KR102439780B1 - 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노 생활성 유리 시멘트 및 이의 제조 방법 - Google Patents

스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노 생활성 유리 시멘트 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자를 포함하며, 상기 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자는 아민기로 표면 개질된 것인, 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있는 것인 나노시멘트에 관한 것으로, 본 발명은 생활성 나노입자에 Sr이온을 도핑하여 상아질-치수 조직 재생에 효과적인 나노시멘트 및 이의 제조 방법을 제공한다.

Description

스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노 생활성 유리 시멘트 및 이의 제조 방법{nanobioactive glass cement comprising strontium doped bioactive glass nanoparticle and preparation method thereof}
본 발명은 스트론튬이 도핑된 생활성 유리 나노입자, 이를 포함하는 나노 생활성 유리 시멘트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 생활성 유리 나노입자에 스트론튬이 도핑되어, 상아질 및 치수 조직 재생에 효과적인 나노 생활성 유리 시멘트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
치수(dental pulp)를 둘러싼 치아 주변 경질 조직인 에나멜(enamel)과 상아질(dentin)은 치수세포(pulp cells)와 치아모세포(odontoblasts)를 포함한다(Hollands, P. et al.,; Dental pulp stem cells in regenerative medicine, 2018; Nakashima, M. et al., Advances in Dental Research, 2011; Honda, M. J.et al., Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, 2011; Huang, M. et al., Acta Biomaterialia, 2016). 치수세포와 치아모세포는 치수의 표면에 삼차 상아질을 증착시킴으로써 손실된 상아질을 복구한다(Chalisserry, E. P. et al., Journal of Tissue Engineering, 2017; Leyendecker Junior, A. et al., A systematic review. Journal of Tissue Engineering, 2018). 치아모세포로 분화하기 위한 치수 줄기 세포(pulp stem cell)의 자극은 새로운 상아질 조직의 제공 및 궁극적으로 치수의 재생을 결과할 수 있다(Luo, L. et al., Stem Cells International, 2018; Gong, T. et al., Stem cells international, 2016; Nozaki, T. et al., Oral Science International, 2005; Piva, E. et al., J Endod, 2017; Wang, Y. et al., Archives of Oral Biology, 2013; Jin, R.et al.,Journal of Tissue Engineering, 2018). 치수 줄기 세포 자극은 치수에 치과 생체 재료(dental biomaterial)의 직접 배치와 관련된 치수 캡핑을 통해 달성될 수있다. 상아질-치수 복합체(dentin-pulp complex)의 복원 및 캡핑을 위한 다양한 재료가 개발되었으며, 예를 들어, 수산화칼슘(Ca(OH)2)(Ji, Y. M. et al., Tissue Engineering Part A, 2010; Kumar, P. et al., Ceramics International, 2019) 및 MTA(mineral trioxide aggregate)(Ko, H. et al., Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, 2010)는 치수 캡핑의 기준(gold standard)로 여겨져 왔고, 수십년간 사용되어 왔다(An, S.et al., Materials in Medicine, 2012; Hoppe, A. et al., Biomaterials, 2011). 그러나, 약한 고정, 상아질에 대한 부착의 결여, 조직 용액에서 쉽게 제거되는 등 단점을 갖는다. 치수의 캡핑에 주로 활용되고 있는 포틀랜드 시멘트 및 비스무트 산화물(bismuth oxide)인 MTA는 예를 들어, 긴 고정 시간, 나쁜 처리(poor handling) 및 다소 높은 비용과 같은 단점을 갖는다(Poggio, C. et al., The Scientific World Journal, 2014). 따라서, 상아질-치수 복합체의 재생을 위한 신규한 치수-캡핑 생체재료의 개발이 강하게 요구되고 있다.
바이오시멘트는 분말상과 수성상을 혼합하여 성형된 독특한 종류의 바이오 물질로주사 가능하며 경화 가능한 시멘트 페이스트를 형성한다. 바이오시멘트의 일반적인 예는 실리케이트(예를들어, MTA) 또는 포스페이트(예를들어, CPC)를 기반으로 한다. 그러나, 바이오 시멘트 생산에 사용되는 분말은 일반적으로 불규칙한 모양과 낮은 표면적을 갖는 결정질 바이오 세라믹 미세 입자를 포함한다(Fernandez de Grado, G. et al., Journal of Tissue Engineering, 2018).
한편, 생활성 유리는 치아 및 골 재생에 대한 높은 잠재력을 갖는다(An, S. et al., Materials in Medicine, 2012; Hoppe, A. et al., Biomaterials, 2011;
Poggio, C. et al., The Scientific World Journal, 2014; Moon, H. J. et al., Journal of tissue engineering, 2018; Chen, F. M. et al., Biomaterials, 2012;
Kang, M. S. et al., Biomaterials, 2018; Lαzaro, G. S. et al., Journal of Non-Crystalline Solids, 2014; Lee, J.-H. et al., Biomaterials, 2017; Lee, J. H. et al., PLOS ONE, 2016). 생활성 유리는 이들 표면에 형성된 하이드록시아파타이트 층을 통해 뼈에 결합하는 입증된 임상적 효능을 나타냈다. 최근 나노 기술에서 생활성 유리 가공 기술의 발전으로 예를 들어, 나노 사이즈 구체, 메조 다공성 구조, 넓은 표면적, 넓은 기공 부피 및 이에 따른 우수한 생활성, 빠른 치료 이온 방출, 약물 로딩, 약물 방출 능력 및 세포 진입 능력과 같은 우수한 결과를 나타낸다(Chen, F. M.et al., Biomaterials, 2012; Kang, M. S.et al., Biomaterials, 2018; Lαzaro, G. S. et al., Journal of Non-Crystalline Solids, 2014; Lee, J.-H. et al., Biomaterials, 2017; Lee, J. H. et al., PLOS ONE, 2016; Li, F. et al., Acta biomaterialia, 2014; Perez, R. A. et al., RSC Advances, 2015; Perez, R. A. et al., Materials Horizons, 2017). 또한, Sr 이온은 줄기 세포의 골 형성을 자극하고 파골 세포 분화를 억제할 수 있다(Lee, J.-H. et al., Acta Biomaterialia, 2017; Liu, J. et al., Dental Materials, 2016).
