KR102392174B1 - 탄소나노튜브가 도포된 생분해성 고분자 나노섬유를 포함하는 스캐폴드 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄소나노튜브가 도포된 생분해성 고분자 나노섬유를 포함하는 스캐폴드에 관한 것으로, 상기 탄소나노튜브의 길이는 20nm~30nm인 것인 바이 모달 나노 지형(bi-modal nano-scale topographical)을 가져, 우수한 골 재생효과, 조직 적합성을 가지며, 골 재생과 관련된 다양한 성장인자의 로딩이 가능하다.

Description

탄소나노튜브가 도포된 생분해성 고분자 나노섬유를 포함하는 스캐폴드 및 이의 제조 방법{scaffold comprising cabon nanotube interfaced biopolymer nanofiber and preparation method thereof}

본 발명은 탄소나노튜브가 도포된 생분해성 고분자(biopolymer) 나노섬유를 포함하는 스캐폴드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 나노 스케일의 탄소나노튜브가 도포되어 바이 모달 나노 지형((bi-modal nano-scale topographical)을 가져 우수한 줄기 세포 부착, 조직 적합성 및 골 재생 효과를 가지는 스캐폴드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

생체 재료의 표면을 맞추는 것은 궁극적으로 조직 치유 및 수리에 도움이 되는 세포 부착, 확산 및 혈통 설명(linage specification)을 포함하는 줄기 세포의 다양한 반응행동을 제어하는 유망한 전략이다(Yang, W. et al., C, Materials for biological applications, 2016, 60; Ortiz, R. et al., Polymers (Basel), 2018; Richbourg, N. R. et al., Journal of tissue engineering and regenerative medicine, 2019; Conserva, E. et al., Stem Cells Int, 2019; Denchai, A. et al., Front Bioeng Biotechnol, 2018, 6; Huang, J. et al., Cell Mol Life Sci, 2019, 76 (3)). 더 구체적으로, 표면 나노/마이크로 지형은 연속적인 세포간 세포 역학적 신호 전달(mechanotransduction)을 통해(Kim, D.-H. et al., The Journal of cell biology, 2012, 197 (3); Murphy, W. L. et al., Nat Mater, 2014, 13 (6); Abagnale, G. et al., Biomaterials, 2015, 61; Yang, Y. et al., Engineering, 2017, 3 (1); Teo, B. K.et al., ACS nano, 2013, 7 (6)) 세포 골격 조직(Yim, E. K. F. et al., Biomaterials, 2010, 31 (6); Han, J. et al., Journal of physics. Condensed matter, 2017, 29 (45); Chen, S. et al., ACS nano, 2019, 13 (2)), 세포 극성(Lee, L. C et al., Biomaterials, 2017, 116; McMurray, R. J. et al., Nature materials, 2011, 10 (8)), 표현형 및 모양을 변경시키는 생물학적 환경(Song, L. et al., Colloids Surf B Biointerfaces, 2016, 148; Bachhuka, A. et al., Nanoscale, 2017, 9 (37); Pedrosa, C. R. et al., ACS applied materials & interfaces, 2019, 11 (9)), 예를 들어, 단백질 테더링(protein tethering)(Wen, J. H. et al., Nat Mater, 2014, 13 (10); Taraballi, F. et al., Advanced healthcare materials, 2012, 1 (4)) 및 인테그린 프리젠테이션(integrin presentation)(Dalby, M. J.et al., Nature materials, 2014, 13 (6); Rosa, A. L. et al., J Cell Biochem, 2014, 115 (3); Maffioli, E. et al., Frontiers in cellular neuroscience, 2017)에서 분자 및 세포적 상호작용에 영향을 미치는 주요 매개 변수이다. 세포외 기질(ECM) 분자는 생물 물리학 단서의 다양한 배열을 제공하고, 주로 세포 수용체에 의한 공간 인식 도메인에 기여하는 나노미터에서 마이크로미터에 이르는 지형적 특징을 갖는다(Guilak, F. et al., Cell stem cell, 2009, 5 (1)).

따라서 생체 재료의 나노/마이크로 지형 변형은 세포 반응을 조절하고 궁극적으로 생물학적 효과를 촉진하는 용이한 도구이다. 반면 합성 중합체 스캐폴드는 조직 호환성 및 다양한 조직의 수리에 널리 사용되나 세포 부착 및 조직 치유의 측면에서 표면 특성이 바람직하지 않다. 또한, 나노/마이크로 프로세싱 도구는 나노/마이크로 패턴 및 나노/마이크로 섬유와 같은 형태를 제조할 수 있지만, 중합체 스캐폴드의 표면 지형은 나노 및 마이크로 스케일에서 구현하기 어려운 문제가 있다.

따라서, 세포와 생물학적 반응 및 궁극적으로 조직 복구 과정을 조절하고 강화할 수 있는 나노 스케일의 물질로 중합체성 스캐폴드 표면을 조절하여, 궁극적으로 조직 복구 과정을 조절할 필요가 있었다.

특허문헌: 국내 등록특허 제10-1323427호

이에, 본 발명자들은 독특한 구조 및 물리 화학적 특성과 우수한 전기 전도성을 갖는 탄소나노튜브(CNTs)에 주목하였다. 최근에, 탄소 기반 나노재료가 약물 전달, 조직 재생 및 이미지화 목적을 포함하는 생물의학적 적용을 위한 잠재적인 후보로 제안된 바 있다(Sajid, M. I. et al., International journal of pharmaceutics, 2016). 본 발명자들은 바이오폴리머 나노섬유와 CNT를 인터페이스하여, 특별한 바이모달(bi-modal) 표면 나노 지형(수십 nm + 수백 nm)을 제작하였다. 그 결과, 시험관 내 실험을 통해 인터페이스된 CNTs는 세포 부착(adhesion) 및 확산(spreading)을 유의하게 조절하고, 유전자 및 단백질 수준에서 골생성 분화를 자극하는 것으로 확인되었다. 또한, 스캐폴드의 생체 내(in vivo) 뼈 재생 능력을 확인하기 위해 쥐의 뼈 결함 모델에 스캐폴드를 이식하여, 감소된 염증 반응을 갖는 우수한 조직 적합성과 함께, CNT 계면 나노섬유는 두개관 결점 모형에 새로운 뼈 형성을 현저히 가속화함을 확인하였다. 또한, 뼈 수리와 관련된 성장 인자의 높은 로딩 능력을 확인하여, 성장 인자 전달 시스템으로서 스캐폴드의 적용 가능성을 확인함으로서 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 탄소나노튜브가 도포된 생분해성 고분자 나노섬유를 포함하는 스캐폴드로서, 상기 탄소나노튜브의 길이는 20nm~30nm인 것인 바이 모달 나노 지형(bi-modal nano-scale topographical)을 갖는 스캐폴드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드를 포함하는 골조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다음의 (a) 탄소나노튜브를 pH 1~2의 강산 용액에 첨가하여 70~90℃에서 유지한 후, 0.1~0.3μm 멤브레인으로 여과하여 pH 6~8이 될 때까지 세척하고 건조시키는 단계; (b) 상기 (a)의 결과물을 0.2 내지 3.0mg/ml 농도의 탄소나노튜브 용액으로 제조하는 단계; (c) 생분해성 고분자의 나노섬유를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 (c)의 결과물인 나노섬유 표면을 카르복실기로 기능화한 후, 상기 (b)의 결과물인 탄소나노튜브 용액에 침지한 후 건조시키는 단계를 포함하는 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드를 손상 골 조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명의 일 양태에 따르면, 탄소나노튜브가 도포된 생분해성 고분자 나노섬유를 포함하는 스캐폴드로서, 상기 탄소나노튜브의 길이는 20nm~30nm인 것인 바이 모달 나노 지형(bi-modal nano-scale topographical)을 갖는 스캐폴드에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생분해성 고분자 나노섬유는 폴리카프로락톤 나노섬유로서 길이가 400nm~600nm이고 카르복실기로 표면 기능화된 것이다.

