JP2017006019A - 新規マンナナーゼ及び、これを産生する新規微生物 - Google Patents

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津村 和伸
Kazunobu Tsumura
和伸 津村
靖彦 吉田
Yasuhiko Yoshida
靖彦 吉田
昭二 久礼
Shoji Kure
昭二 久礼
中村 彰宏
Akihiro Nakamura
彰宏 中村
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Abstract

【課題】(1)マンナンを加水分解しても単糖(マンノース等)の生成が極めて少なく、高収率でマンノビオースを得ることができる新規なマンナナーゼ及び(2)かかるマンナナーゼを産生する微生物。【解決手段】次の理化学的性質を有するマンナナーゼMN−1 1)作用:マンナンに作用してマンノビオースを優先的に生成する。2)基質特異性:β−1,4マンノピラノシド結合を加水分解する。3)安定pHは4〜7。4)作用温度は30〜50℃。5)温度安定性は50℃以下。6)分子量は4万。バチルス属に属しマンナナーゼを産生するバチルス・アミロリケファシエンスMN47(NITE P−01816)。【選択図】なし

Description

本発明はマンナン類多糖を選択的に分解する新規なマンナナーゼ及びこれを産生する新規微生物に関する。
従来、食物繊維等の分解には酸分解、アルカリ分解又は酵素分解等が用いられてきたが、これらの方法では単糖類の生成が多く、食物繊維等の改質(例えば可溶化、低分子化等)やオリゴ糖を目的とする場合にはその収率が下がる欠点を有している場合がある。
食物繊維のなかでも、マンナン等の植物由来の繊維はβ−1,4マンノシド結合した主鎖を有し、このβ−1,4マンノシド結合を加水分解する酵素としてβ−1,4マンナナーゼが知られているが、従来知られているβ−1,4マンナナーゼは単糖(マンノース)まで分解してしまう場合が多い。
一方、バチルス属のベレゼンシス(特許文献1)、バチルス属のポリミキサ(特許文献2)、バチルス属のコアグランス(特許文献3)、アシネトバクター属菌株(特許文献3)、ペニシリウム属菌株(特許文献4)、バチルス・アミロリケファシエンス株(非特許文献1)等から得られるマンナナーゼがすでに報告されている。しかし、従来知られている酵素は、いずれもβ−1,4マンノシド結合を加水分解して単糖類(マンノース)にまで分解して、マンノオリゴ糖の生成が少ないものであって、マンノビオースを優先的に生成して、マンノオリゴ糖を高収率で得られるものではなかった。
特開2009−60805号公報 特開2002−65257号公報 特開平8−322477号公報 特開2000−41663号公報 特開2001−145485号公報
African Journal of Biotechnology Vol. 7 (8), pp. 1123-1128, 2008
本発明が解決しようとする課題は、マンナン類多糖類を分解し、マンノオリゴ糖を高収率で特にマンノビオースおよびマンノトリオースを高収率で得る新しいマンナナーゼ源を提供することである。
本発明者らは、上記の課題に対して鋭意検討を重ねた結果、ある特定の微生物が課題を解決するマンナナーゼを産生することを見出し、本発明を完成させた。
即ち本発明は、
(1)微生物が産生するマンナナーゼであって、以下の性質:
1) 作用:マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのマンノピラノシド結合を加水分解して、マンノビオースを優先的に生成する、
2) 基質特異性:マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのいずれにも作用し、アラビノキシラン、キシラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチンのいずれにも作用しない、
3) 安定pH:pH4.0〜7.0の範囲で最適pHでの活性に対し50%以上の活性を示す、
4) 作用適温:最大活性の80%以上の活性を示す温度範囲は30〜50℃である、
5)温度安定性:pH5において60分間保持をした場合、30℃以下では活性に変化なく、40℃で90%以上の活性が残存し、60℃以上では失活する、
6)分子量:SDS−PAGE法で測定して40,000である、
を有することを特徴とするマンナナーゼ、
(2)該微生物が、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する、(1)記載のマンナナーゼ、
(3)該バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する微生物が、バチルス・アミロリケファシエンスMN47株(独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター微生物寄託受託番号NITE P−01816)であることを特徴とする(2)に記載のマンナナーゼ、
(4)(1)〜(3)いずれか1つに記載のマンナナーゼを使用する、食品用マンノオリゴ糖の製造法、
(5)(1)記載のマンナナーゼを産生する、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する微生物である、バチルス・アミロリケファシエンスMN47株(独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター微生物寄託受託番号NITE P−01816)、
に関するものである。
本発明に係るマンナナーゼは、従来知られていたマンナナーゼに比べ、β−1,4マンノシド結合を加水分解して単糖類(マンノース)を殆ど生成せず、マンノオリゴ糖、特にマンノビオースの生成が多いものである。
本発明に係るマンナナーゼは、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種のバチルス・アミロリケファシエンスMN47の微生物から得られ、以下の理化学的性質を有することを特徴としている。
1) 作用:マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのマンノピラノシド結合を加水分解して、マンノビオースおよびマンノトリオースを生成し単糖(マンノース等)を殆ど遊離しない。