특허문헌: 국내 등록특허 제10-0831348호
이에 본 발명자들은 불규칙한 모양의 마이크로 크기(micron-size) 입자에 비해 구형 나노 크기의 입자가 갖는 큰 이점을 활용하기 위해, APTES 표면 기능화된 Sr-도핑된 칼슘 실리케이트 메조포러스 생활성 유리 나노입자를 기반으로 한 나노시멘트를 개발하였다. 본 발명의 나노시멘트는 메조포러스 생활성 유리 나노입자를 사용하여 용해되는 동안 비정질 구조로부터 Ca2+ 이온을 신속하게 방출하여 하이드록시아파타이트 침전 및 자기-경화(self-setting)을 가속화할 수 있고, 치아와 뼈의 불규칙한 형태의 결함에 주입하고 성형하기 쉬운 플라스틱 시멘트 페이스트를 생산한다. 또한 Sr-도핑 메조포러스 생활성 유리 나노입자를 기반으로 한 나노시멘트는 우수한 상아질 및 치수 조직 재생 효과를 가짐을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노 생활성 유리 시멘트를 제공하는 것이다. 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자는 아민기로 표면 개질된 것으로, 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 스트론튬 이온 수용액을 생활성 유리 나노입자 합성 단계에 첨가하는 단계; (b) 상기 (a)의 결과물을 침전시킨 후 열처리시켜 얻은 나노분말의 표면을 아민기로 개질시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 결과물인 나노분말이 인산염 수용액에 대해 0.4g/ml 초과 0.6g/ml 비율로 혼합시킨 후 건조시키는 단계를 포함하는 나노시멘트 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 생활성 유리 시멘트를 유효성분으로 포함하는 상아질 및 치수조직 재생 효과를 갖는 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 생활성 유리 시멘트를 손상 상아질 및 치수조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자를 포함하며, 상기 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자는 아민기로 표면 개질된 것인, 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있는 것인 나노시멘트이다.
본 발명자들은 상아질-치수 복합체의 재생에 효과적인 나노시멘트를 개발하고자 노력하였다. 스트론튬은 칼슘 수용체의 활성 및 Wnt/β-카테닌 신호 전달 기전의 활성화를 통해 골 전구세포(osteoprogenitor cells)를 조골세포(osteoblasts)로 증식 및 분화를 개선하는 데 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Han, P. et al., Biomaterials, 2012; Kim, B. C. et al., Tissue Eng Part B Rev, 2012, 18), 스트론듐이 도핑된 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노시멘트가 생체 모방 용액에서 하이드록시아파타이트 증착에 따른 생체 적합성 및 상아질-치수 조직 재생에 효과적임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 생활성 유리는 유리-세라믹 생체재료를 의미하는 것으로 생활성 유리는 생체 적합성에 의해 조직재생을 위한 임플란트, 지지체로 널리 이용된다. 생활성 유리는 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 합성할 수 있으며 이는 업계에서 잘 알려져 있다. 졸-겔법의 화학적인 과정은 실리콘이나 금속 알콕사이드 단위 전구체(monomer precursor)로부터 다양한 종류의 무기질 망상 조직(network)을 만드는 것이다. 이 과정을 이용하면 고온에서 용융과정을 거쳐 무기질 유리를 만드는 전통적인 방법과는 달리 상온에서 경도와 투명도, 화학적 안정도, 조절된 기공, 열전도도 등 좋은 성질의 균질한 무기질 산화물질을 만들 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 산화칼슘전구체 및 기공형성 주형으로 계면활성제를 함유하는 용액에 실리카 전구체 및 아미노실란 화합물을 첨가하고 교반하여 생활성 유리 나노입자를 얻은 후 소성하는 단계를 통해 생활성 유리 나노입자를 얻었다.
상기 산화칼슘전구체는 생활성 유리의 산화칼슘 성분을 생성시킬 수 있는 물질을 의미할 수 있다. 상기 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate), 및 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 질산칼슘을 사용하였다.
상기 기공형성 주형으로서의 역할을 수행하는 계면활성제는 생활성 유리 나노입자 내에 정렬된 기공을 형성시킬 수 있다. 상기 계면활성제는 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 또는 폴리에틸렌글리콜(PG)일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 폴리에틸렌글리콜을 사용하였다.
상기 실리카 전구체는 생활성 유리의 실리카 성분을 생성시킬 수 있는 물질을 의미할 수 있다. 상기 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TES(tetraethoxysilane), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 및 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생활성 유리 나노입자는 생활성 유리를 나노수준의 입자로 만든 것으로, 더 넓은 표면적과 더 많은 기공을 가져 생분해성 및 단백질 흡착능이 향상되게 된다. 일반적으로 생활성 유리 나노입자는 SiO2 및 CaO를 주성분으로 한다.
상기 생체모방용액(SBF)는 인간 체액을 모방하여, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3-, HPO4 2-, SO4 2-이온 등을 포함하는 용액으로, 생체모방용액에서 하이드록시아파타이트 결정의 형성은 생체 내에서도 동일한 효과가 나타날 것으로 예상할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자의 SiO2:CaO:SrO의 중량비는 80~90:5~15:1~10이다. 상기의 중량비율 범위에서 가장 안정한 3차원의 나노기공구조가 형성된다. 또한, Si 중량비가 90 이상일 경우, 소량의 Ca으로 인해 생분해성 및 생활성이 저해되거나, 소량의 Sr로 인해 낮은 상아질-치수 재생활성을 나타낼 수 있다. 또한, Ca의 중량비가 15 이상일 경우 다량의 Ca으로 인해 나노입자의 형상이나 크기를 균일하게 만드는데 문제가 발생할 수 있다. 또한, Sr의 중량비가 10 이상일 경우 유리구조의 연결이 감소되어 나노입자의 형상이 유지되기 어려울 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자의 제타전위는 +17 내지 +23 mV이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 제타전위는 +20.2±0.71mV이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노시멘트는 인산염 수용액에 대해 상기 스트론튬 생활성 유리 나노입자가 0.4g/ml 초과 0.6g/ml의 비율로 혼합되어 제조된다. 상기 인산염 수용액에 대해 상기 스트론튬 생활성 유리 나노입자가 0.4g/ml 이하의 비율로 혼합되거나, 0.6g/ml 이상의 비율로 혼합되는 경우 나노입자의 칼슘 이온과 포스페이트 이온 사이의 화학 반응에 의해 증착되는 하이드록시아파타이트 결정이 생성되기 어렵거나, 과다하게 생성되는 문제가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노시멘트는 기공에 성장인자를 적재할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 성장인자는 골형성 인자, 혈관형성 인자 또는 이의 조합이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 골형성 인자는 심바스타틴이다. 심바스타틴은 시험관 내 골 분화 및 생체 내 골 형성에 있어 치아발생에 대한 영향 및 콜레스테롤 강하 효과를 갖는 것으로 알려진 약물이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 나노시멘트 제조 방법을 제공한다.
