KR102289197B1 - 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트에 관한 것이다. 본 발명에 의한 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 및 이의 제조방법을 이용하면 마이크로스피어의 분해에 의해 생성된 빈 공간이 신생 혈관 형성과 신생 골 형성을 촉진할 수 있는 효과가 있다. 마이크로스피어는 브루샤이트 시멘트에서 이온을 용해 및 방출하여 세포 거동을 촉진하여 조골세포 분화를 촉진시키는 효과가 있다.

Description

바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 및 이의 제조방법{Brushite cement containing microspheres derived from bio-glass and method for producing the same}
본 발명은 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인산 칼슘 시멘트(Calcium phosphate cements, CPCs)는 임상 분야에서 골 대체물에 대한 자가 이식 및 동종 이식 대안인 생체 물질로서 사용되고 있는데, 생리 조건에서의 분해(degradation) 및 골전도를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 주입식 골 대체물(injectable bone substitute, IBS) 형태인 CPCs는 불균일한 형태의 골 결함을 미리 형성된(Preformed) 지지체를 이용하여 복구하기 어려운 문제를 해결할 수 있다.
미리 성형된 지지체와는 달리 IBS는 in situ에 투입시 주입 후 결함 부위와 호환 가능한 즉각적인 형상을 형성한다. 그러나, 심각한 골 결함 및 불리한 치명적인 상태에서 CPC의 생물학적 활성은 골 재생에 실제로 기여하는데 충분하지 못하다. 따라서, 골 촉진 인자 또는 골 유도 인자가 직접 또는 간접적인 형태로 CPC에 혼입되어 생물학적 성능을 향상시킬 필요가 있다.
종래의 바이오글라스 분말이 포함된 CPC 복합제는 이식 재료의 생물학적 성능을 향상시킬 수 있는 장점이 있다. 바이오글라스 분말은 우수한 생체적합성과 다양한 조직 재생 및 치아 결손뿐만 아니라 경조직 및 연조직 모두에서 광범하게 사용되고 있다. 또한, 우수한 45S5 바이오글라스 분말은 Ca, P 및 Si 이온을 미세환경으로 방출하여 광물질 골과 유사한 신체부위에 위치시킨 후 하이드록시카보네이트 아파타이트(Hydroxycarbonate apatite, HCA) 층을 형성하며 기존 골과 결합하여 신생 골의 성장을 가능하게 한다. 바이오글라스 물질의 용해물 및 생체활성 표면은 골 세포 활성에 광범위한 영향을 미친다. 다시 말해, 골수 기질 세포로부터 골아세포의 표면 유도 분화에 기여하면서, 골전구 세포에서 몇 종의 골아세포 유전자를 상향 조절함으로써 골아세포 발현을 유발한다.
유사한 방식으로, CPC를 함유하는 바이오글라스 분말, 바이오글라스 증착된 이온은 시멘트 표면에 아파타이트 응집을 강화할 뿐만 아니라 기존 골의 상호 작용을 유도한다. 또한, CPC에 바이오글라스 분말을 첨가하여 조절하는 방법으로 생체 활성을 개선할 수 있고 Si2+가 풍부한 미세 환경은 CaO-P2O5가 풍부한 도막의 형성에 영향을 미치기 때문에 이식재(Implat material)의 재흡수 속도를 증가시켜 연조직 반응을 향상시킬 수 있다.
그러나, 주입용(주사용) CPC의 경우 신생 골 형성을 촉진하는 골 조직이 통합되지 않아 시멘트가 조밀하게 형성되는 문제가 있다. 주입용 CPC에 의해 형성된 고유 미세공극(macropores)은 이식 부위 전체에 필요한 영양분 순환과 대사 배출을 가능하게 하여 골 재생에 유리한 영향을 준다. 그러나, 거대공극(micropores) 또는 자유 공간(Liberal space)은 신생 혈관 형성 및 신생 골 형성뿐만 아니라 골 세포의 침습에 매우 필요한데 CPC 단독으로는 거의 생성되지 않으며, 바이오글라스 분말과 CPC를 조합하더라도 이러한 한계를 극복할 수 없다.
KR 10-181537 B1 (2018.01.05. 공고)
본 발명의 목적은 브루샤이트 기반의 시멘트에 바이오글라스 분말 유래 저소결 마이크로스피어를 혼입하여 이식물에 주입함으로써, 이식물의 전반적인 생체 성능을 향상시킬 수 있는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 골 재생용 브루샤이트 시멘트는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 마이크로스피어의 함량은 30~50 부피비(v/v)인 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함한다.
상기 마이크로스피어의 직경이 50 ~ 600㎛일 수 있다.
상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는, 경화시간이 5 내지 12 분이고, 압축강도가 9~11 MPa일 수 있다.
상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는, 골재생용 이식체에 사용될 수 있다.
상기 마이크로스피어는 조골세포의 분화를 촉진할 수 있다.
상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는 주입용 골 대체 시스템(Injectable bone substitute system)에 사용될 수 있다.
상기 마이크로스피어는 900~1,000 ℃에서 15~25분 동안 열처리될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조방법은, (a) 바이오글라스 분말을 제조하는 단계, (b) 상기 (a) 단계의 바이오글라스 분말을 이용하여 마이크로스피어를 제조하는 단계, (c) 브루샤이트 시멘트를 제조하는 단계, 그리고 (d) 상기 (b) 단계의 마이크로스피어와 상기 (c) 단계의 브루샤이트 시멘트를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 바이오글라스 분말은 650~750 ℃에서 10~15 시간 동안 소결될 수 있다.
상기 마이크로스피어는 900~1,000 ℃에서 15~25분 동안 열처리할 수 있다.
상기 (b) 단계는 제조된 마이크로스피어를 냉각하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 (d) 단계는 브루샤이트 시멘트와 마이크로스피어를 7:3 내지 5:5 부피비(v/v)로 혼합할 수 있다.
