JPH0799988A - トレハロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 この出願発明は、安価な糖質原料と安定な酵
素を用い、目的物の分離精製が発酵法に比べて容易な酵
素法により高い生産性でトレハロースを製造することを
目的とする。 【構成】 無機リン酸および／またはその塩の存在下糖
質に作用してα−グルコース １−リン酸を生成させる
ことができるホスホリラーゼ、α−グルコース１−リン
酸とグルコースからトレハロースを生成させることがで
きるトレハロースホスホリラーゼ、無機リン酸および／
またはその塩の存在下α−ホスホリラーゼの作用により
α−グルコース １−リン酸を生成する糖質、グルコー
ス、および無機リン酸および／またはその塩を任意の順
序で混合して反応させトレハロースを製造することを特
徴とするトレハロースの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本出願の発明は、トレハロースの
製造方法に関する。

【０００２】最近、各種のオリゴ糖が注目され、その開
発が進められている。トレハロースは、微生物界、動物
界、植物界に広く分布する二糖類であり、甘味剤（特開
昭６３−２４０７５８号公報）、蛋白質の乾燥保護剤
（特表昭６３−５００５６２号公報）等の用途が提案さ
れている。

【従来の技術】

【０００３】トレハロースの製造法として、従来は上記
天然物からの抽出法、酵母、アースロバクター、ノカル
ディア等の微生物による発酵法等が知られている。しか
しながらこれらの方法においては生産性が高いとはいい
難く、また目的とする糖質の分離精製に煩雑な操作を要
するため、工業的生産には適さない。

【０００４】トレハロースの製造法として、マルトース
を基質としてβ−グルコース １−リン酸を経てトレハ
ロースを製造する酵素法も知られている（特公昭６３−
６０９９８号公報）。しかしながら、原料マルトース価
格、マルトースホスホリラーゼの供給および価格に問題
があり、またβ−グルコース １−リン酸とグルコース
からトレハロースを生成させるトレハロースホスホリラ
ーゼがあまり安定な酵素ではないうえ、酵素源であるユ
ーグレナ（緑藻の１種）の培養が必ずしも容易ではない
という難点がある。

【０００５】一方、フラムリナ ベルチペス（Flammuli
na velutipes）より得られる酵素がｐＨ７近辺でα−グ
ルコース １−リン酸とグルコースからトレハロースを
生成させる酵素として知られている（FEMS Microbiolog
y Letters, 55, 147-150 (1988)）。 しかし、フラムリ
ナ ベルチペス（Flammulina velutipes）から得られる
トレハロースホスホリラーゼは安定性が低く酵素調製が
困難であり、かつ長時間高温での使用に耐えないのでト
レハロースの工業的生産には適さない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来知られているトレ
ハロースの製造方法として天然物からの抽出法の他に発
酵法と酵素法が知られているが、発酵法では生産性の低
さおよび目的物の分離精製の煩雑さが、また酵素法では
基質の価格、酵素の供給、価格および不安定さが障害と
なってトレハロースの工業的生産は実現していない。目
的物の分離精製を考慮すると発酵法よりも酵素法がすぐ
れているので、安価な基質に作用してトレハロースを迅
速に収率良く生成させることができ、かつ入手が容易で
安定な酵素の開発が望まれる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本出願の発明は安価な糖
質原料と安定な酵素を用い、目的物の分離精製が発酵法
と比較して容易な酵素法により高い生産性でトレハロー
スを製造する方法を提供することを目的とする。

【０００８】すなわち本出願の発明者らは、α−グルコ
ース １−リン酸とグルコースからトレハロースを生産
させる能力を具えるとともに安定性に優れたトレハロー
スホスホリラーゼを見いだし、該トレハロースホスホリ
ラーゼを利用して高い生産性でトレハロースを製造する
方法を鋭意研究した結果、本出願の発明に到達したもの
である。

【０００９】本出願の発明は、無機リン酸および／また
はその塩の存在下糖質に作用してα−グルコース １−
リン酸を生成させることができるホスホリラーゼ（以
下、「α−ホスホリラーゼ」と略記する）を無機リン酸
および／またはその塩の存在下糖質に作用させることに
よりα−グルコース １−リン酸の生成を開始させ、任
意の時間経過後、α−グルコース １−リン酸を分離す
ることなく、α−グルコース １−リン酸とグルコース
からトレハロースを生成させることができるトレハロー
スホスホリラーゼ（以下「トレハロースホスホリラー
ゼ」と略記する）およびグルコースを加えて、α−グル
コース １−リン酸とグルコースからトレハロースを製
造することを特徴とするトレハロースの製造方法を提供
する。

【００１０】本出願の発明はまた、無機リン酸および／
またはその塩の存在下糖質に作用してα−グルコース
１−リン酸を生成させることができるα−ホスホリラー
ゼ、α−グルコース １−リン酸とグルコースからトレ
ハロースを生成させることができるトレハロースホスホ
リラーゼ、無機リン酸および／またはその塩の存在下α
−ホスホリラーゼの作用によりα−グルコース １−リ
ン酸を生成する糖質、グルコース、および無機リン酸お
よび／またはその塩を任意の順序で混合して反応させト
レハロースを製造することを特徴とするトレハロースの
製造方法を提供する。

【００１１】本出願の発明はまた、無機リン酸および／
またはその塩の存在下α−ホスホリラーゼの作用により
α−グルコース １−リン酸を生成する原料糖質１ Kg
に対する無機リン酸および／またはその塩の濃度を規定
することにより、効率よくトレハロースを製造すること
を特徴とするトレハロースの製造方法を提供する。以
下、本発明の方法をさらに詳細に説明する。

