KR101913841B1 - 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스 및 이의 용도 - Google Patents

효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 왕겨실리카에 APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)와 글루타르알데히드가 모식된 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스, 상기 왕겨실리카 매트릭스에 효소가 고정화된 왕겨실리카-효소 복합체, 및 상기 왕겨실리카-효소 복합체를 이용한 유용물질의 생산 방법에 관한 것으로, 나노세공 구조를 가지는 왕겨실리카는 효소반응에서 기질의 확산을 촉진할 뿐만 아니라, 연속적인 효소 반응의 중간체가 전달되는 통로로 활용될 수 있어, 유용물질의 생산에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.

Description

효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스 및 이의 용도{Matrix of rice husk silica for immobilizing enzyme and uses thereof}
본 발명은 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 왕겨실리카에 APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)와 글루타르알데히드로 모식된 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스, 상기 왕겨실리카 매트릭스에 효소가 고정된 왕겨실리카-효소 복합체 및 상기 왕겨실리카-효소 복합체를 이용한 유용물질의 생산 방법에 관한 것이다.
벼는 방어적 호흡 시스템으로, 쌀알을 둘러싸고 있는 왕겨에 비결정형 실리카 층을 형성한다. 이 층은 나노 크기의 세공을 지니고 있어서 기체들에 대해 높은 투과도를 가지며 분자류 특성을 보인다. 왕겨로부터 얻어진 왕겨 실리카(Rice Husk Silica, RHS) 역시 실리카 입자내에 많은 세공(~4 nm)을 포함하고 있어서, 단위 질량당 표면적(~250 m2/g)이 현저히 큰 특징이 있다. 이러한 왕겨 실리카의 특성은 효소의 고정화를 위한 고체상으로서 사용될 수 있는 중요한 장점을 제공하고 있다. 또한 왕겨에서 생산된 나노세공 실리카는 천연 실리카로서 인체에 독성이 낮고, 실리케이트 수용액과 무기산을 반응시켜 얻는 무기 나노세공 실리카 또는 메조실리카에 비하여 화학적 활성이 높아서 모식이 용이할 뿐만 아니라 다양한 형태로 성형이 쉽고 낮은 단가로 대량생산할 수 있어서 단백질 및 생합성 효소의 고정화를 위하여 보다 더 효율적인 물질로 판단된다. 특히, 왕겨 실리카의 나노세공은 공유결합에 의한 효소의 화학적 고정화를 위한 공간적 자리를 제공하여 고정화 효율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 다단계 생합성 효소 반응계에서 중간체의 효율적 이동 통로로 사용될 수 있어서 다단계 효소 반응에 이용될 수 있다.
옥시리핀(oxylipin)은 지방산으로부터 유래되어 생성되는 생물학적으로 활성을 가진 지질로, 생물체의 중요 방어물질로 사용되나, 그 중요성에도 불구하고 입체화학을 비롯한 옥시리핀 분자의 구조적 복잡성으로 인하여 상업적 생산을 위한 화학적 합성이 일반화되어있지 않다. 뿐만 아니라 생물학적으로 중요한 기능을 나타내는 옥시리핀의 대사에 관련되는 효소들은 매우 다양하며 세포내 여러 기관에 분리되어 존재하므로 in vivo 시스템에서 옥시리핀 생합성 경로를 조절하여 옥시리핀을 생산하기는 매우 어려운 실정이다.
본 발명자는 옥시리핀의 효율적 생산을 위한 현재의 미흡한 점을 극복하기 위하여 in vitro 상에서 합성할 수 있는 효소 고정화 시스템 개발에 관심을 집중하던 중, 벼의 부산물인 왕겨에서 생산된 나노세공 실리카가 천연 실리카로서 옥시리핀 생합성 효소의 고정화를 위하여 최적의 물질이라는 점에 착안하여, 옥시리핀 생합성을 위한 핵심 효소들의 고정화를 통하여 옥소파이토디에논산(OPDA, oxophytodienoic acid) 등의 옥시리핀을 산업적으로 생산할 수 있는 방법을 완성하게 되었다.
