KR101671585B1 - 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물 및 이의 제조를 위한 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물 및 이의 제조를 위한 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따른 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물은 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 함유함으로써 인산칼슘 골시멘트의 표면적을 증가시키고 단백질 담지 및 전달이 가능할 뿐만 아니라 인산칼슘 골시멘트의 물리적 강도를 증가시키면서 생체 내 이식 후 분해성을 증가시킬 수 있으므로 생체 내에 원하는 부위에 안전하고 효과적으로 뼈의 재생속도를 촉진시킬 수 있어 골 충진제 및 골 대체제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물 및 이의 제조를 위한 키트{A bioactive nanocomposite calcium phosphate bone cement composition and a kit for preparing the same}

본 발명은 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물 및 이의 제조를 위한 키트에 관한 것이다.

인산 칼슘 시멘트(CPC)는 골 조직 복구 및 재생에 널리 사용되며, 이의 자가-경화 특성은 생활성 분자의 국부 전달 능력과 함께 원하는 결손 부위의 형태에 맞게 외과적 처치를 가능하게 하여 독특한 주입가능한 무기 생체재료로서 이용될 수 있게 한다. 수계 액체와 혼합되었을 때 경화될 수 있는 인산염계 분말의 다양한 조성물로서, 예를 들어, 테트라칼슘 포스페이트(TTCP) 및 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA)의 혼합물, 알파-트리칼슘 포스페이트(α-TCP), 및 β-TCP/모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM) 등이 개발되어 왔다.

이들 중에서, 칼슘-결핍 히드록시아파타이트(CDHA)로 상전환되어 경화되는 α-TCP는 잠재적으로 이상적인 성분으로서 연구되어 왔다. 최종 시멘트 생성물인 CDHA는 세포외 골 매트릭스의 주요 무기 성분이어서 고도의 생체적합성 및 골전도성을 제공한다. 그러나, 결정성 CDHA 상은 생체 내에서 매우 낮은 분해 속도를 가지고, 매우 부러지기 쉬워서 무부하(non-load) 베어링 부품으로서의 용도로 제한된다. CPC가 시험관내 골아세포 및 줄기세포/전발생 세포의 골형성 분화, 및 시험관 내 골 형성을 가능하게 한다는 것은 많은 연구들에서 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, 분해성 및 기계적 강도와 같은 몇몇 특성은 여전히 상당히 개선될 필요가 있다. 또한, 치료 및 재생을 위한 세포 작용을 촉진하기 위하여 상기 재료의 골형성 특성을 개선하고 치료 효능을 부여하기 위한 시도들이 있어 왔다.

CPC의 특성이 일부 분말 조성물의 미세한 조정에 의해 조절되는 것이 가능하여, 복합체 접근법을 사용하여 몇몇 상당한 변화가 이루어질 수 있었다. 많은 첨가제 물질들이 CPC의 특성을 개선하기 위해 도입되어 왔다. 용액 형태의 천연 고분자를 포함하는 고분자성 물질(키토산, 젤라틴, 콜라겐 및 알지네이트) 또는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)과 같은 입자 형태의 합성 고분자가 깨지기 쉬운 시멘트의 가소성을 개선하기 위해 널리 사용되어 왔다. 또한, 카본 나노튜브 및 나노섬유와 같은 나노물질이 혼합되어 왔으며 이들이 복합체의 물리화학적 특성 및 기계적 특성을 개선하는 것으로 밝혀졌다. CPC에 생활성 나노물질을 혼합하는 것은 물리화학적 특성, 기계적 특성 및 생물학적 특성을 상당히 변경시킬 수 있는 흥미롭고 잠재적인 방법인 것으로 여겨진다. 그러나, CPC의 자가 경화 특성을 유지하면서 생체적합성이어야 하고 CPC의 물리화학적 특성, 기계적 특성 및/또는 생물학적 특성을 개선시켜야 하므로 매우 제한적인 부류의 무기 나노물질만이 사용이 허용가능할 수 있다.

본 발명의 목적은 무기 나노물질을 사용하여 기계적 및/또는 생물학적 특성을 개선시킨 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물 및 이의 제조용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 제1양태는 분말상과 액상으로 구성되는 인산칼슘 골시멘트 조성물에 있어서, 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 포함하는 인산칼슘 골시멘트 조성물을 제공한다.

본 발명의 제2양태는 각각 개별 용기에 포장된, 인산칼슘 화합물 및 메조다공성 생활성 유리 나노입자 함유 분말상, 및 경화촉진제 함유 액상을 포함하는 인산칼슘 골시멘트 조성물 제조용 키트를 제공한다.

이하 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 인산칼슘 골시멘트 조성물(CPC)에 메조다공성 생활성 유리 나노입자(mBGn)을 첨가함으로써 CPC의 특성을 향상시킨 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물을 제공할 수 있음을 발견하였다. 특히, 경화 반응, 주입성, 세척(wash-out) 저항성, 점도(consistency), 이온 방출, pH 변화 및 압축 강도를 포함하는 CPC의 물리화학적 특성 및 기계적 특성을 전반적으로 조사하였으며, 더 나아가 골 수복 및 재생을 위한 잠재적인 주입가능한 생체재료로서 CPC/mBGn 나노복합체의 이용가능성을 확인하기 위하여 시멘트의 생체내 조직 적합성을 조사하였다. 그 결과, 분말상과 액상으로 구성되는 인산칼슘 골시멘트 조성물에 있어서, 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 포함하는 인산칼슘 골시멘트 조성물이 인산칼슘 골시멘트의 표면적을 증가시키고 단백질 담지 및 전달이 가능할 뿐만 아니라 인산칼슘 골시멘트의 물리적 강도를 증가시키면서 생체 내 이식 후 분해성을 증가시킬 수 있음을 발견하였으며, 본 발명은 이에 기초한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "생활성 유리"란, 생체 조직 내에서 특정 생물학적 작용을 유도할 수 있는 유리 성분을 의미하는 것으로, 일반적으로 무기물로 구성되는 유리를 의미한다. 특히, 본 발명에서는 나노입자 형태의 메조다공성을 갖는 생활성 유리, 즉 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 사용할 수 있다.

통상 인산칼슘 골시멘트 조성물의 기계적 및/또는 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 고분자성 첨가제를 사용하며, 무기 나노입자를 첨가제로서 사용하는 경우는 드물다. 본 발명에서는 CPC를 위한 무기 나노입자 첨가제로서 나노입자 형태의 메조다공성 생활성 유리(mBGn)를 사용한다. 즉, 본 발명에서는 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 인산칼슘 골시멘트 조성물의 기계적 및/또는 생물학적 특성을 개선시키기 위한 무기 나노물질 첨가제로서 사용한다.

생활성 유리 나노입자(BGn)는 종래의 마이크로입자 형태의 BG와 비교하여 나노스케일의 크기를 가지면서 더욱 큰 표면적을 가져 이와 관련된 물리화학적 특성 및 생활성 특성이 더욱 우수하다. 이에 더하여, 본 발명의 메조다공성을 가지는 mBGn은 세포내 흡수는 가능하면서 치료 분자의 효과적인 담지 및 전달이 가능하다. 결과적으로, 나노스케일 크기 및 실리카-기초의 조성을 갖는 mBGn은 우수한 골-생활성 및 세포 및 조직 적합성을 갖는다.

상기 생활성 유리는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 이 분야에서 공지된 것이면 어느 것이든 가능하며, 대표적으로, SiO₂-CaO 또는 SiO₂-CaO-P₂O₅의 기본적 유리구조로 이루어진 것이 사용 가능하다.

본 발명에서, 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자는 주형(template)으로서 PEG를 사용하여 초음파 졸-겔법을 이용하여 알칼리 조건 하에서 제조된 것일 수 있다.

