JP5219068B2 - グルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンの製造方法、並びに新規微生物 - Google Patents
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また、単糖であるグルコースを原料とし、そのC-1位を保護し、次いでC-6位を酸化した後、強酸で加水分解し、脱保護し、グルクロン酸及びグルクロノラクトンを得る方法がある。この方法は、複雑な脱保護の工程が必要であるという点に問題がある(特許文献3参照)。
(1)ポリグルクロン酸に、パエニバチルス属細菌、または同細菌由来のグルコシド結合加水分解酵素を作用させることによってグルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンを得ることを特徴とする、グルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンの製造方法。
(2)前記パエニバチルス属細菌がパエニバチルスsp. TH501b(NITE P-463)株である、(1)のグルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンの製造方法。
(3)ポリグルクロン酸がデンプン、アミロースまたはアミロペクチンを酸化することによって得られる、(1)または(2)のグルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンの製造方法。
(4)パエニバチルスsp. TH501b(NITE P-463)株。
原料として用いるポリグルクロン酸は、グルクロン酸またはその塩を構成単位として含む多糖類であり、好ましくは、グルコースを構成単位とする多糖類のC-6位第一級水酸基を酸化することによって得られる。
例えば水溶性ラジカル試薬であるTEMPO(2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシラジカル)を用いたTEMPO/次亜塩素酸ナトリウム/臭化ナトリウムを用いた酸化系が好ましく利用でき、デンプンからはα-1→4‐ポリグルクロン酸(アミロウロン酸(Kato, Y.,
Matsuo, R., & Isogai, A. (2003). Oxidation process of water-soluble starch in TEMPO-mediated system. Carbohydrate Polymers, 51, 69-75))が、セルロースからはβ-1→4‐ポリグルクロン酸(セロウロン酸(Isogai, A., & Kato, Y. (1998). Preparation of polyuronic acid from cellulose by TEMPO-mediated oxidation. Cellulose, 5, 153-164))がそれぞれ調製できる。
水分解によりこれらの混合物を得ることができ、また、平衡状態を変化させることでいずれか一方を得ることもできる。
TH501b株は栃木県真岡市の土壌より、α-1→4-ポリグルクロン酸を炭素源とする培地(培地組成;0.82 g/L (NH4)2SO4,1.6 g/L K2HPO4,0.4 g/L KH2PO4,0.2 g/L MgSO4・7H2O,25 mg/L CaCl2・2H2O,2.3 mg/L FeCl3・6H2O,0.1 g/L yeast extract,5 g/L α-1→4-ポリグルクロン酸,pH 7.0)で繰り返し集積培養を行なうことによってα-1→4-ポリグルクロン酸の分解能を有する菌株として単離されたものであり、下記表1に示す性質を有する。
破砕した後、遠心分離(10000g,30分)し、その上澄みをそのまま粗酵素として、もしくは各種カラムクロマトグラフィによって該活性画分を精製して用いることができる。
なお、ポリグルクロン酸加水分解酵素は、微生物より精製されたものには限定されず、同酵素の配列に基づいて単離される遺伝子を用いた遺伝子組み換えによって得られるものでもよい。
上記の粗酵素液中には、α-1→4-ポリグルクロン酸をエンド型に分解してオリゴマーを生成するα-1→4-グルクロナーゼ活性と、エクソ型に作用して直接グルクロン酸を生成するα-1→4-グルクロニダーゼ活性の両者が含まれているため、目的に応じて両者を混合またはα-1→4-グルクロナーゼのみを選択的に使用すればよい。なおα-1→4-グルクロナーゼとα-1→4-グルクロニダーゼの分離は、例えば東ソー社製Toyopearl Super-Qのような陰イオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフィによって容易に行なうことができる。
また、本発明の方法においては、パエニバチルス属細菌そのものを用いることもできる。すなわち、パエニバチルス属細菌を、ポリグルクロン酸を含む培地で培養する発酵法や、増殖させたパエニバチルス属細菌の菌体をポリグルクロン酸と反応させる方法によってもグルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンを得ることができる。
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。なお、以下の実施例等において「%」は「重量%」を意味する。
system. Carbohydrate Polymers, 51, 69-75)に従って、TEMPO酸化し、α-1→4-ポリグルクロン酸(アミロウロン酸)を得た。
カラム(カラムサイズ;2.2cm×10cm)に供した。カラムは予め25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で平衡化しておいた。カラムに粗酵素を添加後、同緩衝液を流速1.5mL/分で約150mL流した後、同緩衝液に1M NaCl を含む緩衝液で直線グラジェント(0〜90%,900mL)をかけて、タンパク質を溶出させた。各フラクションは9mLずつ分画し、それぞれの酵素活性をソモギ-ネルソン法で測定した。その結果、酵素活性は、カラムに吸着せずに溶出されたフラクションと約0.2MのNaClで溶出されたフラクションの2つのピークとして回収された(図1)。それぞれのフラクションの酵素をα-1→4-ポリグルクロン酸を基質として反応させ、その生成物をTLCで分析したところ、前者のフラクションでは、数種のオリゴマーが生成(図2)するα-1→4-グルクロナーゼ活性を含んでいるのに対し、後者のフラクションは、生成物としてモノマーであるグルクロン酸のみを生成(図3)するα-1→4-グルクロニダーゼ活性であった。本菌が生産するα-1→4-グルクロニダーゼは、pH
4〜9で活性を示し、至適pHは 6付近であった。また基質特異性を調べたところ、アルギン酸、デンプン,ペクチンにはほとんど活性を示さず、調べた範囲で強い活性を示したのはα-1→4-ポリグルクロン酸のみであった。
Claims (3)
- ポリグルクロン酸に、パエニバチルス(Paenibacillus) sp. TH501b(NITE P-463)株、または同株由来のグルコシド結合加水分解酵素を作用させることによってグルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンを得ることを特徴とする、グルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンの製造方法。
- 前記ポリグルクロン酸がデンプン、アミロースまたはアミロペクチンを酸化することによって得られる、請求項1に記載のグルクロン酸及び/またはグルクロノラクトンの製造方法。
- パエニバチルス sp. TH501b(NITE P-463)株。
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