한편, 한국등록특허 제0396457호에는 '왕겨로부터 제조되는 다공성 실리카, 다공성 실리카 성형체, 나노 크기 실리카 입자의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0071451호에는 '왕겨로부터 고순도의 실리카를 제조하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스 및 이의 용도에 대해서는 기재되어 있지 않다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 나노세공 구조를 가지는 왕겨실리카를 APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)와 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 모식화하여 단백질 또는 효소를 고정화한 결과, 단백질 또는 효소가 높은 수준으로 고정화되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 왕겨실리카에 옥시리핀(oxylipin) 합성에 관련된 효소들을 고정화하고, 리놀렌산을 기질로 옥시리핀 화합물을 합성한 결과, 옥소파이토디에논산(oxophytodienoic acid)이 합성되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 a) 왕겨실리카(rice husk silica, RHS)에 18~24% 농도의 APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)를 혼합하여 38~42℃에서 반응시키는 단계; b) 상기 a) 단계의 반응 혼합물을 원심분리한 후, 반응하지 않은 잔여 APTES를 제거하여 APTES로 모식된(modified) 왕겨실리카(RHS-APTES)를 회수하는 단계; c) 상기 b) 단계의 회수된 APTES로 모식된 왕겨실리카(RHS-APTES)에 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 혼합하여 상온에서 반응시키는 단계; 및 d) 상기 c) 단계의 반응 혼합물을 원심분리한 후, 반응하지 않은 잔여 글루타르알데히드를 제거하여 APTES 및 글루타르알데히드로 모식된 왕겨실리카(RHS-APTES-GDA)를 회수하는 단계;를 포함하는 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 왕겨실리카 매트릭스에 효소가 고정화된 왕겨실리카-효소 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 왕겨실리카-효소 복합체를 이용하여 유용물질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 왕겨 실리카의 나노세공 구조는 효소반응에서 기질의 확산을 촉진할 뿐만 아니라, 연속적인 효소 반응의 중간체가 전달되는 통로로 활용될 수 있어, 생합성 산물의 생산에 효과적으로 이용될 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 벼의 부산물인 왕겨의 가치를 높일 수 있는 기회가 될 수 있으며, 본 발명은 소수성 분자인 지방산을 기질로 사용하는 옥시리핀의 생성 등 지방산 대사에 관련된 생합성 효소의 고정화 및 이를 이용한 대사산물의 대량생산 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)와 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GDA)를 이용한 왕겨실리카 메트릭스와 효소(단백질)의 고정화 산물의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 왕겨 실리카의 나노세공을 통한 생합성 중간생성물 전달 및 다단계 효소반응에의 적용 방법을 도시한 것이다.
도 3은 리놀렌산(linolenic acid)으로부터 자스몬산에 이르는 옥시리핀 다단계 생합성 경로에서 리폭시게나제(lipoxygenase, LOX), 알렌 옥사이드 합성효소(allene oxide synthase, AOS), 알렌 옥사이드 고리화효소(allene oxide cyclase, AOC)의 작용에 의한 12-옥소파이토디에논산(oxophytodienoic acid, OPDA)의 생성과정을 순차적으로 도시한 것이다.
도 4는 리놀렌산으로부터 LOX, AOS, AOC의 연속적 반응으로 형성된 OPDA의 HPLC 분석 결과로, LOX에 의하여 생성된 13-HPOT(13(S)-hydroperoxides of α-linolenic acid)를 이용한 반응 생성물의 SP-HPLC 분석(A: AOS 반응, B: AOS/AOC 반응) 및 RP-HPLC 분석(C: AOS 반응, D: AOS/AOC 반응)의 결과이다. AOS 반응 및 AOS/AOC 반응에 의하여 생산된 cis-OPDA(12-OPDA)의 CP-HPLC 결과는 A와 B의 안쪽에 각각 삽입하였다.
도 5는 대두 리폭시게나제 효소(soybean LOX)가 왕겨실리카에 고정되지 않은 경우(A)와 고정된 경우(B) 각각에 대하여, 사용된 리폭시게나제 효소의 양에 따라 효소 반응 생성물인 HPOTE(hydroperoxyoctadeca)의 생성량을 보여주는 결과이다.
