CN106473933A

CN106473933A - 粘接辅助的生物矿化材料及其在仿生矿化中的应用

Info

Publication number: CN106473933A
Application number: CN201610893275.1A
Authority: CN
Inventors: 傅柏平; 吴志芳; 金晓婷; 王喆; 洪艳; 王晓侃
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-10-13
Filing date: 2016-10-13
Publication date: 2017-03-08

Abstract

本发明提供了一种粘接辅助的生物材料及其在仿生矿化中的应用，以促进I型胶原蛋白及脱矿牙釉质、牙本质的再矿化。粘接辅助的生物矿化材料是指合成用非胶原蛋白类似物稳定的无定形磷酸钙颗粒。粘接辅助的生物矿化材料在仿生矿化中的应用是将辅助矿化材料与自酸蚀粘接剂混合制成粘接辅助的生物矿化剂，涂于单层重组I型胶原及脱矿牙釉质、牙本质表面研究其对单层重组I型胶原和脱矿牙釉质、牙本质的矿化性能。该发明改变现有生物矿化模式(应用溶液和糊剂，即漱口或局部涂布)。辅助矿化材料与粘接剂混合，固化后从液态转变成固态，成为粘接性防龋涂料，可长期粘附在需要矿化的部位，增加与牙齿的作用时间，使用简便，促进脱矿牙齿的自我修复。

Description

粘接辅助的生物矿化材料及其在仿生矿化中的应用

技术领域

本发明属于仿生生物材料工程技术领域，具体地说涉及一种粘接辅助的生物矿化材料及其在仿生矿化中的应用，促进I型胶原蛋白及脱矿牙釉质、牙本质再矿化。

背景技术

无定形矿物相包括二氧化硅、无定形磷酸钙和无定形碳酸钙等在自然界中广泛存在，是生物矿化过程中最先形成的矿物相。牙体硬组织的形成实际上是一个生物矿化的过程，其中起关键作用的是纳米颗粒前驱相，即无定形磷酸钙(amorphous calciumphosphate,ACP)。羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)构成了牙齿的无机主体部分，赋予牙齿良好的力学硬度和生物学功能。生物矿化过程中，其核心是无机矿物纳米前驱相在有机物的调控下进行有序的沉积、生长，有机物特别是蛋白质的参与对无机物的沉积具有非常重要的作用。在牙釉质的形成过程中，釉原蛋白起着最重要的调控作用，可以对磷酸钙表面进行选择性吸附从而决定晶体的生长方向。在牙本质的形成过程中，只占牙本质有机物中含量10％的非胶原蛋白(non-collagenous proteins，NCPs)可以引导和调节牙本质的生物矿化。这些蛋白质都具有共同的特点，富含很多酸性氨基酸残基，如釉原蛋白中含有丰富的谷氨酸和天冬氨酸，非胶原蛋白中富含丝氨酸和天冬氨酸。其中氨基酸的功能性基团包括多重羧基或磷酸基，对生物矿物的形成起着重要的作用。龋病是危害人类口腔健康最普遍的疾病，龋齿的形成实际是牙齿在生物环境中的脱矿过程。促进牙齿的再矿化，可使牙体组织进行自我修复，阻止龋病的发生。无定形磷酸钙(ACP)在牙齿矿化初期起着关键作用，ACP内部含有高达10-20％的水量，其内部原子介于晶体和溶液的无序排列，赋予了ACP类似于液体的“流动性”，具有极好的生物矿化潜能。随着ACP在生物矿化过程中的发现和生物矿物生成机理的不断揭示，越来越多的研究集中到利用ACP模仿生物矿化途径来制备新型有机无机复合材料。但是ACP性能不稳定，ACP很容易自发地相变成热力学更稳定的结晶态HAp。在制备ACP时必须采用特殊的方法或者加入无机物或是有机生物大分子添加剂，以阻止这一转变。大量研究表明：聚电解质如聚丙烯酸(Polyacrylic acid，PAA)、聚天冬氨酸(Polyaspartic acid，PAsp)、谷氨酸(Glutamic acid，Glu)或表面修饰等方法可以维持ACP亚稳态。由于天然釉原蛋白和非胶原蛋白提取和纯化较困难，成本高，而且除了要保证纯度外，还必须保持蛋白产品的生物学活性，这存在一定的困难。氨基酸是蛋白质的基本组成单元，所以氨基酸在仿生矿化中的作用被广泛的研究。目前与釉原蛋白和NCPs功能结构域相似的多聚电解质如聚丙烯酸，聚乙烯基膦酸(Polyvinylphosphonic acid，PVPA)，聚氨基酸大分子如聚天门冬氨酸、谷氨酸等在仿生再矿化中的应用越来越多，力图通过NCPs类似物在仿生矿化中的应用复制出与自然矿化组织相似的矿化相。但上述研究都是在含钙离子源、磷酸根离子源及非胶原蛋白类似物的仿生矿化溶液或糊剂中促使牙本质胶原纤维矿化，由于与牙齿作用时间短，矿化效果不确定。钙和磷酸根离子是牙齿再矿化的物质基础，钙磷离子浓度越高越有利于牙齿的再矿化，基于此原理所生产再矿化制剂主要是以钙离子或磷酸根离子为主要成分，同时辅以氟离子等物质，如漱口水、护牙素等，但其与牙齿表面结合力差，在牙齿表面停留时间短，无法持续、稳定地提供钙磷源，使得作用于牙齿表面的钙磷量无法达到持续过饱和状态，无法达到理想的矿化效果。同时在高氟区予以氟化制剂会导致慢性氟中毒。因而，能为牙齿持续、稳定提供钙磷源，并能促使脱矿牙齿再矿化的方法及其材料亟待研究。