상기 (a) 바이오글라스 분말을 제조하는 단계는, 35 ml의 TEOS를 1M 질산에 첨가하고 H2O:TEOS 몰비가 18이 되도록 혼합물을 제조하는 과정과, 상기 혼합물을 50~70 분 동안 교반하여 가수분해 하는 과정과, 상기 가수분해된 혼합물과 트리에틸 포스페이트(TEP), 질산 칼슘 4수화물 및 질산 나트륨을 투입하여 졸을 제조하는 과정과, 상기 졸을 밀봉하여 20~30 ℃에서 3~5 일 동안, 60~80 ℃에서 1~3 일 동안 정치하여 겔을 형성하는 과정과, 상기 겔을 110~130 ℃ 오븐에서 12~36 시간 동안 건조하고 막자사발로 분쇄하여 분말을 형성하는 과정과, 상기 분말을 650~750 ℃에서 10~15 시간 동안 열처리하는 과정을 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 및 이의 제조방법을 이용하면 마이크로스피어의 분해에 의해 생성된 빈 공간이 신생 혈관 형성과 신생 골 형성을 촉진할 수 있는 효과가 있다.
마이크로스피어는 브루샤이트 시멘트에서 이온을 용해 및 방출하여 세포 거동을 촉진하여 조골세포 분화를 촉진시키는 효과가 있다.
도 1a는 열처리 전후의 바이오글라스 분말의 XRD 패턴을 분석한 것이다.
도 1b는 구형으로 생성된 마이크로스피어를 촬영한 이미지이다.
도 1c 및 도 1d는 MC3T3E1 세포에 대한 마이크로스피어의 시험관내 세포 반응을 나타낸다.
도 2a는 마이크로스피어 부피에 따른 경화시간을 나타낸 것이다.
도 2b는 마이크로스피어 부피에 따른 압축강도를 나타낸 것이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트(BR/BM)의 파단면 SEM 이미지이다.
도 2d는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 내부의 마이크로스피어 분포를 나타낸 이미지이다.
도 3a는 SBF 용액에 침지한 후 BR 및 BR/BM의 XRD 패턴을 분석한 것이다.
도 3b는 7 일간 SBF 용액에 BR 및 BR/BM을 침지한 후 SEM 및 EDS를 촬영한 이미지이다.
도 3c는 SBF 용액에 침지된 BR 및 BR/BM의 시간에 따른 시험관내 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 3d는 SBF 용액에 침지된 BR 및 BR/BM의 시간에 따른 시험관내 분해도를 나타낸 것이다.
도 4a는 BR 및 BR/BM의 시험관내 생체 적합성 시험에서 시간에 따른 MC3T3E1 배양된 세포의 MTT 분석 그래프이다.
도 4b는 BR 및 BR/BM의 시험관내 생체 적합성 시험에서 시간에 따른 F-액틴 염색을 촬영한 이미지이다.
도 4c는 14 일간 골 형성 조건하에 BR/BM를 이용하여 MCT3E1 세포 배양 후 오스테오폰틴(osteopontin, OPN) 발현을 면역형광 검출 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 4d는 21 일간 골 형성 조건하에 BR/BM를 이용하여 MCT3E1 세포 배양 후 오스테오폰틴(osteopontin, OPN) 발현을 면역형광 검출 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 5a 및 5b는 정상 배지 조건에서 14 및 21 일간 BR 및 BR/BM에서 배양된 MC3T3E1 세포의 알칼리성 포스파타제(ALP) 발현을 나타내는 공초점 면역형광 검출 현미경 이미지이다.
도 5c 및 5d는 골형성 조건에서 14 및 21 일간 BR 및 BR/BM에서 배양된 MC3T3E1 세포의 알칼리성 포스파타제(ALP) 발현을 나타내는 공초점 면역형광 검출 현미경 이미지이다.
도 6a는 BR 및 BR/BM을 토끼 대퇴골에 이식하고 4 및 12 주 후의 마이크로 CT 분석 이미지이다.
도 6b는 BR 및 BR/BM을 토끼 대퇴골에 이식하고 4 및 12 주 후의 마이크로 CT 분석에서 신생 골형성에 대한 정량분석 그래프이다.
도 7a1 내지 7b3은 BR 및 BR/BM을 토끼 대퇴부에 이식하고 4 주 후의 포매 블록 이미지, 전체 결함 부위의 H&E 염색 이미지, 및 물질 분해 및 신생 골 형성을 보여주는 숙주 이식 계면의 확대 이미지이다.
도 8a1 내지 8a3은 BR을 토끼 대퇴부에 이식하고 12 주 후의 포매 블록 이미지, 전체 결함 부위의 H&E 염색 이미지, 및 물질 분해 및 신생 골 형성을 보여주는 숙주 이식 계면의 확대 이미지이다.
도 8b1 내지 8b4은 BR/BM을 토끼 대퇴부에 이식하고 12 주 후의 포매 블록 이미지, 전체 결함 부위의 H&E 염색 이미지, 깊은 골 성장을 보여주는 이미지, 및 물질 분해 및 신생 골 형성을 보여주는 숙주 이식 계면의 확대 이미지이다.
이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 약, 실질적으로 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 골재생용 브루샤이트 시멘트는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 것을 특징으로 한다.
현재 bioglass-calcium phosphate cement (CPC) 복합 재료는 biocompatibility와 bone ingrowths의 면에서 개선된 특성으로 인해 뼈 재생을 위해 관심이 커지고 있다.
본 발명은 주입용 뼈 대체물(injectable bone substitute, IBS) 시스템에 관한 것이며, 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 브루샤이트 기반 시멘트에 혼합하여 평가하였다.
본 발명에서 사용되는 마이크로스피어는 간단하고 낮은 소결 온도 공정으로 합성되었으며, 세포에 대한 우수한 상호 작용을 나타냈으며, 물리적 성질은 마이크로스피어가 삽인된 브루샤이트 시멘트에서 최적화된 것이다.
상기 마이크로스피어의 함량은 30~50 부피비(v/v)일 수 있으며 바람직하게는 40 부피비(v/v)일 수 있다.