【００１２】本発明の方法は、糖質および無機リン酸お
よび／またはその塩の混合物にα−ホスホリラーゼを作
用させ、生成してくるα−グルコース １−リン酸をト
レハロースホスホリラーゼの存在下グルコースと反応さ
せるトレハロースの製造方法である。

【００１３】α−グルコース １−リン酸の供給源とな
る糖質はデンプン、グリコーゲン、デキストリン、１，
４−α−Ｄ−グルカン、セロビオース、セロデキストリ
ン、１，４−β−Ｄ−オリゴグルカン、ラミナリビオー
ス、ラミナリン、１，３−β−Ｄ−オリゴグルカン、
１，３−β−Ｄ−グルカンおよびスクロース等からなる
群から選んで用いる。

【００１４】α−ホスホリラーゼはデンプンホスホリラ
ーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、１，４−α−Ｄ−
グルカンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラー
ゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、１，４−β−Ｄ
−オリゴグルカンホスホリラーゼ、ラミナリビオースホ
スホリラーゼ、ラミナリンホスホリラーゼ、１，３−β
−Ｄ−オリゴグルカンホスホリラーゼ、１，３−β−Ｄ
−グルカンホスホリラーゼおよびスクロースホスホリラ
ーゼ等からなる群から原料糖質にあわせて選んで用い
る。

【００１５】トレハロースホスホリラーゼはα−グルコ
ース １−リン酸とグルコースからトレハロースを生成
させることができ、安定性に優れていればいかなる起源
のトレハロースホスホリラーゼでも用いることができ
る。具体的にはシゾフィルム(S chizophyllum)属、プレ
ウロツス(Pleurotus)属、リオフィルム(Lyophyllum)
属、グリフォラ(Grifola)属、アガリクス(Agaricus)
属、トラメテス(Trametes)属、コリオルス(Coriolus)
属、トリキャプツム(Trichaptum )属およびレンチテス
(Lenzites)属由来の担子菌の子実体、菌糸体あるいは液
体培養菌糸体を酵素源として用いることができる。さら
に具体的にはシゾフィルム コムネ(Schizophyllumcomm
une)、プルロツス オストレアツス(Pleurotus ostreat
us)、リオフィルムウルマリウム(Lyophyllum ulmariu
m)、グリフォラ フロンドーサ(Grifola frondosa)、ア
ガリクス ビスポルス(Agaricus bisporus)、トラメテ
ス ベルシコロル(Trametes versicolor)、コリオルス
ベルシコロル(Coriolus versicolor)、トラメテス
ヒルスタ(Trametes hirsuta)、コリオルス ヒルスツス
(Coriolushirsutus)、コリオルス コンソルス(Coriolus
consors)、トリキャプツム ビフォルメ(Tricaptum bi
forme)およびレンチテス ベツリナ(Lenzites betulin
a)等の担子菌の子実体、菌糸体あるいは液体培養菌糸体
を酵素源として用いることができる。

【００１６】具体的なトレハロースホスホリラーゼ生産
菌株の例としては、通産省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されているシゾフィルム コムネ(Schizop
hyllum commune)微工研菌寄第 １７４４号、 プレウ
ロツス オストレアツス(Pleurotus ostreatus)微工研
菌寄第 １７４６号、リオフィルム ウルマリウム(Lyop
hyllum ulmarium)微工研菌寄第 ９８５号、グリフォラ
フロンドーサ(Grifolafrondosa)微工研条寄第 ３５
号、アガリクス ビスポルス(Agaricus bisporus)微工
研菌寄第 １７４８号、コリオルス ベルシコロル(Cor
iolus versicolor)微工研菌寄第 ２４１２号、コリオ
ルス ヒルスツス(Coriolus hirsutus)微工研菌寄第
２７１１号、コリオルス コンソルス(Coriolus consor
s)微工研菌寄第 ９８８号、トリキャプツム ビフォル
メ(Tricaptum biforme)微工研菌寄第２７１２号、レン
チテス ベツリナ(Lenzites betulina)微工研条寄第 ２
７号等の担子菌の子実体、菌糸体あるいは液体培養菌糸
体を酵素源として用いることができる。

【００１７】また、トラメテス ベルシコロル(Trametes
versicolor)ＡＴＣＣ ２０５４７、トラメテス ヒル
スタ(Trametes hirsuta)ＡＴＣＣ ２０５６１、コリオ
ルスコンソルス(Coriolus consors)ＡＴＣＣ ２０５６
５、コリオルス パルガメヌス(Coriolus pargamenus)
ＡＴＣＣ ２０５６２等の担子菌の子実体、菌糸体ある
いは液体培養菌糸体を酵素源として用いることができ
る。

【００１８】これら寄託菌の菌株の同定、命名は今関六
也氏、本郷次男氏共著による「原色日本菌類図鑑」（正
（昭和３２年）、続（昭和４０年）保育社）、「原色日
本新菌類図鑑」（Ｉ巻（昭和６２年）、ＩＩ巻（平成元
年）保育社）および伊藤誠哉氏著「日本菌類誌」（ＩＩ
巻１部（昭和１１年）、２部（昭和１４年）、３部（昭
和２５年）、４部（昭和３０年）、５部（昭和３４年）
養賢堂）に準拠するものである。

【００１９】本発明の方法に使用し、また通産省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託した菌種は、該菌種
が着生している腐朽植物体の一部、その植物体上に発生
している子実体の組織、または胞子を適当な寒天培地に
移植し、適温で数週間培養するという培養操作を３回な
いし４回繰り返し行なって純粋分離した。

