进其他生化技术的发展中，都有重大的意义。

载体性质会对酶负载量、酶活及酶流失率影响显著。目前，用于固定化酶的载体很多，其中二氧化硅具有成本低、耐酸碱、寿命长、对微生物无毒性、不易被微生物分解等特性，而且其具有较大的比表面积，蛋白吸附量较大，因而是一类重要的载体材料。但是二氧化硅载体是惰性载体，亲水和亲油性能都一般。聚偏氟乙烯载体亲油性好，但是亲水性差，由于水有利于保持酶的活性，因此聚偏氟乙烯载体不利于保持酶的活性。也有人将纤维素与聚偏氟乙烯混合制备的载体，纤维素表面有羟基，对于酶活性的保持有一些帮助，但是太多羟基不利于酶的固定化。综上所述，目前还没有理想的双亲性酶固定化载体。

发明内容

发明目的：为了克服现有的酶固定化载体存在的问题，本发明提供一种双亲性酶固定化载体，兼具优异的亲油和亲水的性能。

技术方案：本发明所述的一种双亲性酶固定化载体，由下述方法制得：

(1)取天然植物纤维材料和聚偏氟乙烯，分别干燥备用；

(2)配制离子液体溶液；

(3)将步骤(1)所得天然植物纤维材料和聚偏氟乙烯加入离子液体溶液中，然后加入仿酶，加热搅拌处理或者气爆处理，再加入修饰剂搅拌均匀，洗涤、干燥、真空脱气，得到双亲性的载体；

(4)采用细菌对步骤(3)所得载体进行生物处理；

(5)对步骤(4)所得载体进行抗菌修饰，产物经洗涤、干燥、真空脱气，得到双亲性酶固定化载体。

上述步骤(1)中，天然植物纤维材料优选为木质素与纤维素的混合物，其中，木质素与纤维素的质量比为1:1～6。

步骤(2)中，离子液体溶液优选为离子液体与二甲基亚砜溶液或N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液，其中，离子液体可为1-乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐、1-甲基-3-甲基咪唑磷酸二甲酯盐、1-甲基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐、1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二甲酯盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基吡啶氯盐中的至少一种；二甲基亚砜溶液或N,N-二甲基甲酰胺溶液的质量为离子液体质量的2～8％。

步骤(3)中，较优的，天然植物纤维材料与聚偏氟乙烯的质量比为1:1～5:7，天然植物纤维材料与离子液体的质量比为1:15～20。仿酶可为Fe-CA、TPPFe、Fe-EDTA中的任意一种或两种的混合物，优选控制加入仿酶后离子液体溶液终浓度为8～30mmol·kg^-1；进一步的，加入仿酶后130～150℃加热搅拌处理或100～130℃气爆处理，处理时间为10～30min。修饰剂可为京尼平、三羟甲基磷、马来酸酐或碳化二亚胺，加入修饰剂后溶液终浓度优选为0.05～0.2M。

步骤(4)中，生物处理采用的细菌可为枯草芽孢杆菌和/或解淀粉芽孢杆菌。

步骤(5)中，抗菌修饰的方法具体为：将步骤(4)所得载体加入抗菌试剂中，油浴加热反应；其中，抗菌试剂优选为壳聚糖与银或二氧化钛的混合物。

发明原理：本发明以天然植物纤维材料(木质素、纤维素)及聚偏氟乙烯为原料，以离子液体为反应介质，对载体进行仿酶、气爆处理，处理过程中，木质素分子内部的聚合结构发生部分破坏，使大量的羧基、醛基、羟基、氨基等游离基团暴露在表面，处理完成后，表面羧基、醛基、羟基、氨基的数量增加了2～3倍，这些游离基团可为固定化酶提供多种活性基团，利于保持酶的活性，同时，纤维素由长纤维断链成短纤维，游离羟基增多，且与聚偏氟乙烯的混合均匀性更佳，使载体的性能更佳，且载体更均匀；然后进一步通过生物处理，可提高载体的生物兼容性，破坏生物不兼容的物质，比如仿酶(气爆)处理产生的有毒物质，同时还可以起到对纤维素成分的表面处理作用，增加载体的粗糙程度。处理后的载体表面具有较多的层叠结构、凸起结构和通道结构，大大提高了载体表面的利用率，酶可以固定于载体内部的空隙中，也可以固定于载体的表面，酶蛋白可以受到较好的保护，因此其稳定性、重复使用性、有机相中的稳定性可得到显著提高。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明的双亲性酶固定化载体兼具亲油和亲水的性能，载体性质稳定性好、酶吸附率高，载体表面的利用率可达60～95％；而且，该酶固定化载体重复使用多次，仍能保持较高的酶活性；(2)本发明的制备方法中，采用离子液体对木质纤维素材料和聚偏氟乙烯处理，处理过程操作条件温和、绿色环保、无污染、处理工艺简易，且处理后的离子液体可以完全回收，可降低载体的生产成本；而且，制备过程中加入了抗菌物质，解决了载体的污染问题。

