CN106539693A - 高分子成膜材料负载acp的仿生矿化贴膜及其体外诱导再矿化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高分子成膜材料负载ACP制成的仿生矿化贴膜及其体外诱导再矿化的方法。将高分子成膜材料如羟丙基甲基纤维素、壳聚糖、魔芋甘露聚糖等其中的一种或几种加入至乙醇水溶液或纯水或无水乙醇中,待完全溶胀成胶浆后,再将聚电解质如聚丙烯酸、聚天冬氨酸其中的一种或几种稳定的ACP加入溶胶中,加非胶原蛋白类似物如谷氨酸、柠檬酸其中的一种或几种充分搅拌混匀,除尽气泡,均匀涂抹一薄层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜。本发明利用高分子成膜材料负载ACP制成仿生矿化贴膜,可干燥、长期保存,并可诱导重组I型胶原、脱矿牙釉质和牙本质再矿化。使用简便,成本低,可粘附于牙齿上任何需要矿化的部位,为再矿化修复提供新的技术方法。
Description
技术领域
本发明涉及仿生生物材料工程技术领域,特别是生物矿化领域,具体涉及高分子成膜材料负载无定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate,ACP)仿生矿化贴膜及其体外诱导再矿化的方法。
背景技术
牙釉质、牙本质的形成和矿化是典型的生物矿化,即纳米晶体颗粒为前驱体在造牙本质细胞诱导下,通过团聚,自组装,从不稳定的前驱体通过介晶转化等方式生成羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAp)晶体的过程。
目前关于牙釉质再矿化方面[1]国内外学者利用釉原蛋白,多肽及各类有机高分子表面活性剂合成具有类牙结构的羟基磷灰石,并将这些技术应用于受损牙釉质的修复领域,以期对龋齿的防治作用起到积极的意义。Yamagishi等[2]最早利用釉原蛋白和和氟离子的作用,在脱矿牙釉质表面形成一层致密的具有高度组装的氟磷灰酸钙,从而实现牙釉质的再矿化。Krishnan等学者[3]发现利用锶掺杂纳米羟基磷灰石可修复牙釉质。现有的研究中都需要引入一些特殊的添加剂如氟,锶离子等,或引入釉原蛋白促牙釉质修复。氟离子虽然被证实可以保护牙齿,但摄入量过多易造成氟中毒,安全性欠佳;而釉原蛋白成本较高,不易批量生产。
研究证明早期牙釉质中的矿物质是无定形的。在牙釉质的矿化过程中,ACP被认为是最初在牙釉质细胞外基质沉积的物相,并最终转化成成熟的羟基磷灰石晶体。ACP极具矿化潜能,且无毒副作用,成本较低,易于批量合成。
而对于牙本质,其不同于牙釉质的是有机物含量较高,其中I型胶原含量占30%,非胶原蛋白(non-collagenous proteins,NCPs)含量不足10%,但对修复性牙本质的生成具有重要的诱导作用。牙本质矿化本质就是在NCPs诱导下以I型胶原纤维为模板,ACP团聚,自组装,从无定形相转变为羟基磷灰石的过程。其中起关键作用的也是ACP。
Tay和Pashley[4]提出了一种经典的仿生矿化方法,即引导组织再矿化(GTR),通过NCPs类似物引导ACP纳米前驱体在胶原纤维内部进行有序沉积,形成与自然牙本质结构类似的矿物质。目前国内外学者[5,6]大多是在溶液中或糊剂研究ACP传输以及相转化形成HAp,使得脱矿牙本质、牙釉质或重组I型胶原纤维内发生生物矿化。但是ACP在溶液或糊剂(如漱口水或护牙素)中无法长期、定向输送ACP到牙釉质或牙本质内,提供长期钙磷来源,导致实际效果不确定。
因此,本发明公开了一种高分子成膜材料负载ACP的仿生矿化贴膜及其体外诱导再矿化的方法,可为牙釉质及牙本质的仿生矿化修复提供新的技术方法。
[1]Cao C,Mei M,Li Q-l,Lo E,Chu C.Methods for BiomimeticMineralisation of Human Enamel:A Systematic Review.Materials 2015;8:2873-86.
[2]Yamagishi K,Onuma K,Suzuki T,Okada F,Tagami J,Otsuki M,etal.Materials chemistry:A synthetic enamel for rapid tooth repair.Nature 2005;433:819.