【００２０】本発明の方法のトレハロースホスホリラー
ゼとしては、トレハロースホスホリラーゼの生産能を有
する菌株の変異株に由来する酵素を使用することもでき
る。

【００２１】本出願の発明のトレハロースホスホリラー
ゼとしては、トレハロースホスホリラーゼまたは修飾さ
れたトレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子を
適当な宿主に挿入し、そしてその宿主を培養することに
より生産されるトレハロースホスホリラーゼまたは修飾
されたトレハロースホスホリラーゼも使用することがで
きる。

【００２２】トレハロースホスホリラーゼを得るには、
上記の担子菌を公知の培養法、例えば酵母エキス０．１
ないし５％、麦芽エキス０．１ないし５％、グルコース
０．５ないし１０％、ｐＨ５．５ないし７．０の組成の
培地で数日間振とう培養した後、遠心分離により菌体を
集め酵素源とする。また、担子菌を公知のおがくず培地
等で培養した子実体、あるいは市販のヒラタケ、シメ
ジ、ブナシメジ、マイタケ、マッシュルーム等を酵素源
とすることもできる。

【００２３】酵素源からのトレハロースホスホリラーゼ
の調製は以下のように行なう。上記担子菌の菌体または
子実体を緩衝液中、例えばリン酸緩衝液中で破砕した
後、不溶物を分離除去して得られる液を粗酵素液とす
る。粗酵素液はそのままトレハロースの製造に用いるこ
ともできるが、さらに分離、精製して用いるのが好まし
い。粗酵素液の分離、精製法としては、硫安沈澱による
塩析法、溶媒沈澱法、イオン交換樹脂による吸着、透析
膜による分離、限外濾過膜による濃縮、ハイドロキシア
パタイトによる吸着、疎水性担体による分離等の一般的
な蛋白質の分離精製法を利用することができる。このよ
うにして得た精製酵素または粗酵素をそのまま用いても
よいが、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋
法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固
定化酵素としてもよい。また、生菌体をポリアクリルア
ミド、κ−カラギナン、アルギン酸、光架橋性樹脂プレ
ポリマー等を利用する包括固定化法により固定化して生
体触媒として用いることもできる。

【００２４】本発明の方法の実施態様の一つとしてとし
て、糖質、無機リン酸および／またはその塩、α−ホス
ホリラーゼ、グルコースおよびトレハロースホスホリラ
ーゼを任意の順序で混合して反応させトレハロースを製
造することがあげられる。

【００２５】本発明の方法の他の実施態様として、α−
ホスホリラーゼの存在下糖質と無機リン酸および／また
はその塩を反応させてα−グルコース １−リン酸を生
成させ、次いで任意の時間経過後、α−グルコース １
−リン酸を分離あるいは分離せずに、グルコースおよび
トレハロースホスホリラーゼを系に加えて、α−ホスホ
リラーゼの作用により生成してくるα−グルコース １
−リン酸を順次トレハロースに転換させることがあげら
れる。

【００２６】さらに本発明の方法の実施態様として、糖
質からのα−グルコース１−リン酸生成反応と、α−グ
ルコース １−リン酸からのトレハロース生成反応を別
個に実施してもよい。しかしその場合は、第一の反応の
生成混合物からα−グルコース １−リン酸を分離回収
する必要があることならびに原料糖質に対して化学量論
量の無機リン酸および／またはその塩を使用する必要が
あるので得策ではない。

【００２７】本発明の方法の特徴の一つは使用する２種
類の酵素が相互に機能を妨げないこと、および相互の基
質および生成物による阻害作用を受けないことである。
この特徴により、α−ホスホリラーゼによるα−グルコ
ース １−リン酸の生成を開始した後、任意の時間後に
グルコースとトレハロースホスホリラーゼを追加する
と、既に生成しているα−グルコース １−リン酸はも
ちろん、未反応の糖質から継続して生成するα−グルコ
ース １−リン酸もグルコースと反応して目的とするト
レハロースが生成する他、無機リン酸が生成して糖質と
の反応に循環再使用されるので、無機リン酸および／ま
たはその塩の使用量は化学量論量よりもはるかに少なく
てよく実用的見地から有利である。

【００２８】本発明の方法においてグルコースはα−グ
ルコース １−リン酸との反応を除いて不活性であるか
ら、その添加時期はいつでもよい。糖質、無機リン酸お
よび／またはその塩およびα−ホスホリラーゼとともに
最初に反応系に加えてもよいし、任意の時間経過後にト
レハロースホスホリラーゼとともに加えてもよい。任意
の時点でグルコースを単独で反応系に加えてもよい。

【００２９】ここまでの説明から容易に推察されるよう
に、本発明の方法においてすべての反応基質と酵素を同
時に混合して反応を開始させることは可能であるばかり
か、好ましい実施態様である。なぜならば、すべての反
応基質と酵素を同時に混合して反応を開始させること
は、α−ホスホリラーゼの作用によるα−グルコース１
−リン酸の生成を開始してからグルコースおよびトレハ
ロースホスホリラーゼを加えてトレハロースの生成を開
始するまでの時間をゼロにすることに相当し、中間体と
して生成するα−グルコース １−リン酸が直ちにトレ
ハロースに変換される可能性を最大にする。したがって
α−グルコース １−リン酸が副反応により失われる可
能性を最小にするからである。

【００３０】ここまでの説明から容易に推察されるよう
に、基質と酵素の混合の順序に関してなんら制約がない
ことは明らかである。極端な場合にはトレハロースホス
ホリラーゼを最初に加えてもよい。