본 발명자들은 조직 적합성이 있으면서도 골 재생에 효과적인 나노섬유를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 탄소나노튜브가 도포된 폴리카프로락톤 나노섬유를 포함하는 스캐폴드로서, 탄소나노튜브의 길이는 20nm~30nm이며, 상기 폴리카프로락톤 나노섬유는 길이는 400nm~600nm이고 카르복실기로 표면 기능화된 경우, 탄소나노튜브와 폴리카프로락톤 나노섬유 간의 도포가 잘 이루어지고, 주위 세포 부착이 용이한 나노 스케일의 바이 모달 나노 지형을 가져 골 재생에 효과적임을 확인하였다.

상기 탄소나노튜브는 그래핀이 감겨있는 형태의 속이 빈 실린더 형태의 물질로서, 특징적인 구조, 전기적 및 기계적 특성을 가지고 있어 조직 재생에서도 많은 연구가 이루어지고 있는 물질이다. 일례로, 탄소나노튜브의 구조는 세포와 접촉시 세포의 부착과 성장을 가능하게 하는 것으로 보고되고 있다((1) Garibaldi et al.; Nanotechnology 2006; 17: 391-7; (2) Meng et al.; J Biomed Mater Res A 2006; 79: 298-306). 탄소나노튜브는 감겨져 있는 층의 수에 따라 단일벽 탄소나노튜브, 이중벽 탄소나노튜브 또는 다중벽 탄소나노튜브로 구분될 수 있다.

상기 생분해성 고분자는(biopolymer) 생분해성을 가져 물리적, 기능적으로 나노섬유가 흡수되며 새로운 조직으로 대체되는 성질을 갖는다. 분해된 산물은 대사되거나 확산되어 몸 밖으로 빠져나가며 새롭게 생긴 조직만 남게 된다. 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(polycaprolactones), 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트(polyhydroxybutyrates), 폴리히드록시발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(polyorthocarbonates), 옥살산염폴리알킬렌(polyalkyleneoxalates), 숙신산염폴리알킬렌(polyalkylenesuccinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes),폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides), 변성 단백질(modified proteins), 이들의 공중합체, 이들의 3 원 중합체(terpolymers), 이들의 혼합물(mixtures) 또는 이들의 중합체 혼합물(polymer blends) 등으로부터 1종 또는 2종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤이다.

상기 탄소나노튜브의 길이 20nm~30nm는 탄소나노튜브 기질 상에 세포 부착 및 확산에 역할을 하는 인테그린의 클러스터링 거리에 대응되며, 인테그린에 의해 세포 분비 점착 단백질 및 혈청의 흡착이 촉진된다. 상기 탄소나노튜브의 길이는 탄소나노튜브의 절단 시 제작 가능한 최소화된 길이이며 탄소나노튜브의 길이가 30nm를 초과하는 경우 줄기세포 부착이나 골 재생 측면에서 덜 효과적일 수 있다.

상기 바이 모달 나노지형은 바이오 폴리머 나노셤유(수백 nm) 및 이를 도포한 탄소나노튜브(수십 nm)에 의해 두 종류의 나노 지형이 결합된 형태를 의미하며, 세포 부착(adhesion) 및 확산(spreading)을 유의하게 조절하고, 유전자 및 단백질 수준에서 골생성 분화를 자극하는 효과가 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 폴리카프로락톤 나노섬유는 탄소나노튜브가 메쉬 형태로 도포된 것이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 스캐폴드는 상온에서 인장 강도는 9~11MPa이고, 항복 강도는 6~8MPa이고, 탄성 계수가 35~60MPa이고, 수율에서의 변형률은 0.1 내지 0.2이다.

탄소나노튜브가 도포된 폴리카프로락톤 나노섬유는 탄소나노튜브가 도포되지 않은 폴리카프로락톤 나노섬유에 비해 낮은 인장 강도를 나타냈으며, 탄성계수가 현저하게 감소하여 기계적 응력하에서 탄소나노튜브의 도포로 더 많은 유연성이 부여됨을 확인할 수 았었으며, 변형률이 증가하여 장력 하중에서 플라스틱 변형에 대응함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 스캐폴드는 성장인자를 포함한다.

본 발명의 일 구현에서, 상기 성장인자는 골형성 인자, 혈관형성 인자 또는 이의 조합이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 골형성 인자는 BMP-2, bFGF, VEGF 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 상기 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드를 포함하는 골조직 재생용 조성물을 제공한다.

유전자 및 단백질 수준에서 골생성 분화를 자극하는 것으로 확인되었다. 또한, 스캐폴드의 생체 내(in vivo) 뼈 재생 능력을 확인하기 위해 쥐의 뼈 결함 모델에 스캐폴드를 이식하여, 감소된 염증 반응을 갖는 우수한 조직 적합성과 함께, 새로운 뼈 형성을 현저히 가속화함을 확인하였다. 또한, 뼈 수리와 관련된 성장 인자의 높은 로딩 능력을 확인하였다.

본 발명의 다른 양태는 상기 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, (a) 탄소나노튜브를 pH 1~2의 강산 용액에 첨가하여 70~90℃에서 유지한 후, 0.1~0.3μm 멤브레인으로 여과하여 pH 6~8이 될 때까지 세척하고 건조시키는 단계; (b) 상기 (a)의 결과물을 0.2 내지 3.0mg/ml 농도의 탄소나노튜브 용액으로 제조하는 단계; (c) 생분해성 고분자의 나노섬유를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 (c)의 결과물인 나노섬유 표면을 카르복실기로 기능화한 후, 상기 (b)의 결과물인 탄소나노튜브 용액에 침지한 후 건조시키는 단계를 포함하는 스캐폴드 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (c)는 클로로포름 및 테트라플루오로에틸렌 혼합물에 용해된 10~15% w/v의 폴리카프로락톤 용액을 전기방사시켜 나노섬유를 수득하는 단계이다.