[3]Krishnan V,Bhatia A,Varma H.Development,characterization andcomparison of two strontium doped nano hydroxyapatite molecules for enamelrepair/regeneration.Dental Materials 2016;32:646-59.
[4]Tay FR,Pashley DH.Guided tissue remineralisation of partiallydemineralised human dentine.Biomaterials 2008;29:1127-37.
[5]Cao CY,Mei ML,Li QL,Lo EC,Chu CH.Methods for biomimeticremineralization of human dentine:a systematic review.Int J Mol Sci 2015;16:4615-27.
[6]Li JL,Xie XQ,Wang Y,Yin W,Antoun JS,Farella M,et al.Long-termremineralizing effect of casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate(CPP-ACP)on early caries lesions in vivo:A systematic review.J Dent 2014;42:769-77.
发明内容
本发明旨在为脱矿牙釉质和牙本质提供一种新型的生物矿化方法,通过高分子成膜材料的羟基可稳定ACP,羧基可模拟非胶原蛋白类似物(non-collagen proteinanalogues,NCPs)促进矿化的特性,这样高分子成膜材料可以负载ACP并能制备成仿生矿化贴膜。该矿化贴膜可使重组I型胶原纤维、脱矿牙釉质和牙本质再矿化。该生物矿化贴膜可赋予牙釉质、牙本质自我修复能力。该矿化贴膜法是一种新型、简便、安全、有效的促进脱矿牙本质或牙釉质再矿化的仿生矿化方法。
本发明的技术方案如下:
一种高分子成膜材料负载ACP的仿生矿化贴膜制备方法如下:
1)在CaCl2溶液中加入聚电解质溶液,聚电解质溶液与CaCl2溶液的体积比为1:10-1:20;采用滴定方法,将等体积的NaH2PO4溶液滴到等体积的CaCl2-聚电解质混合溶液中,滴定过程中保持pH值为9.5±0.5;滴定完成后,反应液内Ca:P的摩尔浓度比为10:6,离心,离心产物即为固态的聚电解质稳定的ACP,放入真空干燥箱内保存;
2)将高分子成膜材料粉末加入至乙醇水溶液、纯水或无水乙醇中,高分子成膜材料粉末与溶剂配比为1:1-1:10,待完全溶胀成胶浆后,再将步骤1)聚电解质稳定的ACP加入溶胶中,聚电解质稳定的ACP与成膜材料质量比为1:1-1:8,并充分搅拌混匀;超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹一薄层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成贴膜。
优选的,所述的高分子成膜材料为具有溶胶和成膜性质的高分子聚合物,优选为HPMC、壳聚糖或KGM中的一种或多种。
优选的,所述的聚电解质溶液为聚丙烯酸溶液、聚天冬氨酸溶液的一种或多种,聚丙烯酸溶液的浓度为100-1000μg/ml,聚天冬氨酸溶液为100-500μg/ml。
优选的,在制备前述矿化贴膜的基础上,在制备过程中加入非胶原蛋白类似物(,non-collagenous proteins,NCPs)混匀,NCPs起到促进矿化作用。NCPs与高分子成膜材料粉末的质量比为1:1-1:20。
优选的,所述的非胶原蛋白类似物为结构与牙齿中非胶原蛋白类似的物质,可促进矿化。优选为谷氨酸,天冬氨酸,柠檬酸中的一种或多种。
优选的,均匀涂抹在平板上的薄层厚度为1mm。
所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜体外诱导重组I型胶原再矿化的方法,步骤为:
1)重组I型胶原:取10μl鼠尾胶原液与1ml组装液混合均匀,室温静置20min后,滴3μl液体于镍网,过夜,戊二醛交联后,去离子水冲洗,晾干;所述的组装液包括甘氨酸、KCl和NaN3,其中,甘氨酸的浓度为50mM,KCl的浓度为200mM,NaN3所占的质量百分比为0.1%;