구체적으로, 주형(template)으로서 PEG를 C_{1 -4} 알코올 중에 용해시킨 다음 pH를 9 내지 13으로 조절하고, 상기 PEG 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 혼합한 후 실리카 전구체를 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조한 뒤, 이를 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성함으로써 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 얻을 수 있다. 이때 상기 pH 조절은 NH₄OH, NaOH, KOH 또는 Tris로 수행할 수 있으며, 산화칼슘 전구체로는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate), 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide) 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있고, 실리카 전구체로는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane), APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane) 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있다. 또한, 초음파 처리는 출력 전력 200 W 내지 240 W, 10 s on/ 10 s off 사이클로 15분 내지 25분 동안 수행할 수 있고, 소성은 대기하에서 550℃ 내지 650℃ 온도범위에서 5시간 내지 7시간 동안 수행할 수 있다. 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자는 실리카(SiO₂)와 산화칼슘(CaO)을 60:40 내지 95:5의 몰 비율로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "골시멘트"란, 분말형 고체상 및 액상의 혼합으로 얻은 골 대체제로서 사용 가능한 페이스트의 경화체를 의미한다. 상기 시멘트의 "경화"는 실온 혹은 체온에서 인위적인 처리 없이 행해진 페이스트의 자발적 경화를 의미하며, 이때의 페이스트는 고체상과 액상을 혼합한 결과로 얻어진 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "인산칼슘 골시멘트"는 분말형 고체상이 인산칼슘화합물 혹은 칼슘 및/또는 인산염 화합물의 혼합물로 구성되는 골시멘트를 의미한다.

상기 인산칼슘 골시멘트는 인산칼슘 입자들이 주성분인 분말과 인산염과 같은 경화를 촉진하는 물질을 함유한 수용액으로 구성되는 소재로, 시술 시 두 성분을 혼합하여 고점도의 액상 상태로 적용시키면 적용 부위에서 두 성분들의 화학 반응에 의해 인산칼슘 화합물이 침전되어 경화됨으로써, 손상된 뼈 및 뼈, 또는 뼈 및 임플란트 사이의 빈 공간을 채워주어 둘 사이를 고정하고 안정화시켜 주는 골 대체물질의 한 형태이다.

상기한 바와 같이 본 발명의 인산칼슘 골시멘트 조성물은 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 첨가로 인하여 인산칼슘 골시멘트의 표면적이 증가하고 단백질 담지 및 전달이 가능할 수 있다.

또한, 본 발명의 인산칼슘 골시멘트 조성물은 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 첨가로 인하여 인산칼슘 골시멘트의 물리적 강도가 증가하고 생체 내 이식 후 분해성이 증가할 수 있다.

본 발명의 인산칼슘 골시멘트 조성물은 골형성 촉진용으로 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 기공 크기는 2 nm 이상, 바람직하기로 2 nm 내지 20 nm, 더욱 바람직하기로 4 nm 내지 10 nm일 수 있다. 또한, 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 평균 입자 크기는 바람직하기로 50 nm 내지 100 nm일 수 있다. 기존의 생체재료로서 사용되는 생활성 유리가 2 nm 미만의 마이크로다공성을 가지는 것에 비해 본 발명에서 사용하는 생활성 유리는 2 nm 이상의 메조다공성을 가지고 이와 동시에 구형 모폴로지를 갖는 나노입자 형태를 가짐으로써 경화 후 인산칼슘 골시멘트의 표면 모폴로지를 표면적이 증가하도록 개질시킬 수 있으며 주입성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 5 nm의 메조기공을 갖는 80 nm 크기의 나노구형의 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 제조하고 이를 인산칼슘 골시멘트 조성물에 첨가하여 인산칼슘 골시멘트 조성물을 제조한 후 이의 특성을 평가하였다. 그 결과, 이러한 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 첨가로 인하여 인산칼슘 골시멘트의 표면적을 증가시키고 단백질 담지 및 전달이 가능할 뿐만 아니라 인산칼슘 골시멘트의 물리적 강도를 증가시키면서 생체 내 이식 후 분해성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서, 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자는 분말상의 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 상기 범위에서 메조다공성 생활성 유리 나노입자로 인한 우수한 기계적 특성 및 생물학적 특성 향상 효과가 발휘될 수 있다.

본 발명에 따른 인산칼슘 골시멘트의 분말상은 비정형 인산칼슘(Amorphous caclium phosphate), 제2인산칼슘(Dicalcium phosphate anhydrous, DCPA), 제4인산칼슘(Tetracalcium phosphate, TTCP), α형 제3인산칼슘(α-Tricalcium phosphate, α-TCP) 및 β형 3인산칼슘(β-Tricalcium phosphate, β-TCP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인산칼슘 화합물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 α-TCP를 사용하였다.

본 발명에 따른 인산칼슘 골시멘트의 액상은 이온화된 칼슘 및 인산 이온들의 침전반응을 촉진하여 HA 생성을 촉진하는 경화촉진제를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 경화촉진제는 Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, K₂HPO₄, NH₄H₂PO₄, Na₂SO₄, 구연산, 말레익산 및 프로피온산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 Na₂HPO₄를 사용하였다.

본 발명에서, 상기 골시멘트 조성물의 액상은 분말상 100 중량부에 대하여 30 내지 45 중량부로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 메조다공성 생활성 유리 나노입자가 우수한 단백질 흡착 능력을 가지고 단백질 담지 및 전달이 가능하므로 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자에 추가로 단백질을 담지하여 단백질 전달체로서 상기 인산칼슘 골시멘트 조성물을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실험예에서는 메조다공성 생활성 유리 나노입자(mBGn)의 소량 첨가로 인해 나노복합체 시멘트의 물리화학적 특성이 변화되는 것을 확인하였다. 먼저, 경화 시간이 현저히 가속화되었다. 이를 통해 초미세 유리 나노입자들이 α-TCP 분말의 경화 반응에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있다. 이는 이온 방출 테스트를 통해 나타난 바와 같이 경화 과정 중 mBGn으로부터 방출된 Ca 이온이 해리-재침전 과정에 연관되기 때문인 것으로 여겨진다. 실제로, 경화의 가속화는 또한 mBGn 첨가로 인한 히드록시아파타이트 형성의 증가된 속도와 관련이 있을 수 있다. 또한, 이는 메조다공성 특성을 갖는 mBGn이 액상으로부터 임의의 여분의 물을 흡수 및/또는 흡착할 수 있어, CPC의 출발 L/P 비를 감소시킬 수 있고, 이로 인해 경화 시간을 간접적으로 감소시킬 수 있다는 점에 기인한 것으로 여겨질 수도 있다. 흥미롭게도, SBF 침지 후, mBGn 첨가된 시멘트는 마이크로스피어 섬(microspherical island) 형태를 갖는 아파타이트 결정 모폴로지를 형성하는 것으로 나타났다. 이는 초기 나노스피어의 결정 성장 메커니즘의 가능성을 반영하는 것이며, 순수한 CPC에서 발생하는 모폴로지와 대조적이었다. 두 경우 모두, 최종 시멘트화 생성물은 나노-플레이트의 꽃 모양의 결정으로 유사한 형태를 갖는 나노 수준의 거친 모폴로지의 아파타이트이었다.