根据粘接剂的操作步骤不同，可以分为酸蚀-冲洗类粘接剂(etch-&-rinseadhesives)和自酸蚀类粘接剂(self-etch adhesives)两大类牙齿粘接系统。常用的弱酸性自酸蚀粘接剂(self-etch adhesives)含有酸性亲水性单体，pH值约为2-3；早期研究发现自酸蚀粘接剂固化后，呈现半渗透膜的特性，电镜下可见微孔样结构。自酸蚀粘接剂处理牙体表面后，可使牙体(牙釉质或牙本质)表面部分脱矿，释放钙和磷酸根离子，这些可溶物随着粘接剂中的水分挥发，又沉积回牙齿表面，并与粘接剂混合，原位固化形成混合层(hybrid layer)-该层既有牙齿成分又有粘接树脂成分。

因而，我们希望经非胶原蛋白类似物如聚电解质PAsp、PAA、Glu等稳定剂稳定的nACP颗粒添加到弱酸性的自酸蚀粘接剂中，粘接剂固化后直接粘附于脱矿的牙本质表面，借助于粘接剂的半渗透特性和分散在粘接剂中的nACP颗粒，依赖粘接剂自身的弱酸性微环境，使ACP相转变为HAp；同时，自酸蚀粘接剂可使牙齿表面部分脱矿，使粘接剂-牙齿界面的钙磷浓度达到饱和状态。此外，借助于粘接作用，nACP颗粒可以长期粘附于牙齿表面，因而可以长期、稳定地提供钙磷源，促进脱矿牙齿的自我修复，同时借助NCPs类似物引导脱矿的牙本质胶原纤维内矿化。

发明内容：

技术问题:本发明旨在提供一种粘接辅助生物矿化材料及其应用。利用本发明的粘接辅助矿化材料，与粘接剂混合，固化后可以长期、稳定地粘附于牙齿表面，持续、稳定地提供钙磷源，解决目前再矿化制剂作用时间短，矿化效果差的问题，促使I型胶原蛋白及其脱矿牙釉质、牙本质再矿化。

技术方案：为达上述目的，本发明的技术方案包含粘接辅助生物矿化材料及其在仿生矿化中的应用。

一种粘接辅助生物矿化材料，其制备方法如下：采用溶液沉淀法，将磷酸二氢钠和非胶原蛋白类似物混合溶液与氯化钙溶液混合反应，钙和磷最终摩尔浓度比为10:6；离心放入真空干燥箱内过夜，得到用非胶原蛋白类似物稳定的nACP；将固态nACP颗粒保存在聚乙烯塑料瓶内室温下密封保存；nACP颗粒大小为20-100nm。