附图说明

图1为本发明的双亲性酶固定化载体的制备流程图；

图2为实施例1中生物处理后所得载体的扫描电镜图；

图3为实施例1中抗菌修饰后所得载体的扫描电镜图；

图4为固定化酶催化乙酸乙酯和丁醇的转酯反应的重复使用性；

图5为固定化酶催化菜籽油酯化反应的重复使用性。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明的一种双亲性酶固定化载体，兼具亲油和亲水的性能，载体表面具有较多的层叠结构、凸起结构和通道结构，载体表面的利用率可达60～95％，酶可以固定于载体内部的空隙中，也可以固定于载体的表面，酶蛋白可以受到较好的保护，因此其稳定性、重复使用性、有机相中稳定性得到大大提高。

该双亲性酶固定化载体由下述方法制得，如图1，包括如下步骤：

(1)取天然植物纤维材料和聚偏氟乙烯，分别干燥备用；

干燥后，可采用粉碎或球磨等方式对原料进一步处理，得粉末状原料，备用；

(2)配制离子液体溶液；

(3)离子液体中仿酶处理：将步骤(1)处理后的天然植物纤维材料和聚偏氟乙烯粉末加入离子液体溶液中，然后加入仿酶，加热搅拌处理或者气爆处理，再加入修饰剂搅拌均匀，洗涤、干燥、真空脱气，得到双亲性的载体；

(4)生物处理：采用细菌对步骤(3)所得载体进行生物处理；

(5)抗菌修饰：将步骤(4)所得载体加入抗菌试剂中进行抗菌修饰，产物经洗涤、干燥、真空脱气，得到双亲性酶固定化载体。

实施例1

(1)原料准备

①木质纤维素材料的准备：1g木质素粉末和1g纤维素粉末，70℃鼓风干燥箱干燥、用粉碎机粉碎5min，过200目筛子，备用。

②聚偏氟乙烯(PVDF)粉末的制备：取聚偏氟乙烯粉末、烘干、研磨、过200目筛子。

(2)离子液体的制备

①制备1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯盐(1-Methyl-3-ethylimidazoliumDimethylphosphate，简写为“[DMIM][DMP]”)

将磷酸三甲酯和1-甲基咪唑按照1.2:1的摩尔比混合于三口烧瓶中，其上安装回流冷凝管，装入磁力搅拌子，一个口连接水泵，并抽真空，油浴加热搅拌反应8-10h，温度控制在130℃。待反应结束后，使用乙酸乙酯萃取反应液三次，然后在60℃的旋转蒸发仪上进行减压蒸馏2h，最后在60℃的真空干燥箱中干燥过夜即得到[DMIM][DMP]。

②制备离子液体溶液

取50g的1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯盐，加入1g的DMSO，搅拌混合均匀。

(3)仿酶Fe-CA的制备

称取硫酸亚铁和顺丁烯二酸，分别配成0.1mol/L的溶液；首先将配制好的顺丁烯二酸溶液转移到三口烧瓶中，加入少量的铁粉，同时在通入氮气的保护下，将三口烧瓶放入恒温水浴锅中低速搅拌10min；然后向三口烧瓶中按照硫酸亚铁与顺丁烯二酸摩尔比1:1加入硫酸亚铁溶液，待硫酸亚铁完全溶解后，反应过程中pH值始终保持在5，40min后将反应溶液转移至烧杯中，加入无水乙醇，搅拌10min左右，待析出螯合物后过滤并用无水乙醇洗涤三次沉淀物，在真空干燥箱中底温干燥得到Fe-CA样品。