2) 基質特異性:マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのいずれにも作用し、アラビノキシラン、キシラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチンのいずれにも作用しない。
3) 安定pH:pH4.0〜7.0の範囲で50%以上の残存活性を示す。
4) 作用適温:最大活性の80%以上の活性を示す温度範囲は30〜50℃である。
5)温度安定性:pH5において60分間保持をした場合、30℃以下では活性に変化なく、40℃で90%以上の活性が残存し、60℃以上では失活する。
6)分子量:SDS−PAGE法で測定して40,000である。
上記マンナナーゼは、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種のバチルス・アミロリケファシエンスMN47(独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 微生物寄託受託番号 NITE P−01816、受領日:2014年3月7日)の培養液から好適に採取することができる。
前記細菌は、形態:桿菌、グラム染色性:陽性、運動性:有、鞭毛の着生状態:周毛、酸素に対する態度:好気性又は通性嫌気性、カタラーゼ反応:陽性、リパーゼ活性:無、芽胞を形成するので、バチルス属有胞子桿菌に一致する性状を持っている。標準寒天培地上に生育したコロニーから定法に従ってDNAを抽出し、16SrRNAの塩基配列法にて同定したところ、Bacillus Amyloliquefaciensと同定された。
本発明を実施する具体的態様を以下に実施例を用いて説明する。
実施例1
香川県高松市付近から採取した土壌約0.5gを滅菌水に懸濁し、分離用寒天培地(*1)に塗布し、37℃で1〜2日間培養しコロニーを形成させた。コロニー周辺にマンナンの分解に基づく透明帯(ハロー)を形成するものを選出し、マンナナーゼ生産菌を取得した。菌学的性質は前記に記載した通りであった。
次に、これら取得菌を更に液体培地(*2)に接種し37℃にて3日間振とう培養し、遠心分離(10,000rpm×10分)して得た上清について次の方法でマンナナーゼ活性を測定(*3)した。
以上の方法にてマンナナーゼ活性の強い菌をスクリーニングし、バチルス・アミロリケファシエンスMN47を得た。
*1(分離用寒天培地)・・・ココナッツマンナン 1%、ポリペプトン 1%、酵母エキス 0.2%、MgSO4・7H2O 0.1%、寒天 1.5%、pH7
*2(液体培地)・・・ココナッツマンナン 2%、ポリペプトン 1%、酵母エキス 0.2%、MgSO4・7H2O 0.1%、pH7
*3〔マンナナーゼ活性測定法〕・・・1%のココナッツマンナンを含む50mM 酢酸緩衝液(pH5.0)0.9mlに適当に希釈した培養液0.1mlを加え、40℃で10分間反応させた後、生じた還元糖をソモギー・ネルソン法にて定量した。酵素活性は、1分間にマンノースとして1μmolに相当する還元糖量を生成する力価を1単位とした。
実施例2
実施例1で得たバチルス・アミロリケファシエンスMN47を液体培地(実施例1の*2と同様)に接種し37℃で4日間振とう培養し、菌体を遠心分離して得た上清液を粗酵素マンナナーゼMN−1とした。pH5におけるマンナナーゼ活性(実施例1の*3の方法による)は5単位/mlであった。
次に、ココナッツマンナン 0.5gに前記粗酵素マンナナーゼMN−1を100単位加え、pH5(5mMの酢酸緩衝液で反応液量は50ml)、40℃で18時間反応させた。
反応後100℃で3分間加熱して酵素失活させ、遠心分離(8000rpm×10分)して上清を減圧濃縮し50%の収率でマンノオリゴ糖を得た。
得られたマンノオリゴ糖をHPLCにて下記条件にて分析したところ、マンノビオース88%、マンノトリオース7%およびマンノースは5%であった。
(HPLC条件)
システム:ICS-3000 (DIONEX社製);カラム:CarboPack PA1(DIONEX社製);溶出液:20mM NaOH;流速:1.0 ml / min;検出器:PAD;カラムオーブン:30℃
比較例1
市販マンナナーゼ(新日本化学工業株式会社製)100単位を実施例2と同様にしてマンナンに加え、pH5にて12時間反応させ、オリゴ糖を得た。
HPLCにより分析した結果、収率40%、マンノビオース48%、マンノトリオース22%マンノース30%であった。
(最適pH及びpH安定性)
前記〔マンナナーゼ活性測定法〕に準じてマンナナーゼMN−1の最適pHを調べた。尚、使用した緩衝液は、pH3〜5はクエン酸緩衝液、pH4及び5は酢酸緩衝液、pH6〜8はリン酸緩衝液、pH8及び9はトリス緩衝液、pH10及び11はグリシン緩衝液を用いた。
又、各々のpH(pH3〜5はクエン酸緩衝液、pH4及び5は酢酸緩衝液、pH6〜8はリン酸緩衝液、pH8及び9はトリス緩衝液、pH10及び11はグリシン緩衝液)にて酵素液を4℃、24時間保持した後の残存活性を前記〔マンナナーゼ活性測定法〕に従って測定してpH安定性を調べた。結果、最適pHは、pH5付近で、pH安定性はpH4.0〜7.0の範囲で50%以上の残存活性を示した。
(最適温度度及び温度安定性)
上記記載と同様にして得られたマンナナーゼMN−1の最適温度及び温度安定性(各温度で60分間処理した後の残存活性を測定) を前記〔マンナナーゼ活性測定法〕により調べた。結果、最大活性の80%以上の活性を示す最適温度範囲は30〜50℃であった。また温度安定性は30℃以下では活性に変化なく、40℃で90%以上の活性が残存し、60℃以上では失活した。
上記記載と同様にして得られたマンナナーゼMN−1を次記クロマトグラフィー法により精製し、SDSポリクリルアミドゲル電気泳動法により単一バンドを示した。分子量マーカーよりマンナナーゼMN−1は分子量4万であることがわかった。
〔クロマトグラフィー法による精製〕
マンナナーゼM−1粗酵素液を
予め50mM Tris・HCl(pH7.5)の緩衝液で平衡化したCapto Qカラムに通液した。通過液を、透析チューブに入れ、5mM Tris・HCl(pH7.5)の緩衝液に対して透析を行った。透析処理液を5mMTris・HCl(pH7.5)の緩衝液で予め平衡化したCapto Qカラムに通液後、同緩衝液を通液した。 次に、0〜1M NaClを含む同緩衝液でリニアグラジエントを行い、活性フラクションを回収し、分画分子量が1万以下の限外濾過膜で脱塩、濃縮した。これを凍結乾燥して精製酵素を得た。精製酵素の比活性は70単位/mg蛋白質であった。

