KR101461161B1

KR101461161B1 - 3차원 공극 구조를 포함하는 골 재생용 나노합성 스캐폴드

Info

Publication number: KR101461161B1
Application number: KR1020130004512A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 도르츠 빌릭자야; 원종은
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2014-11-13
Also published as: KR20140095118A

Abstract

본 발명은 3차원 공극 분포를 포함하는 골 재생용 나노합성 스캐폴드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하이드록시아파타이트, 폴리카프로락톤 및 이온 개질된 탄소나노튜브를 포함하며 로보 디스펜싱법에 의해 제조된 나노합성 스캐폴드에 관한 것이다. 본 발명의 일례에 따르면, 기계적 성질(항복 강도 및 탄성 계수 등)이 향상되며, 아파타이트-형성 능력 및 세포 증식 효과가 현저한 스캐폴드를 제공 가능하다.

Description

3차원 공극 구조를 포함하는 골 재생용 나노합성 스캐폴드{Nanocomposite scaffolds having 3D porous structure for bone reconstruction}

본 발명은 3차원 공극 구조를 포함하는 골 재생용 나노합성 스캐폴드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하이드록시아파타이트, 폴리카프로락톤 및 이온 개질된 탄소나노튜브를 포함하며 로보 디스펜싱법에 의해 제조된 나노합성 스캐폴드에 관한 것이다.

조직공학(Tissue Engineering)이란 생명과학, 의학, 공학의 기본개념과 기술을 바탕으로 생체조직, 예컨대 뼈, 연골, 혈관, 방광, 피부 등의 대용품을 만들어 이식함으로써 생체 기능의 유지, 향상, 복원을 가능하게 하는 분야를 말한다. 지난 40여년동안 인공장기 물질의 제조, 이식, 외과적 재건술 분야에서는 기관 또는 조직의 상실 또는 기능부전을 치료하기 위하여 인공보철을 이용하는 것에 대하여 관심이 증가하였다. 자가이식 및 동종이식이 골전도 및 골유도 증식 인자를 제공하는 골이식 절차에서 가장 바람직하다고 판단되나, 공여 부위, 추가 수술(additional surgery), 질병 전염 및 비용 측면에서의 한계로 인해, 자가이식 및 동종이식에 대한 대체재의 개발 필요성이 대두되었다.

일반적으로, 하이드록시아파타이트는 뼈나 치아를 이루는 무기성분, 즉 칼슘과 인으로 이루어진 무기성분의 화합물이다. 또한 인체에 존재하는 전 칼슘의 99%와 약 85%의 인이 경조직에 존재한다고 알려져 있다. 따라서 크기, 결정도, 형태에 있어서 생체 무기성분과 동일한 조성인 하이드록시아파타이트는 뼈 충진제나 뼈 이식제 등의 생체 경조직 대체 재료로서 그 특성에 관한 연구가 광범위하게 진행되고 있다.

한편, 하이드록시아파타이트는 인체와의 생체적합성, 생체활성, 골전도의 특성이 우수하며, 하이드록시아파타이트를 생체에 이식한 결과 뼈와 직접 결합한다는 사실이 보고된 바 있고, 현재 임상 실험에 응용되고 있다. 또한, 하이드록시아파타이트는 형광재료, 감습재료, 효소담체, 칼슘 강화제 등에 응용되고 있으며, 정형외과 혹은 치과용 임플란트(implant)의 표면특성을 향상시켜 뼈 생성을 개선하기 위한 코팅물질로도 널리 이용되고 있다. 특히, 생체모방용 뼈 물질로 제조된 하이드록시아파타이트는 주로 생체 활성 및 합성된 하이드록시아파타이트의 뼈 형성 능력을 결정하기 때문에 특별한 중요성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 골 이식재료 및 약물 전달물질용 하이드록시아파타이트를 제조하기 위해 활발한 연구가 이루어지고 있으며, 나노구(nanospheres), 나노캡슐(nanocapsules), 나노섬유(nanofibers) 및 나노튜브(nanotubes)와 같은 특정 형태로 개발하는 연구가 진행되고 있다.