(a) 스트론튬 이온 수용액을 생활성 유리 나노입자 합성 단계에 첨가하는 단계;
(b) 상기 (a)의 결과물을 침전시킨 후 열처리시켜 얻은 나노분말의 표면을 아민기로 개질시키는 단계; 및
(c) 상기 (b)의 결과물인 나노분말이 인산염 수용액에 대해 0.4g/ml 초과 0.6g/ml 비율로 혼합시킨 후 건조시키는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 나노분말의 표면을 아민기로 개질시키는 단계는 APTES와 반응시켜 표면 아민기로 개질된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)의 상기 인산염 수용액에 대해 상기 스트론튬 생활성 유리 나노입자 분말이 0.4g/ml 이하의 비율로 혼합되거나, 0.6g/ml 이상의 비율로 혼합되는 경우 나노입자의 칼슘 이온과 포스페이트 이온 사이의 화학 반응에 의해 증착되는 하이드록시아파타이트 결정이 생성되기 어렵거나, 과다하게 생성되는 문제가 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노시멘트를 유효성분으로 포함하는 상아질 및 치수조직 재생 효과를 갖는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노시멘트는 상아질-치수 복합체 재생 관련 유전자의 발현, ALP, ASP 염색을 통해 높은 칼슘 침착에 의한 치아 형성 효과를 가짐을 확인하고, 랫트를 대상으로 생체 내 실험을 수행하여, 본 발명 나노시멘트의 우수한 생체 적합성 및 상아질-치수 재생효과를 확인하여, 본 발명 나노시멘트는 상아질 및 치수조직 재생에 유용한 조직 재생용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노시멘트를 손상 상아질 및 치수조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공한다.
본 발명은 생활성 나노입자에 Sr 이온을 도핑하여 상아질-치수 조직 재생에 효과적인 나노시멘트 및 이의 제조 방법을 제공한다.
도 1은 Sr-도핑된 나노 생활성 유리 시멘트의 제형화 개요도 및 나노 생활성 유리 시멘트의 상아질-치수 복합체 재생 요법에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 SBF 침지 전후 Sr free 나노 생활성 유리 시멘트(NBC) 및 Sr-도핑 나노 생활성 유리 시멘트(Sr-NBC)의 고배율 SEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 SBF 침지 전후 Sr free 나노 생활성 유리 시멘트(NBC) 및 Sr-도핑 나노 생활성 유리 시멘트(Sr-NBC)의 XRD 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 SBF 침지 전후 Sr free 나노 생활성 유리 시멘트(NBC) 및 Sr-도핑 나노 생활성 유리 시멘트(Sr-NBC)의 ATR-FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5 (a)는 Sr free 나노 생활성 유리 시멘트(NBC)의 이온 분비 프로필을 나타내며 (b)는 Sr-도핑 나노 생활성 유리 시멘트(Sr-NBC)의 이온 분비 프로필을 나타낸다.
도 6은 NBC 및 Sr-NBC의 생체 적합성 및 치아형성을 rDPSCs를 이용하여 나타낸다(in vitro). (a)는 인서트(3μm)를 사용한 나노 생활성 유리 시멘트의 세포 생체 적합성 (b)는 액틴 필라멘트(적색)와 핵(청색)에 의해 밝혀진 rDPSCs의 형태, (c 및 d)는 나노 생활성 유리 시멘트 추출물을 이용한 ALP 활성 및 ARS 염색에 의한 치아형성 결과를 나타낸다.
도 7은 NBC 및 Sr-NBC의 생체 내 이식을 통한 치수 조직 호환성 테스트 및 외소성 치아형성을 나타낸다(in vivo). (a)는 실험의 모식도, (b)는 이식 6주 후 μCT 분석, (c 및 d)는 새로운 경질 조직(상아질)의 정량화 분석, (e)는 재생성 상아질을 나타내기 위해 H&E 염색을 통한 조직학적 분석 (f)는 상아질모세포 관련 단백질 발현(DMP-1 및 DSPP)을 나타낸다.
도 8은 NBC 및 Sr-NBC의 생체 내 이식을 통한 상아질-치수 재생 시험을 나타낸다(in vivo). (a)는 실험의 모식도, (b)는 이식 6주 후, 새로운 상아질 형성을 밝히기 위한 μCT 분석 (c)는 새로운 경질 조직(상아질)의 부피, 표면적 및 밀도 측면에서의 정량화를 나타내며, (d)는 재생 상아질-치수 조직 복합체에 대한 H&E 염색을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다,
실시예 1. 실험 재료의 준비 및 분석 방법
1-1. 실험 재료 수득처
테트라에톡시실란(TES≥99%), 질산스트론튬(SN≥99%), 질산칼슘 4수화물 (Ca(NO3)24H2O (CNT), 폴리(에틸렌 글리콜)(PG, Mn=10,000), 수산화 암모늄(28%), 무수 메탄올(99.8%), 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APTES≥98%), 무수 톨루엔(99.8%) 트리스-하이드록시메틸 아미노메탄(Tris-buffer), HCl(1N), HNO3(70%) 및 인산염 정제(PBS), 생체모방용액(SBF) 준비를 위한 높은 수준의 전구체는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 심바스타틴(SV, C25H38O5≥97%)은 또한 Sigma-Aldrich로부터 수득하였다. 실험에 필요한 경우 증류수(Millipore Direct-Q system)를 사용했다.
1-2. 데이터 분석 방법
통계 분석은 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석한 다음 Tukey의 post hoc test를 수행했다. 유의수준은 P<0.05로 고려된다.
