KR102553738B1 - 생체활성 유리 나노입자 기반의 나노시멘트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분말상과 액상으로 구성되는 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 포함하는 시멘트 조성물에 관한 것으로, 기존 CPC보다 높은 표면적으로 인해, 나노시멘트는 Si 및 Ca 이온 방출의 지속 시간이 증가하며, 단백질 담지 및 전달이 향상되고 생체 내 이식 후 분해성이 증가된 것이 특징인 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 포함하는 시멘트 조성물에 관한 것이다.

Description

생체활성 유리 나노입자 기반의 나노시멘트{Nanocements based on bioactive glass nanoparticles}

본 발명은 분말상과 액상으로 구성되는 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 포함하는 시멘트 조성물에 관한 것으로, 기존 CPC보다 높은 표면적으로 인해, 나노시멘트는 Si 및 Ca 이온 방출의 지속 시간이 증가하며, 단백질 담지 및 전달이 향상되고 생체 내 이식 후 분해성이 증가된 것이 특징인 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 포함하는 시멘트 조성물에 관한 것이다.

인산 칼슘 시멘트(CPC)는 골 조직 복구 및 재생에 널리 사용되며, 이의 자가 -경화 특성은 생활성 분자의 국부 전달 능력과 함께 원하는 결손 부위의 형태에 맞게 외과적 처치를 가능하게 하여 독특한 주입가능한 무기 생체재료로서 이용될 수 있게 한다.

CPC가 시험관 내 골아세포 및 줄기세포/전발생 세포의 골형성 분화, 및 시험관 내 골 형성을 가능하게 한다는 것은 많은 연구들에서 밝혀졌다. 그러나, CPC의 낮은 분해성 및 기계적 강도는 개선할 필요가 있는 특성이다. 또한, 혈관 신생 및 세포 귀환의 자극과 같은 골 재생에 필요한 특정 세포 사건은 확장된 적용을 위해 강화되어야 한다.

많은 첨가제 물질들이 CPC의 특성을 개선하기 위해 도입되어 왔다. 용액 형태의 천연 고분자를 포함하는 고분자성 물질(키토산, 젤라틴, 콜라겐 및 알지네이트) 또는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)과 같은 입자 형태의 합성 고분자가 깨지기 쉬운 시멘트의 가소성을 개선하기 위해 널리 사용되어 왔다. 또한, 카본 나노튜브 및 나노섬유와 같은 나노물질이 혼합되어 왔으며 이들이 복합체의 물리화학적 특성 및 기계적 특성을 개선하는 것으로 밝혀졌다. CPC에 생활성 나노물질을 혼합하는 것은 물리화학적 특성, 기계적 특성 및 생물학적 특성을 상당히 변경시킬 수 있는 흥미롭고 잠재적인 방법인 것으로 여겨진다. 그러나, CPC의 자가 경화 특성을 유지하면서 생체적 적합성이 있어야 하며, CPC의 물리화학적 특성, 기계적 특성 및/또는 생물학적 특성을 개선시켜야 하므로 매우 제한적이다.

또한, 초기 입자 크기 및 최종 시멘트의 성질의 중요성이 강조되었으나, 나노입자로의 제조는 분말 준비의 한계로 제한되었다. 분말은 과도하게 성장되거나 부분적으로 소결된 분말로 수십 내지 수백 마이크로 미터 크기의 분말을 생성하는 고온 가공을 필요로 하기 때문에 분쇄 또는 분쇄 공정을 사용하더라도 입자 크기는 거의 서브미터(submicrometers)까지 감소되기 어렵다.

이에 대하여 다양한 연구가 수행되었다. 특히, 특허공개 제10-2003-0082948호에는 치아 충전 재료의 용도로 사용되는 생체활성 유리가 개시되어 있으나, 생체활성 유리 분말을 이용하여 나노시멘트를 제조하는 방법 및 이에 대한 세포 생존력, 혈관 형성 및 골 형성 능력, 생체 내 조직 적합성 등에 대한 분석이 개시된 바 없다. 이러한 상황에서 본 발명의 생체활성 유리 나노입자로 만들어진 나노시멘트가 생체재료로서 현저하게 향상된 생체 적합성 및 골 재생 효과를 가진다는 점에 대한 연구는 이루어지지 않았다.

본 발명의 목적은 메조다공성 생활성 유리 나노입자 무기 나노물질을 사용하여 표면적이 향상된 시멘트를 생산하여 경화 속도 및 분해 속도를 높여 기계적 및/또는 생물학적 특성을 개선시킨 골시멘트 조성물 및 이의 제조용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 제1양태는 전체 분말의 중량을 기준으로 생체활성 유리 나노입자를 50 중량% 이상으로 포함하는 분말 및 수용성 용매를 포함하는 나노시멘트 조성물을 제공한다.

본 발명의 제2양태는 전체 분말의 중량을 기준으로 생체활성 유리 나노입자를 50 중량% 이상으로 포함하는 분말을 제공하는 단계; 및 상기 분말을 수용성 용매 상에서 경화시키는 단계를 포함하는, 나노시멘트 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 제3양태는 전체 분말의 중량을 기준으로 생체활성 유리 나노입자를 50 중량% 이상으로 포함하는 분말 및 수용성 용매가 각각 개별 용기에 포장된, 나노시멘트 제조용 키트를 제공한다.

이하 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 메조다공성 생활성 유리 나노입자(mBGn)로 경화시킨 시멘트 조성물을 제공할 수 있음을 발견하였다. 특히, 본 발명의 메조다공성 생활성 유리 나노입자(mBGn)로 경화시킨 시멘트 조성물은 기존의 인산 칼슘 시멘트(CPC)의 단점을 보완하여 표면적이 증가하고 Si 및 Ca 이온 방출의 지속 시간이 증가하며, 단백질 담지 및 전달이 향상되고 생체 내 이식 후 분해성이 증가된 것이 특징이다. 이는 시멘트 분말의 입자의 크기가 작고 구형일수록 우수한 취급 특성 및 주입성을 가질 수 있기 때문이다. 구체적으로는 mBGn의 표면적, 입자 크기 기공 부피, 경화 반응, 이온 방출, 단백질 흡착능 등의 물리화학적 특성 및 기계적 특성을 전반적으로 조사하였으며, 더 나아가 골 수복 및 재생을 위한 잠재적인 주입가능한 생체재료로서 mBGn 나노시멘트의 이용가능성을 확인하기 위하여 아파타이트 형성 능력 확인, 세포 생존력, 혈관 형성 및 골 형성, 시멘트의 생체 내 조직 적합성을 조사하였다. 그 결과, 메조다공성 생활성 유리 나노입자(mBGn)로 경화시킨 시멘트 조성물은 골시멘트의 표면적을 증가시키고 단백질 담지 및 전달 능력이 향상될 뿐만 아니라 물리적 강도를 증가시키면서 생체 내 이식 후 분해성을 증가시킬 수 있음을 발견하였으며, 본 발명은 이에 기초한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "생활성 유리"란, 생체 조직 내에서 특정 생물학적 작용을 유도할 수 있는 유리 성분을 의미하는 것으로, 일반적으로 무기물로 구성되는 유리를 의미하며, 본원에서 "BG"라고도 칭한다. 특히, 본 발명에서는 나노입자 형태의 메조다공성을 갖는 생활성 유리, 즉 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 사용할 수 있다.

상기 생활성 유리는 Hench에 의해 발견되었으며, 분말 구조의 재생 골로서 임상적으로 사용되었다. 생활성 유리는 체액과 접촉시 표면에서 HCA(hydroxycarbonated apatite)층이 형성되기 때문에 골에 결합된다. HCA는 조성이 골 미네랄과 유사하며, 골과 강한 결합을 형성한다.