순수한 CPC와 나노복합체 시멘트의 주목할만한 차이점은 SBF-침지 및 비침지 샘플에 대해 측정된 표면적이다. mBGn-첨가된 시멘트는 순수한 시멘트에 비해 유의적으로 더욱 높은 표면적을 가졌다. 이는 주로 높은 표면적을 갖는 초미세 나노입자의 존재로 인한 것으로 여겨졌다. 이에 따라 mBGn의 소량 첨가만으로 시멘트 조성물의 표면적을 유의적으로 증가시킬 수 있었다. SBF 매질 내에서 아파타이트 상으로 변화된 후, 두 시멘트 군 모두 유의적으로 증가된 표면적을 가졌다. 이는 마이크로스피어 아파타이트 섬의 성장에서 비롯한, 아파타이트의 나노결정성 모폴로지 및 mBGn-첨가된 시멘트의 여전히 더욱 높은 표면적으로 인한 것으로 여겨졌다. 이러한 증가된 표면적으로 인해 단백질 흡착율의 증가가 관찰되었다. 이를 통해, 본 발명의 mBGn-첨가된 나노복합체 시멘트 조성물이 단백질 담지 및 전달을 위해 사용 가능함을 알 수 있었다. 더 나아가, 일반적으로 부착 단백질 흡착 현상에 의해 영향을 받는 시멘트에 대한 세포 반응이 또한 긍정적인 것으로 여겨졌다.

경화 반응 및 표면 반응성 이외에, 압축 기계 강도가 또한 mBGn 첨가에 의해 특히 SBF 중에 침지시킨 후 유의적으로 향상되었다. 10% mBGn 시멘트의 강도가 순수한 CPC 대비 2배 이상이었다(26 MPa vs. 12 MPa). 강도 증가는 나노복합체 효과에 기여할 수 있다. 즉, 시멘트 매트릭스 내 분산된 나노입자가 크기-관련 강화 효과를 발휘할 수 있다. 또한, mBGn 나노복합체는 아파타이트 나노결정 얽힘을 통해 SBF 내에서 α-TCP 및 mBGn로부터 HA로 전환되는 동안 시멘트 매트릭스와 함께 잘 결합되는 것으로 보였다. 주입성, 세척 저항성 및 점도는 특히, 습한 조건에서 주입가능한 형태로 사용될 때 시멘트의 실질적인 적용에 있어 중요하다. CPC 페이스트 내 초미세 유리 나노스피어의 존재로 인해 주입성 측정에서 확인할 수 있듯이 유동성이 강화되고 레올로지가 조정되었다. mBGn 첨가는 주입성을 향상시켰다. 실질적으로, 시멘트 분말의 입자 크기 및 형태가 주입성에 영향을 미칠 것으로 여겨진다. 즉, 더욱 작은 크기 및 구형 형태를 갖는 분말이 우수한 주입성에 기여할 수 있다. 구형 분말은 그 자체로 구르기 쉽고, 이에 따라 구형 분말을 사용하여 제조될 때 페이스트가 우수한 취급 특성 및 주입성을 가질 수 있다. 또한, 세척 저항성이 mBGn의 첨가로 인해 유의적으로 향상되었다. 시멘트화된 순수한 CPC 샘플이 쉽게 세척되어 나감으로써 초기 형태 및 질량을 보존하지 못한 반면, 5% 및 10% mBGn을 함유한 샘플은 초기 상태를 거의 완전하게 보존하였다. 이를 통해, 나노복합체 시멘트 성분이 높은 응집력을 가지고 물 분자에 노출되었을 때 야기되는 입자의 붕괴를 저지할 수 있음을 확인할 수 있었다.

조율할 수 있는 점도를 갖는 시멘트 페이스트는 다양한 형태의 결손에 대해 적용 가능할 수 있다. 점도 테스트는 첨가되는 mBGn의 양이 변화됨에 따라 페이스트의 점도에 있어 상당한 변화를 보여주었다. 이에 따라, 1차 점도(더욱 낮은 점성, 유체-타입, 빠른 흐름) 또는 2차 점도(진한 점성, 퍼티-타입, 완화된 흐름)와 같은 다양한 페이스트 점도를 얻기 위해, 점도는 mBGn의 양에 따라 조정 가능하였다. 따라서, 본 발명의 나노복합체 페이스트는 임의의 다양한 형태의 결손에 맞도록 임의의 mBGn 양을 통해 잘 제어될 수 있는 가변성 점도를 가질 수 있다. 향상된 주입성, 세척 저항성 및 점도를 포함하는 이러한 나노복합체 시멘트의 두드러지게 향상된 특성은 본 발명의 시멘트 조성물이 주입가능한 골 재생 재료로서 실질적인 적용 가능성을 가짐을 나타낸다.

시멘트의 이온 방출 분석은 생물학적 반응에 영향을 줄 수 있는 이온의 타입 및 용량을 명백하게 보여주었다. 순수한 CPC는 Ca 및 P 이온을 방출하였으며, mBGn-첨가된 시멘트는 추가적으로 Si 이온을 방출하였다. 그러나, 2 군에서 Ca 및 P 이온 방출은 유사하였다. 명백히, Ca 및 P 이온 방출은 1일째 최고치를 보인 후 감소하였다. 이는 Ca 및 P가 다시 침전되는 것을 나타낸다. 또한, 순수한 mBGn으로부터 방출되는 Ca 이온이 상당하였으며, 10% mBGn-첨가된 시멘트는 0% mBGn 시멘트와 유사한 수준으로 Ca 이온을 방출하였다. 이는 10% mBGn로부터 방출되는 Ca 이온이 또한 재침전 과정에 관여하는 것을 나타낸다. 또한 이는 mBGn-첨가된 시멘트의 보다 빠른 미네랄화가 일어남을 나타낸다. 이온 방출에 관한 이러한 결과는 mBGn-첨가된 시멘트에서 경화 반응이 증가됨을 나타낸다. 즉, 방출된 이온이 재침전 과정을 가속화시키고 이에 따라 경화 및 아파타이트 형성에 있어 역할을 수행한다는 것을 나타낸다. Ca 및 P 이온 이외에, Si 이온이 mBGn-첨가된 시멘트에서 높은 수준으로 측정되었다. 이는 Si가 침전 과정에 주로 연관되어 있지 않음을 나타낸다. 이보다는, Si 이온은 방출 매질 중에 더욱 많이 존재하고, 이러한 사실은 Si 이온이 골-관련 세포의 증식 및 분화 과정의 자극제이므로 Si 이온이 세포 증식 및 골형성 분화와 같은 생물학적 반응에 더욱 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.

또한 다른 이온 수준은 시멘트의 pH 변화에 영향을 주었다. mBGn의 첨가는 pH를 덜 산상이 되도록 변경시켰다. 순수한 CPC가 4주 후 pH를 ~6.0로 변화시켰으나, 10% mBGn 시멘트는 동일한 기간 후에 pH를 ~6.6로 변화시켰다. pH 변화는 이온 방출 및 재침전과 밀접하게 관련이 있다. 나노복합체 시멘트 내 mBGn로부터 방출된 추가적인 Ca 이온은 pH를 높일 수 있다. 이러한 pH 변화에 기초하여, 더욱 중성 상태의 pH를 유지하여 세포 생존력에 유리함으로써 mBGn-첨가된 시멘트가 더욱 생물학적으로 유리함을 알 수 있다.

더 나아가, 본 발명에서는 나노복합체 시멘트의 생체적합성을 생체 내에서 직접 평가하였다. 먼저, 시멘트 샘플을 피하에 이식한 결과, 유의적인 염증 징후를 보이지 않고, 풍부한 증식성 세포 접목을 보이며, 내피세포와 함께 실질적인 신생 혈관생성을 나타내는 등의 우수한 조직 반응을 나타냄을 확인하였다. mBGn 첨가 및 비첨가 시멘트 간에 유의적인 조직학적 차이는 관찰되지 않았다. 이를 통해, mBGn 첨가 시멘트가 순수한 CPC와 같이 우수한 생체적합성을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 두개골 결손에 대한 실험을 통해 시멘트의 경계면 영역 및 이의 주변에서의 신생-골 조직 형성과 같은 우수한 조직 반응을 나타냄을 확인하였다. 주목할 만하게, mBGn-첨가된 시멘트는 골 형성 세포와 신생-골 조직의 대체와 함께 재료 내 더욱 큰 분해 징후를 나타내었다. 이에 따라 mBGn 시멘트/조직 경계면은 순수한 CPC/조직의 경우보다 더욱 실질적으로 변화되었다. 아파타이트 CPC가 매우 제한된 분해성을 가지며 이에 따라 이들의 분해성을 개선하기 위해 많은 노력들이 있어 왔다는 점을 고려할 때, 이러한 두개골 실험 결과는 본 발명의 나노복합체 시멘트의 또 다른 이점임을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 개별 용기에 포장하여 포함하는 인산칼슘 골시멘트 조성물 제조용 키트를 제공할 수 있다. 상기 인산칼슘 골시멘트 조성물 제조용 키트는 각각 개별 용기에 포장된, 인산칼슘 화합물 및 메조다공성 생활성 유리 나노입자 함유 분말상, 및 경화촉진제 함유 액상을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 키트는 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 분말상의 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%의 양으로 사용하도록 제시하는 설명서를 구비하거나 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자가 분말상의 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%의 양으로 정량되어 개별 용기에 포장된 것일 수 있다.