도 6은 왕겨 실리카에 APTES와 GDA를 사용하여 LOX, AOS 또는 AOC를 고정하여 제조된 각각의 고정화 시스템의 재사용 횟수에 따른 각 효소 반응 생성물의 양을 나타낸 결과이다.
도 7은 왕겨 실리카에 LOX, AOS 및 AOC를 다중고정(co-immobilization)하여 이들 3개 효소의 순차적인 연속 반응에 의한 cis-OPDA의 합성법에 있어서, GDA를 사용한 다중고정 방법(GDA-(LOX-AOS-AOC))과 에피클로로히드린(epichlorohydrin, ECH) 및 PEG를 사용한 다중고정 방법(ECH-PEG-(LOX-AOS-AOC))의 OPDA 생성량을 보여주는 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스의 제조방법은 구체적으로는,
a) 왕겨실리카(rice husk silica, RHS)에 18~24% 농도의 APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)를 혼합하여 38~42℃에서 1.5~2.5시간 동안 반응시키는 단계;
b) 상기 a) 단계의 반응 혼합물을 원심분리한 후, 반응하지 않은 잔여 APTES를 제거하여 APTES로 모식된(modified) 왕겨실리카(RHS-APTES)를 회수하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 회수된 APTES로 모식된 왕겨실리카(RHS-APTES)에 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GDA)를 혼합하여 상온에서 반응시키는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 반응 혼합물을 원심분리한 후, 반응하지 않은 잔여 글루타르알데히드를 제거하여 APTES 및 글루타르알데히드로 모식된 왕겨실리카(RHS-APTES-GDA)를 회수하는 단계;를 포함할 수 있고, 더욱 구체적으로는,
a) 왕겨실리카(RHS)에 21% 농도의 APTES를 혼합하여 40℃에서 2시간 동안 반응시키는 단계;
b) 상기 a) 단계의 반응 혼합물을 원심분리한 후, 반응하지 않은 잔여 APTES를 제거하여 APTES로 모식된(modified) 왕겨실리카(RHS-APTES)를 회수하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 회수된 APTES가 모식된 왕겨실리카에 글루타르알데히드(GDA)를 혼합하여 상온에서 4시간 동안 반응시키는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 반응 혼합물을 원심분리한 후, 반응하지 않은 잔여 글루타르알데히드를 제거하여 APTES 및 글루타르알데히드로 모식된 왕겨실리카(RHS-APTES-GDA)를 회수하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스에 있어서, 상기 왕겨실리카는 고체상 지지체로서의 기능 뿐 만 아니라, 나노세공 구조를 가지고 있어, 나노세공 구조를 통해 효소반응에서 기질의 확산을 촉진할 뿐만 아니라, 연속적인 효소 반응의 중간산물이 전달되는 통로로 활용될 수 있어, 합성 산물의 생산에 효과적인 재료이다.
생체분자(예컨대, 효소 단백질)를 고정화시키는 기술 분야에 있어서 해결되어야 하는 주된 기술적 과제는 작은 면적에 고밀도의 생체분자들을 결합시키고, 결합된 생체분자들의 생리활성 기능이 최대한 보존되어야 한다는 것이다. 또한, 생산비용의 절감을 통해 누구나 손쉽고 간단하게 고정화 기술을 실현시킬 수 있어야 함은 생리활성물질에 대한 연구 내지 개발을 보다 효과적으로 수행하기 위해 요구되는 조건이다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스를 제공한다.