BG는 체액과 접촉하였을 때 표면에 탄산 HA(hydroxyapatite)의 형성을 유도할 수 있는 우수한 골 생활성 물질이다. 이러한 HA 층은 천연 골 기질과 유사하며, 세포의 정착, 골 분화 및 세포외 기질 분해를 위한 효과적인 인터페이스를 제공하고, 천연 골과의 직접적인 결합을 이끌 수 있다. 또한, 생활성 유리는 인체 내에서 안전하게 용해되어, 유전자 수준에서 골 세포를 자극하는 역할을 하는 임계적 농도의 실리콘 및 칼슘 이온을 방출하며, 심지어 매우 적은 활성 세포가 존재할 때 새로운 골 재생을 일으킨다. 생활성 유리는 용해로 유래된 것 및 졸-겔로 유래된 것의 두 가지 종류가 있다. 본 발명에서는, 실리카를 기초로 한 졸-겔로 유래된 생활성 유리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 생활성 유리는 이 분야에서 공지된 것이면 어느 것이든 가능하며, 대표적으로, SiO₂-CaO 또는 SiO₂-CaO-P₂O₅의 기본적 유리구조로 이루어진 것일 수 있고, Na₂O, P₂O₅ 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "생체활성유리 나노 입자(BGnp)"란, 실리콘, 칼슘, 인 등의 무기성분으로 구성된 나노입자를 의미하는데, 상기 BGnp는 PEG 용액에 칼슘을 포함하는 화합물과 실리콘을 포함하는 화합물을 가하여 반응시킴으로써, PEG, 칼슘 및 실리콘이 응결된 응집체를 수득하고, 상기 응집체를 소결시켜서, PEG를 제거함으로써 제조할 수 있다.

생활성 유리 나노입자(BGN)는 나노필러(nanofiller)로서 나노복합체를 제조할 수 있으며 생분자를 전달할 수 있는 등 많은 장점을 가지고 있다. 또한, 줄기세포의 골분화 촉진, 약물의 로딩과 전달 및 치아의 재미네랄화(dentinremineralization)와 같은 우수한 생물학적 특성을 나타낼 수 있다. 더 나아가, BGn은 졸-겔 제조과정에서 이의 구조 내부에 특정 이온을 결합시킬 수 있고, 고도의 다공 구조가 생성된다.

생체활성 유리 나노입자(BGn)는 종래의 마이크로입자 형태의 BG와 비교하여 나노스케일의 크기를 가지면서 더욱 큰 표면적을 가져 이와 관련된 물리화학적 특성 및 생활성 특성이 더욱 우수하다. 이에 더하여, 본 발명의 메조다공성을 가지는 mBGn은 세포내 흡수는 가능하면서 치료 분자의 효과적인 담지 및 전달이 가능하다. 결과적으로, 나노스케일 크기 및 실리카-기초의 조성을 갖는 mBGn은 우수한 골-생활성 및 세포 및 조직 적합성을 갖는다.

본 발명에서, 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자는 주형(template)으로 서 PEG를 사용하여 초음파 졸-겔법을 이용하여 알칼리 조건 하에서 제조된 것일 수 있다.

구체적으로, 주형(template)으로서 PEG를 C_1-4 알코올 중에 용해시킨 다음 pH를 9 내지 13으로 조절하고, 상기 PEG 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 혼합한 후 실리카 전구체를 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조한 뒤, 이를 원심 분리한 후 세척하고 건조 및 소성함으로써 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 얻을 수 있다. 이때 상기 pH 조절은 NH₄OH, NaOH, KOH 또는 Tris로 수행할 수 있으며, 산화칼슘 전구체로는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate), 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide) 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있고, 실리카 전구체로는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane), APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane) 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있다. 또한, 초음파 처리는 출력 전력 200 W 내지 240 W, 10 s on/ 10 s off 사이클로 15분 내지 25분 동안 수행할 수 있고, 소성은 대기하에서 550℃ 내지 650℃ 온도범위에서 5시간 내지 7시간 동안 수행할 수 있다. 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자는 실리카(SiO₂)와 산화칼슘(CaO)을 60:40 내지 95:5의 몰 비율로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "시멘트"란, 분말형 고체상 및 액상의 혼합으로 얻은 골 대체제로서 사용 가능한 페이스트의 경화체를 의미한다.

상기 시멘트의 "경화 또는 시멘테이션"은 실온 혹은 체온에서 인위적인 처리 없이 행해진 페이스트의 자발적 경화를 의미하며, 이때의 페이스트는 고체상과 액상을 혼합한 결과로 얻어진 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "인산칼슘 시멘트(CPC)"는 분말형 고체상이 인산칼슘 화합물 혹은 칼슘 및/또는 인산염 화합물의 혼합물로 구성되는 골시멘트를 의미한다.

상기 인산칼슘 골시멘트는 인산칼슘 입자들이 주성분인 분말과 인산염과 같은 경화를 촉진하는 물질을 함유한 수용액으로 구성되는 소재로, 시술 시 두 성분을 혼합하여 고점도의 액상 상태로 적용시키면 적용 부위에서 두 성분들의 화학 반응에 의해 인산칼슘 화합물이 침전되어 경화됨으로써, 손상된 뼈 및 뼈, 또는 뼈 및 임플란트 사이의 빈 공간을 채워주어 둘 사이를 고정하고 안정화시켜 주는 골 대체물질의 한 형태이다.

본 발명에서, 생체활성 유리 나노입자는 전체 분말의 중량을 기준으로 30 중량% 이상의 양으로 포함될 수 있고, 구체적으로 50 중량% 이상의 양으로 포함될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 100 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 생체활성 유리 나노입자 기반 시멘트는 전체 분말의 중량을 기준으로 30 중량% 미만일 경우에 비해 표면적이 현저히 증가하여 단백질 담지 및 이온 방출 능력이 향상되므로, 생체 내 이식 후 분해성이 증가하고, 이로 인해 뼈조직 재생을 더욱 촉진시킨다. 이러한 생체활성 유리 나노입자 기반 시멘트의 뼈조직 재생능은 전체 분말의 중량을 기준으로 생체활성 유리 나노입자의 중량이 증가할수록 촉진되며, 최대치는 100 중량%일 때이다.

본 발명에서, 상기 생체활성 유리 나노입자 기반의 나노시멘트 조성물의 분말 대 액상 비율(powder-to-liquid ratio: PL 비)이 구체적으로 0.1 내지 1 이하일 수 있고, 더욱 구체적으로는 0.3 내지 0.5 이하일 수 있다. PL 비가 2.0 이상인 기존의 CPC에 비해 PL비가 현저하게 감소한다. 이에 따라, 소량의 생체활성 유리 나노입자로 자가경화가 가능하다는 장점이 있고, 이로 인해 잔류 액상으로 인한 독성문제를 감소시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자의 기공 크기는 1 내지 10 nm일 수 있고, 구체적으로 6 내지 7 nm일 수 있다. 2 내지 3 nm의 작은 기공의 유리 나노입자는 Ca 함량에 관계없이 모두 경화되는 장점이 있으나, 6 내지 7 nm의 큰 기공의 유리 나노입자의 경우 작은 기공의 나노입자보다, 월등히 높은 성장인자 및 약물의 수용력으로 인해 뼈 조직 재생에 유리한 장점이 있다. 또한, 상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자의 평균 입자 크기는 구체적으로 100 내지 300 nm일 수 있다.

상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자의 Ca:Si의 몰비는 1:99 내지 30:70일 수 있으나, 구체적으로 10:90 내지 20:80의 몰비를 가질 수 있다. Ca의 함량이 감소할수록 경화 시간이 감소하는 장점이 있으나, Ca 비율이 10%보다 더 작아지는 경우, 경화된 나노시멘트에서 방출되는 칼슘이온과 실리카 이온의 양이 Ca:Si의 몰비가 10:90 내지 20:80인 경우에 비해 현저히 낮아, 골 재생 및 혈관 재생능이 떨어지는 단점이 발생한다. 또한, Ca 비율이 30%보다 더 증가하는 경우에는 나노입자형태의 분말이 만들어지지 않는다. 또한, 상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자의 표면적은 구체적으로 50 m²/g 내지 100 m²/g일 수 있다.

본 발명에 따른 나노시멘트의 액상은 DW, PBS, 2.5 wt% NaH₂PO₄, 5 wt% NaH₂PO₄, 2.5 wt% Na₂HPO₄ 또는 2.5 wt% Na₂HPO₄와 NaH₂PO₄의 1:1 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 메조다공성 생활성 유리 나노입자가 우수한 단백질 흡착 능력을 가지고 단백질 담지 및 전달이 가능하므로 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자에 추가로 단백질을 담지하여 단백질 전달체로서 나노시멘트 조성물을 사용할 수 있다.