또한, 탄소나노튜브는 생체적합성 및 생체 내분해성이고 생체분자에 의해 작용화될 수 있어서 조직공학 스캐폴드 재료로 연구되고 있다. 대한민국 특허출원 제10-2007-27248호 “탄소나노튜브 복합체 조성물, 탄소나노튜브 전도성 박막, 및 이들의 제조방법”에서는 단일 가닥 DNA가 결합된 탄소나노튜브(Carbon NanoTube: CNT)들이, 서로 다른 CNT에 결합된 단일 가닥 DNA가 금속 이온을 매개로 한 DNA-DNA 클릭 화학결합을 이룸으로써 매질 중에 분산된 CNT 복합체조성물에 대하여 개시하고 있다.

그러나, 탄소나노튜브의 골조직 성장, 콜라겐 형성 및 생체적합성에 대한 우수한 기계적 특성에도 불구하고, 탄소나노튜브는 유기 또는 무기 용매에 균일하게 분산되기 어렵다는 문제가 있어 종래에는 조직공학에 사용되지 못하는 문제가 있었다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자는 하이드록시아파타이트 및 폴리카프로락톤과 이온 개질된 탄소나노튜브를 조합하여 로보 디스펜싱법에 의해 분산시킴으로써 균질하면서도 3차원 공극 구조를 가지는 스캐폴드를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 폴리카프로락톤, 하이드록시아파타이트 및 이온 개질된 탄소나노튜브를 포함하는 골 재생용 스캐폴드를 제공하고자 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 폴리카프로락톤, 하이드록시아파타이트 및 이온 개질된 탄소나노튜브로 이루어지는 골 재생용 스캐폴드를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 하이드록시아파타이트는 Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ 구조를 가지며, Ca/P 몰비가 1.67로 인체뼈와 유사하다. 이와 같이 화학적, 결정학적으로 뼈나 치아 내의 무기 조직과 유사한 특성을 가진 하이드록시아파타이트로 나노 섬유막을 코팅하여 이식 주위의 뼈나 조직과의 접착력 및 안정성을 우수하게 한다.

본 발명에서 사용되는 “CNT”는 탄소나노튜브를 의미하는 것으로, 하나의 탄소원자가 3개의 다른 탄소원자와 sp² 결합을 이루고, 육각형 벌집무늬 구조를 갖고 있으며, 직경이 수 나노미터에서 수십 마이크로미터인 물질을 의미한다. 본 발명에서는 CNT를 생분해성 고분자에 첨가하여 CNT의 우수한 기계적 특성을 생분해성 고분자에 부가하여 인장 강도를 향상시킬 수 있다. 또한 CNT를 그대로 사용하는 경우에는 응집현상이 크고 표면의 소수성이 커서 고분자 매트릭스에 균일하게 분산하기 어렵고, CNT와 고분자 사이의 계면 상호작용이 약해 고분자/CNT 복합체의 응용이 제한적인 바, 본 발명에서는 이를 개질하여 사용하였다.

본 발명에서 사용할 수 있는 탄소나노튜브는 단일벽 탄소나노튜브, 이중벽 탄소나노튜브 또는 다중벽 탄소나노튜브를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 다중벽 탄소나노튜브를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 “이온 개질된 탄소나노튜브(imCNT)”는 순수 CNT를 알킬화하여 알킬화된 탄소나노튜브가 양전하로 하전된 것에 음이온이 결합된 것이다. 구체적으로는 CNT 몸체는 비편재화된 양전하로 하전되어 상대 음이온[Y]^- 과 이온 결합방식으로 결합되어 제조된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면 스캐폴드의 기계적 특성상에 imCNT가 긍정적인 영향을 미침을 알 수 있다. 특히 뚜렷한 효과는 벌크 샘플보다는 스캐폴드 상에서 나타나며, 벌크 상태와 비교할 때, 스캐폴드는 압축 실험을 행하는 동안 3차원 구조 때문에 인장 응력을 받으며, imCNT는 인장 응력을 견디는 중요한 역할을 한다.

또한, 이온 개질 덕분에 imCNT는 테트라히드로푸란, 클로로폼, 다이클로로메테인과 같은 유기 용매에 효과적으로 용해될 수 있다. 즉, imCNT는 PCL을 포함하는 혼합 용액에 균일하게 분산될 수 있다. 이는 turbidity test를 통해 확인하였으며, THF용액 내에 분산된 imCNT는 안정한 상태이며 안정한 용액 상태는 몇 달이 지난후에도 유지됨을 확인하였다.