본 발명의 인산칼슘 골시멘트 조성물 제조용 키트에서, 상기 분말상, 액상 및 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 성분, 혼합비 등은 상기 인산칼슘 골시멘트 조성물에서 설명한 바와 동일하다.

상기 키트는 사용 직전에 액상에 분말상을 혼합하여 페이스트 형태로 인산칼슘 골시멘트 조성물을 제조한 후 원하는 시술 부위에 상기 페이스트를 주입하여 사용할 수 있다.

상기 시술 시 주사기를 사용할 수 있다.

본 발명의 인산칼슘 골시멘트 조성물은 빠른 시간 내에 경화 가능하며 우수한 골형성 촉진능을 가져 시술 후 빠른 골 접합을 유도할 수 있는 특징을 갖는다.

본 발명의 키트는 조직공학에서 뼈의 수리 및 재생을 위한 나노 복합 주사 시스템에 응용되어 골 치료, 골 증강, 골 재형성, 골 재생 및 골다공증 치료와 관련된 치과, 정형외과, 성형외과 및 신경외과 등에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 메조다공성 생활성 유리 나노입자가 우수한 단백질 흡착 능력을 가지고 단백질 담지 및 전달이 가능하므로 추가로 단백질을 담지하고 있는 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 키트에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물은 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 무기 나노입자 첨가제로서 사용함으로써 인산칼슘 골시멘트의 표면적을 증가시키고 단백질 담지 및 전달이 가능할 뿐만 아니라 인산칼슘 골시멘트의 물리적 강도를 증가시키면서 생체 내 이식 후 분해성을 증가시킬 수 있으므로 생체 내에 원하는 부위에 안전하고 효과적으로 뼈의 재생속도를 촉진시킬 수 있어 골 충진제 및 골 대체제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 mBGn 첨가된 CPC 조성물의 특성 분석 결과를 나타낸다. 이때 (a)는 TEM 이미지이고, 이의 삽입도는 EDS 원자 조성을 나타내며, (b)는 다른 기간 동안 SBF 내에 mBGn을 침지한 후 얻은 XRD 패턴이다.
도 2는 시멘트화된 샘플의 특성 분석 결과를 나타낸다. 이때 (a)는 SEM 이미지이고, 이의 삽입도는 EDS 프로파일이며, (b)는 XRD 패턴이고, (c)는 FT-IR 분석 결과이다.
도 3은 다양한 L/P 비에서의 시멘트의 경화 시간 측정 결과이다.
도 4는 SBF 침지 7일 후 시멘트의 변화를 측정한 결과이다. 이때 (a-d)는 다른 배율의 SEM 이미지이고, (b)는 XRD 패턴이며, (c)는 FT-IR 스펙트럼이다.
도 5는 mBGn 함량 증가에 따른 시멘트의 표면적 및 다공도 변화 분석 결과이다.
도 6은 시멘트의 압축 강도 측정 결과이다.
도 7은 시멘트의 주입성 분석 결과이다. 이때 (a-c)는 0, 5, 및 10% mBGn 첨가된 시멘트의 주입성 곡선이고, (d)는 다른 시멘트 조성에 대해 측정한 주입성 분석 결과이다.
도 8은 시멘트의 세척 저항성 및 점도 테스트 결과이다. 이때 (a)는 세척 저항성 테스트의 중량 변화 결과이고, 삽입도로서 샘플 사진을 포함하며, (b)는 샘플 사진과 함께 점도 테스트의 확산된 직경 측정 결과이다.
도 9는 샘플의 이온 방출 분석 결과이다. (a)는 순수한 mBGn의 결과이고, (b)는 0% mBGn을 첨가한 시멘트의 결과이며, (c)는 10% mBGn을 첨가한 시멘트의 결과이다.
도 10은 37℃에서 PBS 내 시멘트 샘플의 침지 중에 측정된 pH 변화를 나타낸다. 이때 삽입도는 초기 반응 기간을 확대한 것이다.
도 11은 mBGn 첨가가 시멘트의 단백질 흡착 능력을 강화시킴을 보여주는 단백질(cyt C) 흡착 테스트 결과이다.
도 12는 수술 4주 후 래트 피하 조직 내 0% 및 10%mBGn 시멘트의 생체 내 적합성 조사 결과이다. C는 시멘트이고, 스케일 바는 350 mm이다.
도 13은 6주 동안 래트 두개골 내 시멘트 샘플의 생체 내 분석 결과이다. 이때 (a)는 0% mBGn 시멘트 샘플을 나타내고 (b)는 10% mBGn 시멘트 샘플을 나타낸다. 또한, C: 시멘트 ; HB: 호스트 골; NB: 신생 골이다. 스케일 바는 350 mm이다.

이하，본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐，실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: mBGn 함유 시멘트 조성물의 제조

재료

테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS,C₈H₂₀O₄Si, 98%), 질산칼슘 사수화물[Ca(NO₃)₂·4H₂O, 99%], 탄산칼슘(CaCO₃, = 99.0%), 인산수소칼슘(CaHPO₄, 98.0-105.0%), 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄, = 99.0), 폴리(에틸렌 글리콜)[PEG, (C₂H₄)_nH₂O, M_n = 10000], 수산화암모늄(NH₄OH, 28.0% NH₃ in water, = 99.99% metal basis), 무수 메탄올(CH₃OH, 99.8%), SBF 용액용 고순도 화학물질, 트리스 히드록시메틸 아미노메탄, 1N 염산(IN HCl), 및 인산완충식염수(PBS)는 시그마-알드리치로부터 입수하여 추가 정제 없이 그대로 사용하였다. 초순수 탈이온수(18.2 MΩ·cm, Millipore Direct-Q system)를 실험 전반에 사용하였다.

mBGn의 합성

잘 발달된 구형 모폴로지 및 메조다공성 구조를 갖는 메조다공성 생활성 유리 나노스피어를 주형(template)으로서 PEG를 사용하여 초음파 졸-겔법을 이용하여 알칼리 조건 하에서 제조하였다. 85 몰% SiO₂ 및 15 몰% CaO의 조성을 유리 제조에 사용하였다.

먼저, 5 g의 PEG를 120 ml 메탄올 중에 마그네틱 교반 하에 용해시킨 다음, NH₄OH를 첨가하여 용액의 pH를 12.5로 조정하였다. 그 다음, 0.179 g의 Ca (NO₃)₂.4H₂O를 상기 용액에 마그네틱 교반 하에 용해시켰다. 다른 용기에서, 0.895 g의 TEOS를 30 ml 메탄올로 희석시킨 다음, 격렬하게 교반하고 동시에 고전력 초음파(10 seconds on/10 seconds off)를 20분 동안 가하면서 상기 pH-조정된 용액에 적가하였다. 24시간 동안 격렬하게 마그네틱 교반한 후, 백색 침전물을 분리하고 물/에탄올을 사용하여 5000 rpm에서 5분 동안 3회 원심분리/재분산 사이클로 세척한 다음, 70℃에서 하룻밤 동안 건조시켰다. PEG 주형을 제거하기 위하여, 상기 건조된 분말을 1 ℃/min의 가열 속도로 600℃까지 가열하고 최종적으로 대기 중에서 5시간 동안 600℃로 하소한 다음 이후의 사용을 위하여 진공 하에 보관하였다.