전기방사능을 사용하는 바이오폴리머 나노섬유는 섬유질의 천연 조직 구조를 모방할 수 있는 독특한 매트릭스 플랫폼으로 간주되어, 다른 형태의 스캐폴드와 관련하여 세포 반응을 보다 유리하게 지원한다.

상기 생분해성 고분자(biopolymer) 표면에 탄소나노튜브를 코팅하기 위해서는, 고분자 지지체와 탄소나노튜브 간에 계면 상호작용이 필요하나, 실제 고분자와 탄소나노튜브 간에는 계면 상호작용이 극히 적기 때문에 코팅이 잘 되지 않는 문제점이 있다. 탄소나노튜브는 소수성이 강하나 바이오폴리머는 생체 적합성을 가지므로 친수성을 띠는 경우가 많은데, 친수성의 고분자 지지체와 소수성의 탄소나노튜브가 그 성질이 반대되어 코팅이 잘 이루어지지 않는다. 또한, 탄소나노튜브는 강한 응집현상이 있어 용매 등에 탄소나노튜브를 분산하여 사용하여야 하는데, 용매에 잘 분산되지 않으며, 이에 따라 코팅이 된 다하더라도 고분자 지지체의 표면이 고르게 분포하는 것이 아니라 특정 위치에만 집중적으로 코팅이 되는 경향이 있다.

이에, 탄소나노튜브의 수성 분산성을 달성하기 위해 강산 처리로 표면을 개질하고, 폴리카프로락톤 나노섬유를 NaOH로 처리하여 카르복실기로 표면 개질하여 탄소나노튜브와의 전하간 상호작용이 가능한 공간을 부여하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 바이 모달 나노 지형을 갖는 나노섬유를 손상 골 조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공한다.

본 발명은 줄기세포 부착, 우수한 조직 적합성, 골 재생 효과 및 골 재생과 관련된 다양한 성장인자의 로딩이 가능한 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드 및 이의 제조 방법을 제공한다.

도 1은 CNT 도포된 PCL 나노섬유 스캐폴드의 형태 및 재료 특성을 나타낸다. (a)는 SEM에 의해 CNT 도포 유무에 따른 낮고 높은 배율 이미지를 나타낸다. (b)는 아파타이트 형성 능력을 XRD상 분석을 통해 나타낸다. (c)는 인장 기계적 특성을 나타낸다.
도 2는 CNT 계면 PCL 나노섬유 상에 초기 세포 부착 및 확산을 나타낸다. (a)는 시간에 따른 세포 부착 수를 나타내고, (b)는 6시간에 빈쿨린 발현을 나타낸다(*P<0.05, n=3).
도 3은 CNT 계면 PCL 나노섬유 스캐폴드에서 배양된 MSCs의 골형성 분화를 나타낸다. (a)는 배양 기간에 따른 골형성 유전자(ALP, Col-1, BSP 및 OCN)의 mRNA 수준을 나타낸다. (b)는 21일에 OCN 단백질 발현을 나타내는 공초점 현미경 이미지를 나타낸다. 핵은 DAPI에 의해 염색되었고 F-액틴은 Alexa Fluro 488-결합된 팔로이딘(Alexa Fluro 488-conjugated Phalloidin)에 의해 염색되었다. (c)는 7 및 14 일에 MCS의 ALP 활성을 나타낸다. (d)는 28일에 세포의 ARS 염색을 통해 세포 미네랄화를 나타낸다(*P<0.05, n=3).
도 4는 CNT 계면 나노섬유 스캐폴드의 조직 호환성을 나타낸다. (a)는 2주 및 4주 동안 랫트 피하 모델에 이식된 CNT0, CNT0.5 및 CNT1 샘플의 헤마톡신 및 에오신(HE) 염색을 나타낸다. 스캐폴드 주위 대식 세포와 함께 낮은 수준의 염증(화살표)이 CNT 도포로 인해 발견되었다. (b)는 F4/80 대식세포 마커로 염색된 조직 샘플의 대표적인 면역형광이미지를 나타낸다. 핵은 DAPI로 반대 염색되었다(스케일 바=50μm)(*P<0.05, n=3).
도 5는 8주에 두개관(calvaria)에서 뼈 재생 분석을 마이크로 CT 및 조직학에 의해 나타낸다. (a)는 마이크로-CT 이미지를 나타내고, (b)는 골 형성의 정량화를 나타낸다. (c)는 HE&MT 염색에 의한 조직검사 결과를 나타낸다(스케일 바= 500μm) (d)는 새로 형성된 조직의 면역 조직화학적 분석으로, 뼈 관련 단백질 BMP-2, 오스테오칼신 및 오스테오폰틴의 발현을 나타낸다(스케일 바=100μm)(*P <0.05, n=4).
도 6은 CNT 도포 나노섬유의 성장 인자 로딩 용량을 나타낸다. GFP 태그된 뼈 재생(BMP2, FGF2, VEGF)과 관련된 성장인자는 다양한 농도에서 나노섬유에 처리하여, 형광 강도를 분석하였다. 성장 인자의 높은 용량의 로딩은 CNT1에서 확인되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다,

실시예 1. CNT 계면 PCL 나노섬유의 준비 및 특성

1-1. CNT 표면 기능화

시판되는 직경 ~20-30nm 다중벽 CNT(EM-Power Co. Korea)는 수성 분산성 CNT를 달성하기 위해 강한 산처리에 의해 표면 개질되었다. 2.0g의 깨끗한 CNT를 황산(90%, Duksan, Korea) 및 질산(70%, Sigma-Aldrich) 3:1의 몰비의 혼합물에 첨가하고, 300rpm에서 연속 교반하여 4일 동안 80℃에서 유지하였다. 4일간의 연속 환류 후, 용액을 실온(RT)으로 냉각시키고 0.2μm의 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인을 통해 진공 여과하고, 여과액의 pH가 중성이 될 때까지 탈이온수(DW)로 철저히 세척하였다. 마지막으로, 24시간 동안 50℃에서 진공 하에서 건조시켜 추가 실험에 사용하였다.

1-2. CNT 계면 PCL 나노섬유의 제조

서브마이크론 크기의 섬유는 전기방사 기술을 사용하여 PCL(MW=80,000, Sigma-Aldrich) 용액으로부터 제조하였다(Singh, R. K. et al., ACS applied materials & interfaces, 2015, 7 (15)). 요약하면, PCL 용액은 실온(RT)에서 교반기를 사용하여 4:1 비율의 클로로포름(CHL; Sigma-Aldrich) 및 테트라플루오로 에틸렌(TFE)에 12% (w/v)를 용해시켜 제조하였다. 신선하게 제조된 균일하고 안정적인 PCL 용액은 스테인리스 스틸로 제작된 23게이지 바늘이 장착된 10mL 플라스틱 주사기에 로딩되었다. 전기방사를 위한 팁-투-컬렉터(8cm), 사출 유량(0.007mL/min)및 전압(13kV)은 나노섬유 생산에 최적화되었다. 전기방사 공정 동안, 드럼을 DC 모터에 의해 2,000rpm의 일정한 속도로회전시켜 정렬된 섬유를 수집하였다. 모든 실험은 주변 온도에서 수행하였다.