본 발명의 생체활성 유리 나노입자 기반의 나노시멘트 조성물은 골형성 촉진용으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 '골 형성'이란 살아있는 골 모세포나 골 모세포 전 단계 세포를 이식하여 골조직을 만드는 것을 의미하고, '골 전도성'이란 골 결손 부위에 이식된 재료가 새로운 골 성장을 할 수 있게 하는 것을 의미하며, '골 유도성'은 이식된 표본 표면에서 신규한 골 형성을 시작할 수 있게 하는 것을 의미한다.

본 발명의 나노시멘트 조성물 제조용 키트에서, 상기 분말상, 액상 및 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 성분, 혼합비 등은 상기 나노시멘트 조성물에서 설명한 바와 동일하다.

상기 키트는 사용 직전에 액상에 분말상을 혼합하여 페이스트 형태로 나노시멘트 조성물을 제조한 후 원하는 시술 부위에 상기 페이스트를 주입하여 사용할 수 있다

상기 시술 시 주사기를 사용할 수 있다.

본 발명의 키트는 조직공학에서 뼈의 수리 및 재생을 위한 나노 복합 주사 시스템에 응용되어 골 치료, 골 증강, 골 재형성, 골 재생 및 골다공증 치료와 관련된 치과, 정형외과, 성형외과 및 신경외과 등에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 메조다공성 생활성 유리 나노입자가 우수한 단백질 흡착 능력을 가지고 단백질 담지 및 전달이 가능하므로 추가로 단백질을 담지하고 있는 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 키트에 사용할 수 있다.

다공성 BGn의 표면에, 다수의 약 수십 나노미터의 작은 입자(나노-섬)가 관찰되었다(빨간색 화살표, 도 8). 새로 형성된 나노-섬의 선택된 영역 전자 회절(SAED) 분석은 비정질 패턴을 나타냈다(도 9). TEM-EDS 분석을 통해, 새로운 나노-섬이 주로 Si, Ca, 및 O와 P의 소량의 분율로 구성된다는 것을 확인할 수 있다(도 10).

시멘트화된 BGn 입자는 초기 BGn 분말의 조성과는 다른 Si, Ca, 및 P의 조성을 나타내었으며, 이는 시멘트화 과정 중 BGn 성분의 용해로 인한 것일 수 있다. 초기 Si/Ca 원자 비율은 85/15로 계산되었으나, 시멘트화된 BGn의 Si/Ca 원자 비율은 88.6/11.1이었으며, 이를 통해, 시멘트화 과정 중 Si 보다 Ca가 더 많이 방출되었음을 알 수 있다. P의 적은 함량은 액체상태일 수 있다.

한편, 새로 형성된 나노 섬은 각각 81.3 %, 16.2 %, 2.6 %의 Si, Ca, P 함량을 나타내었다. 총체적으로 나노 섬은 Si, Ca, P로 구성된 유리상으로 간주된다. 경화되는 동안 액체상의 인산염과 함께 BGn 분말의 용해된 Si와 Ca는 BGn 분말에 많은 초미세 크기의 비정질상 형태로 침전될 수 있다. 새롭게 형성된 나노 섬의 특성을 보다 자세히 조사하였다. NaH₂PO₄의 액체 및 DW를 사용한 나노시멘트 샘플의 XRD 패턴은 초기 BGn 분말 (도 8의 비결정 패턴)과 유사한 경향을 나타내었지만, 보다 면밀한 조사에 의해 피크 위치 및 광폭의 약간의 차이(2θ=20-30°)가 나타났고(도 11), 비결정질상은 구조상의 차이가 있을 수 있음을 예측할 수 있다. FT-IR 스펙트럼은 시멘트 결합 전후의 두 샘플 모두에 대해 유사한 패턴을 나타냈으나, Si-O-Si, P-O-P 및 PO₄ ^3-에 각각 할당 된 나노시멘트 샘플(도 12)에서만 약 550, 870 및 960 cm^-1의 일부 추가 밴드가 나타났다. 또한, BGn과 2.5% NaH₂PO₄로 경화한 나노시멘트의 ²⁹Si MAS NMR의 스펙트럼 비교 결과를 통해 실시예 2의 Q₄ 강도는 시멘트 결합 후에 감소하고, Q₃ 강도는 약간 증가함을 알 수 있는데, 이는 경화된 유리상이 실리케이트 네트워크의 더 많은 파괴된 산소 결합을 보유할 수 있음을 알 수 있다.

TEM, EDS, XRD, FT-IR, XPS 및 NMR 데이터를 포함하여 나노시멘트의 특성에 기초하여, 도 14에 개략적으로 도시된 바와 같이 시멘테이션 메커니즘이 제안된다. 수성 액체에서 나노 입자 (BGn)는 Ca 및 Si 이온 (가능한 한 Ca보다 Si)을 방출하여 액체의 과포화 수준에 도달하여 이들 이온의 재침전을 초래한다. 인산 이온도 이 과정에 참여할 수 있다. 따라서, 재침전된 생성물은 입자를 연결할 수 있는 비결정성 나노-섬 기반의 Si-Ca-(P)을 형성하는 것으로 확인되었다. 'Glass II'은 구성 및 구조 측면에서 초기의 BGn('Glass I')과 동일하지 않다(도 14). 재침전된 'Glass II'는 나노 입자를 네트워크에 결합시켜 경화시킬 수 있다. 따라서, 용액의 pH 및 이온 강도, 유리 조성 (용해 속도 및 Ca/Si 함량) 등의 조건은 방출된 이온의 양 (과포화 정도 및 재침전 정도)을 결정할 때 매우 중요하다. 재침전된 'Glass II'가 결정질이 아닌 형태로 형성되는 이유는 실리콘, 칼슘 및 산소 원자의 임의의 네트워크로 이끄는 신속한 재침전 과정 때문에 동력학적으로 너무 짧기 때문에 정렬된 결정체를 형성할 수 없는 것으로 판단된다.

나노시멘트 내의 아파타이트 나노 결정질의 크기는 CPC보다 훨씬 작게 나타나는데, 이는 BGn 입자가 인회석 결정화를 위해 더 많은 핵 형성 사이트를 제공하여 추가 결정 성장을 방해하여 결과적으로 SBF에 더 작은 나노 결정을 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한, 나노 결정 크기의 감소로 인해, 나노시멘트는 CPC에 비해 현저히 증가된 표면적을 나타낸다. 종래의 시멘트에 비해 나노시멘트의 표면적이 상당히 증가한 것은 생물학적 분자와의 가능한 상호 작용 가능성을 의미한다. 사실, SBF에서 아파타이트의 형성은 BGn의 나노 입자 형태에서 잘 관찰되었으며, 따라서 나노시멘트에 나타난 인회석 형성 또한 유사하게 추론된다. 그러나 나노시멘트 샘플의 방해석 형성은 다소 흥미롭다. 방해석(calcite)은 또한 유망한 뼈 재생 물질로 간주되며, 인회석 형성의 전구체 역할을 하는 것으로 보고되었다. 현재의 BGn 나노시멘트에서 방해석 형성은 'Glass I'과 다른 조성 및 용해/재침강 메커니즘을 갖는 'Glass II'의 역할에 기인할 수 있다. 이와 관련하여 앞으로 더 많은 조사가 필요하다.

Si 이온에 관해서는, 이전의 연구들은 혈관 신생 및 조골 세포 분화의 자극을 포함하는 중요한 생물학적 효과를 입증하였으며, SBF에서의 근본적인 아파타이트 형성, 향상된 단백질 흡착 능력 및 이온의 방출과 같은 나노시멘트의 성질은 세포와의 생물학적 상호 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지며, 혈관 신생 및 골 재생에 유리하다. 특히, Si 이온 방출이 전구 혈관 신생에 중요한 역할을 할 수 있음을 의미한다.