Claims (5)

  1. 微生物が産生するマンナナーゼであって、以下の性質:
    1) 作用:マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのマンノピラノシド結合を加水分解して、マンノビオースを優先的に生成する。
    2) 基質特異性:マンナン、グルコマンナン及びガラクトマンナンのいずれにも作用し、アラビノキシラン、キシラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチンのいずれにも作用しない。
    3) 安定pH:pH4.0〜7.0の範囲で最適pHでの活性に対し50%以上の活性を示す。
    4) 作用適温:最大活性の80%以上の活性を示す温度範囲は30〜50℃である。
    5)温度安定性:pH5において60分間保持をした場合、30℃以下では活性に変化なく、40℃で90%以上の活性が残存し、60℃以上では失活する。
    6)分子量:SDS−PAGE法で測定して40,000である。
    を有することを特徴とするマンナナーゼ。
  2. 該微生物が、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する、請求項1記載のマンナナーゼ。
  3. 該バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する微生物が、バチルス・アミロリケファシエンスMN47株(独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター微生物寄託受託番号NITE P−01816)であることを特徴とする請求項2に記載のマンナナーゼ。
  4. 請求項1〜3いずれか1項に記載のマンナナーゼを使用する、食品用マンノオリゴ糖の製造法。
  5. 請求項1記載のマンナナーゼを産生する、バチルス(Bacillus)属アミロリケファシエンス(Amyloliquefaciens)種に属する微生物である、バチルス・アミロリケファシエンスMN47株(独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター微生物寄託受託番号NITE P−01816)。
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CN107446969A (zh) * 2017-07-17 2017-12-08 天津科技大学 葡甘低聚糖酶在新鲜魔芋生产魔芋寡糖方面的应用
CN108841894A (zh) * 2018-07-19 2018-11-20 中国农业科学院饲料研究所 一种益生菌转化制备阿拉伯木寡糖的方法
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