2)将高分子成膜材料粉末加入至乙醇水溶液、纯水或无水乙醇中,其与溶剂配比为1:1-1:10,待完全溶胀成胶浆后,再将PAA、PAsp的一种或多种稳定的ACP加入溶胶中,ACP与成膜材料质量比为1:1-1:8,并充分搅拌混匀;超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜;
3)将贴膜贴于含I型胶原的镍网,悬浮于240μl人工唾液中,1,4,7天后取样,TEM观察胶原矿化情况。
所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜体外诱导牙釉质再矿化的方法步骤为:
1)制备脱矿的牙釉质:选取新鲜拔除无龋坏、无缺损、无裂纹的人第三磨牙供实验使用,储存于0.5%氯胺溶液中备用;一个月内使用。在流水下,用Isomet低速切片机平行于牙冠长轴于颊,舌侧制备大小5mm*5mm*1mm的牙釉质片70片;牙釉质样本放于37%磷酸中,脱矿30s,冲洗1min,备用;
2)将高分子成膜材料粉末加入至乙醇水溶液或纯水或无水乙醇中,其与溶剂配比为1:1-1:10,待完全溶胀成胶浆后,再将PAA、PAsp中的一种或多种稳定稳定的ACP加入溶胶中,ACP与成膜材料质量比为1:1-1:8,再加入L-谷氨酸模拟NCPs,L-谷氨酸与ACP质量比为1:1-1:10,并充分搅拌混匀;超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜;
3)将5mm*5mm贴膜贴于脱矿牙釉质片,放入10ml人工唾液中,每天更换贴膜及人工唾液,对照组不贴贴膜;放入37℃恒温水箱中1w,2w,1m,3m,6m取样;SEM、TEM观察胶原矿化情况。
所述高分子成膜材料负载ACP的仿生矿化贴膜体外诱导牙本质再矿化的方法步骤为:
1)制备脱矿的牙本质:选取新鲜拔除无龋坏、无缺损、无裂纹的人第三磨牙供实验使用,储存于0.5%氯胺溶液中备用,一个月内使用。在流水下,用Isomet低速切片机垂直于牙冠长轴于牙冠中部制备大小约3*2*1mm的牙本质片,70片。37%磷酸处理30s,脱矿完成后将样本取出用去离子水冲洗1min;
2)将高分子成膜材料粉末加入至乙醇水溶液或纯水或无水乙醇中,其与溶剂配比为1:1-1:10,待完全溶胀成胶浆后,再将PAA、PAsp中的一种或多种稳定稳定的ACP加入溶胶中,ACP与成膜材料质量比为1:1-1:8,再加入L-谷氨酸模拟NCPs,L-谷氨酸与ACP质量比为1:1-1:10,并充分搅拌混匀;超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜;
3)将3mm*2mm贴膜贴于脱矿牙本质片,放入10ml人工唾液中,每天更换贴膜及人工唾液,对照组不贴贴膜,SEM、TEM观察胶原矿化情况。放入37℃恒温水箱中1w,2w,1m,3m,6m取样;SEM、TEM观察胶原矿化情况。
3、用透射或扫描电镜(transmission/scanning electron microscopy,TEM/SEM)观察矿化情况,用选区电子衍射(selected area electron diffraction,SAED)证实矿化效果。
有益效果:本发明的仿生矿化贴膜利用高分子成膜材料负载ACP制成,可干燥、长期保存。本发明同时利用高分子成膜材料的溶胶特性稳定并负载ACP,使重组I型胶原矿化;并粘附于牙齿表面,缓慢释放ACP、使脱矿牙釉质和牙本质再矿化。通过傅里叶红外光谱(FTIR)表征矿化贴膜中的ACP有无相变,通过SEM对脱矿牙釉质表面的生成物进行观察,利用TEM及选区电子衍射(SAED)对牙本质及重组I型胶原内沉积物进行定性表征。结果显示高分子成膜材料负载ACP的仿生矿化贴膜能在脱矿的牙釉质表面及重组I型胶原纤维内部,诱导出针状晶体的生长。牙釉质表面沉积的羟基磷灰石针状晶体呈编织状排列;在脱矿牙本质与牙本质交界处有胶原纤维变粗并形成纤维内矿化,随时间延长慢慢形成矿化胶原纤维结构。本发明使用简便,可粘附于牙齿上任何需要矿化的部位,成本低廉,用途广泛,可为牙釉质及牙本质的仿生矿化修复提供新的技术方法。
附图说明
图1 ACP、HPMC及ACP-HPMC仿生矿化贴膜的FTIR图;