본 발명의 나노시멘트는 분말 대 액체 비율이 0.4 내지 0.5로 나노 분말과 수용액이 반응하여 경화될 수 있으며, 기존의 인산 칼슘 시멘트 CPC의 경우 2.0 내지 3.0인 것과는 대조적이다. 나노 분말 유래의 나노시멘트는 기존 CPC보다 약 9배 증가한 표면적을 나타내었다. 모의 체액에 나노시멘트를 담그면, 55 nm인 기존 CPC에 비해 초미세한 크기를 갖는 10 nm의 인회석 나노 결정을 생성할 수 있어, 초미세 나노시멘트는 기존 CPC보다 160배 가까이 높은 상당한 수준의 단백질 분자(특히 양전하 단백질)를 흡착할 수 있다. 또한, 나노시멘트는 Si 및 Ca 이온을 2주 동안 연속적으로 방출하였다. Si 방출은 나노시멘트에서 유일했으나 Ca 방출은 기존 CPC에서 관찰된 것과 비슷한 범위였다. 이온 방출은 연구된 세포(rMSCs 및 HUVECs)의 반응을 상당히 자극하였다. RMSCs의 생존력과 골형성은 나노시멘트 이온 추출물에 의해 상당히 향상되었다. 또한, HUVECs의 체외 관형 네트워크는 나노시멘트 이온 추출물에 의해 향상되었다. CAM 모델에서의 생체 내 신생 혈관 형성은 기존의 CPC 비교예와 비교하여 나노시멘트 삽입물로 인해 현저히 높았으며, 이는 Si 이온 방출이 전구 혈관 신생에 중요한 역할을 할 수 있음을 의미한다. 또한, 결함이 있는 쥐의 두개골 뼈에 이식된 나노시멘트의 초기 뼈 형성 반응은 우수한 골전도 및 골기질 형성(bone matrix formation)과 함께 골유도의 징후를 나타내었다. 즉 본 발명의 나노시멘트는 빠른 시간 내에 경화가 가능하며 우수한 골형성 촉진능을 가져 시술 후 빠른 골 접합, 골재생을 유도할 수 있는 특징을 갖는다.

본 발명에 따른 생체활성 유리 나노입자 시멘트 조성물은 시멘트의 표면적이 현저하게 높아 단백질 담지 및 전달 능력이 상당히 증가하고, 생체 내 이식 후 분해성이 증가되고 이온 방출이 향상되어 생체 내에 원하는 부위에 안전하고 효과적으로 뼈의 재생속도를 촉진시킬 수 있으므로 골 충진제 및 골 대체제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 큰 기공의 15% Ca의 BGn의 나노입자의 모폴로지를 분석결과를 나타내는 것으로, FE-SEM 및 TEM 이미지이다.
도 2는 큰 기공 및 작은 기공 BGn의 상대적(P/P₀) 압력에 대한 N₂ 흡착/탈착 곡선이다.
도 3은 큰 기공 및 작은 기공의 0, 5, 15 및 25% Ca의 BGn 각각에 대하여 BJH 방법에 의해 측정된 기공 크기, 표면적, 기공 부피 및 ξ전위의 결과이다.
도 4는 시간에 따라 BGn 분말이 시멘트가 되는 과정을 도식적으로 나타낸 것이며, 시멘트의 마이크로 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 NaH₂PO₄ 액체를 사용한 15% Ca BGn의 다양한 L/P비에 따른 시멘트 경화 시간의 측정 결과이다.
도 6은 PL비가 0.4인 큰 기공의 15% Ca BGn의 다양한 액상의 종류에 따른 시멘트 경화 시간의 측정 결과이다.
도 7은 2.5% NaH₂PO₄의 액상을 사용한 PL 비가 0.4인 큰 기공의 15% Ca BGn의 다양한 Ca 농도에 따른 시멘트 경화 시간의 측정 결과이다.
도 8은 2.5% NaH₂PO₄의 액상을 사용한 큰 기공의 15% Ca BGn의 표면에 나노-섬이 나타난 TEM 이미지이다.
도 9는 나노-섬의 비정질성 패턴을 나타내는 SAED 분석 결과이다.
도 10은 나노-섬의 구성을 나타내는 TEM-EDS 분석 결과와 경화 전 BGn, 나노시멘트 및 나노-섬의 조성 원소의 wt%를 정리한 결과이다.
도 11은 BGn과 2.5% NaH₂PO₄로 경화한 나노시멘트의 XRD 패턴으로 2θ에 따른 강도를 비교한 결과이다.
도 12는 BGn과 2.5% NaH₂PO₄로 경화한 나노시멘트의 FT-IR 스펙트럼 비교 결과이다.
도 13은 BGn과 2.5% NaH₂PO₄로 경화한 나노시멘트의 ²⁹Si MAS NMR의 스펙트럼 비교 결과이다.
도 14는 시멘테이션 메커니즘을 도식화한 것이다.
도 15는 SBF 용액에 침지시키는 동안 상변화를 나타낸 것으로, 침지 시간에 따른 최대 강도를 측정한 XRD 결과(A1), 나노시멘트와 CPC의 아파타이트의 결정 크기 비교(A2), 7일째의 SEM 이미지로 SBF에서 아파타이트 나노 결정 형성으로 인한 시멘트 샘플의 형태학적 변화(A3), 비표면적(SSA)의 비교 결과이다.
도 16은 다양한 초기농도에 따라 Cyt C를 흡착한 나노시멘트와 CPC의 비교(B1), 이의 흡착량을 정량화하여 나타낸 그래프이다(B2).
도 17은 rMSC에서 나노시멘트의 이온 방출을 ICP-AES로 분석한 결과이다.
도 18은 세포 연구를 위해 사용한 다양하게 희석한 농도의 추출물을 정리한 결과이다.
도 19는 CCK 분석에 의해 측정한 rMSC 세포 생존율을 나타낸 결과이다.
도 20은 3일과 6일에 골형성 유전자(Col 1, ALP, 및 OCN)의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과이다.
도 21은 14일까지 측정된 dsDNA 함량으로 표준화한 후 ALP 활성을 측정한 결과이다.
도 22는 나노시멘트의 다양한 이온 희석액으로 처리한 HUVEC의 세포 생존력을 측정한 결과이다.
도 23은 다양한 이온 희석액으로 처리한 Matrigel 코팅 접시에 세포의 관형이 형성된 결과이다
도 24는 다양한 이온 희석액 처리로 형성된 노드 수, 세관 길이 및 측정된 원형 수를 측정한 결과이다.
도 25는 CAM 모델에서 평가된 나노시멘트 및 CPC에 의해 유발된 생체내 신생-혈관 이미지를 나타낸 결과이다.
도 26은 나노시멘트 및 CPC에 의해 유발된 신생-혈관 지표인 총 접합, 혈관 크기 및 길이를 측정한 결과이다.
도 27은 나노시멘트 및 CPC 샘플을 이식한 후 0주 및 6주에 촬영한 μ-CT 영상으로 결함 내 새롭게 형성된 골 영역을 나타내었고, 이를 부피 수치로 정량화한 결과이다.
도 28은 H&E 및 MT 염색에 의한 조직학적 분석으로, 결함 내에 새롭게 형성된 뼈를 집합적으로 보여주는 결과이다.
도 29는 면역 조직 화학 염색을 통해 새로 형성된 골에서 OCN-양성 성숙 골아 세포 및 골 세포를 검출한 결과이다.

이하，본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐，실시예 에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: BGn의 제조

(1) 실시예 1-1: 큰 기공을 갖는 BGn의 제조

CTAB((hexadecyl-trimethylammonium bromide: CTAB) 1 g을 150 mL의 물, 2 mL의 NH₄OH, 40 mL의 에틸 에테르, 20 mL의 에탄올 및 Ca(NO₃)₂.4H₂O로 구성된 용액에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 격렬하게 교반한 후, 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate: TEOS)를 혼합물에 신속히 적가하였다. 생성된 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 후에, 10000 rpm에서 원심 분리하여 백색 침전 분말을 수득하였으며, 순수한 물과 에탄올로 완전히 세척하였다. 공기 중에서 60℃에서 24 시간 동안 건조시킨 다음, 550℃에서 10 시간 동안 하소하여 잔류 CTAB를 제거하였다.

상기와 같은 방법으로, Ca:Si의 비율을 몰 기준으로 5:95, 15:85, 또는 25:75로 변화하여 생체활성 유리 나노입자(BGn)을 제조하였다.

(2) 실시예 1-2: 작은 기공을 갖는 BGn의 제조

40 mL의 에틸 에테르 대신에 40 mL의 2-에톡시 에탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 (1)에서와 동일한 방법으로 BGn을 제조하였다.