상기 음이온은 Cl^-인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 일례에 따른 탄소나노튜브는 양전하로 대전된 측벽과 Cl^-이온을 포함하며, 상기 Cl^-은 다양한 용매에서 다른 음이온과 교환 가능하다.

또한, 상기 이온 개질된 탄소나노튜브는 상기 골 재생용 스캐폴드 총 중량의 0.01wt% 에서 5.0wt%, 바람직하게는 0.1~1wt%인 것이 바람직하다.

상기 중량 비율에서 CNT의 함량은 많을수록 강도 향상 측면에서 좋을 수 있으나, 너무 많으면 (1% 이상) 인산칼슘 입자에 균일하게 흡착되지 못할 수 있어 향후 나노복합체 형성 후 오히려 강도가 저하될 수 있다. 또한, 초과량은 덩어리나 응집체를 형성하는 악영향을 미친다.

또한, CNT 함량이 너무 적을 경우 (0.1% 미만) 효과가 미미할 수 있다.

따라서, 0.2~1wt%가 바람직하며, 특히 0.2wt%의 탄소나노튜브 첨가는 종래에 비해 매우 소량이나 폴리머 매트릭스를 강화시키는 긍정적인 영향을 미치고, 폴리머 매트릭스에서 균일하게 분산되어 복합체를 강화시킨 바 있다.

또한, 상기 골 재생용 스캐폴드는 로보 디스펜싱법에 의해 제조되는 것이 바람직하다.

로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드를 제조하기 위해 로보캐스팅 장치(Ez-ROBO)를 사용하며, PCL, PCL-HA 및 PCL-HA-imCNTs 각각의 용액을 온도조절 시린지에 저장한다. 이후, 상기 용액은 질량 유량의 조절에 따른 힘 제어 플런저의 노즐(지름 520 μm) 을 통해 분산된다.

본 발명의 일례에 따르면, 용매에 균일하게 분산된 3차원 공극 구조의 스캐폴드를 제조함에 따라 아파타이트-형성 능력 및 세포 증식 효과가 향상되어 골 재생이 효과적으로 일어나는 스캐폴드를 제공할 수 있다.

또한, 탄소나노튜브의 첨가에 따라 기계적 성질(항복 강도 및 탄성 계수 등)이 향상된 스캐폴드의 제공이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일례에 따른 다중벽 탄소나노튜브의 용액 안정성 및 TEM 이미지이다.
도 2의 (a)는 3차원 매크로 채널 공극 스캐폴드를 형성하기 위한 로보 디스펜싱법의 개략도이며, (b)는 상이한 복합물(PCL, PCL-HA, PCL-HA-imCNT))로 제조된 스캐폴드의 광학 이미지이다.
도 3은 스캐폴드 모폴로지를 상이한 배율로 관측한 SEM 이미지이다((a,d,g)는 PCL, (b,e,h)는 PCL-HA, (c,f,i)는 PCL-HA-imCNT).
도 4는 PCL-HA-imCNT 나노합성 스캐폴드의 고해상도 SEM 이미지이며, PCL 매트릭스에서 HA는 화살표 헤드, CNTs는 화살표로 나타냈다((a)×5000, (b)×100,000)
도 5는 (a) XRD 패턴이며, (b) 상이한 스캐폴드의 라만 스펙트럼이다.
도 6(a)는 스캐폴드 샘플의 압축 실험에서 응력-변형률 곡선, (b)는 항복점에서의 압축 항복 강도, (c)는 초기 기울기로부터 계산된 탄성계수이다. (d)는 원통형(5mm 지름 × 10mm 높이) 벌크 샘플의 압축 항복 강도 및 (e)탄성계수를 나타낸 것이다.
도 7은 SBF 침지 테스트를 진행하는 동안 1,3,7, 14일에 관측된 스캐폴드 모폴로지의 SEM 이미지이다((a) PCL, (b) PCL-HA, (c) PCL-HA-imCNT).
도 8은 1.5 SBF 테스트 동안 스캐폴드의 중량 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 PCL, PCL-HA, PCL-HA-imCNT 스캐폴드 상의 세포증식을 분석한 것이다.
도 10은 4주 동안 실험용 쥐의 생체 피하 조직에 이식된 스캐폴드의 생체 적합성을 나타낸 것이다((a) PCL, (b)PCL-HA, (c) PCL-HA-imCNT 스캐폴드).