상기 마이크로스피어의 함량이 30 미만이면 원하는 정도의 기공을 충분히 형성할 수 없고, 50를 초과하면 과다한 마이크로스피어의 투입으로 인해 브루샤이트 시멘트와 혼합 및 결합에 문제가 발생할 수 있을 뿐만아니라 압축강도는 낮아지고 경화시간은 크게 증가하는 문제점이 있어 상기한 범위가 바람직하다.
상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는, 경화시간이 5 내지 12 분이고, 압축강도가 9~11 MPa이다.
상기 경화 시간 및 압축 강도는 시험관내 및 생체내 성능에 대해 마이크로스피어의 40 %(v/v)가 될 때까지 거의 변하지 않았다.
상기 마이크로스피어의 직경이 50 ~ 600 ㎛일 수 있으며, 바람직하게는 100~500 ㎛수 있으며, 더욱 바람직하게는 200~300 ㎛일 수 있다.
상기 마이크로스피어의 직경이 상기 범위일 때 생분해되어 기공을 형성할 때 골세포 및/또는 기타 생체 조직들에 의해 빈 공간을 용이하게 수복할 수 있으며, 최종적으로 마이크로스피어가 분해되어 골조직이 생성될 때 유용한 공간을 확보할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 Brushite(BR)/bioglass microsphere(BM) 시멘트는 시험관내 세포실험에서 우수한 생체 활성을 나타냈다. 또한, BR/BM 복합재료의 용존 이온은 아파타이트 성장을 유도하였으며, 산성 pH로 인해 재료 분해를 증가시켰다.
상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는, 골재생용 이식체에 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "이식체(또는 임플란트, implant)"는, 인체 내에서 손상된 부위를 대체 및 수복하기 위하여 사용되는 인공 장기나 이식용 재료 등을 포함하는 것으로, 기관 장기에 이식할 수 있는 성형된 부품, 예컨대 막, 고정 박판, 입체적 또는 공간적 부품, 또는 나사, 핀, 리벳, 압정 등의 고정 수단 등과 같이 치료 중에 조직을 지지하거나 부착시키는 용도, 또는 조직을 다른 조직으로부터 분리시키는 용도에 사용되는 것을 의미한다. 상기 본 발명의 이식체는 골 재생용 및 골 대체용일 수 있다.
본 발명의 이식체는 생체적합성이 향상되어 세포 부착에 유리할 뿐만 아니라 생체 내에 이식한 후 복합체 내부에 매립된 바이오글라스 유래 마이크로스피어가 시간이 지남에 따라 분해되어 기공을 형성하고 이에 신생 골세포들이 채워질 수 있어 단순한 골 대체효과를 넘어 우수한 골재생 효과를 나타낼 수 있다.
상기 마이크로스피어는 조골세포의 분화를 촉진한다.
상기 마이크로스피어는 세포의 성장과 증식에 광범위하게 기여할 수 있는데, 상기 마이크로스피어가 분해되어 방출된 바이오글라스 이온이 세포 및 조골세포의 분화를 촉진한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 BR/BM은 전골아세포주(MC3T3-E1)를 이용한 시험관내 실험에서 세포 부착 및 증식을 유도하였으며, 골 형성 보조제가 없는 정상 성장 배지와 골 형성 유도 배지 모두에서 BR/BM이 골 형성 분화를 유도하는 것을 확인하였다.
더불어 대퇴부 결함 부위의 이식 후 in vive 실험에서 BR에 비해 BR/BM에서 더 높은 재료 분해와 골 형성을 보였으며, 바이오글라스 마이크로스피어의 빠른 용해는 재료 재흡수를 증가시켰다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 BR/BM 시멘트는 뼈 조직 통합을 촉진하며, 뼈 재생 응용을 위한 주입용 뼈 대체물로서의 사용할 수 있는 것을 확인하였다.
상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는 주입용 골 대체 시스템(Injectable bone substitute system)에 사용될 수 있다.
상기 마이크로스피어는 900~1,000 ℃에서 15~25분 동안 열처리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 950 ℃에서 20 분 일 수 있다.
상기 열처리하는 이유는 마이크로스피어의 강도를 높이기 위함이며, 상기 열처리 온도를 벗어나면 마이크로스피어의 형태가 변형되고, 완벽한 구형의 마이크로스피어를 제조할 수 없다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조방법에 대하여 설명한다.
본 발명에 따른 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조방법은, (a) 바이오글라스 분말을 제조하는 단계, (b) 상기 (a) 단계의 바이오글라스 분말을 이용하여 마이크로스피어를 제조하는 단계, (c) 브루샤이트 시멘트를 제조하는 단계, 그리고 (d) 상기 (b) 단계의 마이크로스피어와 상기 (c) 단계의 브루샤이트 시멘트를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계의 바이오글라스 분말을 제조하는 단계는, 35 ml의 TEOS를 1M 질산에 첨가하고 H2O:TEOS 몰비가 18이 되도록 혼합물을 제조하는 과정과, 상기 혼합물을 50~60 분 동안 교반하여 가수분해 하는 과정과, 상기 가수분해된 혼합물과 TEP, 질산 칼슘 4수화물 및 질산 나트륨을 투입하여 졸을 제조하는 과정과, 상기 졸을 밀봉하여 20~30 ℃에서 4일 동안, 70 ℃에서 2 일 동안 정치하여 겔을 형성하는 과정과, 상기 겔을 120 ℃ 오븐에서 12~36 시간 동안 건조하고 막자사발로 분쇄하여 분말을 형성하는 과정과, 상기 분말은 650~750 ℃에서 10~15 시간 동안 하는 과정을 포함한다.
상기 바이오글라스 분말은 650~750 ℃에서 10~15 시간 동안 소결될 수 있다.
상기 바이오글라스 분말을 소결시키는 이유는 질산염을 완전히 제거하여 순수한 바이오글라스 분말을 수득하기 위함이다.
상기 소결이 완료된 바이오글라스 분말(45S5)의 최종 조성은 mol%로 46% SiO2, 24% Na2O, 26% CaO 및 2.6% P2O5일 수 있다.
상기 (b) 상기 (a) 단계의 바이오글라스 분말을 이용하여 마이크로스피어를 제조하는 단계이다.