본 발명의 상기 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스는 벼의 부산물인 왕겨를 사용함으로써, 생산 비용의 절감을 유도할 수 있고, 왕겨실리카의 표면에 모식된(modified) 스페이서(spacer) 물질과 고정화시키고자 하는 효소가 공유결합을 통해 쉽고 간단하게 고정화되므로, 산업상 이용가능성이 우수한 효소(또는 생체물질) 고정화 기술이라 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 왕겨실리카 매트릭스에 효소가 고정화된 왕겨실리카-효소 복합체 및 상기 왕겨실리카-효소 복합체를 이용하여 유용물질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 왕겨실리카-효소 복합체는, 전술한 효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스에 목적하는 유용물질을 생산할 수 있는 활성 효소를 고정화한 것으로, 목적하는 유용물질 생합성 과정에 관여하는 효소를 하나 또는 두 개 이상 고정화한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 왕겨실리카-효소 복합체에 있어서, 상기 효소는 리폭시게나제(lipoxygenase, LOX), 알렌 옥사이드 합성효소(allene oxide synthase, AOS) 및 알렌 옥사이드 고리화효소(allene oxide cyclase, AOC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 LOX, AOS 및 AOC는 옥시리핀(oxylipin)의 다단계 생합성에 관여하는 효소로, 상기 효소들은 리놀렌산을 기질로 하여, 병해충 방제제 및 항암물질로 사용될 수 있는 옥소파이토디에논산(oxophytodienoic acid, OPDA) 또는 자스논산 유도체 등을 생산할 수 있는 효소이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유용물질 생산 방법에 있어서, 상기 유용물질은 옥시리핀(oxylipin) 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 유용물질의 생산 방법은 나노세공 구조를 가진 왕겨실리카에 유용한 효소를 공유결합에 의한 고정을 통하여 간단하게 유용물질을 대량으로 생산할 수 있는 시스템을 제공하며, 특히, 다단계 생합성 과정이 요구되는 유용물질을 생산할 경우, 왕겨실리카의 나노세공 구조로 인해 기질 및/또는 중간산물의 확산 및 이동이 용이하여 유용물질의 생산효율을 증가시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 화학적 고정화를 위한 알렌 옥사이드 합성효소, 알렌 옥사이드 고리화효소의 생산
알렌 옥사이드 합성효소(allene oxide synthase, AOS)를 생산하기 위하여 벼의 알렌 옥사이드 합성효소 유전자(OsAOS1)를 pET28b 벡터에 삽입하여 OsAOS1 효소의 이종 발현을 위한 pET28b-OsAOS1 벡터를 제조하고, pET28b-OsAOS1 벡터로 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시킨 뒤, 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 종균배양(seed culture)으로 사용하여 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, IPTG로 OsAOS1 단백질의 발현을 유도한 후 추가적으로 6시간 동안 배양하였다. 원심분리하여 얻어진 세포 페이스트를 5mM Emolphogene을 포함한 초음파분해 완충용액(50U DNase, 0.2mM PMSF, 50mM sodium phosphate, pH 7.5)를 이용하여 OsAOS1 단백질이 발현된 세포를 파쇄하였다. 얻어진 세포 파쇄액을 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고 OsAOS1 단백질을 포함한 상등액을 Q-Sepharose 컬럼을 이용하여 정제하였다.
알렌 옥사이드 고리화 효소(allene oxide cyclase, AOC)를 생산하기 위하여 벼의 알렌옥사이드 고리화 효소 유전자(OsAOC)를 pRSETB 벡터에 삽입하여 pRSETB-OsAOC 벡터를 제조하였고, 상기 벡터를 이용하여 형질전환된 대장균 BL21(DE3)pLysS를 종균배양으로 사용하여 37℃에서 4~5시간 동안 배양한 후 IPTG로 OsAOC 단백질의 발현을 유도한 후, 추가적으로 6시간 동안 배양하였다. 그 후, 원심분리하여 얻어진 세포 페이스트를 0.2% Tween 20과 10mM EDTA를 포함한 50mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.5)에 현탁시킨 후, PMSF(phenylmethane sulfonyl fluoride)를 0.2mM 첨가한 후, 초음파 분해시켜 세포를 파쇄하였다. 얻어진 세포 파쇄액을 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고 OsAOC 단백질을 포함한 상등액을 40% 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 사용하여 OsAOC 단백질을 포함한 침전된 단백질을 얻었다. 투석(dialysis)을 통하여 황산 암모늄을 제거하고 Q-sepharose 컬럼을 이용하여 정제하였다.