图2重组I型胶原的TEM图;
图3重组I型胶原再矿化的TEM+SAED图;
图4脱矿牙釉质矿化前后SEM图;
图5脱矿牙本质矿化前后的TEM+SAED图。
具体实施方式
本发明技术方案只针对重组I型胶原和离开生物活体组织的牙齿进行处理。该方法用于非治疗目的。
实施例中聚电解质稳定的ACP按如下方法制备:在CaCl2溶液中加入聚电解质溶液,聚电解质溶液与CaCl2溶液的体积比为1:10-1:20;采用滴定方法,将等体积的NaH2PO4溶液滴到等体积的CaCl2-聚电解质混合溶液中,滴定过程中保持pH值为9.5±0.5;滴定完成后,反应液内Ca:P的摩尔浓度比为10:6,离心,离心产物即为固态的聚电解质稳定的ACP,放入真空干燥箱内保存;
优选的,所述的高分子成膜材料为具有溶胶和成膜性质的高分子聚合物,优选为HPMC、壳聚糖或KGM中的一种或多种。所述的聚电解质溶液为聚丙烯酸溶液、聚天冬氨酸溶液的一种或多种,聚丙烯酸溶液的浓度为100-1000μg/ml,聚天冬氨酸溶液为100-500μg/ml。聚电解质溶液为多种混合时,聚丙烯酸溶液和聚天冬氨酸溶液可按任意体积比混合,混合的聚电解质溶液与CaCl2溶液的体积比仍为1:10-1:20。
优选的,在制备前述矿化贴膜的基础上,在制备过程中还可以加入非胶原蛋白类似物(non-collagenous proteins,NCPs),NCPs起到促进矿化作用。NCPs与高分子成膜材料粉末的质量比为1:1-1:20。所述的非胶原蛋白类似物为结构与牙齿中非胶原蛋白类似的物质,可促进矿化。优选为谷氨酸,天冬氨酸,柠檬酸中的一种或多种。
实施方案一:制备HPMC负载ACP仿生矿化贴膜如下:将HPMC粉末以1:6加入至70%乙醇水溶液中,待完全溶胀成胶浆后,再将800μg/ml PAA稳定的ACP按1:4加入HPMC溶胶中并充分搅拌混匀。超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至平板上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜。
在应用HPMC负载ACP贴膜前,通过傅里叶红外光谱(FTIR)表征矿化贴膜中ACP有无相变。结果如图1所示,ACP红外图谱中,在534cm-1及1100cm-1处的吸收峰由PO43-引起,其中534cm-1处的吸收峰未发生分裂,表明所测样品未结晶,为无定形相,说明ACP确为无结晶相;HPMC主要在946cm-1、1065cm-1处有较强的吸收峰,它们分别由C-H面外变形振动、C-O(H)伸缩振动引起。ACP-HPMC贴膜的红外图符合ACP及HPMC的特征峰,534cm-1未见分裂峰证明贴膜中的ACP未发生变性。
重组I型胶原。取10ul鼠尾胶原液与1ml组装液(所述的组装液包括甘氨酸、KCl和NaN3,其中,甘氨酸的浓度为50mM,KCl的浓度为200mM,NaN3所占的质量百分比为0.1%)混合均匀,室温静置20min后,滴3μl液体于镍网,过夜,戊二醛交联后,去离子水冲洗,晾干,乙酸釉染色30s,TEM观察。如图2所示,可见:原纤维呈梯状排列,呈典型的67nm周期结构,与I型胶原特征性结构吻合。
将贴膜贴于含I型胶原的镍网,悬浮于240μl人工唾液中,1,4,7天后取样,TEM观察胶原矿化情况。
实施方案二:制备壳聚糖负载ACP仿生矿化贴膜:将壳聚糖粉末以1:5加入至纯水溶液中,待完全溶胀成胶浆后,再将4mg/ml PAsp稳定的ACP按1:1加入溶胶中并充分搅拌混匀。超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至平板上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜。傅里叶红外光谱(FTIR)表征同方案一。
制备脱矿的牙釉质:选取颗新鲜拔除无龋坏、无缺损、无裂纹的人第三磨牙供实验使用,储存于0.5%氯胺溶液中,一个月内使用。在流水下,用Isomet低速切片机平行于牙冠长轴于颊,舌侧制备大小约5mm*5mm*1mm的牙釉质片70片。牙釉质样本放于37%磷酸中,脱矿30s,冲洗1min,备用。
将5mm*5mm贴膜贴于脱矿牙釉质片,放入10ml人工唾液中,每天更换贴膜及人工唾液,对照组不贴贴膜。放入37℃恒温水箱中1w,2w,1m,3m,6m取样。SEM、TEM观察胶原矿化情况。