상기 (b) 단계는 소결이 완료되어 순수한 바이오글라스 분말을 "유중수 (water in oil)" 방법으로 제조할 수 있다.
상기 (b) 단계는 1 중량%의 아가로오스(I-B형, 시그마 알드리치사)를 일정한 속도로 교반하면서 용융 온도의 증류수에 용해시켜 용해액을 제조하는 과정과, 상기 용해액이 반투명해지면 30 %의 바이오글라스 분말을 첨가하여 균일한 슬러리를 제조하는 과정과, 상기 슬러리를 교반 중인 오일에 300 내지 400 rpm의 속도로 10 ml 주사기를 이용하여 첨가한 후 10 분간 교반하고 생성된 마이크로스피어를 아세톤으로 세척는 과정과, 세척된 마이크로스피어를 공기 중에서 건조하고 950 ℃에서 20 분간 노(Furnace)를 사용하여 중합체를 연소(소결)시키는 과정을 포함할 수 있다.
상기 (b) 단계는 제조된 마이크로스피어를 냉각하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 냉각은 상기 소결 온도를 5℃/분 속도로 단계적으로 냉각할 수 있다.
상기 (c) 단계는 브루샤이트 시멘트를 제조하는 단계이다.
상기 브루샤이트 시멘트는 60 % β-트리칼슘 인산염(β-TCP (Ca3(PO4)2)) 및 40 % 모노칼슘 인산염 일수화물(MCPM (Ca(H2PO4)2·H2O)) 및 0.5M 구연산 이온 용액을 사용하여 브루샤이트 시멘트를 제조할 수 있으며, 이는 통상의 기술자라면 쉽게 제조할 수 있는 것으로 이에 대한 설명은 생략하도록 한다.
상기 (d) 단계는 상기 (b) 단계의 마이크로스피어와 상기 (c) 단계의 브루샤이트 시멘트를 혼합하는 단계이며, 상기 (d) 단계는 브루샤이트 시멘트와 마이크로스피어를 7:3 내지 5:5 부피비(v/v)로 혼합할 수 있으며 바람직하게는 6:4 부피비(v/v)로 포함할 수 있다.
상기 마이크로스피어의 함량이 상기한 범위를 범어나면 원하는 정도의 기공을 충분히 형성할 수 없고, 과다한 마이크로스피어의 투입될 경우 브루샤이트 시멘트와 혼합 및 결합에 문제가 발생할 수 있을 뿐만아니라 압축강도는 낮아지고 경화시간은 크게 증가하는 문제점이 있어 상기한 범위가 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 45S5 생체 활성 유리 분말 합성
테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), 트리에틸 포스페이트(TEP), 질산칼슘 4수화물(Ca(NO3)2·4H2O), 질산 나트륨(NaNO3)을 시그마-알드리치사(USA)에서 구입하였다.
45S5S 분말 약 20 g의 유리 졸을 얻기 위해, 먼저 35 ml의 TEOS를 1M 질산에 첨가하여 500 ml 듀란 실험용 유리병에서 H2O:TEOS 몰비가 18이 되도록 하였다.
상기 혼합물을 투명한 용액으로 가수 분해하기 위해 60 분간 일정한 속도로 교반하였다. 이후 용액이 투명해 졌을 때, TEP, 질산 칼슘 4수화물 및 질산 나트륨을 초기 혼합물에 첨가하였다.
겔을 형성하기 위해, 상기와 같이 제조된 졸을 밀봉한 후 실온에서 4 일간, 70 ℃에서 2 일간 정치하였다.
이후, 오븐에서 120 ℃에서 1 일간 건조한 후, 막자 사발(agate mortar)을 사용하여 고체 시료를 분말로 분쇄하였다. 상기 분말은 700 ℃에서 12 시간 열처리로 안정화하였고, 구조물 내의 질산염을 제거하여 45S5 생체 활성 유리(바이오글라스) 분말 합성하였다.
상기 제조된 생체 활성 유리 45S5의 최종 조성은 mol%로 46% SiO2, 24% Na2O, 26% CaO 및 2.6% P2O5였다.
실시예 2: 45S5 바이오글라스 유래 마이크로스피어의 제조
45S5 바이오글라스 유래 마이크로스피어는 "유중수 (water in oil)" 방법으로 제조하였다. 1 중량%의 아가로오스(I-B형, 시그마 알드리치사)를 일정한 속도로 교반하면서 용융 온도의 증류수에 용해하였다.
반투명액이 얻어지면, 실시예 1에서 제조된 30 %의 바이오글라스 분말을 용액에 첨가하여 균일한 슬러리를 제조하였다.
다음으로, 슬러리를 교반 중인 오일에 300 내지 400 rpm의 속도로 10 ml 주사기를 이용하여 첨가하였다. 10 분간 교반한 후, 생성된 마이크로스피어를 아세톤으로 세척하여 오일을 제거하였다.
제조된 마이크로스피어를 공기 중에서 건조하고, 950 ℃에서 20 분간 노(Furnace)를 사용하여 중합체를 연소(소결)하였다.
소결 온도를 높이고 5℃/분 속도로 단계적으로 냉각하였다.
실시예 3: 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조
60 % β-트리칼슘 인산염 (β-TCP (Ca3(PO4)2), 이노본, 한국) 및 40 % 모노칼슘 인산염 일수화물 (MCPM (Ca(H2PO4)2·H2O), 쥰세이, 일본) 분말을 고상으로 사용하고, 0.5M 구연산 이온 용액(삼천, 한국)을 액상으로 사용하여 브루샤이트 시멘트를 제조하였다.
시멘트 페이스트는 분말과 액체를 사발에 넣고 주걱으로 섞은 다음 16 Х 8 mm 테프론 몰드에 1 ml 바늘 없는 상업용 주사기를 이용하여 첨가하여 제조하였다.
경화 시간 및 압축 강도는 C266-ASTM 표준 방법에 따라 측정하였다.