실시예 2. Sr-도핑 나노 생활성 유리 시멘트의 제형화 및 그 특성
2-1. Sr-도핑 나노 생활성 유리 시멘트의 합성 방법
85SiO2-10CaO-5SrO 및 85SiO2-15CaO 유리 조성물(wt%)에 기반하여 Sr-도핑 또는 Sr free 나노 생활성 유리 시멘트가 제조되었다. 다공성 구조의 주형으로서 PG를 사용하였다. Sr free 및 Sr-도핑된 나노 입자를 위해 5g의 PG와 0.189g의 CNT 또는 5g의 PG, 0.126g의 CNT 및 0.031g의 SN을 알칼라인 메탄올(150㎖, pH 12.5)에 용해시켰다. 0.884g의 TES를 30mL 메탄올에 희석하고 고속 교반 및 순간 초음파(고전력)에서 적가(drop-wise)로 전구체 용액에 첨가하였다. 백색 또는 청색의 침전물을 수집 및 5000rpm로 5분 동안 3회 회전으로 원심 분리 및 재-분산 처리된 증류수/에탄올을 사용하여 세척하고, 침전물은 70℃에서 하룻밤 유지하였다. PG는 공기 중에서 600℃, 5시간 동안 열처리에 의해 태워서 제거되었다(burnt off). 마지막으로, 나노 분말은 APTES와 커플링을 통해 표면-아민기로 개질되었다. 나노 분말은 APTES/Toluene 용액(2% by vol.)에서 2 mg/mL로 분산되고. 24시간 동안 80℃에서 환류시켰다. 나노 분말은 5000rpm에서 5분 동안 원심 분리되고 톨루엔으로 3회 세척/제분산하고 밤새 80℃에서 건조시킨 후 추가 사용을 위해 진공에서 유지시켰다. 나노 생활성 유리 시멘트는 0.5g/ml의 P/L 비율로 생활성 유리 나노 분말과 1xPBS를 혼합하여 제조하였다. 얻어진 나노시멘트 페이스트를 테플론 몰드로 옮겨 디스크 형태로 제형화하고 경화시키기 위해 방치하였다.
그 결과, APTES로 표면 기능화된 Sr free 및 Sr 도핑된 칼슘 실리케이트 메조포러스 생활성 유리 나노입자로부터 나노 바이오 시멘트를 제조하고, 형성된 나노 생활성 유리 시멘트 페이스트는 임의의 주사기로부터 주입될 정도로 부드러워졌고(도 1) 상이한 형상으로 성형이 가능하였다. 이러한 플라스틱 특성은 임상적 적용과 뼈와 치아의 불규칙한 모양의 결함을 복구하는 데 필수적이다. 또한, 시멘트 페이스트는 주변 환경에서 5~10분 이내에 경화(setting)되고 완전히 경화된 나노 생활성 유리 시멘트는 SBF에 담길 때 무너지지 않고 기하학적 모양을 유지하였다.
2-2 나노 생활성 유리 시멘트의 특성 측정 방법
SBF 침지 나노 생활성 유리 시멘트의 표면 형태, 나노구조, 비정질-결정형 변환 및 화학적 구조의 작용기는 필드 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM), X선 회절(XRD)및 감쇠된 총 반사도-푸리에 변환 적외선 분광법(ATR-FTIR)를 사용하여 조사하였다. FE-SEM(Tescan, MIRA II LMH)에 의한 관찰 전에, 샘플은 스퍼터 코터(Cressington 108 Auto sputter coater)를 사용하여 Pt로 스퍼터하였다. XRD 측정은 CuKα 방사선(λ=1.5418A)과 0.02 o의 단계 폭(step size)를 사용하여 Rigaku-Ultima IV에서 실행하였다. ATR-FTIR 스펙트럼은 diamond crystal accessory(GladiATR, PIKE Technologies)와 함께 Varian 640-IR을 사용하여 4cm-1의 분해능으로 400-2,000cm-1 파장수 범위에서 수집하였다. Sr free 나노 생활성 유리 시멘트(NBC) 및 Sr 도핑 나노 생활성 유리 시멘트(Sr-NBC)의 제조에 사용되는 APTES 표면 기능화 나노 입자의 표면 전하는 제타(ζ) 전위 분석기로 측정하였다(Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments). ζ 전위는 20Vcm-의 전계 강도로 pH7.4 및 25℃ 증류수에서 조사되었다. TRIS/HCl 완충액에서 NBC 및 Sr-NBC 디스크에서 방출된 이온은 pH7.4 및 37℃에서 유도 결합 플라즈마-원자 방출 분광법(ICP-AES, Optima 4300DV, Perkin-Elmer, Waltham)으로 분석하였다. 50mg의 NBC 및 Sr-NBC 디스크를 10mL Tris 완충액에 담가 두었다. 미리 정해진 시간에, 분비 배지는 피펫으로 취득하고 원심분리(15,000rpm, 10분)되어 상청액은 분비된 이온을 ICP-AES로 결정하기 위해 수집되었다. 샘플은 분석되고 표준 편차를 가진 평균을 보고하였다.
2-3. 실험 결과
NBC 및 Sr-NBC의 표면 나노 형태는 SBF 침지 0일째 및 28일 후에 SEM 이미징(도 2)에 의해 시각화되었다. NBC 및 Sr-NBC의 높고 낮은 배율 SEM 이미지는 거의 동일한 표면 나노 형태와 나노 구조 시멘트 표면(구형 나노 입자의 섬)을 보였으며, SBF에 28일 동안 침지한 후 하이드록시아파타이트(HA) 나노 바늘 구조 표면으로의 변형을 나타냈다. 분말 형태의 생활성 유리 나노 입자는 일반적으로 고응집 상태로 존재한다. 따라서, 이는 PBS와 혼합한 후 하이드록시아파타이트 증착을 통해 함께 경화됨에 따라 나노 입자의 시멘트 형성 및 자기 경화를 용이하게 한다. 상기 하이드록시아파타이트는 생활성 유리 나노 입자로부터 용해된 칼슘 이온과 PBS 용액에 함유된 포스페이트 이온 사이의 빠른 반응을 통해 형성되었다. 응집된 생활성 유리 나노입자에 결합하여 형성된 하이드록시아파타이트는 SBF에 침지된 후 얽힌 바늘-유사 나노 하이드록시아파타이트(entangled needle-like nano-hydroxyapatite)로 더욱 결정화되었다(도 2).