PCL 나노섬유의 표면에 CNT를 도포(decorate)하기 위해, 나노섬유를 24시간 동안 1.0N NaOH((Dae-Jung Chemicals, Korea)으로 먼저 처리하였다. NaOH 처리는 화학 작용기의 활성화 및 소수성에서, 수용액에 있는 CNTs와의 전하간 상호 작용을 위한 가능한 공간을 부여하는 열린 카르복실기가 있는 친수성으로 섬유 표면을 변경한다. 다음으로, 처리된 섬유를 DW로 세척하고 RT에서 건조시켰다. 건조된 PCL 나노섬유(6cm x 10cm)를 유리 페트리 접시(Ø 18cm)에 0, 0.5 또는 1.0mg/mL 농도(각각 CNT0, CNT0.5 및 CNT1로 지정)의 CNT의 수성 용액에 침지하고 24시간 동안 70rpm에서 원형으로 흔들며 보관하였다. 섬유를 RT에서 건조시키고 DW 100mL로 3회 세척한 다음 50% 에탄올로 3회 세척하여 느슨하게 결합된 CNT를 제거하였다. 건조된 CNT 도포된 PCL 나노섬유를 다음 실험을 위해 사용하였다.

1-3. CNT 계면 PCL 나노섬유의 특성 실험 방법

기능화된 CNT 및 CNT 계면 PCL 나노섬유의 특징은 투과 전자 현미경(TEM), JEOL-7100), 현장 방출 스캐닝 전자 현미경(FE-SEM; Tescan Mira II LMH, Czech Republic), 감쇠된 총 반사도 푸리에 변환 적외선 분광법(ATR-FTIR; Varian 640-IR, Australia)에 의해 기능화 전후의 화학작용기, X선 회절(XRD; Ultima IV, Rigaku, Japan)에 의해 CNT 및 CNT 계면 PCL의 결정상 및 표면 전하를 분석하고, 제타전위(Zetasizer Nano 3600; Malvern Instruments, UK)를 분석하였다. 엑스레이 광전자 분광법(XPS; MultiLab ESCA2000, VG scientific, UK)은 실시 및 계산되었다. 라만 분광법(Raman; LabRAM HR UV/Vis/NIR, China)은 제작된 CNT 구조의 정도를 계산하기 위해 녹색 레이저 여기(514nm)를 사용하여 수행하였다. 스캔은 1.2mW의 10% 전력의 1100~1700 cm^-1의 확장된 범위에서 기록되었다.

1-4. CNT 계면 PCL 나노섬유의 형태적 특징

나노섬유 스캐폴드의 도포에 사용되는 산처리 된 CNT는 다양한 CNT 농도(0.5~1mg/mL의 CNT 용액)에서 알칼리성 변형된 전기방사 PCL 나노섬유 스캐폴드(alkaline-modified electrospun PCL nanofiber scaffolds)에 처리한 후, CNT 처리 전후의 스캐폴드의 형태를 조사하였다(도 1a). 무처리된 PCL(CNT0)의 SEM 이미지는 수백 나노미터 크기(433±78nm)의 섬유질 형태를 나타냈다. 0.5mg/ml 농도의 CNT 용액(CNT0.5) 또는 1mg/ml 농도의 CNT 용액(CNT1)의 처리는 나노섬유 형태 및 크기를 크게 변경하지 않고 나노 관 구조로 나노섬유를 도포할 수 있었다. 고배율 이미지는 CNTs(~25nm 크기)가 PCL 나노섬유 상에 메쉬형 구조를 형성하고, 일부 CNT가 PCL 나노섬유를 연결하고 연동한 것으로 나타났다. 형태학적 연구 결과에 기초하여, CNT 맞춤형 PCL 스캐폴드는 무처리된 PCL 나노섬유와 다르게 특별한 방식으로 세포에 의해 감지될 수 있는 바이 모달(500nm & 25nm) 나노스케일 지형을 특징으로 함을 확인할 수 있었다. FT-IR에 의해 확인한 CNT 맞춤형 PCL 스캐폴드의 화학적 상태는 CNT로 처리된 스캐폴드 샘플에서 카르복실기의 존재를 나타낸다. 더욱이, 스캐폴드의 XRD 패턴은 전형적인 PCL 및 CNT 피크를 나타냈다.

1-5. CNT 계면 PCL 나노섬유의 아파타이트 형성 능력

CNT 계면 PCL 나노섬유 스캐폴드의 아파타이트 형성 능력을 통해 뼈 생활성 능력을 확인하였다. 제조된 CNT 계면 PCL 나노섬유 샘플의 아파타이트 형성 능력은 변형된 생체 모방 체액(2xSBF)을 사용하여 분석하였다. 매 시점에서, 견본은 건져내어 DW로 철저히 헹구고 RT에서 건조되었다. 표면 형태는 FE-SEM에 의해 관찰되었고, 미네랄화된 샘플은 ATR-FTIR 및 XRD에 의해 확인하였다.

그 결과, 다양한 배양 기간(7, 14, 21 및 28일)에서 증착된 광물의 상은 XRD에 의해 확인되었다(도 1b). 결과는 뼈와 유사하게, 불량하게 결정화 된 아파타이트를 나타내는 2θ~26.5°및 ~32.2°에서 넓은 회절 피크를 나타냈다. 배양 시간이 증가하면서 ~32.2°에서 주요 아파타이트 피크는 더욱 명확해졌다. 7일간의 배양 후 미네랄화된 스캐폴드의 전형적인 형태는 SEM에 의해 조사되었으며, 이는 나노섬유 표면을 거의 완전히 덮는 두꺼운 미네랄 결정을 밝혀냈다. 더욱이, 샘플의 FT-IR 스펙트럼은 561, 600 및 1023cm^-1에서 포스페이트 관련 밴드를 나타냈다. 밴드 강도가 침지 시간이 지날수록 증가하는 것은 아파타이트 증착 또는 결정화가 시간이 지남에 따라 더욱 두드러짐을 나타낸다. 또한, C-O stretching에 해당하는 870 및 1412cm^-1밴드는 아파타이트 결정 격자에 카보네이트 기의 혼입을 의미했다. 아파타이트 형성 결과는 CNT 계면 PCL 나노섬유의 우수한 세포성 뼈 생활성을 제안하며, 이는 CNT의 높은 표면적 및 표면 전하의 집단적 효과 때문인 것으로 여겨진다. 특히, 고음전하 표면은 SBF 용액으로부터 양전하 Ca²⁺ 이온의 앵커리지에 유리한 것으로 알려져 있으며, 이는 후속 인산염 침착 및 CaP 미네랄 형성을 유도한다.

1-6. CNT 계면 PCL 나노섬유의 인장 기계적 특성 테스트

CNT 계면 PCL 나노섬유 스캐폴드의 기계적 성질은 500N 로드 셀을 가진 탁상 축식 시험기 인스트론(tabletop uniaxial testing machine Instron)(Instron 5966; USA)로 평가되었다. 5개의 복제 측정을 수행한 다음 평균을 측정했다.