바이오글라스 마이크로스피어(BM)를 포함한 브루샤이트(BR/BM)를 제조하기 위해서, 마이크로스피어를 상기 시멘트 페이스트와 다른 부피비(v/v)로 하기의 표 1과 같이 구연산 이온 용액을 이용하여 혼합하여 제조를 완료하였다.
[표 1]
Figure 112019071820518-pat00001
하기의 실험에서는 두 가지 유형의 시료, 브루샤이트 (BR) 및 40 부피비(v/v) 바이오글라스 마이크로스피어를 갖는 브루샤이트(BR/BM)를 실험들에 사용하였다.
[실험방법]
1. SBF(Simulated Body Fluid) 용액에서 시멘트의 pH 값
pH값 변화는 시료를 SBF 용액에 침지하여 측정하였다. 페이스트 시편을 6 x 8 mm 테프론 몰드에 붓고 24 시간 경화시킨 후 몰드에서 분리하였다. 경화된 시료는 원추형 튜브에 포함된 5 ml SBF 용액에 침지하여 37 ℃ 진탕기에 두었으며, SBF 용액은 매일 교체하였다. 각각의 시간 후에, SBF 용액의 pH값을 pH 미터(pH benchtop, Thermo Scientific)로 측정하였다.
2. SBF 용액에서 시험관 내 생체 활성 시험
경화된 시료를 SBF 용액에 담그고 37 ℃에서 7 일간 진탕기(shaker)에 방치하였다. 용액 배지는 격일마다 교체하였으며, 시료 표면에 하이드록시아파타이트가 풍부한 광물의 침착을 평가하기 위해, 매일 시료를 탈이온수로 세척하고 동결 건조기로 건조하여 SEM으로 관찰하였다. 상변화는 7일과 14일 간 XRD로 분석하였다.
3. SBF 용액에서 시멘트의 시험관내 분해 시험
6 x 8 mm의 경화된 시료를 탈이온수로 세척한 후 초기 무게를 측정하기 전에 24 시간 동결 건조하였다. 그 후, 건조된 시료를 원추형 튜브에 포함된 5 ml SBF 용액에 넣고 37 ℃의 진탕기에 두었으며, 배지 용액은 격일마다 교체하였다.
각 날마다 배지 용액에서 시료를 취하여 탈이온수로 세척하고 24 시간 동결 건조하여 일정한 중량을 수득하였다.
시험관 내 분해(degradation)는 하기의 식으로 계산하였다.
중량 손실 백분율 = [(S0-St)/S0] Х 100%,
여기서, S0는 초기 중량을 나타낸 것이고, St는 분해된 시료의 중량을 나타낸다. 평균값은 그룹별로 5회 시험을 수행하여 얻었다.
4. MC3T3-E1 세포를 이용한 시험관내 생체 적합성 시험
24-웰 세포 배양판에 2 x 104 cells/well의 밀도로 마우스 전골아세포주 (MC3T3-E1, American Type Culture Collection, Manassas, VA)를 지름 8 mm의 BR 및 BR/BM에 도말하였다. 10 % FBS와 1% PS(Sigma-Aldrich)가 첨가된 α-최소 필수 배지(MEM)를 함유한 시료 플레이트를 7 일간 가습 배양기에서 5 % CO2로 37 ℃에서 배양하였다.
48시간마다 배지를 교체하였으며, 시료 채취일마다 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT, Sigma-Aldrich) 용액을 웰에 첨가한 후, 4 시간 다시 배양하였다.
디메틸 설폭사이드(Samchun Pure Chemical, Korea)를 첨가한 후, 배양 플레이트를 쉐이터(Shaker)에 1 시간 동안 두었다.
24-웰 플레이트로부터 반응액 200 μl를 96-웰 플레이트로 취하여 595 nm 흡광도(ISO 10993-5:20099E0)에서 효소 결합 면역 측정법(ELISA) 판독기(Infinite F50, Tecan, Austria)를 이용하여 광학 밀도(OD) 값을 측정하였다.
F-액틴 분석을 위해, 세포를 BR 및 BR/BM를 포함하는 24-웰 배양 플레이트에 7 일간 2 X 104 cells/well의 밀도로 접종하였다. 세포골격 액틴 필라멘트(Sigma-Aldrich)를 분석하기 위해 플루오레세인 이소티오시아네이트 팔로이딘 컨쥬게이트로 면역염색하고 핵은 Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich)로 대조 염색하여 공초점 형광 현미경 (FV10i-W, Olympus, Japan)으로 촬영하고, FV10i-ASW 3.0 뷰어 소프트웨어를 사용하여 현미경 이미지를 분석하였다.
5. 세포 분화 연구
MC3T3-E1 세포의 알카라인 포스파타제(ALP) 및 오스테오폰틴(OPN) 발현은 면역세포화학 분석을 사용한 골 형성 분화 마커로 평가되고 있다.
MC3T3-E1 세포를 트립신으로 처리하고, 재현탁하여, 24-웰 플레이트에 위치한 8 mm 직경의 BR 및 BR/BM 시료에 50 ㎕의 3 X 104 세포를 접종하였다.
초기 부착을 위해서, 세포 접종된 시료를 가습 배양기에서 2 시간 배양하였다.
상기 시료에 세포 부착이 완료되면, 10 % FBS 및 1 % PS이 보충된 성장 배지를 웰에 첨가하였다. 상기 시료에서 세포 합류층(confluent layer)이 생기면, 3 일 이내에 시료를 골 형성 배지에서 배양하였다. 상기 배지에 골 형성을 유도하는 50 μg/ml L-아스코르브산, 10 mM β-글리세롤로포스페이트 및 10 nM 덱사메타손을 으로 보충하고 3 일마다 교체하였다.