α- TCP 및 시멘트 조성물의 제조

CaHPO₄ 및 CaCO₃의 혼합물을 1400℃에서 2 시간 동안 소결하고 이어서 대기 중에서 급냉시켜 α-트리칼슘 포스페이트[α-TCP, α-Ca₃(PO₄)₂] 분말을 제조하였다. 얻어진 α-TCP를 유성볼밀(Retsch, PM 100 CM, Germany)로 밀링한 다음 체질하고, 2 중량%의 히드록시아파타이트 분말(Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany; 900 ℃에서 3시간 동안 소결)과 혼합하였다. 0, 2, 5 및 10 중량%의 mBGn(해당하는 양의 mBGn 분말을 CPC 분말 대신 대체)이 첨가된 인산칼슘 시멘트(CPC) 페이스트를 액상으로서 2.5 중량% Na₂HPO₄ 수용액을 사용하여 0.65 ml g^-1의 액상 대 분말(L/P) 비로 제조하였다. α-TCP 및 mBGn 분말을 볼텍스 믹서기로 5분 동안 잘 혼합한 다음, 액상을 나노-복합체 분말에 첨가하고, 상기 혼합물을 빨리 균질화하여 CPC/mBGn 나노-복합체 페이스트를 형성하였다. 페이스트를 테플론 몰드에 넣고 경화되도록 방치하였다. 마지막으로, 상기 샘플을 7일 동안 SBF 중에 침지시켜 α-TCP의 칼슘-결핍 히드록시아파타이트(CDHA)로의 전환을 완료하였다.

실험예 1: mBGn 함유 시멘트 조성물의 물리화학적 특성 조사

제조된 mBGn의 메조다공성 구조, 입자 크기 및 조성을 에너지 분산 X-선 분광기(TEM-EDX, Oxford Instruments)가 구비된 고해상도 투과전자현미경(HR-TEM, JEM-3010, JEOL, Japan)을 통해 관찰하였다. mBGn, α-TCP 및 시멘트 샘플의 상을 분말 X-선 회절기(XRD, Rigaku, Ultima IV, Japan)로 SBF 침지 전후에 분석하였다. X-선은 40 mA 및 40 kV에서 Cu Kα 선(λ= 1.5418Å)을 사용하여 발생시켰으며, 데이터는 0.02°의 단계 크기 및 2°/min의 스캔 속도로 4° 내지 70°의 회절각(2θ)에서 얻었다.

mBGn 및 시멘트 샘플의 감쇠 전반사-푸리에 변환 적외선 스펙트럼(ATR-FTIR)을 GladiATR diamond crystal accessory (PIKE Technologies, USA)를 사용하여 4000-400 cm^-1 범위에서 푸리에-변환 적외선 분광기(FT-IR, Varian 640-IR, Australia) 상에서 4 cm^-1의 해상도로 SBF 침지 전후에 얻었다. 밀링된 α-TCP 분말의 입자 크기 분포는 레이저 입자 크기 분석기(Mastersizer 2000, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 얻었다. mBGn 및 α-TCP 분말의 표면 전하는 Laser Doppler electrophoresis (LDE) instrument (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 제타(ξ) 표면 전위 측정을 통해 조사하였다. 제타-전위는 20 V/cm의 인가 전기장 세기로 pH 7 하에 물(25℃) 중에서 측정하였다. 5개의 실험을 각 실험마다 40회의 반복 실험을 하고 이를 평균하는 방식으로 수행하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 mBGn의 TEM 이미지를 통해 충상(worm-like) 메조기공(~5 nm)을 갖는 대략 80 nm 크기의 나노구형임을 알 수 있었다(도 1a). TEM-EDS 분석을 통해 설계된 공칭 유리 배치(Si/Ca = 75:25)와 동등한 원소 조성을 확인하였다. SBF 침지 테스트를 통해 분석된 시험관 내 mBGn의 골생활성은 거의 결정화되지 않은 아파타이트 피크가 발달되고 이들의 XRD 패턴 내 세기가 침지 시간에 따라 증가하는 것을 보여주었다(도 1b).

CPC/mBGn 조성물을 제조하기 위해 사용된 mBGn 및 α-TCP 분말의 물리적 특성으로서 입자 크기, 표면적 및 제타-전위 등을 하기 표 1에 요약하였다. α-TCP 대비, mBGn은 현저하게 더욱 높은 비표면적(~6배)을 가졌다. mBGn은 0.133 cm³/g의 기공 부피 및 4.9 nm의 기공 크기를 갖는 분명한 메조다공성 특성을 가졌다. mBGn의 제타-전위는 α-TCP보다 더욱 음의 값이었다(-29 mV vs. -15 mV).

mBGn 함량을 변화시켜 시멘트 혼합물을 조제하고, 상기 혼합물을 다양한 비율로 액상과 혼합하여 경화시켰다. 경화된 시멘트 샘플의 모폴로지, 상(phase) 및 화학적 구조를 분석하였다. 복합체 분말의 SEM 이미지를 통해 마이크론-크기의 α-TCP 분말을 둘러싸는 초미세 나노입자 형태의 mBGn의 존재를 확인하였다(도 2a). XRD 패턴을 통해 모든 제조된 시멘트 샘플에 대해 주된 α-TCP 상을 확인하였다(도 2b). ATR FT-IR 스펙트럼은 대략 559, 597, 및 1020 cm^-1의 인산염 관련 밴드 및 대략 476, 797, and 1220 cm^-1의 실리케이트 관련 밴드를 보여주었다(도 2c). 실리케이트 관련 밴드는 mBGn 함량이 증가함에 따라 세기가 증가하였다.

실험예 2: mBGn 함유 시멘트 조성물의 경화 시간 측정

CPC/mBGn 복합 페이스트의 경화 시간은 길모어 니들법을 사용하여 0.55, 0.65, 및 0.75 ml g^-1의 상이한 L/P 비로 ASTM-C266-08 표준에 따라 측정하였다. 경화 시간은 분말이 액상과 혼합된 시간부터 2.13 mm 직경 및 113.4 g 중량의 니들이 시멘트 페이스트의 표면 상에 임의의 가시적인 흔적을 남지기 않고 로딩될 수 있는 시간까지의 시간 간격으로 간주하였다. 각 시멘트 조성물에 대해 3개의 개별적인 샘플을 취하여 측정을 수행하였다.

그 결과, L/P 비의 증가는 경화 시간의 증가로 이어졌다. 흥미롭게도, mBGn의 첨가는 0.55 ml/g의 L/P 비에서 경화시간을 108 분(0% mBGn)으로부터 25 분(10% mBGn)까지 점진적으로 감소시켰다.

실험예 3: mBGn 함유 시멘트 조성물의 모폴로지 분석

CPC/mBGn 복합 시멘트의 표면 모폴로지를 SEM-EDX (INCA x-act, 51-ADD0076, Oxford Instruments)가 구비된 고해상도 주사전자현미경(SEM, JSM-6510, JEOL Japan)를 통해 관찰하였다. SEM 관찰 전에, 시멘트 샘플을 자동 마그네트론 스퍼터 코팅기(Cressington 108 Auto sputter coater, UK)를 사용하여 120초 동안 백금으로 스퍼터-코팅하였다.