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 재료 및 방법

이온 개질된 탄소나노튜브( imCNTs )의 제조

아르곤 분위기에서 CNT(pCNTs; 다중벽; ILJIN Nanotech, Korea)를 [bmin][Sb₂F₁₁] ([bmim] = 1-butyl-3-methylimidazolium)을 포함하는 다이클로로메테인(DCM)과 혼합하였다. 이렇게 제조된 혼합물에 테트라히드로푸란(THF)을 첨가한 후, 물에서 급냉시켰다. 여과시킨 후에는 아세톤 및 DCM으로 세척하고 진공에서 건조시켜, 공기 중에 안정한 흑색 파우더 CNT-SbF₆를 제조하였다. CNT-SbF₆ 및 NaCl을 물-메탄올에 첨가한 후에 초음파 처리하고 물, 아세톤 및 DCM에 여과시킴으로써 Cl이 결합된 탄소나노튜브(CNT-Cl)를 제조하였다.

FLASH EA 1112에 의한 분석에 따르면, imCNT는 C가 90.8%, H가 0.33%, N이 0.1%의 원자퍼센트를 가지는 반면, pCNT는 C가 93.8%, H가 0.14%, N이 0.1%의 원자퍼센트를 가짐을 확인하였다.

또한, Cl^-의 존재 여부는 말디토프 질량분석기(MALDI TOF-MS, Voyager-DE STR)에 의해 확인하였으며, 동위원소 m/e 피크는 34.97이 100%, 36.97이 32%임을 확인하였다.

도 1은 이온 개질된 탄소나노튜브의 TEM 이미지이다. 이미지에 따르면 ~15nm의 지름을 가지며, ~5nm 쉘 두께를 가지는 중공의 튜브형 이온 개질된 탄소나노튜브임을 확인하였다.

imCNTs 를 포함하는 PCL - HA 나노합성체의 준비

HA 나노파우더(Alfa Aesar)는 1시간 동안 900℃에서 하소되며, 그 결과 표면적이 10.2 m² g^-1이었다. 상기 표면적은 표면적 분석기(Quadrasorb SI-Kr/MP, Quantachrome)에 의해 측정하였다.

HA 나노파우더는 5분 동안 초음파 반응기(Model number LH 700S, UL SSO Hitech)의 초음파 진동하에 40 %(w/v)의 농도로 아세톤에 분산하였다.

PCL-HA-imCNTs 나노합성체를 형성하기 위해, THF 용매에 가해지는 5분의 초음파 진동을 통해 imCNT를 용해시켰으며, 이에 따라 균일한 imCNTs 용액을 얻었다. THF 내 imCNTs의 안정성은 Turbiscan Lab(Leanontech, Korea)을 사용하여 분산광을 모니터링함으로써 확인하였다.

50℃에서 imCNT 용액에 PCL-HA용액을 교반하면서 첨가하였다. imCNT의 농도는 PCL-HA에 대해 0.2%로 고정하였으며, 상기 농도에서 가장 높은 인장 강도를 나타냈다.

나노합성체 용액에 대한 로보 디스펜싱법

로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드를 제조하기 위해 로보캐스팅 장치(Ez-ROBO)를 사용하였다. PCL, PCL-HA 및 PCL-HA-imCNTs 각각의 용액을 온도조절 시린지에 저장한 후, 상기 용액은 질량 유량의 조절에 따른 힘 제어 플런저의 노즐(지름 520 μm) 을 통해 분산된다. 분산 니들은 에탄올 배스에 살짝 담갔다.

xy면 상에 z축을 따라 각각의 레이어가 적층 구조를 형성함에 따라 공극 구조가 제조되며 z축을 따라 섬유의 적층이 이루어졌다. xy 면의 공극 크기는 500μm X 500μm 이었다. z축의 공극 크기는 섬유질 지름에 의해 결정된다.

스캐폴드는 10mm(너비) X 10mm(길이) X 5mm(높이) 또는 5 mm(너비) X 5mm(길이) X 10mm (높이) 크기일 수 있다. 건조한 후에, 증착된 섬유질의 접착을 위해 스캐폴드를 50℃로 예열하였다.

PCL 및 HA 용액을 포함하는 균일한 imCNT용액을 로보 디스펜싱(RD)법에 의해 스캐폴드로 더 제조하였다.