그 결과, 인장 응력-변형률 곡선은 인장 강도, 항복 강도, 탄성 계수, 실패 시 변형률(strain at failure) 및 수율에서의 변형률(strain at yield)을 포함한 중요한 기계적 파라미터를 제공한다(도 1c). CNT0은 ~12.2MPa 인장 강도를 나타낸 반면, CNT0.5 및 CNT1은 각각 ~10.3 및 10.1MPa의 약간 낮은 값을 나타내었으며, 모든 샘플의 항복 강도(yield strengths)는 ~6.8-7.0MPa 와 유사했다. 탄성 계수의 현저한 감소는 CNT 도포 실험군에서 관찰되었으며, CNT0, CNT0.5 및 CNT1에서 각각 ~77MPa, 43MPa, 및 40MPa이었으며, CNT 도포가 기계적 응력 하에서 나노섬유에 더 많은 유연성을 부여하는 것을 암시하였다. CNT 도포로 인해, 실패 시 변형률에 큰 변화가 없었지만, CNT 도포와 함께 수율에서의 변형률은 CNT0의 0.09에서 CNT0.5의 0.16 및 CNT1의 0.2로 증가하여 장식된 CNT 네트워크가 장력 하중에서의 플라스틱 변형에 대항하는 나노섬유의 저항능력에 기여함을 암시하였다.

실시예 2 : CNT 계면 PCL 나노섬유의 세포 부착 및 골 형성 분석

2-1. 세포 부착 및 확산

뼈 재생을 위한 CNT 계면 나노섬유 스캐폴드 활용을 위해, 인간 MSCs은 나노섬유에서 배양한 다음 초기 세포 부착력을 조사하였다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포(MSCs; Rooster Bio, USA)는 시험관 내 연구에 사용되었다. 세포는 제조사의 지침에 따라 고성능 미디어 키트(RoosterBio, USA)에서 배양하였다.

나노섬유에 대한 MSCs의 초기 반응은 팔로이딘-DAPI 염색 및 빈쿨린(vinculin) 발현으로 평가하였다. 10,000개의 MSCs를 24웰 플레이트의 각 샘플(16mm 직경의 CNT0, CNT0.5 및 CNT1)에 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포는 4% 파라포름알데히드 용액(PFA, Tech & Innovation)에 의해 서로 다른 시점(6, 12 및 24시간)에 고정한 다음 세포골격에 대해 Alexa Fluro 488-결합된 팔로이딘 염색 및 핵에 대해 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색했다. 염색된 세포는 IX7151 형광 현미경(Olympus, Japan)에 의해 관찰하였다. 이 이미지에 기초하여, 부착된 세포의 수를 계수하였다. 각 샘플에 대해 250개 이상의 세포가 정량화를 위해 평가되었다.

초기 세포 부착의 분석을 위해, 대표적인 병소 접촉 단백질(focal contact protein)인 빈쿨린의 발현을 면역세포화학적 염색에 의해 모니터링하였다. MSCs는 분주되고 6시간 동안 배양한 후, 항-빈쿨린 항체(abcam,USA)로 고정 및 염색한 다음 FITC-컨쥬게이션 된 이차 항체(Santacruz, USA)와 함께 배양하였다. 염색된 세포는 LSM 700 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰하였고, 빈쿨린 발현 영역은 Image J 소트프웨어(NIH, USA)를 사용하여 정량화하였다. 각 샘플에 대해 250개 이상의 세포가 정량화를 위해 평가하였다.

그 결과, 접착 반응은 세포 형태, 접착 수 및 확산 영역의 평균에 의해 모니터링되었다(도 2). 상이한 시간(6, 12, 및 24시간) 동안 나노섬유 표면에 부착된 MSCs는 F-액틴 및 핵 염색을 형광 현미경검사법으로 시각화하였다. 배양 중, 세포는 나노섬유를 따라 몇몇 정렬을 나타내는 기저의 나노섬유 패턴을 인식하는 것처럼 보였다. 형광 이미지에 기초하여, 부착된 세포 수는 상응하는 시점에서 카운트되었다(도 2a). 주로 초기 기간(6 및 12시간)에서, 부착된 세포 수는 CNT0에 비해 CNT0.5및 CNT1에서 상당히 높았으며, 이는 CNT 도포가 NCS 접착에 유리한 나노섬유를 만들었음을 시사한다.

초기 세포 부착 과정에 관여하는 초점 부착(focal adhesion) 접촉을 나타내는 주요 서브멤브레인(submembrane) 분자인 빈쿨린의 발현은 α-액틴 필라멘트와 함께 면역 형광 염색으로 시각화하였다. CNT로 장식된 나노섬유의 MSC는 PCL 나노섬유(도 2b)에 비해 더 잘 발달된 스트레스 섬유와 더 높은 빈쿨린 발현을 나타내었으며, CNT 도포는 뚜렷한 세포의 병소 접촉 및 세포의 섬유성 스케폴드를 따른 확산을 가능하게 함을 강조하였다. 세포 부착 패턴 및 세포 골격 조직은 발달 및 재생 과정 동안 세포간 세포 역학적 신호 전달을 통해 줄기 세포 운명을 결정하는 데 중요한 역할을 한다. CNT 도포에 의해 가능한게 된 현저하게 변경된 세포 부착과 관련하여, 두가지 나노 도메인 크기 (수십 nm vs. 수백 nm)는 몇 가지 주요 역할을 할 수 있다. 중요한 것은, 나노섬유에 장식된 CNT의 나노관 크기(25nm)는 인테그린 클러스터링의 거리에 잘 대응되며, CNT 크기가 세포의 나노 스케일 감지 기작에 특이적임을 암시한다. 더욱이, 흡착되거나 분비된 세포외 단백질의 분포는 계면 CNTs에 의해 변경될 수 있다. 실제, CNT 기질상에 세포 부착 및 확산이 인테그린 의존적이며, 이는 CNT의 표면에 대한 세포-분비 점착 단백질 및 혈청의 흡착에 의해 촉진되는 것이 알려져 있다. 더 강한 세포골격 발달과 빈쿨린 병소접촉을 갖는 더 많은 MSCs의 확산은 종종 그들의 골생성 분화 기능과 상호연관되었다.

2-2. 골 생성 분화

뼈 재생을 위한 CNT 계면 나노섬유 스캐폴드 활용을 위해, 인간 MSCs을 나노섬유에서 배양한 다음 골 형성 거동을 조사하였다.