(4)离子液体处理过程：将0.2g木质纤维素材料和0.2g聚偏氟乙烯粉末加入4g离子液体溶液中，然后加入仿酶Fe-CA使其终浓度为8mmol·kg^-1，150℃加热搅拌处理10min，冷却至60℃，加入修饰剂京尼平使其终浓度为0.05M搅拌均匀，向体系中加入纤维素混合液5倍体积的水，洗涤除去杂质，然后60℃干燥、真空干燥箱真空脱气制成酶固定化载体。

(5)生物处理：取0.1g载体加入浊度OD₆₀₀＝0.2的枯草芽孢杆菌，室温搅拌处理1h，蒸馏水洗涤，干燥；所得载体的扫描电镜图如图2，可以看到，通过上述处理方法得到的载体为多层叠的结构，可以为酶提供较多的位点。

(6)抗菌修饰：将壳聚糖溶解至在1％CH₃COOH中达到0.8％(w/v)，pH调节至5，加入5mg/mL AgNO₃水溶液，在剧烈搅拌下将2mL NaBH₄加入到30mL混合物溶液中，然后缓慢加入5mg/mL的AgNO₃，将Ag沉积包裹在壳聚糖里面；加入18mL0.1M琥珀酸/琥珀酸盐缓冲液，加入1g生物处理后的载体和0.1mg漆酶，40℃搅拌反应6h，水洗涤，在50℃下干燥，真空干燥箱真空脱气，得到本发明的双亲性酶固定化载体；其扫描电镜图如图3。

实验一抗菌性能检测

制备聚偏氟乙烯载体：取烧杯按照1:7(W/W)的比例加入聚偏氟乙烯和N，N-二甲基甲酰胺，混合均匀，70℃干燥，获得聚偏氟乙烯膜。

比较本实施例制得的双亲性酶固定化载体与聚偏氟乙烯载体的抗菌性能。

实验方法如下：

在LB培养基中接种大肠杆菌、金黄葡萄球菌或枯草杆菌，在37℃，110r/min的恒温培养箱中培养8h。取定量的菌液于5ml液体培养基中，加入定量样品，每隔一小时取出菌液，将培养物使用离心的方法将培养基与细胞分离，并用已灭菌的生理盐水洗涤三次，再次离心以得到纯净细胞。然后将沉淀悬于生理盐水中，测定菌在600nm处的吸光值。

取20ml上述细菌悬浮液与载体置于已灭菌锥形瓶中，并在37℃和230r/min下温育，将处理3h后的悬浮液用无菌生理盐水稀释5×10⁶倍，涂布在平板培养基上，并进一步在37℃下培育12～24h(每个样品重复3组)计菌落数，并与未经样品处理的菌液(空白对照)进行对比，计算菌落生长情况，并绘制下表1。

由表1可见，本实施例制备的双亲性酶固定化载体对常见微生物有较好的抗性，大肠杆菌、金黄葡萄球菌和枯草杆菌的存活菌落数分别为2、2、3，而聚偏氟乙烯载体的相应微生物存活菌落数分别为104、94和110，说明本发明制备的双亲性酶固定化载体具有较好的抗菌性能，可以长期使用，不用担心微生物对载体造成破坏。

表1不同载体的抗菌性能分析

实验二固定化酶性能检测

取20ml的50mM，pH7.6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，加入1mg脂肪酶，加入1g本实施例制得的酶固定化载体，在40℃水浴摇床中反应3h，过滤获得固定化酶，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤直至检测不到蛋白为止。采用考马斯亮蓝法检测脂肪酶的吸附率，检测到脂肪酶的吸附率为1400mg/g，酶表观活性为1200IU/g。

实验三酶活力测定

分别采用本实施例制备的双亲性酶固定化载体、上述制得的聚偏氟乙烯载体固定化脂肪酶，然后进行两组平行实验，测试比较双亲性酶固定化载体固定化脂肪酶与聚偏氟乙烯载体固定化脂肪酶的相对活性。测试方法如下：

用乙酸乙酯和丁醇的转酯反应作为酶活性测试条件。实验条件为乙酸乙酯和正丁醇摩尔比为1:1，反应温度为60℃，转速为260r·min^-1。反应后所测样品和乙腈混合后在离心机离心30s，然后用气相色谱进行分析。定义每分钟催化消耗1mol乙酸乙酯所需的酶质量为一个活力单位(U)。固定化脂肪酶活性所占同等质量的游离脂肪酶活性的比例作为固定化脂肪酶的相对活性，并定义相同质量的游离脂肪酶活性为100％。