실험예 1: 나노시멘트의 모폴로지 및 화학적 특성 분석

주사 전자 현미경(SEM; Mira II LMH, Tescan)과 투과 전자 현미경(TEM; JEM-3010, JEOL)을 이용하여 상기 실시예 1-1 및 1-2의 BGn의 모폴로지 및 나노구조를 조사하였다. 실시예 1-1 및 1-2의 원자 조성을 TEM에 부착된 에너지 분산 분광기(EDS)로 분석하였다. 실시예 1-1 및 1-2를 분말 X-선 회절기(XRD, Rigaku, Ultima IV, Jpan)를 사용하여 분석하였다. 40 mA 및 40 kV에서 Cu Kα 선을 사용하여 X-선을 발생시켰으며, 0.02°의 단계 크기와 2.0°/min의 스캔 속도로 데이터를 얻었다. GladiATR 다이아몬드 크리스탈 액세서리(PIKE Technologies)를 사용하여 감소된 총 반사율-푸리에 변환 적외선 분광기(reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy(ATR-FTIR; Varian 640-IR))로 화학 결합구조를 분석하였다. 레이저 도플러 전기영동(Laser Doppler electrophoresis: LDE) 기기 (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK)를 사용하여 제타(ξ) 전위 측정에 의해 표면도 특성을 분석하였다. ξ-전위는 DW (25℃, pH 7, 20 V/cm)에서 측정하였다. 실시예 1-1 및 1-2의 메조 기공의 특성은 N₂ 흡착/탈착 곡선에 기초하여 측정하였다. Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 따라 비표면적 및 세공 용적을 계산하였고, Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의해 세공 크기 분포를 결정하였다. 나노 시멘트 샘플의 표면적도 BET 방법으로 조사하였다. 표면 화학은 고해상도 X-선 광전자 분광법 (HR-XPS)으로 분석하였다. 단색 Al Kα X-선 (hn = 1486.6 eV)을 120W에서 작동시켰다(MultiLab ESCA2000).

상기 실시예 1의 (1) 및 (2)에서 제조된 BGn의 FE-SEM 이미지를 통해 수백 나노미터 크기의 구형 입자의 생성과 거친 다공성 형태를 확인하였고, TEM 이미지를 통해 나노입자의 메조다공성을 확인하였다(도 1). 또한, TEM 이미지를 통해, 실시예 1-1의 입자 크기는 약 200-300 nm 인 반면, 실시예 1-2의 입자 크기는 약 100-200 nm임을 알 수 있었고, 입자 크기는 BGn의 Ca 함량이 증가함에 따라 약간 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로, 실시예 1-1 및 1-2의 BGn의 N₂ 흡착/탈착 곡선은 상대적(P/P₀) 압력에 대한 흡착된 부피의 히스테리시스 루프(이력 곡선)를 나타내었으며, 이를 통해 실시예 1-1 및 1-2가 다공성 나노 입자임을 확인할 수 있었다(도 2).

BJH 방법에 의해 계산된 실시예 1-1 및 1-2의 표면적, 세공 용적 및 세공 직경 값을 도 3에 나타내었다. 실시예 1-1의 기공 크기는 약 6 내지 7 nm인 반면, 실시예 1-2의 기공 크기는 2 내지 3 nm으로 측정되었다. 실시예 1-1의 나노입자의 비표면적(specific surface area)은 610 내지 670 m²/g이며, 실시예 1-2의 나노입자의 비표면적은 550 내지 600 m²/g이었고, 실시예 1-1의 나노 입자의 기공 부피는 0.54 내지 0.58 cm³/g이었고, 실시예 1-2의 나노입자의 기공 부피는 0.35 내지 0.45 cm³/g으로 측정되었다. 실시예 1-1 및 1-2의 ξ-전위 또한 조사되었으며, 유사한 음의 값(-10 내지 11 mV)을 나타내었다.

실시예 2: BGn의 경화(cementation)

상기 실시예 1에서 제조된 큰 기공의 실시예 1-1 중에서 15%의 Ca의 BGn을 수성용매와 나노입자 분말을 혼합하여 경화하였다. DW, PBS, 2.5 wt% 또는 5 wt% NaH₂PO₄, 2.5 wt% Na₂HPO₄, 및 2.5 wt% Na₂HPO₄와 NaH₂PO₄의 1:1 혼합물을 용매로 사용하였다. BGn 파우더를 액체와 혼합한 후, 페이스트를 원통형 틀(직경 6 mm x 높이 3 mm)에 넣고, 수화시키기 위해 상대습도 100%인 37℃에서 보관하여 나노시멘트를 제조하였다.

비교예 1: 인산 칼슘 시멘트(CPC)의 제조

비교 목적을 위해, α-TCP (알파-트리칼슘 포스페이트) 분말을 대표적인 시멘트 제조용 분말로 사용하였다. α-TCP를 2.5 wt% NaH₂PO₄ 액체와 2.5의 PL 비율로 혼합한 다음, 상기 실시예 2와 동일한 과정으로 경화하여 제조하였다.

실험예 2: 경화 시간 측정

경화 반응을 조사하기 위한 실시예 1의 분말-액체 (PL) 비율을 0.3, 0.4, 및 0.5로 변화시켜 실시예 2와 동일한 과정으로 경화하여 제조하였다. 주어진 PL 비율에서 BGn 파우더를 액체와 혼합한 후, 페이스트를 원통형 틀(직경 6 mm x 높이 3 mm)에 넣고, 수화시키기 위해 상대습도 100%인 37℃에서 보관하여 나노시멘트를 제조하였다.

실시예 2 및 비교예 1의 시멘트화 시간은 Gilmore 니들법(직경 2.13 mm 및 중량 113.4 g)을 사용하여 ASTM-C266-08 표준에 따라 결정하였다. 경화 시간은 분말이 액상과 혼합된 시간부터 2.13 mm 직경 및 113.4 g 중량의 니들이 시멘트 페이스트의 표면 상에 임의의 가시적인 흔적을 남기지 않고 로딩될 수 있는 시간까지의 시간 간격으로 간주하였다. 각 시멘트 조성물에 대해 3개의 개별적인 샘플을 취하여 PL 비, 액체의 종류, BGn 조성 및 기공 크기에 따른 경화 시간을 측정하였다.

PL 비율이 0.3에서 0.5로 증가함에 따라, NaH₂PO₄ 액체를 사용한 실시예 2의 경화 시간은 실질적으로 100 분에서 30 분으로 감소하는 것으로 측정되었다(도 5).

PL 비는 0.4이고, 실시예 1-1 중 15% Ca의 BGn에 대하여 DW, PBS, 2.5% Na₂HPO₄, 2.5% NaH₂PO₄, 5% NaH₂PO₄, 및 2.5% Na₂HPO₄+2.5% NaH₂PO₄의 다양한 액체에 따른 경화 시간을 분석하였다. 나노분말은 DW에서 80분, PBS에서 61분의 경화시간이 측정되었다. 또한, 2.5wt% Na₂HPO₄의 경화 시간 67분이었으나, 5wt% NaH₂PO₄에서는 33분으로 현저히 감소하였다. 이 결과를 통하여, 나노 분말의 경화 시간은 산도 및 이온 강도에 의존하여 산도 및/또는 이온 강도가 증가함에 따라 경화 시간이 단축되었음을 알 수 있었다(도 6). 또한, 히드록시아파타이트 형성이 경화 속도의 증가와 관련되어 있을 것으로 예측할 수 있으며, 이는 메조다공성 특성을 갖는 mBGn이 액상으로부터 여분의 물을 흡수 및/또는 흡착할 수 있기 때문으로 판단된다.

또한, BGn 조성 및 기공 크기 (실시예 1-1 및 1-2에 대한 0, 5, 15 및 25% Ca의 BGn)가 경화 시간에 미치는 영향을 조사하였다(도 7). 작은 기공의 모든 BGn 나노 분말은 경화되었으며, 5% Ca에서 47분 < 15% Ca에서 54분 < 25% Ca에서 70분으로 측정되었다. 그러나 큰 기공의 BGn의 경우 15% 및 25% Ca 조성물만 경화되었고, 15% Ca (41분)의 경화 시간은 25% Ca (75분)보다 짧은 것으로 측정되었다. 즉, 경화 시간은 Ca 함량이 증가함에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다.

실험예 3: SBF 용액에서의 아파타이트 형성 능력 확인

뼈 복구를 위해 개발된 재료의 무세포 생체 외 뼈-생체 활성을 분석하기 위해, SBF 용액에서의 아파타이트 형성 능력을 확인하였다. 실시예 2의 체내 아파타이트 형성은 pH 7.4와 37℃에서 모의 체액에서 관찰되었다. 실시예 2 및 비교예 1을 최대 7일 동안 SBF 용액에 침지시키고 소정의 시점에서 세척하고 형태 변화를 SEM으로 관찰하였다. 상 변화와 화학 결합 구조는 XRD와 FTIR에 의해 각각 조사되었다.