도 2(a) 에 도시된 바와 같이, 스캐폴드의 3차원 구조는 노즐을 통하여 나노합성체 용액의 분사에 따르며, 적층 구조를 형성하였다. 3개의 상이한 구성을 포함하는 추가 실험/ 3차원 스캐폴드는 도 2(b)에 나타내었다. 생성된 모든 3차원 스캐폴드는 회전 가능한 형상을 가졌다. 특히 imCNT를 포함하는 것은 보다 진한 색을 나타냈다.

3차원 스캐폴드의 공극 구조는 표 1에 정리하였다. 표 1에 따르면, 모든 스캐폴드는 xy 면에 유사한 공극 사이즈 (섬유질간 간격; 220~230μm)를 가지며, z축을 따라(섬유질 지름; 230~240μm) 좁은 편차를 가짐을 확인하였다.

실험예 1 : 나노합성체 스캐폴드의 구조 및 모폴로지 관측

로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드의 공극 구조 및 모폴로지를 다음과 같이 확인하였다.

구체적으로, 스캐폴드에 Au 코팅하여 주사전자현미경(SEM; S-3000H, Hitachi)을 통해 관찰하였다. 특히, 평균 섬유질의 지름 및 상호 연결된 공극의 크기를 관찰하였다.

또한, 고해상도 SEM(JSM7000F, JEOL)을 통해 스캐폴드의 나노구조를 관찰하였으며, 개질된 탄소나노튜브는 투과전자현미경(TEM, TECNAI-FE12, Philips)을 통해 관찰하였다.

또한, 표면의 습윤성 변화를 관찰하기 위해 샘플을 박막으로 제조하여, 접촉각 측정기(Phoenix300, SEO)를 통해 대기 조건에서 물 접촉각을 측정하였다. 탈이온수 0.5ml가 박막 표면에 적가되며, 캡쳐된 이미지로부터 전진 접촉각을 측정하였다.

그 결과 도 3을 참조하면, 관찰된 스캐폴드는 정렬된 매크로채널 공극을 포함함을 알 수 있었다. 확대시키면, PCL 스캐폴드의 표면이 부드러우며, 나노합성체 스캐폴드는 HA 때문에 거친 표면을 나타냄을 확인하였다. 표면 일부가 공극을 포함하는 것처럼 보일지라도, 폴리머 매트릭스는 미립자로 뒤덮히고 밀폐되어 있으며 이러한 공극으로 연결되어 있었다.

PCL-HA 및 PCL-HA-imCNT 스캐폴드의 표면 모폴로지는 유사하며, imCNT는 매트릭스 상에 낮은 농도가 함유되어 SEM으로 관찰하기 어려움을 확인하였다.

또한, 나노합성체 매트릭스 내의 imCNT의 정렬 및 존재 여부를 관찰하기 위해, 스캐폴드의 표면을 고해상도 SEM으로 관찰하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, HA 나노입자는 PCL 매트릭스 상에 분산되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PCL 매트릭스와 HA 나노입자 접합에서 나노튜브형 구조체를 일부 확인하였다. imCNT의 덩어리나 응결체가 없음을 확인하였으며, 매트릭스 내에서 CNT 분자가 효율적으로 분산되었음을 확인하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이 3개의 상이한 스캐폴드의 XRD 패턴 및 라만 스펙트럼을 분석하였다. XRD 패턴에서 추가적인 HA 피크를 명백하게 확인하였으나, imCNT의 피크는 나타나지 않았다. 라만 스펙트럼 역시 양 나노합성체 스캐폴드에 대한 HA의 피크가 존재하였으나, imCNT는 나타나지 않았다. 이는 상기 장치들이 감지할 수 있는 최저 농도 이하로 존재하기 때문이다. 즉, SEM 이미지에서 확인한 바와 같이 imCNT가 존재함에도 불구하고, XRD 및 라만은 imCNT첨가에 따라 뚜렷한 화학적 구조 변화나 상변화가 없음을 확인하였다.

박막 상에 형상된 샘플의 접촉각은 대기 조건에서 측정되었으며, 표 2에 정리하였다. 특히 나노합성체 표면을 2N NaOH에 상이한 시간만큼 노출시켰다. NaOH 처리 안한 경우에 초기 접촉각은 어떠한 나노합성체의 효과도 나타나지 않으면서 모든 샘플이 ~70~80도의 접촉각을 나타냈다. 이는 PCL의 표면효과 때문이며, 나노합성체의 얇은 층의 표면은 PCL에 의해 커버되기 때문이다.