优选的，所述的非胶原蛋白类似物为Pasp、PAA或谷氨酸，最终混合反应液中PAA浓度为10-1000ug/ml，PAsp浓度为10-1000ug/ml，谷氨酸的浓度是10-500mM/L。

本发明公开了一种所述粘接辅助生物矿化材料在仿生矿化中的应用，应用于体外诱导重组I型胶原再矿化；具体方法为：

1)将鼠尾I型胶原溶于缓冲液配制成50ug/ml的胶原溶液中，缓冲液溶液中甘氨酸浓度为50mM和KCl浓度为200mM，PH＝9.2，然后将3uL的胶原溶液滴在透射电镜镍网上，37℃恒温箱过夜，用质量百分比浓度为0.5％的戊二醛交联1-2h；得到附有重组胶原的TEM镍网；

2)制备权利要求1所述的粘接辅助生物矿化材料，按粘接剂的重量的5-85％，将粘接辅助生物矿化材料与粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于载有I型重组胶原的TEM镍网上，静置30-60s，光照固化40s；将镍网悬浮于人工唾液中，用TEM及选区电子衍射(selected areaelectron diffraction，SAED)观察矿化情况。

应用于体外诱导脱矿牙本质再矿化；具体方法为：

1)收集无龋的人第三磨牙，用Isomet慢速切割机垂直于牙长轴切取厚度1mm牙本质块，然后用600-2000目SiC纸逐一打磨，再将牙片放入37wt％磷酸溶液中，30秒后取出，用去离子水冲洗，获得约5-8um的脱矿层；

2)制备权利要求1所述的粘接辅助生物矿化材料，按粘接剂的重量的5-85％，将粘接辅助生物矿化材料与粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于脱矿牙本质表面，静置30-60s，光照固化40s；将牙本质片放入人工唾液中，在37℃恒温箱内培养。将矿化的牙本质样本酒精梯度脱水，用TEM及SAED观察矿化效果。

应用于体外诱导脱矿牙釉质再矿化；具体方法为：

1)收集无龋的人第一前磨牙，用Isomet慢速切割机垂直于牙冠切取大小约3*3*0.5mm的牙釉质块，然后用600-2000目SiC纸逐一打磨，再将牙片放入37wt％磷酸溶液中，30秒后取出，用去离子水冲洗，获取脱矿牙釉质；

2)制备权利要求1所述的粘接辅助生物矿化材料，按粘接剂的重量的5-85％，将粘接辅助生物矿化材料与粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于脱矿牙釉质表面，静置30-60s，光照固化40s；将牙釉质片放入人工唾液中，在37℃恒温箱内培养。将矿化的牙釉质样本酒精梯度脱水，用SEM/TEM及SAED观察矿化效果。

优选的，粘接剂为自酸蚀粘接剂，如Clearfil S3，Easy one bond(3M)等。

有益效果1.粘接辅助矿化材料制备工艺简单，保存方便，适合大规模生产，所合成的粘接辅助矿化材料固态nACP颗粒约为20-100nm大小，易于进入胶原纤维内的空隙内；2.粘接辅助矿化材料具有良好的生物相容性，无毒无刺激；3.粘结辅助矿化材料在仿生矿化中的应用简单有效：将自酸蚀粘接剂与粘接辅助矿化材料按照一定的质量比混合，形成一种液态矿化源，然后涂于单层I型重组胶原或脱矿牙釉质、牙本质表面，光照固化。SEM、TEM及选区电子衍射(SAED)观察牙本质及重组I型胶原出现纤维内矿化，脱矿牙釉质表面出现再矿化。4.获得良好的长期牙本质粘结强度。