XRD로 분석한 상은 2θ= 32°(도 15의 A1)의 결정질 피크를 나타내며, 이는 아파타이트의 주요 피크이다. 최대 강도는 침지 시간이 증가함에 따라 증가하였다. 특히, 방해석(CaCO₃)에 할당된 2θ= 30°에서 추가적인 결정 피크가 관찰되었다.

Scherrer의 방정식을 사용하여 XRD 데이터로부터 측정된 SBF에 잠긴 실시예 2의 나노 결정 크기는 나노시멘트의 경우 7 내지 10 nm인 반면, 비교예 1의 경우 45 내지 55 nm(도 15의 A2)로 큰 차이를 나타내었다. 실시예 2 내의 아파타이트 나노 결정질의 크기는 비교예 1보다 훨씬 작게 나타나는데, 이는 BGn 입자가 인회석 결정화를 위해 더 많은 핵 형성 사이트를 제공하여 추가 결정 성장을 방해하여 결과적으로 SBF에 더 작은 나노 결정을 형성할 수 있다는 것을 의미한다.

7일째의 SEM 이미지는 SBF에서 아파타이트 나노 결정 형성으로 인한 시멘트 샘플의 형태학적 변화를 나타내었다(도 15의 A3). 이러한, 나노 결정 크기의 감소로 인해, 실시예 2는 비교예 1에 비해 현저히 증가된 표면적을 나타내었다(도 15의 A4). SBF 담금 7일 동안 기록된 표면적은 실시예 2의 경우 78.7 m²/g이고, 비교예 1의 경우 9.5 m²/g으로 측정되었다.

실험예 4: 방출된 이온에 대한 분석

실시예 2로부터의 이온(Ca, Si 및 포스페이트)의 방출을 측정하였다. 디스크 모양(직경 6 mm x 두께 3 mm)의 실시예 2 및 비교예 1을 10ml Tris-HCl (pH 7.4, 37℃)로 완충된 10 ml의 탈 이온수에 담근 후, 37℃에서 14일 동안 배양액을 신선하게 하면서 배양하였다. 이온 방출 배양액은 15000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 수집되었으며, 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광법 (ICPAES; OPTIMA 4300 DV, Perkin-Elmer, USA)으로 분석하였다.

ICP-AES에 의한 분석을 통해, rMSC에서 Si와 Ca 이온이 실시예 2로부터 방출되었음을 확인할 수 있었으며(도 17), 이는 실시예 2의 조성이 비교예 1과 다르기 때문임을 나타내는 것이다.

또한, 실시예 2에서 Si 이온은 14일까지 시간에 따라 서서히 방출되지만, Ca 이온은 초기 기간에 다소 급속하게 방출된 다음 실질적으로 느린 속도로 방출된다는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 2에서의 Si 및 Ca 이온의 방출량은 14일 동안 각각 8.2 mM 및 4.8 mM으로 측정되었다. 점진적 방출 속도 또는 일일 속도(incremental release rate)는 Si 이온의 경우 방출이 매우 일정하며 (약 0.6 mM / 일 = 21.6 ppm / 일), Ca 이온의 경우 방출 속도는 시간이 지남에 따라 감소됨을 확인하였다. 비교예 1의 경우, 14일 동안 Ca 및 P 이온의 방출은 각각 3.0 mM 및 5.3 mM으로 측정되었다. 즉, 실시예 2와 비교예 1에서의 Ca 이온의 방출은 유사하지만, 비교예 1과 대조적으로, 실시예 2에서는 Si 이온을 방출하고 방출 속도는 14일의 시험 기간 동안 거의 일정한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5: 단백질 흡착 분석

실시예 2 및 비교예 1 상에 흡착된 단백질의 흡착량을 측정하였다(도 16). 모델 단백질로는 사이토 크롬 C (Cyt C), 소 혈청 알부민(BSA) 및 리소자임이 사용되었다. 중성의 pH 7.4에서 Cyt C (Mw 12 kDa)와 리소자임 (Mw 14.3 kDa)은 양전하를 띠며(등전점은 각각 10.2와 11.3), BSA (Mw 14.5 kDa)는 음전하를 나타낸다(등전점 4.7). 37 ℃에서 각각의 모델 단백질을 0.125, 0.250, 0.50, 1, 2, 4 mg/ml DW로 함유한 용액에 직경 6 mm, 높이 3 mm 크기의 디스크 형태의 실시예를 침지시켰다. 단백질의 초기 농도를 변화시키면서, 침지 2시간 동안 흡착된 단백질의 양은 UV-Vis 분광계(Libra S22, Biochrom, UK)를 사용하여 측정하였다. 흡광도는 Cyt C, BSA, 리소자임 각각 λ= 408, 278, 282 nm에서 기록하였으며, 단백질 흡착량은 각 단백질 용액의 표준 곡선으로부터 계산하였다.

실시예 2에서 흡착된 Cyt C를 나타내는 진한 적색 변화는 비교예 1에서 색상 변화와 차이를 나타내었다(도 16의 B1). 실시예 2의 경우 흡착된 양은 초기 Cyt C 농도가 증가함에 따라 거의 선형으로 증가하였다(도 16의 B2). 실시예 2는 125 ㎍/ml에서 대략 77.9 ㎍을, 2mg/ml에서 대략 1.1 mg의 Cyt C 단백질을 흡착하는데, 이것은 초기 농도의 50 내지 60% 흡착에 해당한다(도 16의 B2). 이와 대조적으로 비교예 1의 경우, 2 mg/ml에서도 97.7 ㎍ 이하의 Cyt C가 흡착되며, 이는 초기 농도의 3%에 해당하였다. 즉, 실시예 2는 비교예 1에 비해 약 11배의 Cyt C를 흡착할 수 있음을 확인할 수 있었고, 이는 실시예 2의 현저히 높은 표면적으로 인한 것이다. SBF-침지된 시료를 Cyt C에서도 시험하였을 때, 흡착 수준은 실시예 2와 유사함이 관찰되었다.

상기와 같은 방법으로, 리소자임 흡착도 분석하였다. 흡착 경향은 Cyt C에서 관찰된 것과 유사하였다. 초기 농도가 증가함에 따라 증가되는 흡착량뿐만 아니라 비교예 1(82.3 mg)보다 실시예 2(207.6 mg)에 대해 상당히 높은 흡착량을 나타내었다.

그러나 실시예 2에 흡착된 BSA의 흡착량은 매우 낮아 3.7 mg 밖에 흡착되지 않았으며, 이는 비교예 1의 경우와 유사하게 나타났다. 결론적으로, 실시예 2에 대한 단백질 흡착량은 Cyt C > 리소자임 >> BSA의 순서이고, Cyt C와 리소자임에 대해서만 실시예 2는 비교예 1과 유의한 차이가 있는 것을 확인하였다.

이와 관련하여, 실리카의 등전점은 2.5로, 매우 음전하를 띠는 나노시멘트 표면과 충전 - 전하 상호 작용 또는 반발이 가능해야 하는 것으로 판단된다. 다만, 두 단백질 모두 등전점(Cyt C의 경우 10.2, 리소자임의 경우 11.3)과 분자량 (Cyt C의 경우 12 kDa, 리소자임의 경우 14.3 kDa)이 유사하나, Cyt C의 실시예 2에 대한 흡착력은 리소자임보다 훨씬 높게 측정되었다. 이는, 실시예 2의 표면에 대한 단백질 친화성 또한 이러한 차이에 기여할 것으로 판단된다. 결론적으로, 본 발명의 실시예 2의 높은 표면적으로 인해 비교예 1보다 실시예 2가 단백질과 더 상호 작용한다는 것을 알 수 있었다.

