CN103027845A

CN103027845A - 一种修复脱矿牙本质的方法

Info

Publication number: CN103027845A
Application number: CN2013100051776A
Authority: CN
Inventors: 顾新华; 唐睿康; 陈怡�; 王建明; 孙健
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-01-06
Filing date: 2013-01-06
Publication date: 2013-04-10

Abstract

本发明涉及一种修复脱矿牙本质的方法。现有修复脱矿牙本质的方法是采用两种牙本质非胶原蛋白类似物，借助于波特兰水门汀缓释体系来实现的，但是这种方法装置过于复杂，达到全层矿化所需的时间需4个月之久。本发明方法先用简便易得的聚丙烯酸作为调节剂，以钙离子和磷离子作为原料，合成15-20nm尺寸具有流动性的无定形磷酸钙颗粒；然后于7天之内再矿化脱矿的牙本质，恢复了脱矿牙本质天然的等级结构，而再矿化后的牙本质的力学性能也达到了与天然牙本质相当的水平。本发明与现有再矿化技术相比，在达到同样恢复等级结构和力学性能的基础上，装置简单，耗时短，更为有效的解决了再矿化脱矿牙本质这一问题。

Description

一种修复脱矿牙本质的方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，涉及一种修复脱矿牙本质的方法。

背景技术

在牙本质粘接过程中，牙本质酸蚀脱矿致胶原纤维暴露，暴露胶原遭内源性基质金属蛋白酶降解是限制树脂—牙本质粘接复合体寿命的关键因素。中度及深度龋齿病变也表现为牙本质层的脱矿和龋坏。解决这些问题都涉及到对脱矿的牙本质进行再矿化。随着人们对牙本质精细结构、胶原纤维与矿物的有机结合情况知识的丰富，对非胶原蛋白在牙本质矿化中作用的认识以及生物矿化具体过程逐渐被人理解并在体外模拟，脱矿牙本质修复领域进入了仿生再矿化的时代。目前主流的仿生再矿化方式为：用两种牙本质非胶原蛋白的仿生类似物，在以Portland Cement作为钙离子缓释源的含磷溶液中成功地使酸蚀脱矿的牙本质再矿化，并且生成纤维内矿物和纤维外矿物。但是，这样的方法耗时达四个月之久，不具备临床实用性。而且，该装置由钙离子源，磷离子源，非胶原蛋白类似物等组成，太过复杂，难以让临床医生从繁忙的工作中解脱。

纳米级无定形磷酸钙颗粒作为存在于生物矿化过程中的前驱体，近年来受到越来越多的关注。有学者研究表明该颗粒内部高达 10-20%的含水量和内部原子介于晶体和溶液的无序排列赋予了其类似液体的“流动性”，无定形颗粒凭借“流动性”预先复制模板的形貌和结构，然后逐渐失水、结晶、固化生成热力学更稳定的结晶态矿物。无定形磷酸钙的基本构成单元是Ca₉(PO₄)₆(Posner Cluster)，这种物质被称作“小团簇”，尺寸大约为0.95 nm，可以相互团聚为尺寸更大的矿物颗粒。本课题组在研究过程中发现，调控聚丙烯酸的浓度可以调控Posner Cluster的团聚，间接调控颗粒的直径，依次方法可以制备出与牙本质天然矿物大小相近的无定形磷酸钙颗粒。

所以，基于上述两个特点，将这一颗粒应用于脱矿牙本质的修复必将在短期内恢复其天然等级结构和优良力学性能。但是相关研究在国内外尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种修复脱矿牙本质的方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案是：

本发明首先合成无定形磷酸钙颗粒，然后再矿化脱矿牙本质。

所述的合成无定形磷酸钙颗粒具体是：

用8～10g/L聚丙烯酸作为调控剂，在36～38℃下，使用0.1～0.2M、PH为9.5±0.1的磷酸氢二钠水溶液和0.2～0.3M氯化钙水溶液作为合成母液；采用滴定管在20～30分钟内将氯化钙水溶液按体积比1：1加入至磷酸氢二钠水溶液中，过程中采用磁力搅拌器搅拌，并使用0.1M 氢氧化钠溶液调控 pH 保持在 9.5±0.5 区间；使得钙离子最终浓度为9.0～11.0mM，磷离子的最终浓度为5.0～7.0mM，聚丙烯酸的最终浓度为300～1000 μg/mL；最终合成直径为15～20nm的无定形磷酸钙颗粒，该颗粒合成后以溶液形式贮存。