NBC 및 Sr-NBC의 위상은 경화 직후인 SBF 침지 후 0일째 XRD로 조사하여 경화 반응을 확인하였다. XRD 스펙트럼은 하이드록시아파타이트에 해당하는 2θ= 29.5 및 2θ=31.8o에서 그래프 상 저강도 피크를 나타내었다(도 3a, b). 이 피크는 나노 유리 위상이 빠르게 Ca2+ 이온을 방출하는 것을 나타내며, 이는 PBS에서 PO4 3-이온과 반응하여 하이드록시아파타이트 침착으로 이어졌다. 더욱이, Sr-NBC에 대해 기록된 XRD 피크는 NBC에 관찰된 것보다 상대적으로 높은 강도를 가지고 있는 것으로 나타났다. 이는 Sr-NBC의 경우에 침전된 하이드록시아파타이트의 양이 NBC에 비해 높아 Sr-NBC가 NBC에 비해 더 빠르게 경화함을 암시한다. 이는 Sr가 실리카 유리 구조에 대해 구조적 영향을 미치며, 이의 후속 유리 용해 공정에 대한 효과에 영향을 미치는 것을 암시한다. Ca 이온을 Sr 이온으로 대체하는 것은 Sr(1,12 A°)이온이 Ca(0.99 A°)에 비해 큰 이온 반경을 가져 실리카 프레임 워크 구조의 확장을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 Ca를 Sr로 교체하면 유리 구조의 연결이 감소하고 중단된다. 따라서, 생활성 유리 나노 입자는 스트론튬 치환으로 더 분해되고 더 많은 하이드록시아파타이트 증착 및 더 빠른 경화를 나타낸다.
NBC 및 Sr-NBC의 생활성은 SBF에 침지하여 28일 동안 시험관 내에서 조사되었다. XRD, FT-IR 및 SEM 조사는 NBC와 Sr-NBC를 하이드록시아파타이트 단계로 전환하는 것을 확인했다. Sr-NBC는 NBC에 비해 Sr-NBC의 XRD 스펙트럼에서 더 강하고 더 강렬한 하이드록시아파타이트 피크를 통해 NBC보다 더 높은 생활성을 보였다(도 3c). 이 결과는 Sr 치환의 관점에서 설명될 수 있으며, Ca가 Sr로 치환되어 분해성과 이온 방출을 증가시키고, 따라서, 더 많은 하이드록시아파타이트를 증착시킨다. 더욱이, Sr-NBC의 XRD 피크 위치는 Sr-치환 하이드록시아파타이트로 알려진 낮은 2θ값(도 3c는 대표적인 피크인 211의 변화를 나타냄)으로 이동된다.
FT-IR 스펙트럼을 통해 XRD 결과를 더 확인하여 전형적인 하이드록시아파타이트 스펙트럼을 확인하였다. Sr-NBC의 FT-IR 스펙트럼은 NBC에 비해 날카롭고 매우 강렬한 피크를 나타내고 따라서 NBC에 비해 Sr-NBC의 우수한 생활성을 확인하였다(도 4). 450cm-1, 796cm-1 및 1057cm-1에서 피크는 칼슘 실리케이트 나노 생활성 유리에서 유래한 실리케이트 기에 해당된다. 반면, 560cm-1, 603cm-1 및 1015cm-1에서 밴드는 하이드록시아파타이트의 인산기와 관련이 있다. 성장한 하이드록시아파타이트는 CO3 2-기에 속하는 870cm-1, 1415cm-1 및 1455cm-1에서 밴드를 나타냈다. 따라서, 성장된 하이드록시아파타이트는 탄산화된 형태이며, 이는 탄산화 하이드록시아파타이트가 경조직에서 천연 아파타이트를 모방하기 때문에 중요하다.
치료이온 즉, Sr, Ca 및 Si의 분비는 생리학적 조건을 모방하고 생체 관련성을 위해 pH 7.4 및 37℃에서 Tris-HCl 완충액에 4주 동안 침지되어 ICP-AES에 의해 측정되었다. NBC는 APTES 표면 기능화된 메조다공성 생활성 유리 나노입자 (Zeta 전위 +20.2±0.71mV)로부터 제조되어 상당한 양의 Ca 및 Si 이온을 방출하였다. NBC에서 Si 이온 방출이 빠르고, 7일째에 선형적으로 250ppm에 도달한 다음 3주 동안 점진적으로 증가하여 28일에 350ppm에 도달하는 것을 보여준다. Ca 이온의 농도는 침지의 초기 시간 동안 빠르게 증가하여 100ppm에 도달한 다음 28일에 꾸준한 선형 증가를 통해 300rpm에 도달했다(도 5a). Sr-NBC는 APTES 표면 기능화된 Sr-도핑된 메조다공성 생활성 유리 나노입자(제타 전위 +24.3±1.2mV)로부터 제조되어 상당량의 Sr, Ca 및 Si 이온을 방출하였다. Sr과 Ca는 유사하게 초기 7일 이내 빠른 분비 프로필을 나타낸 다음 속도가 느려지고 평준화(21일 이내)되었다. Ca 이온은 처음에 7일째에 150ppm에 도달한 다음 28일째에 220ppm으로 완료한 반면, Sr 이온은 7일째에 100ppm에 도달한 다음 28일째에는 150ppm으로 완료되었다. 반면, Si 이온은 처음 7일 이내에 빠른 분비를 보이고 7 일째에 200ppm에 도달한 다음 Si 방출 350rpm에 도달하는 28 일까지 거의 선형 방출 패턴을 따랐다(도 5b). Sr-NBC는 NBC에 비해 Ca 이온의 적은 양을 분비하고 이것은 NBC 제조에 사용된 생활성 유리 나노입자(BGn) 조성물(85% SiO2-15% CaO)에서 5wt% CaO 가 5wt% SrO(85% SiO2-15% CaO)로 대체되어 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자(Sr-BGn)를 생산하기 때문이다.