실험예 6: 세포 생존력, 혈관 형성 및 골형성에 대한 평가

세포 생존 능력 평가

혈관 신생 및 골 형성에 사용되며, 골 형성에 중요한 HUVEC 및 rMSC의 두가지 유형의 세포가 사용되었다. 특히, 세포의 생존력과 기능적 활성에 영향을 줄 수 있는 나노시멘트에서 방출되는 이온을 분석하기 위해, 이온 추출물이 세포를 치료하는데 사용되는 간접 배양 분석이 사용되었다. 각각의 시멘트 샘플 (디스크, 직경 6 mm x 높이 3 mm)을 10ml의 세포 배양 배지 (α-MEM 또는 HUVEC 세포 배지)에 담그고 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 추출물을 10분간 원심분리 (15,000 rpm)하고 상등액을 부드럽게 모아 남은 찌꺼기를 제거한 다음 0.22 ㎛ 필터(Millipore)로 멸균시켰다. Ca 및 Si 이온 추출물의 농도는 ICP-AES 분석에 기초하여 계산하였다. 배양 배지(1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 및 1/128)로 희석 한 일련의 농도의 추출물을 세포 배양 연구에 사용하였다(도 18). MSCs 또는 HUVECs를 96-웰 플레이트의 각 웰에 1 x 10⁴ 세포/웰로 접종하였다. 세포 부착을 가능하게 하는 24시간 배양 후, 배양 배지를 희석된 추출물로 대체하였다. 세포 계수 키트 분석 (CCK-8; 일본 동진)을 수행하여 세포 생존 능력을 조사하였다. 1일 및 2일 후, 10% CCK 용액을 각 배양 배지에 첨가하고, 3시간 동안 배양하였다. 반응액을 배양 웰에 옮기고, 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Devices)를 사용하여 파장 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각 Si 및 Ca 이온에 대해 38.9 ppm 내지 80.55 ppm에서 시작하여 배양 배지에서 일련의 희석액을 1일 및 2일 동안 rMSC로 먼저 처리하고 세포 생존력을 CCK 분석법으로 측정하였다(도 19).

세포 생존 능력의 자극은 실시예 2의 추출물의 경우만큼 높지는 않지만 비교예 1의 추출물에서도 확인할 수 있었다. 세포 생존율은 비교예 1과 비교하여 특히 2일째 (1/4 내지 1/128)의 특정 희석(1/4 내지 1/128)에서 유의하게 향상되어 실시예 2에서 방출된 이온의 rMSCs 생존 능력 효과를 알 수 있었다(도 19).

또한, 실시예 2의 추출물을 처리하여 HUVEC를 배양하고 시험관내 세포 생존력을 평가하였다. HUVEC는 비교예 1과 비교할만한 수준의 좋은 생존력을 나타내었다(도 22).

골 형성 평가

뼈 골수에서 유래된 MSC를 골 형성 연구에 사용하였다. rMSCs의 골 형성을 검사하기 위해 실시예 2의 대표적인 이온 추출물 (1/1, 1/4, 1/8)로 치료했다. 3일 및 6일에 콜라겐 1형(Col I), 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase: ALP), 오스테오칼신(osteocalcin: OCN)의 골아세포와 관련된 유전자의 발현을 RT-PCR로 분석하였다(도 20). 동물에 대한 모든 실험 과정은 단국대학교의 동물 실험 윤리위원회에 의해 확립된 동물 관리 및 사용에 대한 가이드라인에 따라 검사되고 평가받았다. 수컷 성인 Sprague-Dawley 래트의 근위 및 원위 선단 대퇴골과 경골을 잘라내고 골수 조직을 PBS 중의 I형 콜라게나제 용액으로 세척하였다. 비부착성 조혈 세포를 배지 교환 중에 제거하고 3번 관에서의 세포를 추가 실험에 사용하였다. 50 μg/ml의 아스코르브산나트륨(sodium ascorbate), 10 mM의 β-글리세롤인산(β-glycerol phosphate), 100 nM의 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 유도 인자를 골 형성 자극에 사용하였다. 4번 관에서 인간의 제대 정맥 내피 세포(HUVECs, cat # PCS-100-010, ATCC)는 혈관 신생 분석에 사용되었다. HUVEC는 내피 세포 성장 키트-VEGF (cat # PCS-100-041, ATCC)가 보충된 혈관 세포 기저 배지(cat # PCS-100-030, ATCC)에서 유지되었다. 세포를 37℃, 5%의 CO₂로 유지한 인큐베이터에서 배양한 다음 3일마다 배양액을 신선하게 하였다.

Col I의 경우, 실시예 2의 이온 추출물(특히 1/4과 1/8)은 3일째에 유전자 발현을 유의하게 자극하였고, 6일째의 자극이 3일째보다 약한 것으로 나타났다. OCN의 경우 실시예 2의 이온 추출물(특히 1/4)도 유전자 발현을 증가시켰다. 나노시멘트 추출물로 처리한 rMSC의 ALP 활성을 dsDNA 함량으로 표준화한 후 측정하였다(도 21). ALP의 경우, 유전자 발현은 이온 추출물에 의해 상향 조절되었고, 그 경향은 Col I의 경향과 다소 차이가 있었다. 1/1 추출물이 가장 높은 자극을 나타내었고, 6일째는 3일째보다 더 많은 자극을 나타내었다. 비교예 1의 배지에서 ALP 활성은 3-7 일부터 현저하게 증가하고 14 일째에 포화되었으며, 이는 골 형성 배지를 가진 MSC 배양에서 잘 알려진 현상이다. 나노시멘트 추출물로 처리했을 때, 특히 7 일에 ALP 활성의 증가가 비교예 1보다 유의하게 나타났으나 시간에 따른 ALP 경향은 비교예 1과 유사했다.

즉, Col I와 OCN 유전자는 비교예 1보다 실시예 2에 대해 상당히 높은 수준으로 상향 조절된 것을 알 수 있었으며, 이는 나노시멘트 추출물이 rMSCs 골 형성에 더 많은 자극 효과를 나타냄을 보여주는 것이다.

CAM 모델에서의 혈관 형성 평가

친-혈관 신생 효과는 CAM 모델에 의해 평가하였다(도 25 및 26). 수정된 달걀을 가습기 배양기에서 37℃에서 3일간 보관하여 배아를 키웠다. 약 3ml의 알부민을 바늘로 제거한 후 4일 동안 배양하여 안정화시켰다. 7일째에, 각 샘플을 CAM(chorioallantoic membrane) 표면에 놓았다. 이식 4일 후, 배아를 희생시키고, 샘플이 박힌 CAM 복합체를 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정시키고, 사진을 찍고 혈관 확장 프로그램으로 분석하였다.

총 접합, 혈관 크기 및 길이(면적)를 포함한 주요 혈관 신생 지표를 계산하였다(도 26). 대표적인 혈관 이미지를 통하여, 실시예 2에서 더 많은 혈관이 형성된 것을 확인할 수 있었다(도 25). 또한, 실시예 2는 비교예 1보다 유의하게 높은 총 접합부, 혈관 크기 및 혈관 길이를 나타내었다. 즉, CAM 분석에 기반하여 실시예 2는 생체 내 친-혈관 생성(pro-angiogenesis) 효과에서 현저히 높은 것으로 나타났고, 비교예 1과 명백한 차이를 나타내었다. 실시예 2와 비교예 1에서 방출된 이온을 고려할 때, 유일한 차이점은 Si 이온으로, 이는 혈관 신생 자극에 핵심적인 역할을 하는 것으로 판단할 수 있다.

다음으로, 세포의 관형 형성을 Matrigel의 지지로 분석하였다. Matrigel의 세포는 모든 조건에서 3 내지 6시간 동안 세관과 같은 구조를 형성하였다(도 23). 노드 수, 세관 길이 및 측정된 원형 수는 실시예 2의 추출물의 효과를 명확하게 나타내었고(도 24), 나노시멘트의 친-혈관 생성(pro-angiogenic) 효과를 입증하였다.

생체 내 조직적합성 및 초기 혈관 신생 능력 평가

10주된 수컷 Sprague-Dawley 래트의 피하 조직에서 실시예 2의 생체 내 조직 적합성 및 혈관 신생 가능성을 평가하였다. 동물에 대한 모든 실험 과정은 단국대학교의 동물 실험 윤리위원회에 의해 확립된 동물 관리 및 사용에 대한 가이드라인에 따라 검사되고 평가받았다. 래트를 케타민(80 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)의 근육 내 주사로 마취시켰다. 등 부위의 피부를 면도하고 알코올 및 포비돈 용액으로 소독하였다. 2 cm 길이로 피부 절개를 수행하고, 4개의 피하 포켓을 만들었다. 디스크 형태의 실시예 2와 비교예 1 샘플을 무작위로 이식하였다. 이식 후, 조직을 4-0 비 흡수성 모노 필라멘트 봉합사(Prolene)로 봉합하였다. 1주 및 2주 후에, 상기 동물을 희생시키고, 샘플을 조직학적 분석을 위해 적출하였다. 적출한 조직 샘플을 4% 완충된 포름알데히드에 고정시켜 탈수시키고, 파라핀화하여 마이크로톰으로 절단한 다음, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여, 광학 현미경으로 관찰하였다.