정량 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR) 분석

MSCs의 골 분화는 골형성 배지(10 mM β-glycerophosphate, 50 μg/mL 아스코빈산, 10nM 덱사메타손이 첨가된 1% 페니실린-스트렙토마이신 배지 및 10% 우태아혈청(Gibco)이 있는 α-MEM(Gibco, USA))에서 수행되었다. 세포의 골형성은 qRT-PCR에 의해 특성화 하였다. 7, 14 및 21일 동안 세포를 배양한 후, 알칼리성 인산염(ALP, alkaline phosphates), 콜라겐 타입 I(COLI, collagen type I), 뼈 시알로단백질(BSP, bone sialoprotein), 오스테오칼신(OCN, osteocalcin)을 포함하는 골형성 관련 유전자의 발현을 qRT-PCR에 의해 확인하였다. 요약하면, cDNA의 제1가닥은 제조사의 지시에 따라 PCR(Bioneer, Korea)을 위한 SuperScript first strand synthesis system을 사용하여 RNA 1μg로부터 합성하였다. 반응 혼합물을 최대 50μL까지 제작되었다. qRT-PCR은 총 cDNA 50ng, SYBR GreenER qPCR SuperMix 시약을 사용하여 수행되었다. 상대적인 전사체 수량은 샘플로부터 증폭된 내인성 기준로서 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)과 함께 △△Ct 방법을 사용하여 계산하였다. 배수 변화값(fold change)은 이후 2-△△Ct.를 통해 결정되었다. 유전자의 프라이머 서열은 다음과 같다: ALP forward 5'-GTACGAGCTGAACAGGAACAA-3', reverse 5'-CCTTCCACCAGCAAGAAGAA-3'; Col1 forward 5'-CCTGTCTGCTTCCTGTAAACTC-3', reverse 5'-GTTCAGTTTGGGTTGCTTGTC-3'; BSP forward 5'-GAGGAGGAAGAGGAAGGAAATG-3', reverse 5'-TGGTACTGGTGCCGTTTATG-3'; OCN forward 5'-GGCACCCTTCTTTCCTCTT-3'; GAPDH forward 5'-GTATGACAACAGCCTCAAGAT-3', reverse 5'-GTCCTTCCACGATACCAAAG -3'

알칼라인 포스파타제(ALP)와 알리자린 레드 S(ARS) 분석

MSCs의 ALP 활성은 p-니트로페닐 포스페이트의 가수분해 황색 생성물 및 p-니트로페놀의 양을 정량화하여 조사하였다. 30,000개의 세포를 7 및 14일 동안 각 샘플에서 배양하고 ALP 효소 활성을 ALP 활성 키트(abcam, UK)를 사용하여 평가하고, 이중 가닥 DNA(dsDNA) 정량화는 PicoGreen 분석으로 수행하였다. 그 후 ALP 활성을 총 dsDNA 함량으로 정규화하였다.

세포 미네랄화 활성의 정량적 분석은 ARS 분석으로 평가하였다. ARS 염색을 조사하기 위해, 세포는 골형성 배지에서 28일 동안 배양한 다음, 샘플을 PBS로 3회 세척하고 10분 동안 4% PFA로 고정하였다. 고정된 세포를 1% 알리자린-적색 용액으로 RT에서 2 시간 동안 염색하였다(pH 4.2; Sigma-Aldrich). 다음으로, 샘플을 PBS로 철저히 세척한 다음 RT에서 건조시켰다. 오렌지 염료를 10mM 소듐포스페이트(pH 7.0, Sigma-Aldrich)의 10% 세틸피리디늄 클로라이드(Sigma-Aldrich)에서 용해시켰다. 그리고 나서 OD 값은 iMark 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad, USA)를 사용하여 562nm에서 측정하였다.　세포 없이 얻은 평균 OD 값은 계산에서 빼었다.

실험 결과

MSCs의 골생성 분화는 ALP, Col I, BSP및 OCN을 포함하는 뼈 관련 유전자의 발현에 의해 분석되었다(도 3a). qRT-PCR 결과는 모든 유전자의 mRNA 발현 수준이 14일 이후 bare PCL과 비교하여 CNT 계면 나노섬유에서 배양될 때 현저하게 상향 조절됨을 나타냈다. 특히, MSC에서 늦고 성숙한 골형성 마커인 BSP 및 OCN 유전자 발현은 CNT0에 비하여 CNT1에서 거의 40배 더 높았다

다음으로, 성숙한 골성 마커 OCN의 발현을 면역형광 염색으로 21일(도 3b)에 평가하였다. OCN 단백질 신호는 CNT 도포된 스케폴드 상에 배양된 MSC에서 더 강렬하고 두드러졌다. ALP 효소 생산은 베어 PCL에 비해 CNT 도포된 표면상에서 배양된 MCS에서 유의하게 높았다(도 3c). 줄기세포의 골생성 성숙은 ARS 분석 키트를 사용하여 미네랄화에 의해 분석되었다. 28일째에, MSCs에 증착된 칼슘의 양은 CNT 도포에 의해 현저히 향상(3배)되었다(도 3d).

시험관 내 실험을 통한 골형성 결과는 CNT 계면 나노섬유 표면이 MSC가 정의된 배양 조건 하에서 골형성 계보로 더 현저하게 분화할 수 있음을 입증하였다. 이러한 골형성의 자극은 세포 부착 매개 신호 처리가 종종 후속 MSCs의 골형성 분화 잠재력에 결정적이기 때문에 가속 접착 이벤트와 밀접한 관련이 있을 수 있다.

2-3. 생체 내 조직 적합성 연구(in vivo)

생체 내 조직 적합성 및 이물질 반응은 Sprague-Dawley 랫트(수컷 5주령)의 피하 조직에 샘플을 이식함으로써 관찰되었다. 동물은 수술 전 5-7일 동안 입수되었고 각 랫트는 온도 및 습도가 조절된 환경에서 케이지에 보관되었고, 12시간의 밝은-어두운 주기에 노출되었고, 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있었다. 동물은 이식하기 전에 3개의 실험군(CNT0, CNT0.5 및 CN T1)으로 무작위로 분배되었다.

수술은 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물의 근육 내 주사를 사용하여 전신 마취하에 수행되었다. 피부의 등쪽 부위는 수술 부위에 요오드와 70% 에탄올 용액으로 면도하였다. 4개의 샘플은 척추로부터 양쪽 측면의 피부 밑에 만든 별도의 주머니에 이식하였다. 피하 조직은 흡수되지 않는 봉합사 물질(4-0 Prolene)로 봉합되었다. 수술 2 및 4주 후에, 동물을 CO₂ 흡입에 의해 안락사시키고 주변 조직 부분을 수집하고 RT에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린으로 고정시켰다.

조직 연구를 위한 부분은 ~5μm 두께의 마이크로톰(라이카 RM2245, 라이카 바이오시스템즈, 독일)을 사용한 절단으로 제작되어, 코팅된 유리 슬라이드로 옮겨졌다. 조직 부분이 있는 슬라이드는 일련의 자일렌 및 등급이 있는 에탄올 용액을 통해 탈파라핀화 및 수화되었고 헤마톡실린 및 에오신(HE) 및 마손 트리크롬(MT, Masson Trichrome)으로 염색된 다음 광학 현미경(IX71, Olympus, Japan)에 의해 관찰되었다.