【００３１】本発明の方法の実施にあたり、全反応液１
００容量部（リットル）に対してα−グルコース １−
リン酸の原料となる糖質を０．１ないし７５重量部（キ
ログラム）使用する。例えば、デンプンでは、０．５な
いし５０重量部、好ましくは１ないし３０重量部、また
スクロースでは０．１ないし７５重量部、好ましくは１
ないし５０重量部使用する。なお本明細書中で全反応液
の容量とはすべての基質および酵素を加え終わったとき
の反応液の反応温度における容量を意味する。

【００３２】本発明の方法の実施にあたり、全反応液１
００容量部（リットル）に対してグルコース０．０１な
いし５０重量部（キログラム）、好ましくは１ないし２
５重量部使用する。

【００３３】本発明の方法において使用する無機リン酸
および／またはその塩としては、オルトリン酸、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム等の通常の無機リン酸及びそ
の塩等を使用することができ、好ましくはリン酸緩衝液
の形態で用いる。

【００３４】本発明の方法においては、原料糖質１ kg
に対して無機リン酸および／またはその塩を０．１ミリ
モルないし６モル、好ましくは１ミリモルないし０．５
モル使用する。

【００３５】本発明の方法においては、α−グルコース
１−リン酸の供給源となる糖質１kg に対してα−ホ
スホリラーゼを０．１単位以上、好ましくは１単位以上
用い、トレハロースホスホリラーゼを０．１単位以上、
好ましくは１単位以上用いる。酵素の使用量に上限は存
在せず、最適な酵素使用量は経済性を考慮して決定され
る。

【００３６】本発明の方法においてα−グルコース １
−リン酸を製造するときは、ｐＨ２ないし１０、好まし
くは４ないし９、反応温度１０ないし８０℃、好ましく
は１５ないし６０℃で行なう。α−グルコース １−リ
ン酸からトレハロースを製造するときは、ｐＨ２ないし
１０、好ましくは４ないし９、反応温度１０ないし８０
℃、好ましくは１５ないし６０℃で行なう。

【００３７】α−ホスホリラーゼとトレハロースホスホ
リラーゼを同時に存在させて、生成してくるα−グルコ
ース １−リン酸を順次トレハロースに変換する場合に
は、ｐＨ２ないし１０、好ましくは４ないし９、更に好
ましくは５ないし８、温度１０ないし８０℃、好ましく
は１５ないし６０℃で反応させる。

【００３８】本発明の方法を実施するにあたり減圧下、
常圧下あるいは加圧下で行なうことができる。減圧下で
行なうときは０．５ないし１ kg/cm² （絶対圧）、加圧
下で行なうときは１ないし１０ kg/cm² （絶対圧）の圧
力下で行なう。

【００３９】本出願の発明の酵素反応終了後、必要であ
れば酵素を失活させ、遠心分離、濾過等により不溶物を
除去し、上清を得ることができる。この上清はトレハロ
ースを主成分とする糖組成物であり、目的に応じてその
まま使用することもでき、必要に応じてトレハロースを
単離精製して用いることもできる。例えば活性炭吸着処
理することによりトレハロースを吸着させ２０％エタノ
ール水溶液により溶出させ、ダウエックス^TM−１（ダウ
ケミカル社製）、ＣＭセルロース等のアニオン型イオン
交換樹脂で処理することによって糖液として精製するこ
とができる。また、この糖液をほう酸型イオン交換樹脂
に吸着させ、ほう酸カリウム等の水溶液にて溶出させる
ことにより精製し、最後に濃縮してトレハロースの結晶
を得ることができる。以下に、調製例、実施例により本
出願の発明を具体的に説明する。

【００４０】

【実施例】

調製例１（トレハロースホスホリラーゼの調製） 新鮮な市販マイタケ子実体２９５ g に２０mM トリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、２０％グリセロール、１ mM
ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールを含む。以下同
じ）６００ ml を加え、ワーリングブレンダー^TM（ダイ
ナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶物
を除去し、上清液７８０ ml を得、これを粗酵素液とし
た。この粗酵素液に６０％飽和硫酸アンモニウム濃度に
なるように硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム
沈澱処理を行なった。遠心分離により沈澱物を回収し、
３０％硫酸アンモニウムを含む２０ mM トリス−塩酸緩
衝液に溶解し、同じ緩衝液で平衡化したブチル−トヨパ
ール^TM６５０（トーソー社製）２４ ml を充填したカラ
ム（１５ mmφ×１４０ mm）に通し、同じ緩衝液にて洗
浄後、硫酸アンモニウム濃度３０％から０％の直線濃度
勾配溶出（２０ mM トリス−塩酸緩衝液、総容量２５０
ml）を行なった。酵素活性画分を２０mM クエン酸−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、２０％グリセロー
ル、１ mM ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールを含
む。以下同じ）に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化し
たＡＦ-ブルートヨパール^TM６５０（トーソー社製）２
０ml を充填したカラム（１５ mmφ×１１０ mm）に通
し、同じ緩衝液にて洗浄後、塩化カリウム濃度０から
０．５Ｍの直線濃度勾配溶出（２０ mM クエン酸−水酸
化ナトリウム緩衝液、総液量２００ ml）を行なった。
酵素活性画分をホローファイバー限外濾過装置を使用し
て濃縮し、酵素液３．１ ml を得た。この酵素液のトレ
ハロースホスホリラーゼ活性、比活性は、それぞれ１
０．８単位／ml、３．４８単位／mg蛋白質であった。