이식된 실시예 2 및 비교예 1 모두에서 생체적합성을 나타내었으나, 특히, 실시예 2에서 우수한 생체적합성을 나타내었다. 샘플은 최소 염증 징후를 갖는 매우 얇은 육아 조직으로 캡슐화하였고, 4주 후에 감소하였으며, 특히 2주째에 비교예 1보다 실시예 1에서 현저히 많은 신혈관 생성이 관찰되었다.

관상 동맥 모델에서 초기 골 형성 평가

실시예 2의 초기 생체 내 뼈 형성 능력은 10주령 수컷 Sprague-Dawley 래트의 두개관 결함 모델에서 평가하였다. 두개골 표면은 피부 절개와 골막의 상승에 의해 노출되었다. 생리 식염수로 세척한 트레핀 버(trephine bur)를 사용하여 2개의 5 mm 크기의 원형 뼈 결함을 양측으로 생성시켰다. 삼각형 모양의 실시예 2와 비교예 1 샘플을 무작위로 각 두개골 결함에 삽입하였다. 이식 후, 피부 절개를 4-0 프롤렌(Ethicon, Germany)으로 봉합하였다. 6주째에 동물을 희생시킨 다음, 칼 바리움 조직을 적출하였다. 추가 분석을 위해 샘플을 10% 완충 중화 포르말린에 고정시킨 후, 나노시멘트의 새로운 뼈 형성을 μ-CT 스캐너 (Skyscan 1176; Skyscan, Aartselaar)에 의해 평가하였다. μ-CT 영상을 재구성하여 결함 내에 새롭게 형성된 골 영역을 도 27에 나타내었다. X-선 전압은 65 kV이고 전류는 385 μA이었다. 스캔된 이미지를 재구성한 후, 새로 형성된 뼈의 부피(%)를 분석하였다.

다음으로, 조직적 분석을 위해, RapidCalTM 용액(BBC Chemical Co., Stanwood, WA)으로 탈석회화시킨 후 탈수 및 파라핀에 매립하여 5㎛ 두께로 절단하고 탈파라핀화하여 H&E 및 Masson Trichrome(MT) 염색을 수행하고 광학 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다. 오스테오칼신(OCN)에 대한 샘플의 면역 조직 화학 염색을 위해, 탈파라핀 절편을 PBS로 세척하였다. 비특이적 결합을 막기 위해 블로킹 용액(PBS 중 3 % BSA)에서 배양한 후 안티-오스테오칼신 항체(1 : 100, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)을 사용하여 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 샘플을 PBS로 세척하고 항-래빗 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 1시간 동안 배양하였다.

6주 후의 실시예 2의 삼각형 모서리는 둔화되는 것으로 관찰되었지만, 비교예 1의 가장자리는 여전히 날카롭게 유지되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 실시예 2가 비교예 1보다 생체 내 분해성이 더 높음을 확인할 수 있었다. 또한, 새로 형성된 골 부피는 실시예 2 및 비교예 1 모두에서 증가하였고, 실시예 2에서의 부피가 더 높음을 확인할 수 있었다(도 27). 이를 통해 실시예 2의 생체내 분해성이 더 높음을 알 수 있었다.

낮은 배율에서, 결점 마진으로부터 성장한 새로운 뼈('#')는 실시예 2 및 비교예 1 그룹 모두에서 잘 드러나며, 이것은 골 전도능을 의미한다. 참고로, 샘플 표면에서 형성된 새로운 뼈는 표본 ('

')의 표면 (바닥이 아닌 주로 측면)에서도 발견되어 실시예 2의 우수한 골 유도성을 확인할 수 있었다. 새롭게 형성된 뼈는 비교예 1 표면에서도 발견되었지만, 이것은 주로 갈바륨 결점 모델에서 발견되는 경질 물질의 아래에서 오는 줄기 세포의 과정으로 인해 표본의 바닥면(측면이 아님)에서 발견되었다(도 29).

조직적 분석을 통해, 골 유도성 및 골 전도성으로 생성된 뼈 사이의 활성 뼈 형성 영역이 잘 나타났으며, 혈관(BV)과 함께 비칼슘화된 콜라겐 섬유 매트릭스(푸른 색의 MT 염색)를 확인할 수 있었다. 면역 조직 화학 염색을 통해 새로 형성된 골에서 OCN-양성 성숙 골아 세포 및 골 세포를 검출한 결과를 도 29에 나타내었다. 실시예 2의 경우, 골 전도성으로 형성된 뼈는 오래된 뼈와 비슷한 수준의 많은 OCN(osteocalcin)-양성 골세포를 나타내었으며, 더욱이, 골 유도성으로 형성된 뼈는 골소강(lacunae)에 많은 OCN-양성 골세포를 나타내었다. 비교예 1에서는 골 전도성으로 형성된 뼈의 OCN-양성 골세포의 분포는 실시예 2와 유사하였으나 골 유도성으로 형성된 뼈는 성숙한 골세포가 거의 없다는 것을 의미하는, 상당히 집중되어 있지 않고 분산된 OCN-양성 분포를 나타내었다.

이러한 생체 내 결과를 바탕으로 비교예 1은 전형적인 골 유도 과정을 보여준 반면, 실시예 2는 골 형성의 골 유도 작용을 초기에 보여주었음을 확인할 수 있었다. 즉, 결함이 있는 쥐의 두개골 뼈에 이식된 실시예 2의 초기 뼈 형성 반응을 통하여, 나노시멘트의 우수한 골전도 및 골기질 형성(bone matrix formation)과 함께 골유도의 징후를 확인할 수 있었다.

Claims (10)

1. 메조다공성 생체활성 유리 나노입자로 이루어진 분말 및 수용성 용매를 포함하는, 나노시멘트 조성물로서, 상기 분말은 인산칼슘을 포함하지 않고,
   상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자의 평균 입자 크기는 200 nm 내지 300 nm이고,
   상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자는 시멘트화 전을 기준으로 15:85의 Ca:Si의 몰비를 가지며,
   상기 메조다공성 생체활성 유리나노입자의 표면에 나노-섬(nano island)이 형성되는, 나노시멘트 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자는 6 내지 7 nm의 기공 크기를 갖는 것인, 나노시멘트 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 분말 대 액상의 중량 비율(powder-to-liquid ratio: PL 비)이 0.01 내지 0.3 인 것인, 나노시멘트 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자의 표면적은 50 m²/g 내지 100 m²/g인 것인, 나노시멘트 조성물.
   
6. 메조다공성 생체활성 유리 나노입자로 이루어진 분말을 제공하는 단계; 및
   상기 분말을 수용성 용매 상에서 경화시키는 단계를 포함하는,
   나노시멘트 조성물의 제조 방법으로서, 상기 분말은 인산칼슘을 포함하지 않고 상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자의 평균 입자 크기는 200 nm 내지 300 nm이고,
   상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자는 시멘트화 전을 기준으로 15:85의 Ca:Si의 몰비를 가지며,
   상기 메조다공성 생체활성 유리나노입자의 표면에 나노-섬(nano island)이 형성되는, 나노시멘트 조성물의 제조 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자 분말은,
   1) PEG 또는 CTAB를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계;
   2) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;
   3) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계; 및
   4) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성 유리 나노입자를 제조하는 단계;
   를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것인, 제조 방법.
   
8. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항의 나노시멘트 조성물이 경화된 나노시멘트.
   
9. 제8항에 있어서, 단백질이 상기 메조다공성 생체활성 유리나노입자의 기공 사이에 탑재되는 것인, 나노시멘트.
   
10. 메조다공성 생체활성 유리나노입자로 이루어진 분말 및 수용성 용매가 각각 개별 용기에 포장된, 나노시멘트 제조용 키트로서, 상기 분말은 인산칼슘을 포함하지 않고,
    상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자의 평균 입자 크기는 200 nm 내지 300 nm이고,
    상기 메조다공성 생체활성 유리 나노입자는 시멘트화 전을 기준으로 15:85 의 Ca:Si의 몰비를 가지며,
    상기 메조다공성 생체활성 유리나노입자의 표면에 나노-섬(nano island)이 형성되는, 나노시멘트 제조용 키트.

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