이식된 물질에 의한 염증 및 이물질 반응의 평가를 위해, 대식세포 모집 및 분포는 조직 부위에 대해 항-F4/80 항체, 대식세포 항체(pan-macrophage antibody) 면역조직염색에 의해 염색 및 정량화되고 Zeiss LSM 510 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM; 자이스, 독일)으로 관찰되었다. 핵은 DAPI에 의해 염색되었다. 대식세포 발현은 무작위로 포획된 염색 조직에서 형광 강도에 의해 정량화되었다.

그 결과, CNT 계면 나노섬유는 2주에 무처리 PCL(bare PCL) 스캐폴드에 비해 낮은 수준의 염증을 보였다. 스캐폴드를 둘러싼 모집된 대식세포 및 섬유질 캡슐 형성은 CNT0.5 및 CNT1에 비해 CNT0에서 더 명백했다. 4주에, CNT1 샘플은 심각한 염증의 명백한 표시를 나타내지 않았다. 시간에 따라 현저하게 감소된 모집된 대식세포 수와, 또한 조직 수선에 필요한 실질적인 혈관 신생을 나타냈다. CNT1 샘플은 스캐폴드 주위의 다수의 섬유아세포 및 혈관(*) 형성을 나타낸다(도 4a). 그러나, CNT0 샘플은 여전히 스캐폴드 주위에 분포된 활성화된 대식세포를 갖는 이식된 부위에 대한 섬유질 캡슐화를 보여주었다. 다음으로, 이식 부위에 모집된 대식세포는 대식세포 항체 F4/80(pan-macrophage antibody F4/80)로 면역화학염색에 의해 정량 분석되었다(도 4b). 염색 결과는 모집된 대식세포가 CNT0.5과 CNT1에 비해 CNT0에서 2주 및 4주에 더 명확하게 관찰되었음을 나타내었으며, 정량분석에 의해 뒷받침되었다. 인테그린 신호 과정을 통한 세포 부착은 중요하며 세포 주기, 세포 분리, 세포 사멸 및 조직 재생을 조절하는 데 역할을 한다. 생체 재료의 표면은 부착 신호를 방해하거나 세포 부착을 촉진하지 않을 수 있으며, 이는 세포 분리 및 결과적으로 지지 매트릭스(supportive matrix)로부터 세포 분리에 의한 세포 사멸의 한 유형인 아노이키스(anoikis)를 결과한다. 아폽토시스의 유도는 세포 융합과 반비례하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 이물질 반응에서 이물질 거대 세포를 형성하는 것으로 알려진 대식세포 융합은 세포자살을 피하는 탈출 기작 중 하나이다. 따라서 생체 재료표면의 특징은 in vitro 및 in vivo 부착 대식세포의 아노이키스에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

즉, CNT 도포 PCL 나노섬유의 감소된 대식세포 수로부터 대식세포 아노이키스가 발생한 것으로 해석되며, 이로 인해 이물질 반응을 위해 부착된 대식세포의 융합을 저지하게 되어 결과적으로 생물체 내에서 생체 재료 표면에 형성되는 대식세포로 구성되는 섬유질 캡슐의 형성을 저지하여 염증을 감소시킬 수 있고, 조직 재생 단계를 가속화 할 수 있다.

2-4. 랫트 두개관(calvarium) 결함 모델의 뼈 재생 능력(in vivo)

랫트 두개관(calvarium) 결함 모델의 준비

12주령 Sprague-Dawley(SD) 랫트는 생체 내 뼈 재생 연구에 사용되었다. 동물은 이식 전에 3개의 실험군인 2개의 연구군(CNT0 및 CNT1) 및 1개의 대조군(empty control)(Sham)으로 무작위 배정되었다. 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 혼합물의 근육 내 주사로 전신 마취가 사용되었다. 선형 피부 절개는 수술용 블레이드(No.10)로 수행되었다. 전체 두꺼운 피부판(flap)이 벗겨지고 머리덮개 뼈(calvaria bone)가 노출되었다. 각 랫트에서 2개의 5mm 직경의 머리덮개 뼈 결함이 이루어졌다. 치과 핸드피스와 5mm 직경 트레핀 드릴(trephine drill)을 사용하여 멸균 식염수와 냉각 조건하에서 하나의 결함은 정수리 뼈(parietal bone)의 오른쪽에, 다른 하나의 결함은 왼쪽에 진행되었다. 피하 조직 및 골막(periosteum)은 흡수성 봉합사(4-0 Vicryl®, Ethicon)으로 봉합하였고, 피부는 흡수되지 않는 봉합재료(4-0 Prolene, Ethicon)로 접혀 있었다. 이식 후, 동물은 감염, 염증 및 해로운 반응의 가능한 임상 징후를 위해 정기적으로 모니터링되었다. 수술 8주 후, 동물을 CO₂ 흡입에 의해 안락사시키고 머리덮개 뼈 결함의 주변 조직 부분을 수확하고 RT에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르민으로 고정시켰다.

마이크로 CT 및 조직학적 분석 방법

고정된 샘플에서 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 이미지는 각 부분(μm)에 대한 279ms의 노출시간에서 65kV와 385μA에서 발생되는 X선으로 Skyscan 1176 X-ray Micro CT(Aartselaar)에 의해 촬영되었다. 스캔된 이미지로부터 재구성된 이미지는 CTAn Skyscan 소프트웨어를 사용하여 관심 영역에 걸쳐 경조직 형성을 분석하는 데 사용되어, 새로운 뼈 부피, 뼈 표면 및 뼈 표면 밀도(BS/BV)가 정량화 되었다. 3D 이미지는 CTvol Skyscan 소프트웨어(ver.2.3.2.0)에 의해 시각화되었다.

조직학적 분석을 위해 고정 샘플을 RapidCal?? 용액(BBC Chemical Co.)으로 5일 동안 탈석회화시켰다. 탈석회화 후, 샘플을 조직학적 절차에 의해 이어서 H&E-및 MT-염색하여 새로운 뼈 생성을 추정하였다. 조직 샘플상에 발현된 뼈 관련 단백질은 anti-bone morphogenic protein 2 (BMP2), 항-오스테오칼신(OCN) 또는 항-OPN 항체로 면역조직화학적 염색에 의해 검사한 후 CLSM에 의해 관찰하였다. 조직에 있는 핵은 DAPI로 반대 염색되었다. 단백질의 발현 수준은 무작위로 포획된 염색 조직에서 형광 강도에 기초하여 정량화되었다.