여기서 관찰된 본 발명의 개선된 용해 및 빠른 이온 분비는 다음을 포함하는 여러 요인에 기인한다 1) 본 발명에 따라 제조된 생활성 유리의 메조다공성 구조 및 나노스케일 형태, 2) APTES 표면 개질로 -NH2의 도입으로 인해 생활성 유리 나노입자의 친수성이 증가되어 개질되지 않은 것에 비해 이온 방출이 개선되고 분해성이 향상, 3) 스트론튬 교체가 유리 구조의 연결을 감소시켜 분해 속도를 증가시키는 실리카 유리 기질에 대한 Sr의 구조적 효과, 4) 마지막으로, 여기서 관찰된 이러한 더 높은 양의 Si의 방출은 실리카 기질 자체의 분해 외에도 APTES 표면 잔기의 분해에 의한 것일 수 있다. 반면 비기능화 나노입자의 경우, 유리 네트워크를 형성하는 Si는 실리카 기질의 분해로부터만 발생하므로 적은 양으로 방출된다.
실시예 3. NBC 및 Sr-NBC의 생체 적합성 및 치아형성 능력
3-1. 치수 줄기 세포(DPSC) 배양 방법
치과 치수 줄기 세포 DPSC는 5주령 수컷 Sprague-Dawley 래트의 절개 치아로부터 수집하였다. 랫트는 CO2 가스에 의해 안락사된 후, DPSC를 수확하고 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 PBS로 세척하였다. 분리된 조직은 0.08% 콜라게나아제 유형 I(collagenase type I) 및 0.2% 디스파제 II(dispase II)를 함유하는 용액으로 효소적으로 30분 동안 소화하였다. DPSC는 1500rpm, 3분 원심분리를 통해 수집되고 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco) 및 10% 우태아혈청(FBS)으로 개선된 α-MEM을 함유한 치수 줄기 세포 배지(GM)에서 37℃ 및 5% CO2 습한 환경에서 배양하였고, DPSC의 상아질모세포 분화는 100nM 덱사메타손, 50μg/mL 아스코르브산 및 10mM β-글리세로포스페이트를 함유하는 치아형성 배지(OM)에서 조사되었다.
3-2. NBC 및 Sr-NBC 이온 추출 및 생체 적합성 분석 방법(in vitro)
나노 생활성 유리 시멘트 샘플을 간접 세포 배양 방법으로 시험하였다. 실험에 앞서, 나노입자는 EO 가스에 의해 멸균되었다. 시멘트 디스크(5mm 직경 x 2mm 높이)는 둥근 모양의 PDMS 몰드로 만들고 클린 벤치에서 밤새 배양하였다. 디스크는 다공성 인서트(3μm)의 상부에 위치시키고, DPSC 세포는 24웰 플레이트의 바닥에서 배양되었다. 컨디셔닝된 배지(CM)는 1개 디스크(10mg 나노입자)를 위해 제조되었고, 그 후 37℃에서 하룻밤 동안 10 mL의 치아형성 배지에 담근 후, 그 배지를 수집하였다.
세포 독성은 WST 시험 및 CCK 키트에 의해 분석되었고, 여기서 반응 혼합물 100μL을 96웰 플레이트로 이동시키고 iMark 마이크로플레이트 리더(BioRad, USA)에 의해 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 광학 밀도 값의 백분율을 기초로 했다. 104개의 DPSC를 치수줄기세포배지(GM)으로 배양하고 컨디셔닝된 배지(CM)에 의해 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포 생존가능성을 1일 및 3일째에 CCK 키트에 의해 관찰하였다. 세포를 육안으로 검사하기 위해, 세포는 면역세포화학 염색을 실시하였다. 세포를 PBS에 의해 세척하고, 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 20분 동안 4℃에서 고정하고, 0.2% 트리톤 X-100으로 처리한 다음, DAPI(p36965, Invitrogen)와 팔로이드(Phalloidin)(Alexa Flour 546, Life Technologies, Invitrogen)에 의해 염색하였다. 세포는 공초점 레이저 현미경 검사법(CLSM; Zeiss LSM 700)에 의해 포착되었다.
3-3. 치수 줄기 세포(DPSC)의 치아형성 분화 분석 방법
DPSC의 치아형성(odontogenic) 분화는 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성 및 알리자린 레드 S(ARS) 염색을 통해 조사되었다. 2.5x104 세포/well를 24웰 플레이트에서 배양하고, 상이한 배지 조건인 성장배지(GM), 치아형성배지(OM), 및 컨디셔닝된 배지(CM)를 사용하였다. 21일째에, 샘플을 0.25% TE(트립신 및 EDTA, Gipco)에 의해 수집하였다. ALP 분석의 경우, ALP 키트로부터 0.6 mL 완충액을 4℃에서 15분 동안 10,000rpm에서 원심분리 전에 각 샘플에 첨가한 다음 상청액을 수집하였다.
ALP 양은 405nm에서 흡광도 측정에 의해 확인되었다. dsDNA양을 dsDNA 검출 키트(Quant-iT Picogreen, Invitrogen)에 의해 520nm에서 측정하고, ALP 활성은 dsDNA로 정규화되었다. ARS 염색을 위해, 40mM ARS 분석용액(pH 4.2)을 실온에서 부드럽게 회전 조건하에서 10분 동안 세포에 처리하였다. 이어서, 샘플은 여러 번 세척되고 카메라(D1000, Canon)와 광 현미(IX71, Olympus)에 의해 포착하였다. 결국, ARS 정량화는 인산나트륨(pH 7.0 및 10 mM)에서 10% CPC(cetylpyridinium chloride, Sigma)에 의해 이루어졌고, 그 후 562nm에서 흡광도를 측정하였다.
3-4. 실험 결과
rDPSCs과 간접 배양은 NBC 및 Sr-NBC가 생물학적인 세포 독성을 나타내지 않았다는 것을 보여주었다(도 6a). 나노 생활성 유리 시멘트 이온 추출물은 rDPSCs의 생존력과 치아발생형성능력을 크게 향상시켰다. 세포는 1일 및 3일 후에 시각화하고 거의 유사한 형태와 적합한 세포 부착을 보였다(도 6b). 이온의 분비는 세포 반응을 현저하게 자극했다. 세포 미네랄화는 ARS 염색에 의해 시험하였다. Sr-NBC가 NBC에 비해 훨씬 더 많은 칼슘 증착을 보여주고 더 많은 바이오-미네랄화를 촉진함을 확인했다(도 6c). 초기 골생성/치아형성 마커인 ALP는 Sr-NBC군에서 다른 군에 비해 가장 높은 ALP 활성을 보여 치아형성 잠재력을 나타냈다.