경화된 시멘트를 7일 동안 SBF 중에 침지시켜 모폴로지 및 상의 변화를 조사하였다. SBF-침지된 샘플은 침지 전의 샘플 대비 명백한 모폴로지의 변화를 보여주었다(도 4a-d). 순수한 CPC가 α-TCP 기초의 CPC의 전형적인 러플형 아파타이트 결정성을 보여주는데 반해, 10% mBGn 시멘트는 마이크로-구형의 발달을 보여주었으며 이를 더욱 면밀히 분석했을 때 순수한 CPC와 유사한 나노토폴로지를 나타내었다. XRD 스펙트럼은 특징적인 히드록시아파타이트 회절 패턴(도 4e)의 발달을 보여주었으며, 10% mBGn 시멘트의 아파타이트 피크 세기가 순수한 CPC보다 더욱 강해지는 것으로 나타났다. 또한, 인산염 밴드의 실질적인 변화(561, 601 및 1023 cm^-1의 세기 증가)는 TCP의 HA로의 변화와 연관이 있었다(도 4f).

실험예 4: mBGn 함유 시멘트 조성물의 표면적 및 다공도 측정

제조된 mBGn의 비표면적, 기공 부피 및 기공 크기 및 CPC/mBGn 복합 시멘트의 비표면적을 N₂ 흡착-탈착 측정법으로 얻었다. N₂ 흡착-탈착 등온선을 자동 표면적 및 기공 크기 분석기(Quadrasorb SI, Quantachrom instruments Ltd., USA.)로 -196.15℃에서 얻었다. 샘플을 분석 전에 300℃에서 12시간 동안 진공 하에 탈기시키고, Brunauer-Emmett-Teller (BET) 법에 따라 비표면적을 계산하였다. mBGn의 기공 크기 분포를 국지적 밀도범함수이론(NLDFT)의 기초 하에 상기 얻어진 N₂ 흡착-탈착 등온선의 N₂ 탈착 등온선을 사용하여 결정하였다.

CPC/mBGn 샘플의 다공도를 자동 수은 침투 다공도 분석기(PoreMaster?, Quantachrom instruments Ltd., USA)를 사용하여 수은 침투 다공도 분석법을 통해 측정하였다. 각각의 CPC/mBGn 조성물의 3개의 정확히 칭량된 시멘트 디스크(6 mm diameter, 3 mm height)를 분석 튜브에 삽입하였다. 샘플을 저압 및 고압에서 분석하였고, 각 측정은 3회 반복 수행하였다.

SBF 내 침지 전후의 다양한 함량의 mBGn을 함유한 시멘트의 비표면적 및 다공도는 BET 및 Hg 침투 측정으로 평가하였다. mBGn의 증가는 SBF 침지 전과 후 모두 표면적의 유의적인 증가로 이어졌다(도 5a). SBF 침지 전에, 0% mBGn 및 10% mBGn 시멘트는 각각 약 3.5 m²/g 및 14.2 m²/g의 표면적을 보였다. 침지 후, 상기 값은 0% mBGn의 경우 21.6 m²/g으로, 10% mBGn의 경우 31.7 m²/g으로 유의적으로 증가하였다.

더 나아가, SBF-침지 전의 시멘트의 다공도는 mBGn 함량의 증가에 따라 단지 약간만 증가하였고, SBF-침지 후에 샘플들은 유사한 다공도 수준을 가졌다(도 5b). 표면적의 변화와 비교하여, 다공도 변화는 매우 작았다.

실험예 5: mBGn 함유 시멘트 조성물의 압축 강도 테스트

시멘트의 기계적 강도는 1 mm/min의 크로스-헤드 속도 하에 10KN load cell로 universal testing machine (Instron 5966, USA)을 사용하여 압축 기계적 테스트를 통해 평가되었다. 각 조성물에 대한 한 세트의 원통형 시편(6 mm in diameter and 12 mm in height)을 원통형 테플론 몰드에 시멘트 페이스트를 넣어 제조하였다. 테스트되는 시편은 다음의 2개의 다른 군으로부터 얻었다: 하나의 군은 37℃에서 7일 동안 SBF 내에 침지되었으며(SBF-침지), 다른 군은 침지되지 않았다(SBF-비침지). 테스트는 젖은 샘플 상에서 수행되었고, 적어도 6개의 샘플을 각 조성물에 대해 테스트하였으며, 평균±표준편차를 기록하였다.

압축 하의 시멘트 샘플의 기계적 성능을 SBF 처리 전후에 테스트하였다(도 6). SBF-침지 전에, 샘플(경화되고 HA로 전환되지 않음)은 매우 낮은 압축 강도를 보였으며 mBGn 첨가시 0.87 MPa (0% mBGn)로부터 1.84 MPa (10% mBGn)로 소폭 증가하였다. SBF 침지시, 모든 시멘트의 강도가 유의적으로 향상되었고, mBGn 첨가량의 증가에 따라 순수한 시멘트의 경우 12 MPa로부터 10% mBGn 시멘트의 경우 26 MPa로 강도 값이 점진적으로 증가하였다.

실험예 6: mBGn 함유 시멘트 조성물의 주입성 , 세척 저항성 및 점도 분석

시멘트 페이스트의 주입성은 압출 테스트를 통해 측정하였다.

먼저, 일정량의 시멘트 페이스트를 2 mm의 노즐 직경을 갖는 상용 시린지(5 mL 용량 및 14 mm 내경) 내에 주입하였다. 상기 시린지를 단축 테스트 기기(Instron 5966, USA)에 고정된 인젝션 셋-업에 배치하였다. 테스트는 15 mm min^-1의 일정한 주입 속도로 수행하였으며, 시멘트 분말과 액상을 L/P = 0.45 ml g^{- 1}으로 혼합하고 15분 후에 압출을 시작하여 가해진 힘이 150 N에 도달하였을 때 멈추었다. 주입성 비율을 시린지로부터 압출된 시멘트 페이스트의 중량과 시린지 내로 주입된 시멘트 페이스트의 초기 중량으로부터 계산하였다. 3개의 표본을 각 조성물에 대해 테스트하고, 대표적인 주입성 곡선을 시린지 플런저의 이동 대 가해진 힘을 플롯팅하여 얻었다.

CPC/mBGn 시멘트의 응집력 또는 세척(wash-out) 저항성 정도를 PBS 용액 내에서 제조된 샘플을 기계적으로 쉐이킹함으로써 평가하였다. CPC 디스크(6 mm 직경 및 3 mm 두께)를 정확히 칭량하고 이들을 제조한지 2시간 후에 곧바로 테스트하였다. 각 샘플의 건조 중량을 기록하고, 각 샘플을 50 ml PBS 용액을 담고 있는 50 ml 튜브에 넣은 다음, 37℃에서 30분 동안 인큐베이터 쉐이커(100 rpm) 내에 두었다. 샘플을 조심스럽게 꺼내어 1시간 동안 70℃에서 건조시키고 이들의 중량을 최종적으로 측정하였다. 초기 디스크 중량 대 침식 테스트 후 최종 디스크 중량을 비교하여 침식 비율을 얻었다.

시멘트 페이스트의 점도를 치아의 인산 아연 시멘트에 대한 ISO 1566 표준에서 정의된 방법에 따라 평가하였다. 상기 방법에서, 점도는 혼합 3분 후에 0.5 ml의 페이스트 상에 유리 플레이트(140 ± .5 g)를 두었을 때 퍼진 시멘트 페이스트의 직경으로서 정의된다. 본 실험에서, 145 g 유리 플레이트는 시멘트 페이스트의 0.5 ml 샘플 상에 놓여지며, 퍼진 직경은 3분 후에 측정되었다.