마이크로스피어 용해물의 잠재적인 효과를 분석하기 위해 ALP 발현도 정상 성장 배지에서 평가하였다. 각 날마다 시료 위의 세포를 PBS로 세척하고, 실온에서 15 분간 4 % 파라포름알데히드에 고정시킨 후, 비특이적 염색을 위한 블로킹 용액인5 % BSA로 처리하였다. ALP 발현 분석을 위한 토끼 ALP 항체(1:50; Santa Cruz Biotechnology)와 OPN 발현 분석을 위한 마우스 OPN 항체(1:50; Santa Cruz Biotechnology)를 첨가하고 4 ℃에서 밤새 정치하였다. PBS로 3 회 세척한 후, 2 차 항체인 Alexa Fluor 488(1 : 1000, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 1 차 항체와 반응시켰다. 또한, 상기 시료는 F-액틴 분석을 위해 Alexa Fluor 594 팔로이딘과 DAPI에 의해 염색되었으며 적색으로 표지하고 핵은 청색으로 표지하였다. 시각화 검사는 공초점 현미경으로 수행하고 이미지은 60X 배율로 촬영하였다.
6. 토끼 대퇴골의 생체 내 이식
생체 내 실험을 위해 두 가지 유형의 시료인 BR과 BR/BM을 그룹별로 4 주 및 12 주 동안 3 회 반복하여 토끼 대퇴골에 이식하였으며, 각 그룹에서 각 기간동안 3회 반복 실험하였다. 수컷 뉴질랜드 토끼 12 마리를 수술 7 일 전에 동물 실험실에 넣었다. 동물을 각각 스테인리스강 우리에 넣고 표준 음식과 물을 제공하였다. 동물 케어와 실험에 대해서는 순천향대학교 동물 윤리위원회의 승인을 받아 실험을 수행했다. 동물은 대퇴골 노출 전에 산소와 이소플루란 증기 혼합물을 흡입하여 마취시켰다(TERRELLTM Isoflurane, Piramal Critical Care Inc.).
지름 6 mm, 두께 5 mm의 결함은 트레핀 드릴을 이용하여 형성하였고 즉시 준비된 BR과 BR/BM 시료로 충진하였다. 그 후, 수술 부위를 층 형태로 폐쇄하고 봉합했다. 수술 후 감염을 예방하기 위해 항생제(Baytril, Bayer Korea)를 3 일간 매일 근육 내 주사하였다. 4 주 및 12 주 후, 전신 마취하에 동물에 공기를 정맥 주사하여 희생시키고 골 시료를 추출하였다. 추출된 시료는 마이크로 전산화 단층 촬영 (micro-computed tomography, micro-CT)를 위해 10 % 포르말린에서 3 일간 고정하였다.
마이크로 CT 스캔이 완료되면, 조직학적 분석이 준비될 때까지 실온에서 시료를 보관하였다. 마이크로-CT 분석을 위해 이식 추출물의 X선 방사선 이미지 촬영에는 Skyscan Deskop Micro-CT 1172(Aartselaar, Belgium)를 사용하였다. 소스 전압은 60 kV였고 전류는 167 μ A였다. 결함은 스캔 이미지으로부터 재구성되었고 신생 골 형성의 정량 측정은 Skyscan 소프트웨어로 수행되었다. 조직학적 염색을 위해 5 % 질산으로 시료를 탈석회화(decalcification)였다. 그 후, 시료를 에탄올과 자일렌으로 순차적으로 탈수시켜 알코올을 제거하였다. 시료를 파라핀 왁스에 포매(embedding)한 후, 마이크로톰(HM325, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 5 ㎛ 조직 절편으로 절단하였다. 조직 절편을 유리 슬라이드에 고정시키고 헤마톡실린과 에오신(H & E)으로 염색하고, 광학 현미경(BX53, 올림푸스, 일본)을 이용하여 염색된 조직 부위를 촬영하였다.
7. 통계 분석
모든 반복된 실험 데이터는 평균 표준 편차(SD)로 나타내었다. 통계 분석은 스튜던트 t-검정 또는 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 수행되었으며, p <0.05의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
[실험결과]
실험예 1: 45S5 생체 활성 유리(바이오글라스) 분말과 마이크로스피어의 특성 분석
45S5 바이오글라스(생체 활성 유리) 분말과 마이크로스피어의 상 조성은 X선 회절(XRD; D/MAZ-250, Rigaku, Japan)에 의해 특성화하였다. 생성된 마이크로스피어의 생체 적합성은 조골세포(MC3T3-E1)와 함께 배양하여 평가하였다.
도 1a의 A(검정) 피크를 참조하면, 열처리 전 바이오글라스 분말의 XRD 패턴은 비정질상과 질산염 함량을 나타내어 합성 과정의 순도를 확인할 수 있다.
도 1a의 B(적색) 피크를 참조하면 700 ℃에서 열처리 후 바이오글라스 분말의 XRD 패턴은 결정상 Na2-Ca2Si3O9 (컴바이트, combeite)가 나타나므로 결과적으로 질산염 함량이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 1b를 참조하면, 생성된 마이크로스피어는 효과적인 방법으로 성공적으로 제조된 것을 확인할 수 있으며, 50 내지 600 μm 크기의 구형의 형태인 것을 확인할 수 있다.
도 1a의 C(파란) 피크를 참조하면, 마이크로스피어의 회절 피크에서는 결정질의 아파타이트 유사 인이 풍부한 상인 Na2Ca4(PO4)2SiO4가 거의 나타나지 않았다.
도 1c 및 도 1d는 MC3T3E1 세포에 대한 마이크로스피어의 시험관내 세포 반응을 나타낸다. 마이크로스피어는 세포 부착, 즉 세포 성장과 증식에 광범위하게 기여하였다. 세포가 단단히 부착되고 정상 형태의 외관을 가진 마이크로스피어에 잘 분포되었으며, 이는 마이크로스피어의 제조방법이 생체 적합성을 손상시키지 않았음을 증명하는 것이다.
실험예 2: 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 특성 분석
브루샤이트(BR) 시멘트와 마이크로스피어를 함유한 브루샤이트 시멘트(BR/BM)의 경화시간 및 압축강도는 C266-ASTM 표준 방법으로 측정하였으며, 브루샤이트(BR) 시멘트와 마이크로스피어를 함유한 브루샤이트 시멘트(BR/BM)의 상조성은 X선 회절을 통해 특징을 규명하였다. 프캐폴드(지지체)의 파단 형태와 마이크로스피어 분포를 SEM 분석하였다. 시멘트 내부의 마이크로스피어 분포는 마이크로 CT 스캔 사진으로부터 3D 재구성하여 관찰하였다.