실험 결과

CNT 도포 PCL 나노섬유 스캐폴드 이식 후 8주 동안, 두개관 조직을 μCT 및 조직학에 의해 수확 및 분석하였다. 먼저, 3D μCT 이미지를 재구성하여 결함 내의 경조직 형성을 보여주었다. 대조군(empty control, Sham) 및 CNT0 군은 한계 결함 영역에서 최소한의 뼈 형성을 보였고, 반면 CNT1은 결함 내에서 상당한 수준의 뼈 형성을 나타냈다(도 5a). μCT 데이터의 정량화는, 골부피, 골표면적 및 골표면 밀도에 의해 인덱싱된 바와 같이, CNT 도포 스캐폴드에서 현저하게 향상된 골 형성을 뒷받침하였다(도 5b). 수확된 조직을 HE 및 MT 염색으로 조직학적으로 분석한 결과, 모든 실험군에 대해, 주변 조직은 염증에 대한 중요한 표시 없이 쳔연(native) 형태로 존재했다. Sham 실험군에서, 결손 부위는 느슨한 결합 조직과 새로 형성된 혈관으로만 채워졌지만, CNT0 실험군은 결함의 일부 영역에서 석회화 된 조직의 형성을 나타냈고, CNT1 군은 크게 증가된 수준의 석회화 조직 형성을 나타냈다(도 5c). 고배율 영상은 새로 형성된 석회화 조직을 나타냈으며 이는 라쿠나에서 다수의 적혈구와 함께 고도로 성숙된 뼈, 전형적인 네이티브 뼈 구조를 나타냈다. 새로 형성된 조직은 면역조직화학염색에 의해 추가로 분석하여 골분화 관련 단백질, BMP-2, OCN 및 OPN의 발현을 조사하였다(도 5d). Sham 군은 약한 신호를 보였고 반면 CNT1 실험군은 강렬한 신호를 보였으며 정량 분석은 다른 실험군보다 CNT1 실험군에서 상당히 높은 단백질 발현을 나타냈다. 이러한 단백질 발현은 생체 내 환경에 존재하는 MSCs의 자극된 골생성 활동의 결과일 수 있다. 피하 모델에서 입증된 바와 같이 CNT 도포 나노섬유의 혈관생성 효과는 가속화된 골 형성을 설명하였다.

In vivo 결과에 기초하여, CNT 도포 나노섬유는 감소된 염증 반응 및 피하 조직에서 혈관 신생을 가속화를 하는 우수한 조직 적합성을 나타내고, 주요 크기의 두개관 결함 모델에서 더 향상된 새로운 뼈 형성을 입증하며, 이는 집단적으로, CNT 계면은 뼈 재생 목적에 스캐폴드를 적용하기 위한 잠재적인 전략이 될 수 있음을 시사한다.

실시예 3 : 성장 인자 및 로딩 분석

성장 인자의 로딩 연구를 위해 녹색 형광 단백질(BMP2-GFP, FGF2-GFP, VEGF-GFP)으로 태그가 붙은 BMP2, FGF2, VEGF의 재조합 형태가 준비되었다. 요약하면, 형질전환(transformation) 후에 E.Coli TOP10 세포는 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 하룻밤 배양되었다. 박테리아는 원심분리에 의해 펠렛되었고(pelleted), NaCl-Tris-EDTA 완충제에서 용해되고, 초음파 처리되었다. 수용성 추출물을 냉장 원심분리기에서 5,000rpm, 20분 동안 원심분리하여 제조하였고, 상청액을 신선한 튜브로 옮겼다. 원심분리 후, 용해성 부분을 니켈-나이트릴로트라이아세트산 (nickel-nitrilotriacetic acid) 수지 컬럼(ELPISBIOTECH)을 통과하여 SDS-PAGE 분석에 의해 90% 순도까지 정제하였다.

CNT 도포된 PCL 나노섬유의 단백질 로딩 용량 평가를 위해, GFP 태그가 달린 단백질이 96웰 배양 플레이트의 각 샘플에 다양한 농도(1, 2, 4, 6, 8 및 10μg)로 처리된 후 수평 진탕 배양기를 사용하여 12시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 샘플의 GFP 형광 강도는 단백질 로딩 분석을 위해 SpectraMax 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, USA)에 의해 측정되었다.

그 결과, CNT 도포된 스캐폴드에 성장 인자의 로딩은 성장 인자 전달 시스템에 대한 스캐폴드의 용량을 평가하기 위해 간략하게 조사되었다. BMP-2, bFGF 및 VEGF를 포함한 뼈 재생을 위한 몇 가지 중요한 성장 인자를 선택하였다. 특히, GFP는 검출 분석을 용이하게 하기 위해 인간 단백질의 재조합 형태에 컨쥬게이션되었다. 상이한 농도에서의 성장 인자는 각 시료에 12시간 동안 처리한 다음, 로딩량을 형광 강도를 통해 측정하였다. 결과는 모든 성장 인자의 로딩이 농도에 따라 증가하는 것으로 나타났으며, 참고로, CNT 도포 스캐폴드에서 로딩 수준이 현저히 높았으며, 차이는 2-4배였다(도 6). 이전 연구 중 일부는 탄소 기반 나노 물질이 일반적으로 안정적이고 효과적인 단백질 흡착 능력을 나타내었다.

Claims (10)

1. 탄소나노튜브가 도포된 생분해성 고분자 나노섬유를 포함하는 스캐폴드로서, 상기 탄소나노튜브의 길이는 20nm~30nm이고,
   상기 생분해성 고분자 나노섬유는 폴리카프로락톤 나노섬유로서 길이가 400nm~600nm이고 카르복실기로 표면 기능화된 것이며,
   상기 폴리카프로락톤 나노섬유는 탄소나노튜브가 메쉬 형태로 도포된 것인, 바이 모달 나노 지형(bi-modal nano-scale topographical)을 가지며, 성장인자를 포함하는 골조직 재생용 스캐폴드.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 스캐폴드는 상온에서 인장 강도는 9~11MPa이고, 항복 강도는 6~8MPa이고, 탄성 계수가 35~60 MPa이고, 수율에서의 변형률은 0.1~0.2인 것인, 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드.
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 성장인자는 골형성 인자, 혈관형성 인자 또는 이의 조합인, 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드.
7. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드를 포함하는 골조직 재생용 조성물.
8. 다음의 단계를 포함하는 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 바이 모달 나노 지형을 갖는 골조직 재생용 스캐폴드 제조 방법:
   (a) 탄소나노튜브를 pH 1~2의 강산 용액에 첨가하여 70~90℃에서 유지한 후, 0.1~0.3μm 멤브레인으로 여과하여 pH 6~8이 될 때까지 세척하고 건조시키는 단계;
   (b) 상기 (a)의 결과물을 0.2 내지 3.0mg/ml 농도의 탄소나노튜브 용액으로 제조하는 단계;
   (c) 생분해성 고분자의 나노섬유를 수득하는 단계;
   (d) 상기 (c)의 결과물인 나노섬유 표면을 카르복실기로 기능화한 후, 상기 (b)의 결과물인 탄소나노튜브 용액에 침지한 후 건조시키는 단계; 및
   (e) 상기 (d)의 결과물에 성장인자를 로딩하는 단계.
9. 제8항의 상기 (c)는 클로로포름 및 테트라플루오로에틸렌 혼합물에 용해된 10~15% w/v의 폴리카프로락톤 용액을 전기방사시켜 나노섬유를 수득하는 단계인 것인 스캐폴드 제조방법.
10. 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 바이 모달 나노 지형을 갖는 스캐폴드를 인간을 제외한 동물의 손상 골 조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법.

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