샘플을 NaOH로 처리한 경우, 접촉각은 현저하게 감소하였다. PCL 샘플의 접촉각을 12시간 처리 이후 측정한 결과 약 60도였다. 또한, 복합체 샘플을 PCL 샘플보다 훨씬 감소한 약 40~45도를 나타내었다. PCL 샘플의 접촉각 감소는 알칼리 처리에 의한 하이드록실기 및 카르복실기때문이며, 친수성 구성요소(HA 또는 HA- imCNT)를 포함하는 나노합성체는 친수성 성질의 증가에 큰 영향을 미치기 때문이다. 나노합성체 사이에 접촉각 차이는 거의 없었다.

실험예 2 : 스캐폴드의 기계적 특성 분석

로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드의 기계적 특성을 Instron(model 3344)을 사용하여 다음과 같이 확인하였다.

구체적으로, 5mm (너비) X 5mm(길이) X 10mm(높이)를 가지는 샘플에 100N 로드셀, 크로스헤드 속도 1mm min^-1을 사용하여 압축 하중을 실험하였다. 로보 디스펜싱법에 의한 스캐폴드의 샘플은 100℃ 몰드 내에 Carver hot pressing apparatus(Model number 38510, USA)을 통해 원통형(5mm 지름 X 10mm 높이)으로 제공될 수 있다. 각 샘플의 응력-변형률 곡선을 기록하였으며, 항복 강도는 상기 곡선으로부터 계산하였다. 또한, 탄성계수는 그래프의 초기 기울기로부터 계산하였으며, 모든 샘플은 각각의 조건에서 실험하였다.

응력-변형률 곡선은 도 6(a)에 나타내었다. 모든 스캐폴드에 대해 유사한 응력-변형률 패턴이 나타났다. 항복점에 이르기까지 선형 그래프가 계속되며, 기울기가 감소하였다.

첫번째 영역은 스캐폴드가 소성 변형이 일어나기 전의 탄성 영역을 나타냈으며, 두번째 영역에서는 응력이 증가함에 따라 압축 변형 역시 증가함을 나타냈다. 두번째 영역은 항복점을 지난 상태이며, 응력이 계속해서 증가하면 소성 변형된 스캐폴드의 공극 막힘 현상이 일어난다. 따라서, 스캐폴드가 하중을 견디고 있는 것처럼 보이더라도 지지 용량을 나타내는 것이 아니며, 스캐폴드의 붕괴 또는 파괴를 의미한다.

항복 강도는 도 6(b)를 통해 알 수 있다. PCL 또는 PCL-HA 나노합성체 스캐폴드의 강도와 비교하면, PCL-HA- imCNT 나노합성체 스캐폴드의 항복 강도는 현저하게 향상됐음을 알 수 있었다.

도 6(c)는 스캐폴드의 탄성계수를 나타낸 것이다. PCL 스캐폴드와 비교하면, 양 나노합성체 스캐폴드는 현저하게 강화된 값(~20MPa vs 40-50 MPa)을 가졌다. 또한 PCL-HA- imCNT 스캐폴드는 PCL-HA 보다 높은 탄성계수를 나타냈다.

원통형 벌크 샘플에 대해서도 압축 하중 시험을 실시하였다.

항복 강도 및 탄성 계수는 도 6(d.e)에 각각 나타내었다. 도 6(d,e)에 따르면, imCNT를 첨가함에 따라 현저한 강도의 향상이 있음을 알 수 있었다. 탄성 계수 또한 HA 또는 HA- imCNT의 결합에 따라 현저하게 향상되었다.

실험예 3 : 스캐폴드의 유사 체액 내 무기질 형성 분석

스캐폴드의 체내 무기질 형성 여부를 다음과 같이 확인하였다.

구체적으로, 스캐폴드의 체내 아파타이트 무기질 형성을 위한 침전 반응을 빠르게 하기위해 유사 체액(1.5배 SBF; 1.5SBF) 내에 스캐폴드를 함침시켰다. 1.5SBF는 Na⁺ 213.0 Mm, K⁺ 7.5mM, Mg² ⁺ 2.25mM, Ca² ⁺ 3.75mM, Cl^- 221.7 mM, HCO₃ ^- 6.3Mm, HPO₄ ² ^- 1.5Mm, SO₄ ² ^- 0.75mM이며, pH 7.25에서 (CH₂OH)₃(CNH)₂/HCL 완충용액을 사용하였다.