도 2a는 마이크로스피어 부피에 따른 경화시간을 나타낸 것이며, 도 2b는 마이크로스피어 부피에 따른 압축강도를 나타낸 것이고, 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트(BR/BM)의 파단면 SEM 이미지이며, 도 2d는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트 내부의 마이크로스피어 분포를 나타낸 이미지이다.
도 2a 내지 도 2d를 참조하면, 브루샤이트 시멘트에 바이오글라스 마이크로스피어를 첨가함으로써, 경화 시간 및 압축 강도는 마이크로스피어의 40 %(v/v)를 첨가할 때까지 현저한 변화는 없었으며, 마이크로스피어의 최대 40 %까지는 경화 시간 범위는 5 내지 12 분이었으며 압축 강도는 약 10 MPa였다. 추가 연구를 위해 마이크로스피어를 포함하지 않은 브루샤이트와 40 %(v/v) 마이크로스피어를 포함한 브루샤이트를 선택하고 BR 및 BR/BM으로 각각 지정하였다. 또한, 도 2c의 SEM 사진을 통해 마이크로스피어와 시멘트가 공존하는 것을 확인할 수 있으며, 도 2d를 통해 마이크로스피어는 브루샤이트 시멘트 전체에 잘 분산되어 있는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3: SBF내 물질의 시험관내 생체 활성 및 골 형성 특성 분석
시료의 생체 활성 및 골 형성 특성을 확인하기 위하여 BR, BR/BM을 SBF 용액에 침지하여 시험관내 반응을 확인하였다.
도 3a를 참조하면, SBF에 침지하기 전 BR은 디칼슘 포스페이트 디하이드레이트(dicalcium phosphate dehydrate, DCPD)와 미반응 β-TCP의 모든 특징적인 피크를 확인할 수 있다. BR의 경우, 침지시간이 경과함에 따라 미반응 β-TCP는 DCPD 결정이 성숙할 때까지 감소하였는데, 이는 아파타이트의 형성을 나타낸다. 반면에, 바이오글라스 마이크로스피어(BR/BM)를 첨가하면 브루샤이트의 피크 강도가 감소하고, 이는 바이오글라스와 브루샤이트 피크의 중첩에 의한 것이다.
한편, SBF 용액에 침지하는 시간에 따라 여러 피크 강도가 증가 또는 감소하였는데, 이는 미세 환경에 미치는 바이오글라스 마이크로스피어의 영향을 의미한다. SBF에 노출된 후 SEM 사진과 EDS 표면 프로파일에서 바이오글라스 마이크로스피어의 용해도와 미세환경에 미치는 영향이 확인되었다(도 3b).
도 3c를 참조하면 7 일 후, 표면 형태 분석 결과 BR에 비해 BR/BM에서 아파타이트 형성이 우수한 것을 보여주었는데, 이는 미세 환경에 더 많은 이온이 퇴적되고 표면에 축적되기 때문이다. 산성 pH는 시간이 지남에 따라 거의 중화되는 것을 확인할 수 있다.
그 결과로 BR/BM의 분해 속도가 증가되었다. 이는 물질 분해에 대한 용액 매개 반응이 바이오글라스 마이크로스피어가 첨가된 브루샤이트 시멘트의 조절된 pH에 의해 분해속도가 방해를 받지 않았기 때문이다(도 3d).
실험예 4: 시험관내 생체적합성 및 재료에 대한 세포 반응 분석
시험관내 생체적합성은 BR 및 BR/BM 시료에서 배양된 MC3T3E1 세포로 평가하였으며, 골 형성 표지자인 ONP와 ALP에 미치는 재료 효과 및 이온 방출 효과를 조사하였다.
도 4a 및 도 4b를 참조하면, MTT 분석에서 BR, 및 BR/BM 그룹 간에 유의한 차이는 발견되지 않았지만 7일의 배양 기간 후 BR/BM는 세포에 대한 독성이 없는 것을 확인할 수 있다. 그리고 BR 및 BR/BM 모두 세포 성장 및 증식에 기여하는 것을 보여주었다.
시험관내에서, 골 형성 표지자인 ONP와 ALP에 미치는 재료 효과 및 이온 방출 효과를 조사하였다. 도 4c 및 도 4d는 14일과 21일에 BR과 BR/BM 모두에서 수많은 핵(청색 염색)이 나타나는 것을 보여준다
도 4c 및 도 4d를 참조하면, BR/BM의 OPN 발현 강도는 14 일에 BR 보다 높았고, 21 일에 감소하였으나, BR의 강도는 21에 증가하였다.
도 5a 및 도 5b를 참조하면, 골 형성 보충제가 없는 정상 성장 배지에서 BR과 별개로 ALP 발현에 대한 현저한 형광이 BR/BM에서 관찰되었다. 그러나, ALP에 대한 형광 강도는 BR/BM에서 21 일 내에 감소하였다. 이러한 결과는 마이크로스피어가 분해되어 방출된 바이오글라스 이온이 세포 분화 초기에 영향을 미친 것을 의미한다. 또한, 골 형성 처리 배지에서 BR에 비해 BR/BM이 14 일후 보다 강한 ALP 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있으며(도 5c), 21 일에는 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 5d).
실험예 5: 생체내 평가를 위한 마이크로-CT 및 조직학적 분석
생체내 평가를 위해 마이크로-CT 분석을 수행하였다.
도 6a는 BR 및 BR/BM을 토끼 대퇴골에 이식하고 4 및 12 주 후의 마이크로 CT 분석 이미지이고, 도 6b는 BR 및 BR/BM을 토끼 대퇴골에 이식하고 4 및 12 주 후의 마이크로 CT 분석에서 신생 골형성에 대한 정량분석 그래프이다.