采用GC检测条件：柱温35℃；进样量10μL；流动相为85％甲醇水溶液(v/v)；等度洗脱；流速1mL/min；二级管阵列检测器检测210nm处波长。

酶重复使用性：为了确定固定化酶的重复使用性，反应体系温度定为60℃，当底物转化率达到50％时停止反应，用磷酸缓冲液洗涤固定化酶并干燥后加入到预热好的下一批次的反应液中进行反应，每次固定化酶的相对活性随反应次数的实验结果如图4。由图4可以看出，60℃下重复使用固定化酶活性略有下降，但仍能在重复使用10次之后保持86.2％的相对活性，且活性降低趋于平稳，说明重复使用性很好。载体重复15次使用后，酶活性开始下降，聚偏氟乙烯载体固定化酶的相对酶活性为70.5％，而本载体固定化酶的相对酶活性为81.3％。可见，与聚偏氟乙烯载体相比，本发明制备的双亲性的酶固定化载体对于酶的稳定性能够保持得更好。

实施例2

(1)原料准备

①木质纤维素材料的准备：0.5g木质素粉末和3g纤维素粉末，70℃鼓风干燥箱干燥、用粉碎机粉碎5min，过200目筛子，备用。

②聚偏氟乙烯粉末的制备：取聚偏氟乙烯粉末、烘干、研磨、过200目筛子。

(2)离子液体的制备

①[EMIM][DEP]的合成：精确称取磷酸三乙酯182.15g和1-乙基咪唑96.13g置于500mL的三口烧瓶中，加冷凝回流装置，通氮气保护的情况下加热反应。先在80℃反应2h，接着升温至100℃反应2h，最后在150℃反应5h。反应结束后冷却至室温，用乙酸乙酯洗涤3次，旋转蒸发仪60℃下减压蒸馏2-3h，最后放入真空干燥箱中70℃干燥过夜。

②制备离子液体溶液

取100g的[EMIM][DEP]，加入8g的DMF，搅拌混合均匀。

(3)仿酶四苯基卟啉铁(TPPFe)的制备

在配有磁力搅拌和氮气保护的50mL三口烧瓶中，加入1.0g分析纯四苯基卟啉(TPP)和50.0mL的N,N-二甲基乙酰胺，水浴加热(温度为40℃)，搅拌回流。分批加入4.8gFeCl₂·4H₂O，回流4h。应结束后冷却过滤，固体分别用0.1M的稀盐酸、水和95％乙醇洗涤。再加入两倍体积的二氯甲烷重结晶以除去过量的无机盐，真空干燥24h后即得晶体，产率为82.9％。

(4)离子液体处理过程：将2g木质纤维素材料和2g聚偏氟乙烯粉末加入30g离子液体溶液中，然后加入仿酶TPPFe使其终浓度为30mmol·kg^-1，130℃气爆处理15min，冷却至80℃，加入修饰剂马来酸酐使其终浓度为0.05M搅拌均匀，向体系中加入5倍体积的水，洗涤除去杂质，然后60℃干燥。

(5)生物处理：取0.1g载体加入浊度OD₆₀₀＝0.2的解淀粉芽胞杆菌，室温搅拌处理1h，蒸馏水洗涤，干燥，得到处理后的载体。

(6)抗菌修饰：将壳聚糖溶解至在1％CH₃COOH中达到0.8％(w/v)，pH调节至5，加入5mg/mL AgNO₃水溶液，在剧烈搅拌下将2mL NaBH₄加入到30mL混合物溶液中，然后缓慢加入5mg/mL的AgNO₃，加入18mL 0.1M琥珀酸/琥珀酸盐缓冲液，加入1g生物处理后的载体和0.1mg漆酶，40℃搅拌反应6h，水洗涤，在50℃下干燥，真空干燥箱真空脱气，制得双亲性酶固定化载体。

实验一固定化酶性能检测

取20ml的50mM，pH7.6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，加入1mg脂肪酶，加入1g本实施例制得的双亲性载体，在40℃水浴摇床中反应3h，过滤获得固定化酶，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤直至检测不到蛋白为止。采用考马斯亮蓝法检测脂肪酶的吸附率，检测到脂肪酶的吸附率为1550mg/g，酶表观活性为1320IU/g。