【００４１】酵素の活性は、以下により求めた。すなわ
ちトレハロース１０．８ g 、グルタチオン８６０ mg、
ＥＤＴＡ・２Ｎａ１７．２ mg を５７ mM リン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し全量を１００mlとした
溶液１４００μｌ、２０mMＮＡＤＰ⁺水溶液１００μ
ｌ、２６ mM 塩化マグネシウム水溶液１００μｌ、１．
３４ mM グルコース １，６−二リン酸水溶液１００μ
ｌ、ホスホグルコムターゼ３１単位／ml 水溶液 １００
μｌ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml
水溶液１００μｌ、および被検酵素液１００μｌを混合
し、３０℃で反応させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３
４０ nm の吸光度によって経時的に測定する。この条件
下で１分間に１μmol のＮＡＤＰＨを生成する酵素量を
１単位とする。

【００４２】調製例２（トレハロースホスホリラーゼの
調製） 酵母エキス０．７５％、グルコース５．０％からなる培
地１００ ml （ｐＨ５．５）を３００ ml 三角フラスコ
に分注して滅菌（１２０℃、２０分間）した。表１の菌
株群から選ばれた各菌株を滅菌した培地に接種し、２６
℃、３日間振とう培養した。培養後遠心分離により菌糸
体を集め、２０mM リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加
え、ワーリングブレンダー^TM（ダイナミックス社、米
国）で破砕し、遠心分離により不溶物を除去し、粗酵素
液を得た。この粗酵素液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール^TM６５０Ｃ
（トーソー社製）を充填したカラムに通し、同じ緩衝液
にて洗浄後、塩化カリウム濃度０から０．５Ｍの直線濃
度勾配溶出（２０mM リン酸緩衝液、総容量４００ ml）
を行なった。このときのそれぞれの菌株由来の酵素液の
液量およびそのトレハロースホスホリラーゼの活性、総
活性、比活性を表１に示す。

【００４３】

【表１】

【００４４】調製例３（トレハロースホスホリラーゼの
調製） マッシュルーム（アガリクス ビスポルス(Agaricus bis
porus)）、まいたけ（グリフォラ フロンドーサ(Grifo
la frondosa)）、ひらたけ（プレウロツス オストレア
ツス(Pleurotus ostreatus)）、ぶなしめじ（リオフィ
ルム ウルマリウム(Lyophyllum ulmarium)）から選ばれ
た各菌株の新鮮な子実体それぞれ１００g に２０ mM リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０、２０％グリセロール、１ mM
ＥＤＴＡ、１ mM ジチオスレイトールを含む。以下同
じ）約１５０ ml を加え、ワーリングブレンダー^TM（ダ
イナミックス社、米国）で破砕し、遠心分離により不溶
物を除去し上清液を得、これを粗酵素液とした。粗酵素
液を、ＱＡＥトヨパール^TM（トーソー社製）２０mlを充
填したカラムに通し、同じ緩衝液にて洗浄後、塩化カリ
ウム濃度０から０．５ M の直線濃度勾配溶出（２０mM
リン酸緩衝液、総容量４００ml）を行なった。トレハロ
ースホスホリラーゼ活性画分をホローファイバー限外濾
過装置を使用して濃縮し酵素液を得た。それぞれの菌株
由来の酵素液の液量、およびそのトレハロースホスホリ
ラーゼ活性、総活性、比活性を表２に示す。

【００４５】

【表２】

【００４６】調製例４（α−ホスホリラーゼの調製） ジャガイモ３５０ｇを小片とし、２０ mM リン酸緩衝液
（ｐＨ７．０、２０％グリセロール、１ mM ＥＤＴＡ、
１ mM ジチオスレイトールを含む。以下同じ）２００ m
l を加えワーリングブレンダー^TM（ダイナミックス社
製、米国）により破砕し、ガーゼ濾過によりデンプンを
除去し、さらに遠心分離で不溶物を除き粗酵素液４００
ml を得た。この粗酵素液を２０ mM リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール^TM６５０Ｃ
（トーソー社製）１００ ml に吸着させ、塩化カリウム
濃度０から０．５ M の直線濃度勾配溶出（２０mM リン
酸緩衝液、総容量６００ ml）を行ない、各７．６ml ず
つ分画した。α−ホスホリラーゼ活性は、画分３１から
４１に見られた。活性画分を集めて（８４ml）ホローフ
ァイバー限外濾過装置を使用して濃縮し、５．４ ml の
酵素液を得た。この酵素液の活性は３２．３単位／ml
であった。

【００４７】酵素の活性は、以下により求めたものであ
る。すなわち、加温溶解して調製した５．７２％デンプ
ン水溶液７００μｌ、グルタチオン１．７２ g 、ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ３４．２ mg を１１４ mM リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し全量を１００mlとした溶
液７００μｌ、２０mM ＮＡＤＰ⁺水溶液１００μｌ、２
６ mM 塩化マグネシウム水溶液１００μｌ、１．３４ m
M グルコース １，６−二リン酸水溶液１００μｌ、ホ
スホグルコムターゼ３１単位／ml水溶液１００μｌ、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素３５単位／ml水溶液１
００μｌ、および被検酵素液１００μｌを混合し、３０
℃で反応させて生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０ nm
の吸光度によって経時的に測定する。この条件下で１分
間に１μmol のＮＡＤＰＨを生成する酵素量を１単位と
する。

【００４８】実施例１ ２００ mM スクロース水溶液７５０μｌ、４００ mM リ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３７５μｌ、５００
mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）３００μｌ、スクロー
スホスホリラーゼ（シグマ社製）１７．８単位／ml水溶
液５０μｌ、および精製水２５μｌを混合し、３５℃、
１０時間、エッペンドルフチューブ中で反応させた。加
熱処理により酵素を失活させた後、反応液中のα−グル
コース１−リン酸量を下記の方法で測定したところ、α
−グルコース １−リン酸濃度は７５ mM であった。こ
のときのスクロースから生成したα−グルコース １−
リン酸のモル収率は７５％であった。