实施方案三:制备KGM负载ACP仿生矿化贴膜:将KGM粉末以1:9加入至无水乙醇中,待完全溶胀成胶浆后,再加入聚电解质稳定的ACP和L-谷氨酸模拟NCPs,L-谷氨酸与聚电解质稳定的ACP质量比为1:3充分搅拌混匀。超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至平板上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜。
制备脱矿的牙本质:选取颗新鲜拔除无龋坏、无缺损、无裂纹的人第三磨牙供实验使用,储存于0.5%氯胺溶液中,一个月内使用。在流水下,用Isomet低速切片机垂直于牙冠长轴于牙冠中部制备大小约3*2*1mm的牙本质片70片。37%磷酸处理30s。脱矿完成后将样本取出用去离子水冲洗1min。
将3mm*2mm贴膜贴于脱矿牙本质片,放入10ml人工唾液中,每天更换贴膜及人工唾液,对照组不贴贴膜,SEM、TEM观察胶原矿化情况。放入37℃恒温水箱中1w,2w,1m,3m,6m取样。SEM、TEM观察胶原矿化情况。
效果观察
扫描电镜观察脱矿牙釉质矿化情况:
取出牙釉质后,去离子水冲洗30秒,戊二醛固定,酒精系列脱水,临界点干燥,喷铂金后用SEM观察矿化情况。如图4所示,可见脱矿的牙釉质表面诱导出针状晶体的生长。沉积的羟基磷灰石针状晶体呈编织状排列。图4A:牙釉质表面经37%磷酸酸蚀30秒,可见釉质脱矿后,釉柱周边被溶解,表面呈鱼鳞状脱矿形貌。(放大5000倍);图4B:脱矿牙釉质经应用仿生物矿化贴膜2周后,釉质表面有大量矿物质沉积,釉柱隐约可见,但未见牙釉质酸蚀形貌即鱼鳞状结构。(放大5000倍)
透射电镜观察重组I型胶原及牙本质矿化情况:
取牙本质块后,用去离子水冲洗30秒,戊二醛固定,酒精系列脱水,包埋剂:丙酮1:1处理1小时,包埋剂:丙酮3:1处理3小时,纯包埋剂包埋,70℃过夜。矿化后的牙本质块切割成超薄切片和粘附重组I型胶原的镍网用TEM观察矿化情况。如图3所示,可见在重组I型胶原变黑变粗,内部有晶体物质生成;其中图3A:为重组I型胶原在应用仿生矿化贴膜1天,胶原纤维呈淡灰色,其周围有ACP颗粒沉积,但纤维内未见明显矿化(放大10000倍);图3B:为I型胶原在应用仿生矿化贴膜后7天,胶原明显变粗变黑,其内部有晶体物质生成(放大60000倍);图3C:为B图的选区电子衍射(SAED)图,图中002、211、004符合羟基磷灰石的晶格参数。
如图5所示,脱矿牙本质与牙本质交界处有胶原纤维变粗并形成纤维内矿化,随时间延长慢慢形成矿化胶原纤维结构。图5脱矿牙本质矿化前后TEM图及脱矿后应用生物矿化贴膜2周后矿化情况。图5A:牙本质表面经37%磷酸酸蚀30秒后,牙本质脱矿,胶原纤维脱矿后颜色呈浅灰色与未脱矿牙本质(黑色)形成鲜明对比;(放大80000倍);图5B:为应用仿生矿化贴膜2周后,脱矿牙本质与牙本质交界处可见一层再矿化层,再矿化层中胶原纤维变粗并形成纤维内矿化,;(放大80000倍);图5C:为图5B图中再矿化层的选区电子衍射(SAED)图,图中002、004、211符合羟基磷灰石的晶格参数。
Claims (8)
1.一种高分子成膜材料负载ACP的仿生矿化贴膜,其特征在于其制备方法如下:
1)合成聚电解质稳定的ACP
在CaCl2溶液中加入聚电解质溶液,聚电解质溶液与CaCl2溶液的体积比为1:10-1:20;采用滴定方法,将等体积的NaH2PO4溶液滴到等体积的CaCl2-聚电解质混合溶液中,滴定过程中保持pH值为9.5±0.5;滴定完成后,反应液内Ca:P的摩尔浓度比为10:6,离心,离心产物即为固态的聚电解质稳定的ACP,放入真空干燥箱内保存;
2)将高分子成膜材料粉末加入至乙醇水溶液、纯水或无水乙醇中,高分子成膜材料粉末与溶剂配比为1:1-1:10,待完全溶胀成胶浆后,再将步骤1)聚电解质稳定的ACP加入溶胶中,聚电解质稳定的ACP与成膜材料质量比为1:1-1:8,并充分搅拌混匀;超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹一薄层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成贴膜。