BSA(bovine serum albulin)와 대두 리폭시게나제(Soybean lipoxigenase, LOX)는 Sigma-Aldrich(미국)에서 구매하여 사용하였다. LOX와 AOS의 활성은 알려진 방법(Yoeun et al. 2013, BMB reports 46:151)에 따라 측정하였으며, LOX, AOS, AOC 반응을 연결하여 리놀렌산으로부터 OPDA(oxophytodienoic acid)를 합성하였다(도 3). 리놀렌산으로부터 LOX를 이용하여 합성한 HPOT(hydroperoxides of α-linolenic acid)에 AOS와 AOC를 연속적으로 반응시켜 얻어진 반응 산물을 다이클로로메테인(dichloromethane)으로 추출한 후 straight phase HPLC(SP-HPLC)로 분리하여 cis-OPDA 분획을 수집하였다(도 4A 및 4B). 수집된 cis-OPDA에 대한 GC/MS 분석을 통하여 구조를 동정하였으며, chiral phase HPLC(CP-HPLC)를 이용하여 생성된 cis-OPDA 중 cis(+)-OPDA와 cis(-)-OPDA의 비율을 분석하였다(도 4A 및 4B 내부 삽입 도). 또한 LOX/AOS/AOC 반응 산물을 추출과정 없이 직접 분석할 수 있는 reversed phase HPLC(RP-HPLC)를 이용하여 OPDA 합성 효율을 분석하였다(도 4C 및 4D). HPLC 분석중 α-ketol, OPDA, HPOT에 대하여 사용된 UV-검출기의 파장은 각각 205nm, 220nm 및 234nm이다. 상기 분석 결과, 대두 유래 LOX, 벼 유래 AOS 및 AOC 효소를 이용하여 리놀렌산으로부터 cis-(+)OPDA를 효율적으로 생성할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 왕겨의 나노세공 실리카(RHS, rice husk silica)를 이용한 단백질의 고정화
한국등록특허 제0396457호에 제시된 방법에 따라 산처리-탄화-산처리-산화 과정을 거쳐 평균 입경 50~500nm, 10nm 이하의 내부 관통 세공을 가진 왕겨 실리카를 제조하였다. 제조된 왕겨실리카(RHS) 100mg을, 에틸알코올에 희석한 21%(w/v) APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)와 혼합하고 40℃에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어주며 반응시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하고 에틸알코올과 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.2)으로 각각 씻어 여분의 APTES를 제거하여 APTES로 모식된(modified) RHS(RHS-APTES)를 얻었다. 1㎖의 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.2)에 재현탁된 RHS-APTES(10mg)에 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GDA)를 첨가하고(1%) 실온에서 4시간 동안 서서히 흔들면서 반응시켜 옅은 핑크색의 생성물을 얻었다. 반응물을 원심분리하여 글루타르알데히드가 도입된 RHS(RHS-APTES-GDA)를 얻었다. 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.2)으로 여분의 GDA를 씻어내고 약 300㎍의 BSA를 첨가한 후 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 원심분리하고 1M 염화나트륨과 1% Tween 20을 포함한 용액으로 세척하여 고정되지 않은 단백질을 완전히 제거하여 BSA가 화학적 공유결합을 통하여 RHS에 고정된 조성물(RHS-APTES-GDA-BSA)을 얻었다. 리폭시게나제(LOX), 알렌 옥사이드 합성효소(AOS), 알렌 옥사이드 고리화효소(AOC)의 화학적 고정을 위하여 리폭시게나제는 Sigma-Aldrich에서 구매하였고, 벼의 알렌 옥사이드 합성효소(OsAOS1) 및 알렌 옥사이드 고리화효소(OsAOC)는 상기 실시예 1에 기술된 방법에 따라 준비하고, BSA의 경우와 동일한 방법으로 RHS-APTES-GDA와 반응시켜 각각의 효소가 화학적 공유결합을 통하여 RHS에 고정된 조성물인 RHS-APTES-GDA-LOX, RHS-APTES-GDA-AOS, RHS-APTES-GDA-AOC를 얻었다. 각 단백질의 고정화에 대하여 고정화된 단백질의 양을 계산하여 고정화 효율을 분석하였다(표 1). 고정화 효율은 단백질의 종류에 따라 상이하게 나타났으나, 약 50-93%의 고정화 효율을 보였다.