所述的再矿化脱矿牙本质具体是：

步骤1.收集无龋的离体牙，用慢速ISOMET钻石切片机垂直于牙长轴先切除牙釉质，再切取厚度为0.5～1mm的牙本质片。

步骤2. 将上述牙片放入质量浓度为35%的磷酸中，10秒后取出，用大量的二次蒸馏水冲洗，得到脱矿层厚度在2～3微米范围内的脱矿牙本质模型。

步骤3.取15～20ml上述合成的无定形磷酸钙颗粒溶液置于培养瓶中，将脱矿牙本质模型置于无定形磷酸钙颗粒溶液中。

步骤4.将上述培养瓶放在35～38℃恒温箱中，于7天后取出。

本发明的有益效果：具有很好的生物相容性；符合脱矿牙本质修复中提出的 “最小损坏”原则，能以已有脱矿纤维为模板进行再矿化；相比于传统矿化法，本方法由底部至上进行矿物生长，能够恢复脱矿牙本质的矿物含量，保护胶原，防止脱矿进一步发生；恢复了牙本质特殊的等级结构；恢复牙本质的超强力学性能；相比于已有的仿生矿化法，原料易得，体系更简单；更重要的是，本方法中矿化完成所需要的时间大大仅为7天，对于再矿化脱矿牙本质技术来讲是一种突破。

附图说明

图1为实施例1,2,3中脱矿牙本质胶原的扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）图片。

图2为实施例1,2,3中不同浓度聚丙烯酸调控下的不同无定形磷酸钙修复脱矿牙本质的扫描电镜（SEM）图片。

图3为实施例2中500ug/mL的聚丙烯酸调控合成的无定形磷酸钙颗粒红外（FTIR）图片和扫描电镜（SEM）图片。

图4为实施例2中500ug/mL的聚丙烯酸调控合成的无定形磷酸钙修复脱矿牙本质的细节，扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）图片。

图5为实施例2中500ug/mL的聚丙烯酸调控合成的无定形磷酸钙修复脱矿牙本质的纳米压痕图片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步阐述：

实施例1：

配备 0.25M 氯化钙（CaCl₂）水溶液， 0.15M 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）水溶液，10g/L 聚丙烯酸（PAA）水溶液做合成实验的母液。取2.4 mL Na₂HPO₄ 母液和2.0mL的PAA 母液混合，二次蒸馏水稀释，用 1M NaOH 水溶液调节pH至9.5±0.1，常温搅拌 0.5h，总体积为 30mL。取 2.4mL CaCl₂母液加水稀释至30mL。用滴定管将30mL钙液30加入 30mL磷溶液，滴加过程中磁力搅拌器搅拌，0.1M NaOH 溶液调控pH保持在 9.5±0.5 区间。最终，钙离子浓度为 10.0mM，磷离子浓度为6.0mM，PAA浓度为300ug/mL。保证整个滴加过程持续25～30分钟。收集无龋的离体牙，用慢速ISOMET钻石切片机垂直于牙长轴先切除牙釉质，再切取厚度为0.5～1mm的牙本质片；然后用 500 # -2000 # 砂纸逐一打磨，大量二次蒸馏水清洗；将上述牙片放入质量浓度为35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸馏水冲洗，得到脱矿层厚度在2～3微米范围内的脱矿牙本质模型；取15ml上述合成的无定形磷酸钙颗粒溶液置于培养瓶中，将脱矿牙本质模型置于无定形磷酸钙颗粒溶液中；将上述培养瓶放在37.5℃恒温箱中，于7天后取出。将再矿化的牙本质样本一分为二，一半用酒精梯度脱水的方式进行干燥，做扫描电镜（SEM）和透射电镜(TEM)的观察,另一半不作脱水处理，直接进行纳米压痕检测。

实施例2：

配备 0.25M 氯化钙（CaCl₂）水溶液， 0.15M 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）水溶液，10g/L 聚丙烯酸（PAA）水溶液做合成实验的母液。取2.4 mL Na₂HPO₄母液和3.0mL的PAA 母液混合，二次蒸馏水稀释，用1M NaOH 水溶液调节pH 至9.5±0.1，常温搅拌0.5 h，总体积为 30mL。取 2.4mL CaCl₂母液加水稀释至30mL。用滴定管将30 mL 钙液30加入 30mL 磷溶液，滴加过程中磁力搅拌器搅拌，0.1M NaOH 溶液调控 pH 保持在 9.5±0.5区间。最终，钙离子浓度为 10.0 mM，磷离子浓度为6.0 mM，PAA浓度为500 ug/mL。保证整个滴加过程持续25～30分钟。收集无龋的离体牙，用慢速ISOMET钻石切片机垂直于牙长轴先切除牙釉质，再切取厚度为0.5～1mm的牙本质片；然后用 500 # -2000 # 砂纸逐一打磨，大量二次蒸馏水清洗；将上述牙片放入质量浓度为35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸馏水冲洗，得到脱矿层厚度在2～3微米范围内的脱矿牙本质模型；取15ml上述合成的无定形磷酸钙颗粒溶液置于培养瓶中，将脱矿牙本质模型置于无定形磷酸钙颗粒溶液中；将上述培养瓶放在37.5℃恒温箱中，于7天后取出。将再矿化的牙本质样本一分为二，一半用酒精梯度脱水的方式进行干燥，做扫描电镜（SEM）和透射电镜(TEM)的观察,另一半不作脱水处理，直接进行纳米压痕检测。