附图说明：

图1是PAA稳定的nACP颗粒的TEM图；

图2是PAA稳定的nACP颗粒的红外光谱图；

图3是PAA稳定的nACP颗粒的生物相容性实验结构图；

图4是重组I型胶原自组装的TEM图；

图5是粘接辅助矿化重组I型胶原TEM及SAED图；

图6是PAsp稳定的nACP颗粒的TEM图；

图7是PAsp稳定的nACP颗粒的XRD图；

图8是粘接辅助矿化脱矿牙本质的TEM图；

图9是粘结辅助矿化剂的牙本质微拉伸粘结强度。

具体实施方式

本发明技术方案只针对重组I型胶原和离开生物活体组织的牙齿进行处理。该方法用于非治疗目的。结合附图及实施例对本发明进行进一步阐述：

实施例1

1.1合成用非胶原蛋白类似物聚丙烯酸(PAA)稳定的nACP颗粒(PAA-ACP)

采用溶液沉淀法，向磷酸二氢钠和PAA的混合液中滴入等体积的氯化钙液，滴定过程中溶液的PH值控制在9.5±0.5，控制滴定时间为0.5-1h。钙和磷最终摩尔浓度比为10:6，PAA最终浓度为500ug/ml。离心放入真空干燥箱内过夜。次日将所合成的nACP颗粒保存在聚乙烯塑料瓶内室温下密封保存。透射电子显微镜(TEM)观察观察PAA稳定的ACP颗粒形态规则，大小约为20-100nm(附图1)。傅里叶红外分析(FTIR)所合成的ACP在580cm^-1处有一个包峰，未发生劈裂，为无定形相(附图2)。采用CCK-8方法检测所合成的PAA-ACP颗粒具有良好的生物相容性(附图3)。

1.2重组I型胶原模型制备，模拟牙本质I型胶原

将来源于鼠尾的I型胶原(sigma公司)溶于缓冲液(甘氨酸50mM、KCl 200mM，PH＝9.2)中，配制成50ug/ml的胶原溶液，然后将3uL的胶原溶液滴在透射电镜镍网上，37℃恒温箱过夜，次日用0.5％戊二醛交联1-2h。随机抽取附有重组胶原的TEM镍网，乙酸釉中染色，TEM观察，判断胶原是否重组成功。附图4所示胶原纤维呈明暗相间的67nm周期结构，与I型胶原特征性结构吻合。

1.3对单层重组I型胶原矿化

按粘接剂的剂量的25wt％，将上述合成固态PAA-ACP颗粒与将商品化粘接剂如Clearfil S3 Bond粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于载有I型重组胶原的TEM镍网上，静置30-60s，光照固化40s。将镍网悬浮于人工唾液中，21天后，TEM及SAED观察胶原出现纤维内矿化(附图5A)。

实施例2

2.1合成用非胶原蛋白类似物聚天冬氨酸酸(PAsp)稳定的nACP颗粒(PAsp-ACP)

采用溶液沉淀法，将磷酸二氢钠和PAsp的混合液与等体积的氯化钙液混合反应10-30min，钙和磷最终浓度比为10:6，Pasp最终浓度为240ug/ml。离心放入真空干燥箱内过夜。次日将所合成的固态nACP颗粒保存在聚乙烯塑料瓶内室温下密封保存。用透射电子显微镜(TEM)观察观察ACP形态规则，大小约为20-80nm(附图6)。XRD检测所合成的ACP为无定形相(附图7)。

2.2重组I型胶原模型制备，模拟牙本质I型胶原：同实施例1

2.3对单层重组I型胶原矿化

按粘接剂的剂量的20wt％，将上述合成固态PAsp-ACP颗粒与商品化粘接剂如Easyone粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于载有I型重组胶原的TEM镍网上，静置30-60s，光照固化40s。将镍网悬浮于人工唾液中37℃恒温箱内培养，14天后，TEM及SAED观察胶原出现纤维内矿化(附图5B)。