각각의 샘플(크기 5mm X 5mm X 10mm)은 14일 동안 37℃의 1.5 SBF 용액 10ml에 침지시키어 저장하였다. 침지 후의 샘플은 표면 모폴로지의 변화를 관찰하기 위해 세척하였다. 침지 동안의 중량 변화 역시 측정하였다. 또한, 무기질의 구성요소 및 상(phase)은 SEM에 부착된 EDS 및 XRD를 통해 각각 관찰하였다.

도 7은 SBF-침지 실험을 하는 1,3,7, 및 14일에 스캐폴드의 SEM 모폴로지 변화를 나타낸 것이다.

도 7(a)에 따르면 14일이 될 때까지 PCL 스캐폴드 표면의 변화는 거의 없었다.

반면, 초기의 PCL-HA 표면은 함침 시간에 따라 변화하였다. 3일째에는 변화가 조금 생겼으며, 7일째에는 표면 일부 상에 침전된 무기물을 관측할 수 있었다. 또한, 14일에는 상당량의 무기물이 관측되었다(도 7(b)).

또한, 무기물화 작용은 PCL-HA-imCNT 에서도 관측되었다(도 7(c)).

도 8에는 침지 실험동안의 스캐폴드 중량 변화를 나타내었다.

PCL-HA와 PCL-HA-imCNT 스캐폴드의 중량은 3일째까지 유사하게 소량 증가하였으며, 이후 14일까지는 빠르게 증가하였다. 최종적으로 14일째에는 ~6-7%가 증가함을 확인하였다.

다만, PCL 스캐폴드에서는 1% 미만의 중량 변화가 발생하였음을 확인하였다.

따라서, PCL 스캐폴드에 비해 PCL-HA-imCNT의 무기질 형성이 뛰어나다는 것을 확인하였다.

실험예 4 : 스캐폴드의 생체 외 세포 배양

세포 독성 및 생장에 대한 스캐폴드의 세포 및 조직 반응을 다음과 같이 확인하였다.

구체적으로, 전골모세포 라인(MC3T3-EA, ATCC)를 사용하였다. 세포는 소태아혈청이 추가되며 α-개질된 최소 필수 배지인 배양기에 저장하였고, 상기 배양기는 37℃, CO₂ 5%의 대기 하의 항생/항진균성 용액 1%를 포함하였다.

상이한 구성(PCL, PCL-HA 또는 PCL-HA-imCNT)을 가지는 RD 스캐폴드는 10mm X 10mm X 5 mm로 준비하였다. 실험 전에 샘플은 70% 에탄올에서 10분 동안 살균되며 층류에서 밤새 건조시켰다.

MC3T-3E1 세포는 24 웰 플레이트의 각 웰에 포함된 스캐폴드 상에 배양하였다. 스캐폴드 상에 세포가 초기에 흡착하는 것을 돕기 위해, 세포의 50μL 분취액을 6시간동안 각각의 스캐폴드에 침지시키며, 이후 150μL의 배양액을 첨가하였다. 그리고 나서, 샘플은 또 다른 분석을 위해 14일 동안 37℃에서 인큐베이터에 저장하였다.

골세포의 분화를 유도하기 위해서, 10mM의 β-글리세롤 포스페이트 및 50 μg mL^-1의 L-아스코르브산을 배양지에 첨가하였다. MTS (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 분석키트(CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)를 사용하여 미토콘드리아 활성을 평가하였다. 각각의 그룹의 샘플은 모든 세포 테스트에 사용되며, 가정 평균 시사법에 의해 비교하였다.

도 9는 14일동안 MTS assay의 배양에 의해 측정된 세포 성장도를 나타내었다.

배양 기간 동안, 세포 증식은 PCL 스캐폴드에 비해 양 나노합성체 스캐폴드에서 현저하게 높게 나타났다. PCL-HA 복합체는 PCL에 비해 현저하게 향상된 세포 증착 및 성장을 보였다. 친수성이 향상된 HA의 결합에 따라 초기 세포 증착이 용이하며, 세포 증식 또한 용이하기 때문이다.