임상적 적용에 있어 시멘트의 성공적인 이용을 위해서는 우수한 주입성을 갖는 시멘트 조성물의 개발이 필요하다. 본 발명에서는 단축 압축 기계에 고정된 시린지 주입 셋-업을 사용하여 다양한 mBGn 함량을 갖는 CPC 페이스트의 주입성을 조사하였다. 150 N의 최대 인가 힘 하에 시린지로부터 압출된 CPC 페이스트의 양으로부터 주입율(injectability percentage)을 구하고, 15 mm/min의 압축 속도 하에 얻어진 0, 5, 및 10% mBGn을 혼합한 CPC 페이스트의 대표적인 주입성 곡선을 나타내었다(도 7a-c). 상기 곡선을 주입율을 계산하는데 사용하였다(도 7d). 이는 최대 5%까지 mBGn 함량이 증가함에 따라 초기 향상을 보여주었다. 주입성은 순수한 시멘트의 경우 60%로부터 5% mBGn 첨가된 시멘트의 경우 75%로 증가한 다음, 10% mBGn 첨가된 시멘트의 경우 71%로 약간 감소하는 것으로 나타났으나, 여전히 순수한 CPC에 비해 더욱 높았다.

수성 환경에서의 세척에 대한 저항성은 시멘트 응집력의 정도에 대한 지표로 고려될 수 있다. 제조된 CPC/mBGn 샘플의 세척 저항성은 PBS 용액 중에서 기계적 쉐이킹을 통해 테스트하였으며, 세척되어 나온 입자의 양을 테스트 끝에 측정하였다. 순수한 CPC는 대략 95% 붕괴를 보인 반면, 10% mBGn을 첨가함에 따라 세척량에 있어 유의적인 감소(~12%)가 관찰되었다(도 8a).

점도는 CPC/mBGn 페이스트의 취급 특성에 영향을 주는 또 다른 인자이다. 이는 외부 하중을 인가한 후에 시멘트 페이스트의 확산된 직경을 측정하여 평가되었다. 순수한 CPC 페이스트에 대하여, 액체-유사 페이스트를 나타내는, 8.8 cm의 확산된 직경이 기록되었다. 그러나, mBGn을 첨가한 후에, 확산된 직경은 상당히 감소되었다(2% mBGn의 경우 ~5.3 cm, 5% mBGn의 경우 2.8 cm, 10% mBGn의 경우 2 cm). 이는 mBGn이 페이스트의 점도를 제어하는 역할을 효과적으로 수행한다는 점을 나타낸다.

실험예 7: mBGn 함유 시멘트 조성물의 이온 농도 및 pH 변화 조사

칼슘, 인, 및 규소 이온 방출을 14일 동안 37℃에서 순수 mBGn 및 10 wt% mBGn을 첨가한 CPC 샘플에 대하여 측정하였다. CPC 디스크(0.450 g in weight, 15 mm in diameter, and 2 mm in thickness) 및 20 mg mBGn 샘플을 Tris-HCl 버퍼를 사용하여 pH 7.4로 완충된 10 ml의 탈이온수 중에 침지시킨 다음, 다양한 시간 동안 배지를 재충전하지 않으면서 37℃에서 인큐베이션시켰다. 각각의 기간의 끝에, 각 샘플의 방출 배지를 빼내어 15분 동안 15000 rpm으로 원심분리하고, 맑은 상등액을 수집하여 inductively coupled plasma atomic emission spectrometry(ICP-AES; OPTIMA 4300 DV, Perkin-Elmer, USA)를 통해 이온 측정하였다. 각 샘플에 대해 3회 반복 실험을 수행하고 평균값을 기록하였다.

PBS 중에서 CPC/mBGn 샘플을 침지하는 동안 발생하는 pH 변화를 벤치-탑 pH-미터(bench-top pH-meter)(Orion 3 STAR, Thermo electron, USA)를 사용하여 기록하였다. 각각의 CPC/mBGn 조성물에 대하여, 3개의 시멘트 디스크(6 mm 직경, 3 mm 높이)를 37℃에서 10 ml PBS (pH 7.4) 내에 침지하고 인큐베이션시켰다. 용액의 pH를 미리결정된 시점에 측정하였으며, 3개의 독립된 샘플로부터 수집된 값의 평균±S.D.를 기록하였다.

이온성 용해 및 재침전 과정이 CPC 기초의 시멘트의 시멘트화 및 상 전환과 함께 수반되기 때문에 매질의 이온 농도 변화를 조사하였다. Ca 및 P 이온과 함께 Si 이온을 ICP-AES 분석을 통해 측정하였다. 먼저, mBGn의 이온 변화는 침지 첫째날 이내에 초기 급속한 Ca 및 Si 이온 방출을 보였으며, 이후 Ca 방출이 계속적으로 증가하면서 Si 이온은 매우 느리게 방출되었다(도 9a). 그 다음, 시멘트의 이온 변화를 조사하였다. 0% mBGn 시멘트는 Ca 및 P 이온의 초기 급속한 증가를 보인 다음, 이후 급속한 저하를 보였다(도 9b). 10% mBGn 시멘트는 0% mBGn 시멘트와 거의 유사한 Ca 및 P 이온 방출 거동을 보이면서, Si 이온 방출이 지속되었다(도 9c).

pH 7.4의 PBS 용액 내에 시멘트를 침지하는 동안 pH 변화를 모니터링하였다(도 10). 모든 경우에, pH가 초기(1일 이내)에 증가한 다음 시간이 지남에 따라 감소하였다. 그러나, mBGn의 첨가로 인해 pH 변화가 더욱 약한 산성 쪽으로 이동하였다. 4주 후, 0% mBGn의 경우 대략 5.9로 pH가 변화되었고 10% mBGn의 경우 대략 6.6으로 변화되었다.

실험예 8: mBGn 함유 시멘트 조성물의 단백질 흡착 분석

시멘트 샘플 상에서의 단백질의 흡착 능력은 모델 단백질로서 시토크롬 c(cyto.c)를 사용하여 평가하였다. SBF 침지 전후의 CPC/mBGn 시멘트 상에서의 cyto.c 흡착은 정확하게 칭량된 시멘트 디스크(6 mm 직경, 3 mm 높이)를 0.125, 0.250, 0.50, 1, 2, 및 4 mg/ml의 cyto.c를 함유하는 용액 중에 담금으로써 수행되었다. 37℃에서 6시간 침지 후 흡착된 cyto.c의 양을 UV-Vis 분광법(UV-Vis spectrometer, Libra S22, Biochrom, UK)으로 측정하였다. 일련의 d-H₂O 중의 표준 cyto.c 용액을 제조하고, 이들의 흡광도 값을 λ_max = 409 nm에서 측정하였다. cyto.c에 대한 선형 교정 곡선을 0-125 ㎍/ml의 농도 범위에서 얻었다. 이는 Lambert and Beer 법칙에 맞았으며, A가 λ_max = 409 nm에서의 흡광도이고 C가 ㎍/ml 단위의 농도일 때 A₄₀₉ = 0.0071 C - 0.007 (R² _cyto.c = 0.9998)를 나타내었다.

상기한 바와 같이, 시멘트의 단백질 흡착 능력은 SBF 중에 침지시킨 후에 조사하였다(도 11). 시토크롬 C (cyto.c)를 모델 단백질로 사용하였으며, 0.125 mg/ml로부터 4 mg/ml까지 농도를 변화시켰다. 흡착된 단백질 함량은 모든 시멘트 군에 대하여 cyto.c 함량이 증가함에 따라 증가하였다. 특히, mBGn 함량의 증가로 인해 cyto.c 흡착 함량이 유의적으로 증가하였다.

실험예 9: mBGn 함유 시멘트 조성물의 생체적합성 및 골형성 능력 조사

12주령 수컷 스프라그-다우리 래트를 피하 및 두개관 이식을 포함하는 실험에 사용하였다. 상기 동물을 개별적으로 제어된 환경 하에서 사육하고 무제한적으로 표준 펠렛 사료 및 식수를 공급하였다. 동물에 대한 모든 실험 과정은 단국대학교 천안캠퍼스의 동물 실험 윤리위원회에 의해 확립된 동물 관리 및 사용에 대한 가이드라인에 따라 검사되고 평가받았다.