도 6a를 참조하면, BR, BR/BM의 이식 후 2 차원 (2D)단면 사진을 통해, 이식재료(BR/BM)과 숙주 골이 강한 상호 작용이 있고 이러한 상호 작용이 저하되지 않음을 확인할 수 있다. BR/BM 이식 후 4 주에는 시멘트와 골 사이의 계면에서 BR 보다 심한 시멘트 분해를 나타냈으며, 이러한 현상은 12 주에 더욱 두드러졌다. 시멘트의 계면 외관의 차이가 많다는 것은 재료 흡수와 골의 내부 성장이 증가한 것을 의미한다.
도 6b를 참조하면, 마이크로 CT 스캔에 의한 신생 골 형성의 정량 평가에서는 시간이 지남에 따라 BR/BM가 BR 보다 유의하게 (p<0.05) 증가함을 보였다.
도 7a1 내지 7b3은 BR 및 BR/BM을 토끼 대퇴부에 이식하고 4 주 후의 포매 블록 이미지, 전체 결함 부위의 H&E 염색 이미지, 및 물질 분해 및 신생 골 형성을 보여주는 숙주 이식 계면의 확대 이미지이다.
도 7을 참조하면 이식 후 4주째 조직 절편에서 BR 및 BR/BM 이식 결손 주변부에서 골 형성이 나타났다. BR/BM의 마이크로스피어가 분해되기 시작하여 계면 측면 마이크로스피어의 유리 용해물(Glass dissolution droduct)이 숙주 이식 초기 단계 계면에서 더 많은 세포 반응을 일으키는 것을 확인할 수 있다(도 7b3). 4 주의 포배 부위(도 7b1)에서 마이크로스피어 분포는 그레이스케일 3D 재구성과 잘 일치한다(도 2d, 참고)
도 8a1 내지 8a3은 BR을 토끼 대퇴부에 이식하고 12 주 후의 포매 블록 이미지, 전체 결함 부위의 H&E 염색 이미지, 및 물질 분해 및 신생 골 형성을 보여주는 숙주 이식 계면의 확대 이미지이고, 도 8b1 내지 8b4은 BR/BM을 토끼 대퇴부에 이식하고 12 주 후의 포매 블록 이미지, 전체 결함 부위의 H&E 염색 이미지, 깊은 골 성장을 보여주는 이미지, 및 물질 분해 및 신생 골 형성을 보여주는 숙주 이식 계면의 확대 이미지이다.
도 8을 참고하면, 12 주에 BR/BM 마이크로스피어는 거의 분해되었다(도 8b1). 12 주에 BR/BM에서는 계면이 거의 발견되지 않았고, 마이크로스피어의 분해로 인해 골 세포와 상호 작용하는 중공이 형성되었으며, 세포 침입이 관찰되었다. 또한, 임플란트(Imprant) 재흡수가 증가되었다(도 8b1, b2). 바이오글라스 마이크로스피어의 용해물은 생리적 환경에 노출되었을 때 골 세포의 이동에 영향을 미치고, 신생 혈관을 형성하였다(도 8b4). 반면에, 12 주 후에도 BR 임플란트 분해와 이에 따른 신생 골 형성은 결함 주변부에서만 일어는 것을 확인할 수 있다(도 8a2, 8a3).
이상, 본 발명을 바람직한 실시예를 사용하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.

Claims (14)

  1. 직경이 50 ~ 600㎛이고, 구형인 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 30~50 부피비(v/v)로 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에서,
    상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는,
    경화시간이 5 내지 12 분이고,
    압축강도가 9~11 MPa인 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트.
  5. 제1항에서,
    상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는,
    골재생용 이식체에 사용되는 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트.
  6. 제1항에서,
    상기 마이크로스피어는 조골세포의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트.
  7. 제1항에서,
    상기 골재생용 브루샤이트 시멘트는 주입용 골 대체 시스템(Injectable bone substitute system)에 사용되는 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트.
  8. 제1항에서,
    상기 마이크로스피어는 900~1,000 ℃에서 15~25분 동안 열처리된 것임을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트.
  9. (a) 바이오글라스 분말을 제조하는 단계,
    (b) 상기 (a) 단계의 바이오글라스 분말을 이용하여 마이크로스피어를 제조하는 단계,
    (c) 브루샤이트 시멘트를 제조하는 단계, 그리고
    (d) 상기 (b) 단계의 마이크로스피어와 상기 (c) 단계의 브루샤이트 시멘트를 혼합하는 단계를 포함하고,
    상기 (d) 단계는, 상기 마이크로스피어와 브루샤이트 시멘트를 3:7 내지 5:5 부피비(v/v)로 혼합하는 것이며,
    상기 마이크로스피어는 구형이고, 직경이 50 ~ 600㎛인, 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조방법.
  10. 제9항에서,
    상기 바이오글라스 분말은 650~750 ℃에서 10~15 시간 동안 소결되는 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조방법.
  11. 제9항에서,
    상기 마이크로스피어는 900~1,000 ℃에서 15~25분 동안 열처리하는 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조방법.
  12. 제9항에서,
    상기 (b) 단계는 제조된 마이크로스피어를 냉각하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 제9항에서,
    상기 (a) 바이오글라스 분말을 제조하는 단계는,
    35 ml의 TEOS를 1M 질산에 첨가하고 H2O:TEOS 몰비가 18이 되도록 혼합물을 제조하는 과정과,
    상기 혼합물을 50~70 분 동안 교반하여 가수분해 하는 과정과,
    상기 가수분해된 혼합물과 트리에틸 포스페이트(TEP), 질산 칼슘 4수화물 및 질산 나트륨을 투입하여 졸을 제조하는 과정과,
    상기 졸을 밀봉하여 20~30 ℃에서 3~5 일 동안, 60~80 ℃에서 1~3 일 동안 정치하여 겔을 형성하는 과정과,
    상기 겔을 110~130 ℃ 오븐에서 12~36 시간 동안 건조하고 막자사발로 분쇄하여 분말을 형성하는 과정과,
    상기 분말을 650~750 ℃에서 10~15 시간 동안 열처리하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오글라스 유래 마이크로스피어를 포함하는 골재생용 브루샤이트 시멘트의 제조방법.
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