实验二酶活力的测定

以菜籽油乳化液为底物(取4％的聚乙烯醇溶液与菜籽油按3:1(V/V)混合，在磁力搅拌器上高速搅拌10min，即得到乳白色的菜籽油乳化液，保存于4℃下备用)。取两个100ml的三角瓶，分别作为样品瓶(A)和对照瓶(B)，在两瓶中各加底物溶液2ml、pH7.6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液2.5mL，再于A瓶中加入95％的乙醇7.5mL，然后在40℃水浴锅中预热5min。之后，在两瓶中各加待测固定化脂肪酶1cm²，在40℃水浴中反应15min，然后在B瓶中补加95％乙醇7.5ml，终止反应。

最后以酚酞为指示剂，用0.05mol/L的NaOH标准溶液滴定，记录其消耗体积，根据下列公式即可计算出固定化酶的酶活力。我们定义酶活力单位为：每平方厘米固定化脂肪酶膜在pH7.6条件下，水解脂肪每分钟产生1μmol的脂肪酸所消耗的酶量为一个酶活力单位，以U/cm²表示。

U＝(V_样－V_空)×N×10³×(1/t)×n

式中：U为样品脂肪酶的活力/(U/cm²或U/mL)；V_样为滴定样品时NaOH标准溶液消耗的体积/mL；V_空为滴定空白时NaOH标准溶液消耗的体积/mL；N为NaOH标准溶液的浓度/(mol/L)；10³是由0.05mol/L的NaOH标准溶液浓度换算系数与0.05mol/LNaOH标准溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol换算而来的；t为酶活力测定时的反应时间/min；n为酶液样品的稀释倍数(游离酶)。

图5为固定化脂肪酶在多次重复使用后相对酶活力的变化情况。由图5可见，与聚偏氟乙烯固定化载体相比较，本发明制备的固定化载体对于酶的稳定性保持得更好，本实施例制备的载体固定化酶第二次使用时酶活为88.3％；第六次使用时酶活保持在20.3％，而聚偏氟乙烯固定化酶的活性仅仅为5.1％。

Claims

1.一种双亲性酶固定化载体，其特征在于，该固定化载体由下述方法制得：

（1）取天然植物纤维材料和聚偏氟乙烯，分别干燥备用，所述天然植物纤维材料为木质素与纤维素的混合物，其中，木质素与纤维素的质量比为1:1~6；

（2）配制离子液体溶液；

（3）将步骤（1）所得天然植物纤维材料和聚偏氟乙烯加入离子液体溶液中，然后加入仿酶，加热搅拌处理或者气爆处理，再加入修饰剂搅拌均匀，洗涤、干燥、真空脱气，得到双亲性的载体，所述修饰剂为京尼平、三羟甲基磷、马来酸酐或碳化二亚胺，加入修饰剂后溶液终浓度为0.05~0.2M，所述天然植物纤维材料与聚偏氟乙烯的质量比为1:1~5:7，天然植物纤维材料与离子液体的质量比为1:15~20，所述仿酶为Fe-CA、TPPFe、Fe-EDTA中的任意一种或两种的混合物，加入仿酶后离子液体溶液终浓度为8~30 mmol·kg^-1；加入仿酶后130~150℃加热搅拌处理或100~130℃气爆处理，处理时间为10~30min；

（4）采用细菌对步骤（3）所得载体进行生物处理，所述细菌为枯草芽孢杆菌和/或解淀粉芽孢杆菌；

（5）对步骤（4）所得载体进行抗菌修饰，产物经洗涤、干燥、真空脱气，得到双亲性酶固定化载体。

2.根据权利要求1所述的双亲性酶固定化载体，其特征在于，步骤（2）中，所述离子液体溶液为离子液体与二甲基亚砜溶液或N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液，其中，所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐、1-甲基-3-甲基咪唑磷酸二甲酯盐、1-甲基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯盐、1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二甲酯盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基吡啶氯盐中的至少一种；所述二甲基亚砜溶液或N,N-二甲基甲酰胺溶液的质量为离子液体质量的2~8%。

3.根据权利要求1所述的双亲性酶固定化载体，其特征在于，步骤（5）中，所述抗菌修饰的方法为：将步骤（4）所得载体加入抗菌试剂中，油浴加热反应；其中，所述抗菌试剂为壳聚糖与银或二氧化钛的混合物。