实施例3：

配备 0.25M 氯化钙（CaCl₂）水溶液，0.15M 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）水溶液，10g/L 聚丙烯酸（PAA）水溶液做合成实验的母液。取2.4 mL Na₂HPO₄ 母液和6.0mL的PAA 母液混合，二次蒸馏水稀释，用1M NaOH 水溶液调节pH至 9.5±0.1，常温搅拌0.5 h，总体积为30 mL。取2.4mL CaCl₂母液加水稀释至30mL。用滴定管将 30mL 钙液30加入 30 mL 磷溶液，滴加过程中磁力搅拌器搅拌，0.1M NaOH 溶液调控 pH 保持在 9.5±0.5 区间。钙离子、磷离子最终浓度分别为10.0 mM和6.0 mM。最终，钙离子浓度为10.0mM，磷离子浓度为6.0 mM，PAA浓度为1000 ug/mL。保证整个滴加过程持续25～30分钟。收集无龋的离体牙，用慢速ISOMET钻石切片机垂直于牙长轴先切除牙釉质，再切取厚度为0.5～1mm的牙本质片；然后用500#-2000 #砂纸逐一打磨，大量二次蒸馏水清洗；将上述牙片放入质量浓度为35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸馏水冲洗，得到脱矿层厚度在2～3微米范围内的脱矿牙本质模型；取15ml上述合成的无定形磷酸钙颗粒溶液置于培养瓶中，将脱矿牙本质模型置于无定形磷酸钙颗粒溶液中；将上述培养瓶放在37.5℃恒温箱中，于7天后取出。将再矿化的牙本质样本一分为二，一半用酒精梯度脱水的方式进行干燥，做扫描电镜（SEM）和透射电镜(TEM)的观察,另一半不作脱水处理，直接进行纳米压痕检测。

图1为实施例1,2,3中脱矿牙本质胶原的扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）图片。可以看出脱矿之后剩下胶原纤维网架，在透射电镜成像中衬度低。

图2为实施例1,2,3中不同浓度聚丙烯酸调控下的不同无定形磷酸钙修复脱矿牙本质的扫描电镜（SEM）图片。可以看出牙本质胶原基质表面形成矿物层，单根胶原纤维得到矿化，胶原纤维仍然裸露。

图3为实施例2中500ug/mL的聚丙烯酸调控合成的无定形磷酸钙颗粒红外（FTIR）图片和扫描电镜（SEM）图片。可以看出初始ACP颗粒尺寸为～15 nm, 约14天之后相变成～100 nm针状颗粒。

图4为实施例2中500ug/mL的聚丙烯酸调控合成的无定形磷酸钙修复脱矿牙本质的细节，扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）图片。可以看出矿化层矿物密度和矿物有序性与基底天然牙本质相当。

图5为实施例2中500ug/mL的聚丙烯酸调控合成的无定形磷酸钙修复脱矿牙本质的纳米压痕图片。可以看出再矿化牙本质力学性能表现比脱矿牙本质大幅加强，接近天然牙本质。

Claims

1. 一种修复脱矿牙本质的方法，其特征在于该方法首先合成无定形磷酸钙颗粒，然后再矿化脱矿牙本质；

所述的合成无定形磷酸钙颗粒具体是：

用8～10g/L聚丙烯酸作为调控剂，在36～38℃下，使用0.1～0.2M、PH为9.5±0.1的磷酸氢二钠水溶液和0.2～0.3M氯化钙水溶液作为合成母液；采用滴定管在20～30分钟内将氯化钙水溶液按体积比1：1加入至磷酸氢二钠水溶液中，过程中采用磁力搅拌器搅拌，并使用0.1M 氢氧化钠溶液调控 pH 保持在 9.5±0.5 区间；使得钙离子最终浓度为9.0～11.0mM，磷离子的最终浓度为5.0～7.0mM，聚丙烯酸的最终浓度为300～1000 μg/mL；最终合成直径为15～20nm的无定形磷酸钙颗粒，该颗粒合成后以溶液形式贮存；

所述的再矿化脱矿牙本质具体是：

步骤1.收集无龋的离体牙，用慢速ISOMET钻石切片机垂直于牙长轴先切除牙釉质，再切取厚度为0.5～1mm的牙本质片；

步骤2. 将上述牙片放入质量浓度为35%的磷酸中，10秒后取出，用大量的二次蒸馏水冲洗，得到脱矿层厚度在2～3微米范围内的脱矿牙本质模型；

步骤3.取15～20ml上述合成的无定形磷酸钙颗粒溶液置于培养瓶中，将脱矿牙本质模型置于无定形磷酸钙颗粒溶液中；

步骤4.将上述培养瓶放在35～38℃恒温箱中，于7天后取出。