【００４９】α−グルコース １−リン酸の濃度は、以
下により求めた。すなわち、ＥＤＴＡ・２Ｎａ１７．１
mg を４７ mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に
溶解し、全量を１００ ml とした溶液２．５ ml 、１
４．８ mM ＮＡＤＰ⁺水溶液１００μｌ、２６mM 塩化マ
グネシウム水溶液１００μｌ、１．３４ mM グルコース
１，６−二リン酸水溶液１００μｌ、ホスホグルコム
ターゼ３１単位／ml水溶液５０μｌ、グルコース−６−
リン酸脱水素酵素３５単位／ml水溶液５０μｌ、および
被検液１００μｌを混合し、３０℃、３０分間反応させ
て生成するＮＡＤＰＨ量を波長３４０ nm で吸光度測定
しα−グルコース １−リン酸量とした。

【００５０】実施例２ 加熱処理により酵素を失活させたα−グルコース １−
リン酸含有上記実施例１の反応終了液１１５０μｌ、５
００ mM グルコース水溶液３００μｌ、酵素調製例１に
より得たトレハロースホスホリラーゼ１０．８単位／ m
l 水溶液４０μｌ、および精製水１０μｌを混合し３５
℃、２１時間、エッペンドルフチューブ中で反応させ
た。加熱処理により酵素を失活させた後、反応液中のト
レハロース量を下記の方法で測定したところ、トレハロ
ース濃度は３３ mM であった。このときのα−グルコー
ス １−リン酸から生成したトレハロースのモル収率は
５７％であった。

【００５１】トレハロースの濃度は以下により求めた。
反応液をポリアミンカラム（ＹＭＣＰａｃｋ^TM Ｐｏｌ
ｙａｍｉｎｅ ＩＩ ４．６ mm φ×２５０ mm 、ＹＭＣ
社製）、溶離液アセトニトリル：水＝７：３、流速１ m
l／min、カラム温度３５℃、示差屈折計（セル温度３５
℃）による高速液体クロマトグラフィーにより測定し
た。このＨＰＬＣ条件においてトレハロースの保持時間
は１５．７分であった。

【００５２】実施例３ 調製例２により得たコリオルス ヒルスツス(Coriolus
hirsutus)微工研菌寄第 ２７１１号由来の酵素液６９
ml をホローファイバー限外濾過装置を使用して濃縮
し、トレハロースホスホリラーゼ活性２．４単位／ml
の酵素液２．０mlを得た。この酵素液５０μｌ、５００
mM スクロース水溶液５０μｌ、５００ mM グルコース
水溶液５０μｌ、４００ mM リン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）１０μｌ、５００ mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
６．５）５０μｌ、スクロースホスホリラーゼ（シグマ
社製）１１．５単位／ ml 水溶液１０μｌ、および精製
水３０μｌを混合し３０℃、１８時間、エッペンドルフ
チューブ中で反応させた。加熱処理により酵素を失活さ
せた後、反応液中のトレハロース量を実施例２に記載の
方法で測定したところ、トレハロース濃度は２４ mM で
あった。このときのスクロースから生成したトレハロー
スのモル収率は２４％であった。

【００５３】実施例４ 調製例３により得たプレウロツス オストレアツス(Pleu
rotus ostreatus)由来のトレハロースホスホリラーゼ
５．１単位／ml 水溶液２４μｌ、５００mM スクロース
水溶液５０μｌ、５００ mM グルコース水溶液５０μ
ｌ、４００ mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１
０μｌ、５００mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）５０μ
ｌ、スクロースホスホリラーゼ（シグマ社製）１１．５
単位／ml水溶液１０μｌ、および精製水５６μｌを混合
し３０℃、３６時間、エッペンドルフチューブ中で反応
させた。加熱処理により酵素を失活させた後、反応液中
のトレハロース量を実施例２に記載の方法で測定したと
ころ、トレハロース濃度は２９mM であった。このとき
のスクロースから生成したトレハロースのモル収率は２
９％であった。

【００５４】実施例５ ５００ mM スクロース水溶液３００μｌ、５００ mM グ
ルコース水溶液３００μｌ、１００ mM リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６．５）１５０μｌ、５００ mMＭＥＳ緩
衝液（ｐＨ６．５）３００μｌ、酵素調製例１によって
得たトレハロースホスホリラーゼ１０．８単位／ml 水
溶液５０μｌ、スクロースホスホリラーゼ（シグマ社
製）１７．８単位／ml 水溶液３０μｌ、および精製水
３７０μｌを混合し２７．５℃、７０時間、エッペンド
ルフチューブ中で反応させた。加熱処理により酵素を失
活させた後、反応液中のトレハロース量を実施例２に記
載の方法で測定したところトレハロース濃度は９６ mM
であった。このときのスクロースから生成したトレハロ
ースのモル収率は９６％であった。