实施例3

3.1合成用非胶原蛋白类似物聚丙烯酸(PAA)稳定的nACP颗粒(PAA-ACP)同实施例1，PAA最终浓度为300ug/ml。

3.2重组I型胶原模型制备，模拟牙本质I型胶原

同实施例1

3.3对单层重组I型胶原矿化

按粘接剂的剂量的5wt％，将上述合成固态PAA-ACP颗粒与将商品化粘接剂如Clearfil S3 Bond粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于载有I型重组胶原的TEM镍网上，静置30-60s，光照固化40s。将镍网悬浮于人工唾液中，21天后，TEM及SAED观察胶原出现纤维内矿化，TEM图与实施例1相同。

实施例4

4.1合成用非胶原蛋白类似物聚天冬氨酸酸(PAsp)稳定的nACP颗粒(PAsp-ACP)同实施例2，PAsp最终浓度为120ug/ml。

4.2脱矿牙本质样本制备

收集无龋的人第三磨牙，用Isomet慢速切割机垂直于牙长轴切取厚度约1mm牙本质块，然后用600-2000目SiC纸逐一打磨，再将牙片放入37wt％磷酸溶液中，30秒后取出，用去离子水冲洗，获得约5-8um的脱矿层。

4.3脱矿牙本质样本矿化研究

对照组按照商品化粘接剂Clearfil S3 Bond的操作说明，将粘结剂涂在脱矿牙本质表面，实验组按粘接剂的剂量的20wt％，将固态PAsp-ACP颗粒与商品化粘接剂ClearfilS3 Bond粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于脱矿牙本质表面，静置30-60s，光照固化40s。将牙本质片放入人工唾液中，在37℃恒温箱内培养。将矿化的牙本质样本酒精梯度脱水，1个月后，透射电镜(TEM)及选区电子衍射(SAED)观察发现实验组在脱矿牙本质底部出现矿化(附图8)。图8中Dentin:牙本质；D：脱矿层，R：再矿化层；A：对照组；B：实验组；C：为B图中再矿化层(R)的SAED图。

实施例5

5.1合成用非胶原蛋白类似物聚天冬氨酸酸(PAsp)稳定的nACP颗粒(Pasp-ACP)

同实施例2

5.2脱矿牙本质样本制备:

同实施例4

5.3脱矿牙本质样本矿化研究

对照组按照商品化粘接剂Clearfil S3 Bond的操作说明，将粘结剂涂在脱矿牙本质表面，实验组按粘接剂的剂量的85wt％，将固态PAsp-ACP颗粒与商品化粘接剂ClearfilS3 Bond粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于脱矿牙本质表面，静置30-60s，光照固化40s。将牙本质片放入人工唾液中，在37℃恒温箱内培养。将矿化的牙本质样本酒精梯度脱水，透射电镜(TEM)及选区电子衍射(SAED)观察发现实验组在脱矿牙本质底部出现矿化，TEM图同实施例4。

实施例6

6.1合成用非胶原蛋白类似物聚天冬氨酸酸(PAsp)稳定的nACP颗粒(Pasp-ACP)

同实施例4

6.2牙本质样本的制作

收集无龋的人磨牙，用慢速切割机垂直于牙体长轴，在牙冠的牙合中1/3处切除牙合面釉质，暴露牙本质表面(不暴露髓角)。然后，将牙本质表面用600颗粒度(grit)碳化硅纸在流水作用下打磨1分钟。随机分成5组。对照组采用粘接剂Clearfil S3 Bond(可乐丽公司，日本)。实验组将nACP颗粒按质量比5％wt、10％wt、20％wt和30％wt添加进粘接剂Clearfil s3 Bond中。牙本质表面用粘接剂处理静置30-60s，强吹5s，光照固化40s。接着，用复合树脂Clearfil Majesty(可乐丽公司，日本)将样本都堆成4mm的树脂冠，每次2mm，光照20s。

6.3微拉伸强度测试

将上述所制的牙本质样本放置在37℃去离子水中储存，24h和1年后进行微拉伸测试。结果显示：自酸蚀粘接剂中添加nACP对即刻牙本质粘接强度有所降低，且与添加nACP含量相关，但能提高长期牙本质粘接强度。自酸蚀粘接剂中添加少量nACP不会显著降低即刻牙本质粘接强度，而会增加长期的粘接强度(图9)。