실시예 4. 나노 생활성 유리 시멘트의 생체 적합성 및 치아형성 능력(in vivo)
10주령의 건강한 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트가 생체내 연구에서 사용되었다. 이식 수술 전에, 권장 동물 주거 조건을 제공하고 동물은 무작위로 3 실험 그룹으로 선택되었다: NBC와 Sr-NBC 및 empty(대조군)가 전신 마취 하에(10mg/kg xylazine + 80 mg/kg ketamine) 각 치아에 이식되었다. 이 연구에서, 두 개의 다른 생체 내 모델을 검사했다. 첫 번째는 낮은 치아형성 조건에서 치아형성 및 생체 내 치수-조직 호환성을 조사하기 위한 1차 모델로서 이소성 치아 발생 모델이다. 두번째는 임상적으로 관련된 실제 적용 조건을 모방하는 치아 결함 모델이다. 이 모델은 임상-유사 상황에서 NBC 및 Sr-NBC의 치아 발생 효과를 실험하기 위해 활용되었다.
4-1. 이소성 치아발생 모델의 제작 방법
이소성 치아발생의 경우, 추출된 첫번째 치아에 결함을 발생시킨 후 이소성 조건(피하 조직의 등쪽 양면에 자가 치아 이식)에서 나노 생활성 유리 시멘트 이식을 수행하여 가혹하고 낮은 치아형성 조건에서 생체 내 치수 조직 호환성 및 치아형성을 관찰하였다. 결함 구멍(직경 1.35mm)은 치아 치수강을 노출하기 위해 추출된 어금니 치아 상단의 오른쪽과 왼쪽의 교합측에 만들어졌다. 이어서, 1mg의 NBC 또는 Sr-NBC를 5개의 치아를 포함하는 각 그룹의 결함 구멍으로 투여하고, 샘플을 랫트에 피하 이식하였다. 이식 전에 등쪽 피부를 면도하고 수술 부위를 요오드 및 무균 알코올로 처리하고, 작은 피하 포켓은 선형 피부 절개를 통해 열렸다. 이식 후, 피부 포켓을 봉합했다. 동물은 염증 또는 감염의 어떤 표시든지 기록하기 위하여 정기적으로 검토되었다. 주변 조직을 가진 이식된 치아를 CO2 흡입하에 안락사된 동물로부터(수술 후 6주) 수집하였다. 샘플은 10% NBF(neutral buffered formalin)에서 24시간 동안 고정하였다.
4-2. 치아 결손 모델의 제작
이전에 보고된 방법에 따라 치아 결함을 생성하고 재료를 적용한 후 임상적으로 관련된 in vivo 치아모델은 자연 치아에서 조정하였다(Bencherif, S. A.et al., J Periodontal Implant Sci, 2013). 치수강이 노출될 때까지 전술한 바와 같이 결함 구멍이 생성되었다. NBC 또는 Sr-NBC 1mg은 5개의 치아를 포함하는 각 그룹의 결함 구멍에 적용되었다. 절차의 나머지는 전술한 바와 같다.
4-3. μ-CT 분석 방법
NBF 고정된 샘플은 μ-CT에 의해 스캔되고, 279ms 노출 시간 조건에서 9μm 섹션, 385μA 및 65kV에서 X선을 사용하여 스카이 스캔 소프트웨어 (Aartselaar) 사용하여 분석하였다. 둘째, 재구성된 이미지는 관심 지역에 대해 경질 조직 생성을 위해 CTAn Skyscan에 의해 조사되었다. 결함 영역에서 표면적(mm2), 새로운 경조직 부피(%) 및 밀도(1/mm)가 결정되었다. 마지막으로, 3D 구조는 CTvol Skyscan에 의해 생산되고 캡처되었다.
4-4. 면역조직형광 및 면역조직화학 염색에 의한 치아의 조직구조
RapidCalTM 용액은 5-7일 동안 고정된 샘플을 석회질 제거하는 데 사용되었다. 이어서, 샘플을 상이한 등급의 에탄올에 의해 탈수시키고 파라핀에 내장하였다. 이어서, 시료의 관상부(coronal section) 두께 5μm를 반자동 회전 마이크로톰에 의해 절단하고 유리 슬라이드로 옮겼다. 견본은 새로운 뼈 형성의 분석을 위한 H&E(hematoxylin and eosin) 및 면역조직화학 염색에 의해 염색된 후에 광학 현미경에 의해 시각화되었다. 면역형광 염색 동안, 조직 절편은 구연산 완충액에 의해 항원 회수를 20분 동안 처리하였다. 다음으로, 1 차 항체 (DMP-1/M-20/and DSPP /M-300/, Santa Cruz Biotechnology, INC) 로 밤새 4℃에서 배양하였다. 또한, 실온에서 1시간 동안 이차 항체로 처리하고 마지막으로 공초점 레이저 현미경으로 포착하였다.
4-5. 실험 결과
상아질-치수 복합체 재생은 추출된 치아가 나노 생활성 유리 시멘트를 적용한 후 피하 조직에 이식된 이소성 상아질 형성을 통해 시험되었으며, 임상 적용 전 생체내 치수-조직 호환성 및 가혹하고 덜 치아형성(odontogenic) 조건에서 치아발생을 관찰하였다.
도 7a는 6주 동안 어금니에 나노 생활성 유리 시멘트 이식을 위해 수행된 외과적 시술의 모식도이다. 결함 부위에서 새로 형성된 상아질 및 잔여 나노 생활성 유리 시멘트의 3D 재구성된 이미지 및 μCT 는 나노 생활성 유리 시멘트의 생체 내 치아형성 전위를 조사하기 위해 활용되었다. 이식 전후 μCT 이미지는 도 7b에 나타냈다. 새로운 상아질 형성은 붉은 색으로 표시된다. μCT 이미지의 분석결과 Sham 및 NBC 그룹에 비해 Sr-NBC 그룹의 높은 상아질 재생 잠재력을 나타낸다(도 7 c 및 d). 더욱이, H&E 염색에 의한 조직학적 분석(도 7e)은 NBC군 및 Sham 군에 비교하여 Sr-NBC 그룹과 관련되어 삼차 상아질의 형성을 확인하였다. Sr-NBC 그룹은 또한 NBC 군보다 상아질 매트릭스 단백질-1(DMP-1) 및 상아질-시알로포스포테인트(DSPP)의 더 높은 발현을 보였다(도 7f). 종합하면, Sr-NBC는 이소성 조건에서도 치수-조직 생체 적합성 및 치아발생을 강력하게 하여 임상적으로 연관된 치아 결함 모델에 Sr-NBC를 적용하게 한다.