왕겨 나노세공 실리카를 메트릭스로 사용한 단백질의 화학적 고정화 효율a
단백질 단백질의 양
(A) (㎍)		 고정되지 않은 단백질의 양
(B)b (㎍)		 고정된 단백질의 양
(C=A-B) (㎍)		 고정화 효율
((C/A)x100)(%)
BSA 320.3 ± 0.9 108.0 ± 2.0 211.6 ± 2.0 66.2 ± 0.6
LOX 251.2 ± 0.9 69.4 ± 5.7 191.4 ± 5.7 73.4 ± 2.2
AOSc 288.1 ± 0.9 145.1 ± 3.5 143.1 ± 3.5 49.6 ± 1.2
AOC 194.7 ± 0.9 14.7 ± 0.4 180.0 ± 0.4 92.5 ± 0.2
a, 실험 결과는 3번씩 반복하여 얻은 평균값 ±표준편차로 나타냈다.
b, 고정되지 않고 용액상에 남아있는 단백질의 농도는 BCA(bichinconic acid) 방법으로 정량하여 결정하였다.
c, 0.02% Emulphogene을 포함.
실시예 3. 왕겨의 나노세공 실리카(RHS)에 고정된 효소의 활성 분석
RHS에 고정된 LOX의 활성은 자일레놀오렌지(xylenol orange) 분석법을 이용하여 측정하였으며(del Carmen Pinto et al., (2007) J. Agric. Food Chem. 55:5956-5959), AOS의 활성은 LOX를 이용하여 생산한 HPOT를 기질로 사용하여 측정하였고(Yoeun et al. 2013), LOX, AOS, AOC 반응을 연결하여 리놀렌산으로부터 OPDA를 합성하였다. AOC의 활성은 RP-HPLC를 이용하여 분리된 OPDA 생산량으로 나타냈다. 고정화된(immobilized) 효소의 활성을 고정화되지 않은(free) 효소의 활성과 비교한 결과(표 2), LOX와 AOS의 활성은 공유결합적 방법을 이용한 효소의 고정화에 의하여 크게 감소하였으나 AOC의 활성은 약간 증가함을 알 수 있었다.
고정화(immobilized) 시스템과 고정화되지 않은(free) 시스템에서 효소의 활성 비교
효소 특이적 활성(μmol/sec.㎍) 상대적 활성(%)a
free system immobilized system
LOX 1.1 x 10-5 2.7 x 10-7 2.4
AOS 3.8 x 10-4 4.8 x 10-6 1.3
AOCb 464.7 507.2 109.0
a, 고정화되지 않은(free) 시스템에 대한 고정화(immobilized) 시스템의 상대적인 촉매효율을 백분율로 표시.
b, AOC 반응에 의한 생성된 OPDA의 상대량을 RP-HPLC 크로마토그램으로 분석하여 백분율로 표시.
실시예 4. LOX 효소반응에서 사용된 효소량에 대한 생성물의 양 분석
리폭시게나제의 경우 반응 시간에 따른 효소반응 생생성물인 HPOTE의 생성양을 분석한 결과, 고정화되지 않은(free) LOX에서는 사용된 효소의 총량이 감소함에 따라 생성되는 HPOTE의 양도 감소하였다. 이러한 결과는 free LOX의 경우 효소 반응이 진행됨에 따라 비활성화가 일어남을 시사하고 있다. 그러나, 고정화된(immobilized) LOX에서는 사용되는 효소의 양과 무관하게 항상 일정량의 HPOTE가 생성되었다(도 5). 따라서, RHS와 GDA를 사용하여 LOX 효소를 고정화시킴에 따라 효소의 특이적 활성은 감소하였으나(표 2), 반응에 따른 LOX 효소의 비활성화를 방지할 수 있어서(도 5) HPOTE를 생산할 수 있는 효과적인 방법이라고 할 수 있다.