实施例7

7.1合成用非胶原蛋白类似物聚天冬氨酸酸(PAsp)稳定的nACP颗粒(Pasp-ACP)

同实施例2

7.2脱矿牙釉质样本的制作

收集无龋的人第一前磨牙，用Isomet慢速切割机垂直于牙冠切取大小约3*3*0.5mm的牙釉质块，然后用600-2000目SiC纸逐一打磨，再将牙片放入37wt％磷酸溶液中，30秒后取出，用去离子水冲洗，获取脱矿牙釉质。

7.3脱矿牙釉质样本矿化研究

对照组按照商品化粘接剂Clearfil S3 Bond的操作说明，将粘结剂涂在脱矿牙釉质表面，实验组按粘接剂的剂量的20wt％，将PAsp-ACP颗粒与商品化粘接剂Clearfil S3Bond粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于脱矿牙釉质表面，静置30-60s，光照固化40s。将牙片放入人工唾液中，在37℃恒温箱内培养。将矿化的牙釉质样本酒精梯度脱水，1个月后，透射电镜(TEM)及选区电子衍射(SAED)观察发现实验组在脱矿牙釉质表面出现矿化。

Claims

1.一种粘接辅助生物矿化材料，其特征在于其制备方法如下：采用溶液沉淀法，将氯化钙溶液、磷酸二氢钠和非胶原蛋白类似物混合溶液混合反应，Ca：P最终摩尔浓度比为10:6；离心放入真空干燥箱内过夜，得到用非胶原蛋白类似物稳定的固态纳米无定形磷酸钙；将固态纳米无定磷酸钙颗粒在聚乙烯塑料瓶内室温下密封保存；固态纳米无定形磷酸钙颗粒大小为20-100nm。

2.根据权利要求1所述的粘接辅助生物矿化材料，其特征在于所述的非胶原蛋白类似物为聚丙烯酸、聚天冬氨酸，谷氨酸，混合后溶液中：聚丙烯酸浓度为10-1000ug/ml，聚天冬氨酸浓度为10-1000ug/ml，谷氨酸的浓度是10-500mM/L。

3.权利要求1所述粘接辅助生物矿化材料在仿生矿化中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于应用于体外诱导重组I型胶原再矿化；具体方法为：

1)将鼠尾I型胶原溶于缓冲液配制成50ug/ml的胶原溶液中，缓冲液PH＝9.2，缓冲液中甘氨酸的浓度为50mM，氯化钾的浓度为200mM KCl；然后将3uL的胶原溶液滴在透射电镜镍网上，37℃恒温箱过夜，用质量百分比浓度为0.5％的戊二醛交联1-2h；得到附有重组胶原的TEM镍网；

2)制备权利要求1所述的粘接辅助生物矿化材料，按粘接剂的重量的5-85％，将粘接辅助生物矿化材料与粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于载有I型重组胶原的TEM镍网上，静置30-60s，光照固化40s；将镍网悬浮于人工唾液中，观察胶原矿化情况。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于应用于体外诱导脱矿牙本质再矿化；具体方法为：

2)制备权利要求1所述的粘接辅助生物矿化材料，按粘接剂的重量的5-85％，将粘接辅助生物矿化材料与粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于脱矿牙本质表面，静置30-60s，光照固化40s；将牙本质片放入人工唾液中，在37℃恒温箱内培养；将矿化的牙本质样本酒精梯度脱水，观察脱矿牙本质内胶原矿化情况。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于应用于体外诱导脱矿牙釉质再矿化；具体方法为：

2)制备权利要求1所述的粘接辅助生物矿化材料，按粘接剂的重量的5-85％，将粘接辅助生物矿化材料与粘接剂混合，搅拌均匀，涂刷于脱矿牙釉质表面，静置30-60s，光照固化40s；将牙片放入人工唾液中，在37℃恒温箱内培养；将矿化的牙釉质样本酒精梯度脱水，观察脱矿牙釉质再矿化情况。

7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述的粘接剂为自酸蚀粘接剂。