특히, CNT를 포함하는 나노합성체는 세포 성장 속도가 빠르며, 이는 적어도 세포 증식 단계에 있어서 생체 활성적인 PCL-HA 의 세포 반응이 imCNT가 첨가됨에도 보존되었기 때문이다.

실험예 5 : 실험용 쥐의 피하 조직에 대한 스캐폴드의 생체 적합성 분석

스캐폴드의 체내 조직 적합성을 실험용 쥐의 피하 조직을 사용하여 다음과 같이 실험하였다.

구체적으로, 10주된 스프라귀 다우레이(Sprague Dawley) 수컷 쥐를 케타민 80 mg kg^-1 및 자일라진 10mg kg^-1 을 포함하는 근육주사로 마취시켰다. 쥐의 족배부분을 면도하고, 70%의 에탄올 및 포비돈 요오드로 소독하였다. 피부 절개는 실험용 쥐의 척추로부터 후측면으로 Bard-Parker No. 10 knife 수술가위를 사용하여 비절개 박리하였다.

스캐폴드의 이식 전에, 스캐폴드(PCL, PCL-HA, PCL-HA-imCNT)는 에틸렌 옥사이드로 소독하였다. 샘플을 절개 부위로부터 준비된 자리에 둔 후, 봉합하였다. 수술 4주 후에 실험용 쥐를 희생시킨 후, 샘플 준비를 위해 이식된 샘플 및 주위 조직을 쥐로부터 채취하였다.

그 다음, 상온의 10% 중성화된 완충 용액에 샘플을 24시간 동안 함침시킨 후, 에탄올 희석액으로 탈수시켰다. 얇은 섹션을 얻기 위해, 스캐폴드를 이등분하여 파라핀에 매립시키고, 4~6 μm 두께로 절단하였으며, 슬라이드를 헤마톡실린-에오신 염색시켰다(도 10(a) PCL, (b) PCL-HA, (c) PCL-HA-imCNT).

도 10에서 빈 공간은 스캐폴드이며, 염색된 부분은 매크로 공극 채널의 일부이고 여기서 조직 성장이 일어난다. 스캐폴드의 일부분이 샘플 준비 과정에서 파괴된다 하더라도, 스캐폴드를 둘러싼 채널 내의 세포 및 조직 반응이 명백함은 확인할 수 있었다.

PCL 스캐폴드에서 섬유질 조직의 두꺼운 층은 스캐폴드 줄기 표면에 정렬되어 있다. PCL과 같은 생체폴리머 스캐폴드에서 일반적으로 관찰 가능한 많은 양의 섬유 아세포 및 일부 새로운 혈관이 형성됨을 확인하였다.

PCL-HA 및 PCL-HA-imCNT 스캐폴드에서 스캐폴드 형상은 보다 잘 유지되었다. 또한, 공극 구조도 잘 드러남을 확인하였다. 조직 및 세포 반응은 유사하였다. 공극 채널 내에서 세포 및 조직의 성장이 있었으며, 이는 PCL과 비교하여 스캐폴드 표면을 따라 얇게 형성되었다. 보다 흥미로운 것은, 새로운 혈관 형성이 두드러지며, 혈관 사이즈가 더 크다는 것이었다. 이러한 실질적인 형성은 세포 성장에 대해 체내 환경을 효과적으로 제공함을 나타낸다.

PCL-HA 스캐폴드에 대한 imCNT의 첨가는 조직 반응에 악영향을 미치지 않으며, 4주의 실험 동안 뛰어난 조직 적합성을 나타내었다.

Claims

폴리카프로락톤, 하이드록시아파타이트 및 이온 개질된 탄소나노튜브로 이루어지며 상기 탄소나노튜브의 표면은 양전하를 띠며 로보 디스펜싱법에 의해 제조되어 매크로 채널을 포함하는 적층 구조인, 골 재생용 스캐폴드.
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제1항에 있어서, 상기 이온은 Cl^-인 것을 특징으로 하는, 골 재생용 스캐폴드.
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제1항에 있어서, 상기 이온 개질된 탄소나노튜브는 상기 골 재생용 스캐폴드 총 중량의 0.01wt% 내지 5.0wt%인 것을 특징으로 하는, 골 재생용 스캐폴드.
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