【００５５】実施例６ １ M スクロース水溶液３ ml、１Ｍグルコース水溶液３
ml 、０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
０．２ ml、５００mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）２ m
l 、酵素調製例１によって得たトレハロースホスホリラ
ーゼ１０．８単位／ml 水溶液０．３３ ml、スクロース
ホスホリラーゼ（シグマ社製）１７．８単位／ml 水溶
液０．２ ml、および精製水１．２７ ml を混合し２
７．５℃、９７時間、密閉したガラス容器中で反応させ
た。加熱処理により酵素を失活させた後、反応液中のト
レハロース、フラクトース、グルコース、スクロース量
を実施例２に記載の方法と同じ方法で測定したところ、
それぞれ２８３、３０５、１８、１０ mM であった。こ
のときのスクロースから生成したトレハロースのモル収
率は９４％であった。なお、反応液のＨＰＬＣプロフィ
ールを図１に示す。図１において、スクロース、グルコ
ース、トレハロース、フラクトースはそれぞれ１２．５
分、９．９分、１５．７分、８．０分に溶出している。

【００５６】実施例７ １ M スクロース水溶液３００μｌ、１ M グルコース水
溶液３００μｌ、５００mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．
５）３００μｌ、 酵素調製例１によって得たトレハロ
ースホスホリラーゼ１０．８単位／ml水溶液１５０μ
ｌ、スクロースホスホリラーゼ（シグマ社製）１０．１
単位／ml水溶液１５０μｌ、および最終の無機リン酸濃
度が０から１００ mM になるように計算量のリン酸緩衝
液と精製水を混合して調製した液３００μｌを混合し、
２７．５℃、４時間エッペンドルフチューブ中で反応さ
せた。加熱処理により酵素を失活させた後、トレハロー
ス量を実施例２に記載の方法で測定した。各無機リン酸
濃度に対して生成したトレハロース濃度を表３に示し
た。その結果、本反応系では、無機リン酸の最適濃度は
スクロース１ kg に対して０．３７モルであった。

【００５７】

【表３】

【００５８】実施例８ ６００ mM グルコース水溶液２００μｌ、６０％デキス
トリン（ＤＥ２２）水溶液２００μｌ、１２５ mM リン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１０μｌ、５００ mM
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）１００μｌ、酵素調製例４
により得たジャガイモ由来のα−ホスホリラーゼ水溶液
４０μｌ、調製例１によって得たトレハロースホスホリ
ラーゼ１０．８単位／ml 水溶液４０μｌ、 および精製
水１０μｌを混合し３５℃、４９時間、エッペンドルフ
チューブ中で反応させた。反応液中のトレハロース量を
実施例２に記載の方法で測定した。その際に、反応液を
α−アミラーゼ、グルコアミラーゼで処理し、マルトー
スをグルコースに変えトレハロースを測定したところ、
トレハロース濃度は７３ mM であった。このときのデキ
ストリンから生成したトレハロースの重量収率は１２．
５％であった。また、グルコースから生成したトレハロ
ースの重量収率は７０％であった。

【００５９】実施例９ 実施例６により生成したトレハロースを単離精製するた
めに、反応終了液を活性炭カラム（２５ mmφ×３００
mm 、約１４７ ml、クロマトグラフ用、和光純薬社製）
に通し、トレハロースを吸着させ、水で洗浄し、次に２
０％エタノールで溶出させた。トレハロース画分を減圧
下で濃縮した後、高速液体クロマトグラフィーにより分
取を行なった。分取は、ポリアミンカラム（ＹＭＣ Ｐ
ａｃｋ^TMＰｏｌｙａｍｉｎｅ １０ mmφ×２５０ mm、
ＹＭＣ社製）、溶離液アセトニトリル：水＝７０：３
０、流速５ ml／min、カラム温度３５℃、示差屈折計
（セル温度３５℃）によって行なった。保持時間１２．
５から１６．５分のトレハロースのピークを分取した。
このトレハロース画分を濃縮し白色粉末約７５０ mgを
得た。

【００６０】上記のようにして得た白色粉末の２５０Ｍ
ＨｚプロトンＮＭＲスペクトルは、市販のトレハロース
標品のプロトンＮＭＲのスペクトルと一致した。またこ
の白色粉末のソモギ−ネルソン法による還元糖の試験は
陰性であった。さらにこの白色粉末を０．０５Ｎ硫酸中
に溶解して２０ mM 溶液とし、密閉容器中１００℃で１
５時間加熱し、ＨＰＬＣで測定したところ３７ mM のグ
ルコースが得られた。

【００６１】

【発明の効果】本発明の方法のように、無機リン酸およ
び／または無機リン酸塩の存在下、α−ホスホリラーゼ
および新規なトレハロースホスホリラーゼを作用させる
ことにより、安価で入手容易な糖質例えばデンプン、ス
クロース、セロビオース等からα−ホスホリラーゼの作
用によりα−グルコース １−リン酸を生成させ、この
α−グルコース １−リン酸をトレハロースホスホリラ
ーゼの作用によりグルコースと反応させてトレハロース
を製造することができる。また本発明の方法で用いるト
レハロースホスホリラーゼはトレハロースの生産性ばか
りでなく安定性にも優れ、そのうえ調製も容易なのでト
レハロースの工業的生産に適している。