2.如权利要求1所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜,其特征在于所述的高分子成膜材料为具有溶胶和成膜性质的高分子聚合物,优选为HPMC、壳聚糖或KGM中的一种或多种。
3.如权利要求1所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜,其特征在于所述的聚电解质溶液为聚丙烯酸溶液、聚天冬氨酸溶液的一种或多种,聚丙烯酸溶液的浓度为100-1000μg/ml,聚天冬氨酸溶液为100-500μg/ml。
4.如权利要求1所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜,其特征在于在制备矿化贴膜时还可加入非胶原蛋白类似物混匀,起促进矿化作用;非胶原蛋白类似物与高分子成膜材料粉末的质量比为1:1-1:20。
5.如权利要求4所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜,其特征在于所述的非胶原蛋白类似物为结构与牙齿中非胶原蛋白类似的物质,优选为谷氨酸,天冬氨酸,柠檬酸中的一种或多种。
6.一种权利要求1所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜体外诱导重组I型胶原再矿化的方法,其特征在于步骤为:
1)重组I型胶原:取10μl鼠尾胶原液与1ml组装液混合均匀,室温静置20min后,滴3μl液体于镍网,过夜,戊二醛交联后,去离子水冲洗,晾干;所述的1ml组装液中甘氨酸的浓度为50mM,KCl的浓度为200mM,NaN3所占的质量百分比为0.1%;
2)将高分子成膜材料粉末加入至乙醇水溶液、纯水或无水乙醇中,其与溶剂配比为1:1-1:10,待完全溶胀成胶浆后,再将PAA、PAsp稳定的ACP加入溶胶中,ACP与成膜材料质量比为1:1-1:8,并充分搅拌混匀;超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜;
3)将贴膜贴于含I型胶原的镍网,悬浮于1ml工唾液中,TEM观察胶原矿化情况。
7.一种权利要求1所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜体外诱导牙釉质再矿化的方法,其特征在于步骤为:
1)制备脱矿的牙釉质:选取新鲜拔除无龋坏、无缺损、无裂纹的人第三磨牙供实验使用,储存于0.5%氯胺溶液中备用;在流水下,用Isomet低速切片机平行于牙冠长轴于颊,舌侧制备大小5mm*5mm*1mm的牙釉质片;牙釉质样本放于37%磷酸中,脱矿30s,冲洗1min,备用;
2)将高分子成膜材料粉末加入至乙醇水溶液或纯水或无水乙醇中,其与溶剂配比为1:1-1:10,待完全溶胀成胶浆后,再将PAA、PAsp稳定的ACP加入溶胶中,ACP与成膜材料质量比为1:1-1:8,并充分搅拌混匀;超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜;
3)将5mm*5mm贴膜贴于脱矿牙釉质片,放入10ml人工唾液中,每天更换贴膜及人工唾液,SEM、TEM观察胶原矿化情况。
8.一种权利要求1所述高分子成膜材料负载ACP仿生矿化贴膜体外诱导牙本质再矿化的方法,其特征在于步骤为:
1)制备脱矿的牙本质:选取新鲜拔除无龋坏、无缺损、无裂纹的人第三磨牙供实验使用,储存于0.5%氯胺溶液中备用;在流水下,用Isomet低速切片机垂直于牙冠长轴于牙冠中部制备大小约3*2*1mm的牙本质片,37%磷酸处理30s,脱矿完成后将样本取出用去离子水冲洗1min;
2)将高分子成膜材料粉末加入至乙醇水溶液或纯水或无水乙醇中,其与溶剂配比为1:1-1:10,待完全溶胀成胶浆后,再将PAA、PAsp稳定的ACP加入溶胶中,ACP与高分子成膜材料质量比为1:1-1:8,再加入L-谷氨酸模拟NCPs促进矿化,L-谷氨酸与ACP质量比为1:1-1:10,充分搅拌混匀;超声或真空除尽溶胶中气泡后,均匀地涂抹薄薄一层至载玻片上,放于烘箱内烘干、冷却、成膜,裁剪成大小不等的贴膜;
3)将3mm*2mm贴膜贴于脱矿牙本质片,放入10ml人工唾液中,每天更换贴膜及人工唾液,SEM、TEM观察胶原矿化情况。
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