다음으로, 나노 생활성 유리 시멘트의 재생 전위는 6주 동안 임상적으로 연관된 생체 내 모델에 의해 평가하였다(도 8a). 이식 전후 μCT 이미지는 도 8b에 나타냈다. 새로운 상아질 형성은 녹색으로 표시된다. μCT 이미지의 분석은 Sham 및 NBC 군과 비교하여 Sr-NBC 군에서 더 높은 상아질 부피 및 더 높은 상아질 조밀도를 나타냈다. NBC와 Sr-NBC의 거의 유사한 상아질 표면적이 관찰되었지만 sham그룹에 비해 상당히 넓었다. H&E 염색에 의한 조직학적 분석(도 8d)은 Sr-NBC가 Sr2+ 및 Ca2+ 분비로 인해 NBC에 비해 생체 내 치수-상아질 조직 재생이 더 좋은 것으로 나타났다. Sr-NBC의 생체 내 생물활성반응은 치아 줄기 세포에 대한 Sr2+ 이온의 자극 역할과 이의 Ca2+ 이온보다 약간 더 큰 반경으로 인해 유리 네트워크를 확장시키고, 후속 빠른 분해를 통해 NBC와 sham 그룹보다 더 높았다. 따라서 체액의 Sr2+ 및 Ca2+에 의한 높은-포화는 Sr-NBC에서 빠르게 일어나고 NBC에 비해 빠르게 하이드록시아파타이트를 침전시킨다
실시예 5. 나노 생활성 유리 시멘트의 약물 로딩 능력
심바스타틴 나트륨 염(SVS)의 다양한 농도를 다음 절차에 따라 제조하였다. SVS 용액 1ml의 제조를 위해, 상응하는 양의 SV가 에탄올 100μL에 용해되었다. 150μL의 NaOH 0.1N을 SV 에탄올 용액에 첨가한 다음 2시간 동안 50℃에서 배양하였다. 0.1N HCl을 사용하여 pH를 7.2로 조정하였다. 탈이온수가 용액에 첨가되어 1mL를 완료하고, 다음 실험을 위해 4℃에서 저장하였다. 선형 캘리브레이션 곡선(A239=0.0144+0.0453C(R2=0.996))은 자외선 가시 분광광량계(Libra S22, Biochrom)를 사용하여 일련의 SVS 용액(0-50μg/mL)을 λmax=239nm에서 흡광도를 측정하여 수득하였다. SVS 로딩 용량을 확인하기 위해, NBC 및 Sr-NBC 디스크(10mg)는 37℃에서 2시간 동안 1ml의 SVS 0.25, 0.5, 1, 2 및 4mg/ml에 담가두었다. 약물 용액을 신중하게 수집하고 5분 동안 15,000rpm로 원심 분리한 후, 그들의 흡광도는 λmax=239nm에서 결정되었다. SVS 전체 로딩 용량은 SVS의 초기 및 최종 용액 농도 차이로부터 추정되었다.
그 결과, NBC 및 Sr-NBC는 유사한 심바스타틴 로딩 용량을 보였다. SVS의 4mg/mL 로딩 용액이 사용되었을 때, 10mg Sr-NBC는 SVS 약 1893μg(즉, 189.3μg SVS/mg 시멘트)을 로딩하는 반면, 10mg NBC는 SVS 약 1625μg(즉, 162.5μSVS/mg 시멘트)을 로딩할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자를 인산염 수용액에 대해 0.4 g/ml 초과 0.6 g/ml의 비율로 혼합하여 제조되는 상아질 및 치수조직 재생용 나노시멘트로서, 상기 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자는 아민기로 표면 개질되고, SiO2:CaO:SrO의 중량비는 80~90:5~15:1~10이며, 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있고, 상아질 매트릭스 단백질-1(dentin matrix protein 1, DMP-1) 및 상아질-시알로포스포테인트(dentin siaalophosphoprotein, DSPP)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 나노시멘트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 스트론튬 도핑 생활성 유리 나노입자의 제타전위는 +17 내지 +23 mV인 나노시멘트.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 나노시멘트는 기공에 성장인자를 적재한 것인, 나노시멘트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 성장인자는 골형성 인자, 혈관형성 인자 또는 이의 조합인 것인, 나노시멘트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 골형성 인자는 심바스타틴인 것인, 나노시멘트.
  8. 제1항, 제3항, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노시멘트 제조 방법에 있어서,
    (a) 스트론튬 이온 수용액을 생활성 유리 나노입자 합성 단계에 첨가하는 단계;
    (b) 상기 (a)의 결과물을 침전시킨 후 열처리시켜 얻은 SiO2:CaO:SrO의 중량비가 80~90:5~15:1~10인 나노분말의 표면을 아민기로 개질시키는 단계; 및
    (c) 상기 (b)의 결과물인 나노분말이 인산염 수용액에 대해 0.4g/ml 초과 0.6g/ml 비율로 혼합시킨 후 건조시키는 단계;를
    포함하며,
    상기 나노시멘트는 상아질 매트릭스 단백질-1(dentin matrix protein 1, DMP-1) 및 상아질-시알로포스포테인트(dentin siaalophosphoprotein, DSPP)의 발현을 증가시키며, 상아질 및 치수조직 재생용인 것인, 나노시멘트 제조 방법.
  9. 제1항, 제3항, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노시멘트를 유효성분으로 포함하는 상아질 및 치수조직 재생 효과를 갖는 조직 재생용 조성물.
  10. 제1항, 제3항, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노시멘트를 인간을 제외한 동물의 손상 상아질 및 치수조직에 처리하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법.
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