제조된 그대로의 순수한 CPC 및 mBGn-첨가된 CPC 샘플의 생체 내 생적합성을 래트의 피하 조직에서 평가하였다. 동물을 케타민/자일라진의 근육내 주사로 마취시켰다. 래트의 등 부위 상의 피부를 면도하고 포비돈 아이오딘 및 70% 에탄올로 소독하였다. 2 cm 피부 절개를 수행하고, 4개의 작은 피하 포켓을 비절개박리(blunt dissection)에 의해 척추 측면으로 등 상에 만들었다. 4개의 제조된 샘플의 0% 및 10% mBGn-첨가된 CPC 디스크 (6 mm 직경 및 3 mm 높이)를 70% 에탄올/PBS 용액으로 헹군 다음, 에틸렌 옥사이드 가스 (EO 가스) 멸균법을 이용하여 멸균시켰다. 멸균된 샘플을 상기 제조된 포켓 내로 이식한 다음, 절개를 단일섬유 봉합사를 사용하여 봉합하였다. 상기 동물을 수술 2주 후에 희생시킨 다음, 샘플을 조직학적 분석을 위해 적출하였다.

임계-크기의 래트 두개관 골 결손 모델 내에 상기 제조된 0% 및 10% mBGn-첨가된 CPC 디스크 (6 mm 직경 및 3 mm 높이)를 이식함에 따른 생체 내 골 형성을 평가하였다. 시멘트 샘플을 상기와 같이 멸균시켰다. 상기 언급된 마취 조건 하에서, 두개의 배면 영역 상의 피부의 털을 면도하고, 상기 영역을 포비돈과 70% 에탄올을 사용하여 수술을 위해 무균 상태로 만들었다. 선형 중심-선 피부 절개를 두개관 상에 만들고, 피부 및 골막의 전체-두께 플랩을 들어 올렸다. 6 mm 직경을 갖는 2개의 전체-두께 두개 골 결손을 전기 톱을 사용하여 각각의 래트에 생성시켰다. 샘플을 각 골 결손 내에 이식하고, 동물을 무작위로 0% 및 10% mBGn-첨가된 군으로 배분하였다. 그 다음, 피하 조직을 흡수성 재료로 막고 피부 절개를 비흡수성 재료로 봉합하였다. 두개골을 수집하기 위하여 동물을 이식 6주 후에 희생시키고, 시편을 희생 직후에 적출하고 상온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린 내에서 고정시켰다.

두개골 시편을 산 탈회 용액 내에서 탈회시키고 70%로부터 100%로 농도를 증가시킨 일련의 에탄올 내에서 탈수시켰다. 그 다음 시편을 파라핀화하고, 이등분하고, 마지막으로 조직학적 절편화를 위해 준비된 파라핀 블록 내에 삽입하였다. 5 마이크로미터 두께의 두개골 절편을 반자동 회전 마이크로톰 (Leica RM2245, Leica Biosystems, Germany)을 사용하여 원형 결손의 중앙 영역으로부터 얻은 다음, 코팅된 글래스 슬라이드에 놓았다. 조직 절편을 놓은 슬라이드를 탈파라핀화하고 일련의 자일렌 및 농도구배의 에탄올을 통해 탈수시킨 후 마지막으로 광학 현미경 하에서 관찰하기 위해 헤마톡실린 & 에오신 (H&E)으로 염색시켰다.

상기한 바와 같이, 래트 피하 조직의 조직학적 평가를 통해 이식된 0% 및 10% mBGn 시멘트 모두 수술 4주 후 생체적합한 것으로 확인되었다(도 12). 모든 샘플은 우수한 생체적합성을 보였으며, 2개의 군은 조직학적 특징에 있어 차이가 없었다. 샘플을 최소 염증 징후를 갖는 매우 얇은 육아 조직으로 캡슐화하였으며, 적절한 신혈관 생성이 샘플 주변에서 관찰되었다.

또한, 래트 두개골 결손 내에 이식된 시멘트의 조직학적 H&E 이미지를 저배율 및 고배율에서 평가하였다(도 13). 이식 6주 후, 상당한 수준의 새로운 골 형성이 0% 및 10% mBGn 시멘트 모두에서 검출되었다. 새로운 골은 주로 호스트 골 또는 뇌척수 경막 표면의 결손 여백으로부터 주로 형성되었으며, 이는 블록 형태로 샘플의 표면을 향해 확장되었다. 샘플/조직의 경계면에 대한 더욱 면밀한 분석을 통해, 새로운 골의 상기 물질 내로의 내부성장이 10% mBGn 시멘트의 경우 더욱 두드러졌으며, 이는 더욱 서로 섞이고 복잡한 경계면을 형성하였다. 2개의 군 간의 차이는 이들의 분해 거동이었다. 10% mBGn 시멘트 블록 대비, 0% mBGn 시멘트 블록의 분해가 두드러지지 않았다. 0% mBGn 시멘트의 경우, 새로운 골이 대부분 샘플의 표면 상에 형성되었다. 그러나, 스캐폴드 내로의 뚜렷한 골 침투가 10% mBGn 시멘트에서 관찰되었다. 이는 경계면 영역에서 시멘트의 분해 징후에 따른 것으로 보였다.

Claims (13)

1. 분말상과 액상으로 구성되는 인산칼슘 골시멘트 조성물에 있어서,
   상기 분말상은 인산칼슘 화합물 및 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 포함하고, 상기 액상은 경화촉진제를 포함하며,
   상기 인산칼슘 골시멘트 조성물 중의 액상은 분말상 100 중량부에 대하여 30 내지 45 중량부로 포함되고, 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자는 분말상의 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%의 양으로 포함되며,
   상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 첨가로 인하여 인산칼슘 골시멘트의 물리적 강도가 증가하고 생체 내 이식 후 분해성이 증가하는 골형성 촉진용인 인산칼슘 골시멘트 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 첨가로 인하여 인산칼슘 골시멘트의 표면적이 증가하고 단백질 담지 및 전달이 가능한 것이 특징인 인산칼슘 골시멘트 조성물.
   
3. 삭제
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5. 제1항에 있어서, 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 기공 크기는 2 nm 내지 20 nm인 것이 특징인 인산칼슘 골시멘트 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자의 평균 입자 크기는 50 nm 내지 100 nm인 것이 특징인 인산칼슘 골시멘트 조성물.
   
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 분말상은 비정형 인산칼슘(Amorphous caclium phosphate), 제2인산칼슘(Dicalcium phosphate anhydrous, DCPA), 제4인산칼슘(Tetracalcium phosphate, TTCP), α형 제3인산칼슘(α-Tricalcium phosphate, α-TCP) 및 β형 3인산칼슘(β-Tricalcium phosphate, β-TCP)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인산칼슘 화합물을 포함하는 것인 인산칼슘 골시멘트 조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 액상은 이온화된 칼슘 및 인산 이온들의 침전반응을 촉진하여 하이드록시아파타이트 생성을 촉진하는 경화촉진제를 포함하는 것인 인산칼슘 골시멘트 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 경화촉진제는 Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, K₂HPO₄, NH₄H₂PO₄, Na₂SO₄, 구연산, 말레익산 및 프로피온산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 인산칼슘 골시멘트 조성물.
    
11. 삭제
12. 각각 개별 용기에 포장된, 인산칼슘 화합물 및 메조다공성 생활성 유리 나노입자 함유 분말상, 및 경화촉진제 함유 액상을 포함하고, 제1항에 따르는 인산칼슘 골시멘트 조성물 제조용 키트.
    
13. 제12항에 있어서, 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 분말상의 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%의 양으로 사용하도록 제시하는 설명서를 구비하거나 상기 메조다공성 생활성 유리 나노입자가 분말상의 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%의 양으로 정량되어 개별 용기에 포장된 것인 키트.

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