【００６２】

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例６の酵素反応液の高速液体クロマトグラ
フィーのプロフィールである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無機リン酸および／またはその塩の存在
   下糖質に作用してα−グルコース １−リン酸を生成さ
   せることができるホスホリラーゼ、α−グルコース１−
   リン酸とグルコースからトレハロースを生成させること
   ができるトレハロースホスホリラーゼ、無機リン酸およ
   び／またはその塩の存在下α−ホスホリラーゼの作用に
   よりα−グルコース １−リン酸を生成する糖質、グル
   コース、および無機リン酸および／またはその塩を任意
   の順序で混合して反応させトレハロースを製造すること
   を特徴とするトレハロースの製造方法。
2. 【請求項２】 無機リン酸および／またはその塩の存在
   下糖質に作用してα−グルコース １−リン酸を生成さ
   せることができるホスホリラーゼを無機リン酸および／
   またはその塩の存在下糖質に作用させることによりα−
   グルコース１−リン酸の生成を開始させ、任意の時間経
   過後、α−グルコース １−リン酸を分離することな
   く、α−グルコース １−リン酸とグルコースからトレ
   ハロースを生成させることができるトレハロースホスホ
   リラーゼおよびグルコースを加えて、α−グルコース
   １−リン酸とグルコースからトレハロースを製造するこ
   とを特徴とするトレハロースの製造方法。
3. 【請求項３】 無機リン酸および／またはその塩の存在
   下糖質に作用してα−グルコース １−リン酸を生成さ
   せることができるホスホリラーゼを無機リン酸および／
   またはその塩の存在下糖質に作用させることによりα−
   グルコース１−リン酸を製造し、該α−グルコース １
   −リン酸を分離し、α−グルコース１−リン酸とグルコ
   ースからトレハロースを生成させることができるトレハ
   ロースホスホリラーゼの存在下該α−グルコース １−
   リン酸をグルコースと反応させトレハロースを製造する
   ことを特徴とするトレハロースの製造方法。
4. 【請求項４】 無機リン酸および／またはその塩の濃度
   が、糖質１ kg に対して、０．１ミリモルから６モルで
   あることを特徴とする請求項１ないし３に記載のトレハ
   ロースの製造方法。
5. 【請求項５】 無機リン酸および／またはその塩の存在
   下糖質に作用してα−グルコース １−リン酸を生成さ
   せることができるホスホリラーゼがデンプンホスホリラ
   ーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、１，４−α−Ｄ−
   グルカンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラー
   ゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、１，４−β−Ｄ
   −オリゴグルカンホスホリラーゼ、ラミナリビオースホ
   スホリラーゼ、ラミナリンホスホリラーゼ、１，３−β
   −Ｄ−オリゴグルカンホスホリラーゼ、１，３−β−Ｄ
   −グルカンホスホリラーゼおよびシュクロースホスホリ
   ラーゼからなる群から選ばれるホスホリラーゼであるこ
   とを特徴とする請求項１ないし４に記載のトレハロース
   の製造方法。
6. 【請求項６】 α−グルコース １−リン酸とグルコー
   スからトレハロースを生成させることができるトレハロ
   ースホスホリラーゼがシゾフィルム(Schizophyllum)
   属、プレウロツス(Pleurotus)属、リオフィルム(Lyophy
   llum)属、グリフォラ(Grifola)属、アガリクス(Agaricu
   s)属、トラメテス(Trametes)属、コリオルス(Coriolus)
   属、トリキャプツム(Trichaptum)属およびレンチテス(L
   enzites)属由来であることを特徴とする請求項１ないし
   ５に記載のトレハロースの製造方法。
7. 【請求項７】 α−グルコース １−リン酸とグルコー
   スからトレハロースを生成させることができるトレハロ
   ースホスホリラーゼがシゾフィルム コムネ(Schizophy
   llum commune)、プルロツス オストレアツス(Pleurotu
   s ostreatus)、リオフィルム ウルマリウム(Lyophyllu
   m ulmarium)、グリフォラ フロンドーサ(Grifola fron
   dosa)、アガリクス ビスポルス(Agaricus bisporus)、
   トラメテス ベルシコロル(Trametes versicolor)、コ
   リオルス ベルシコロル(Coriolus versicolor)、トラ
   メテス ヒルスタ(Trametes hirsuta)、コリオルス ヒ
   ルスツス(Coriolus hirsutus)、コリオルス コンソル
   ス(Coriolus consors)、トリキャプツム ビフォルメ(T
   ricaptum biforme)およびレンチテス ベツリナ(Lenzit
   es betulina)由来であることを特徴とする請求項１ない
   し６に記載のトレハロースの製造方法。
8. 【請求項８】 糖質が、無機リン酸および／またはその
   塩の存在下該糖質にホスホリラーゼが作用してα−グル
   コース １−リン酸を生成することができる糖質である
   ことを特徴とする請求項１ないし７に記載のトレハロー
   スの製造方法。
9. 【請求項９】 無機リン酸および／またはその塩の存在
   下ホスホリラーゼの作用によりα−グルコース １−リ
   ン酸を生成することができる糖質が、デンプン、グリコ
   ーゲン、デキストリン、１，４−α−Ｄ−グルカン、セ
   ロビオース、セロデキストリン、１，４−β−Ｄ−オリ
   ゴグルカン、ラミナリビオース、ラミナリン、１，３−
   β−Ｄ−オリゴグルカン、１，３−β−Ｄ−グルカンお
   よびスクロースであることを特徴とする請求項１ないし
   ７に記載のトレハロースの製造方法。
10. 【請求項１０】 じゃがいも由来のホスホリラーゼおよ
    びスクロースホスホリラーゼからなる群から選ばれるホ
    スホリラーゼを無機リン酸および／またはその塩の存在
    下デンプンまたはスクロースに作用させることにより生
    成するα−グルコース １−リン酸をグリフォラ フロ
    ンドーサ(Grifola frondosa)由来のトレハロースホスホ
    リラーゼの存在下グルコースと反応させることを特徴と
    する請求項１ないし４に記載のトレハロースの製造方
    法。
11. 【請求項１１】 糖組成がトレハロース２５ないし５０
    モル％、フルクトース２５ないし５０モル％、スクロー
    ス０ないし２５モル％、グルコース０ないし２５モル％
    からなることを特徴とする請求項１ないし９に記載の方
    法により製造される糖組成物。