실시예 5. 고정화된 효소의 재사용에 따른 활성의 변화
고정화된 효소 시스템의 내구성을 평가하기 위하여 APTES와 GDA를 사용하여 LOX, AOS 또는 AOC 각각을 고정하고, 각 고정화 시스템에 대하여 재사용에 따른 효소반응 생성물의 양을 실시예 3에서와 같이 분석하였다. 그 결과, LOX 고정화 시스템의 경우 재사용 3회째까지는 효소반응 생성물의 양이 증가하였으나, 4회째에 급격히 하락하였고, 그 후 서서히 효소반응 생성물의 양이 감소하는 것으로 확인되었다. AOS 고정화 시스템의 경우, 재사용 2회째까지는 효소반응 생성물의 양이 증가하였으나, 3회째부터 효소반응 생성물의 양이 급격히 감소하는 것으로 확인되었다. AOC 고정화 시스템의 경우, 재사용 5회째까지는 반응 생성물의 양이 증가하였으나, 6회째부터 반응 생성물의 양이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, AOC의 경우, 동일 재사용 횟수 기준으로 LOX 또는 AOS 효소보다 반응 생성물의 양이 많음을 확인할 수 있었다(도 6). 이는 AOC의 높은 고정화 효율에 기인한 것으로 사료되었다(표 1). 재사용에 따라 반응 생성물의 양이 증가한 것은 1회째에는 효소반응 생성물이 RHS에 흡착하여 용액상으로 석출되지 않았기 때문으로 판단되었다.
실시예 6. 리폭시게나제, 알렌 옥사이드 합성효소, 알렌 옥사이드 고리화효소의 다중고정( co - immobilization ) 시스템
리놀렌산(linolenic acid)을 출발물질로 하고 글루타르알데히드(GDA)를 사용하여 제조한 고정화 시스템(GDA-(LOX-AOS-AOC)과 ECH-PEG를 스페이서(spacer)로 사용하여 제조한 고정화 시스템(ECH-PEG-(LOX-AOS-AOC))을 사용하여 OPDA를 생산한 결과를 비교하였다.
그 결과, GDA-(LOX-AOS-AOC) 다중고정 시스템이 ECH-PEG-(LOX-AOS-AOC) 다중고정 시스템에 비하여 OPDA의 생성효율도 높고, 재사용에 따른 내구성도 높게 확인되었다(도 7).

Claims (8)

  1. a) 왕겨실리카(rice husk silica, RHS)에 18~24% 농도의 APTES((3-aminopropyl)triethoxysilane)를 혼합하여 38~42℃에서 반응시키는 단계;
    b) 상기 a) 단계의 반응 혼합물을 원심분리한 후, 반응하지 않은 잔여 APTES를 제거하여 APTES로 모식된(modified) 왕겨실리카(RHS-APTES)를 회수하는 단계;
    c) 상기 b) 단계의 회수된 APTES로 모식된 왕겨실리카(RHS-APTES)에 글루타르알데히드(glutaraldehyde, GDA)를 혼합하여 상온에서 반응시키는 단계; 및
    d) 상기 c) 단계의 반응 혼합물을 원심분리한 후, 반응하지 않은 잔여 글루타르알데히드를 제거하여 APTES 및 글루타르알데히드로 모식된 왕겨실리카(RHS-APTES-GDA)를 회수하는 단계;를 포함하는 알렌 옥사이드 고리화효소(allene oxide cyclase) 고정화용 왕겨실리카 매트릭스의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 왕겨실리카는 나노세공 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 알렌 옥사이드 고리화효소 고정화용 왕겨실리카 매트릭스의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 알렌 옥사이드 고리화효소(allene oxide cyclase) 고정화용 왕겨실리카 매트릭스.
  4. 제3항의 왕겨실리카 매트릭스에 알렌 옥사이드 고리화효소(allene oxide cyclase)가 고정화된 왕겨실리카-알렌 옥사이드 고리화효소 복합체.
  5. 삭제
  6. 제4항의 알렌 옥사이드 고리화효소(allene oxide cyclase)가 고정화된 왕겨실리카-알렌 옥사이드 고리화효소 복합체를 이용하여 옥시리핀(oxylipin) 화합물을 생산하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
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