KR102361469B1 - 구리가 도핑된 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노시멘트 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구리 생활성 유리 나노입자(Cu-BGn, copper-bioactive glass nanoparticle)를 포함하는 나노시멘트로서, 상기 나노시멘트는 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있는 것인 나노시멘트에 관한 것으로, 신생혈관 형성 및 골 형성 효과가 있는 생활성 나노입자에 Cu 이온을 도핑하여 조직 재생뿐만 아니라 조직의 박테리아 감염에 대하여 항균 효과를 가지는 나노시멘트 및 이의 제조 방법을 제공한다.

Description

구리가 도핑된 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노시멘트 및 이의 제조 방법{nanocement comprising copper doped bioactive glass nanoparticle and preparation method thereof}

본 발명은 구리가 도핑된 생활성 유리 나노입자, 이를 포함하는 나노시멘트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 생활성 유리 나노입자에 구리가 도핑되어, 골 재생 및 신생혈관 잠재력뿐만 아니라 조직의 박테리아 감염에 대하여 항균 효과를 가지는 나노시멘트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

인간은 조직 손상 또는 생체 재료를 사용한 치료 중에 세균 감염에 쉽게 노출되어 국소 조직의 재생 잠재력이 손상되거나, 염증 항상성을 넘어서는 통제되지 않은 박테리아 성장으로 인해 생명을 위협받기도 한다(M.O. Dellacherie et al., Nature Reviews Materials, 2019; C.R. Arciola, D et al., Nature Reviews Microbiology, 2018). 뼈와 치아와 같은 경질 조직이 골절이나 만성 염증 상황에서 박테리아에 감염되면 대부분 연질 조직 뒤에 위치하는 해부학적으로 제한된 위치, 크게 손상된 자가 치유 능력 및 연질 조직에 비해 국소 감염 위치에 혈액이나 약품의 불충분한 수송으로 발견하거나 치료하기가 쉽지 않다(N. Anasane et al., Academic Press, 2017). 골수염은 드물게 발생하지만 심각한 상태를 유발하는 경질 조직 감염의 예로, 감염된 경질 조직의 재생은 정형외과, 일반외과 및 악안면외과 분야에서 여전히 도전적인 분야이다(K. Sadtler et al., Nature Reviews Materials 1,2016).

박테리아 활성으로 뼈의 결함이 발생할 때, 항생제의 전신 또는 국소 투여는 감염을 제어하는 전형적인 치료로 제안된다. 그러나, 이는 감염 위치로 전달되는 항생제의 낮은 최적화 효율에 의해 때때로 많은 시간 또는 높은 비용이 소요된다. 따라서, 젠타마이신, 토브라마이신, 반코마이신 및 클라다마이신 등과 같은 항생제가 통합된 골 시멘트(폴리(메틸 메타크릴레이트) 또는 칼슘 포스페이트에서 유래)가 일반적으로 항생제 투여 및 후속 골 이식과 함께 치료에서 활용되고 있다(J. Mart

nez-Moreno et al., Orthopaedic Surgery, 2017). 그러나, 국소 지역에 대한 항생제의 독성 및 메티실린 또는 반코마이신 내성 S.auresus와 같은 항생제 내성 박테리아의 분포 가능성이 대두되고 있어, 여전히 생체 의료 골 시멘트를 대체할 최적의 선택지가 제안되고 있지 않다(X. Lin et al., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2017)

최근, 새로운 생체 의료 시멘트인 나노시멘트는 매우 넓은 표면적, 높은 생체 적합성, 치료적 이온의 방출 특성, 혈관 신생 촉진 및 골 유도를 나타내는 시멘트화 기작과 관련된 나노-섬 및 생활성 유리 나노입자(BGn, bioglass nanoparticle)를 사용하여 개발되었다(M.S. Kang et al., Biomaterials 162, 2018). 나노시멘트는 생체 내 칼슘 포스페이트 골 시멘트에 비해 칼바리아 골(calvarias bone) 재생 능력과 함께 신혈관 형성이 유의하게 향상되었다. 그러나, 현재 형태의 나노시멘트는 감염된 골 재생에 적용되기 위한 항균 효과가 부족하다.

이에 본 발명자들은 나노시멘트의 골 재생 및 신생혈관 형성 능력과 함께 경질 조직 감염에 대한 항균 효과를 갖는 구리가 도핑된 생활성 유리 나노입자(Cu-BGn) 및 이를 포함하는 나노시멘트를 제작하였다. 제작된 나노시멘트는 시멘트로서 자가 경화 능력 및 골 형성, 신생 혈관 형성 및 항균 효과 등의 다기능성을 갖도록 최적화되었다.

특허문헌: 국내 등록특허 제10-0831348호

본 발명의 하나의 목적은 구리 생활성 유리 나노입자(Cu-BGn, copper-bioactive glass nanoparticle)를 포함하는 나노시멘트를 제공하는 것이다. 구리가 도핑된 생활성 유리 나노입자는 골재생, 신생 혈관 형성 및 항균 효과를 갖는다. 상기 나노시멘트는 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 구리 이온 수용액을 생활성 유리 나노입자 합성 단계에 첨가하는 단계; (b) 상기 (a)의 결과물을 교반, 침전시킨 후 건조시켜 구리 생활성 유리 나노입자를 수득하는 단계; (c) 상기 구리 생활성 유리 나노입자를 분쇄하고 500℃~600℃에서 굽는 단계; 및 (d) 상기 (c)의 결과물인 구리 생활성 유리 나노입자를 인산염 수용액에 대해 0.2 초과 0.4 미만의 중량비로 혼합시킨 후 건조시키는 단계를 포함하는 나노시멘트 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노시멘트를 유효성분으로 포함하는 항균, 골 재생 및 신생혈관 촉진 효과를 갖는 경조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노시멘트를 손상된 경조직에 처리하는 단계를 포함하는 경조직 재생 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 구리 생활성 유리 나노입자(Cu-BGn, copper-bioactive glass nanoparticle)를 포함하는 나노시멘트로서, 상기 나노시멘트는 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있는 것이다.

본 발명자들은 항균활성이 있으면서도 골 재생 및 신생혈관 형성 등 조직 재생에 효과적인 나노시멘트를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 구리가 도핑된 생활성 유리 나노입자를 포함하는 나노시멘트가 세포 독성이 없으면서도 항균 활성 및 조직 재생에 효과적임을 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 생활성 유리는 유리-세라믹 생체재료를 의미하는 것으로 생활성 유리는 생체적합성에 의해 조직재생을 위한 임플란트, 지지체로 널리 이용된다. 생활성 유리는 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 합성할 수 있으며 이는 업계에서 잘 알려져 있다. 졸-겔법의 화학적인 과정은 실리콘이나 금속 알콕사이드 단위 전구체(monomer precursor)로부터 다양한 종류의 무기질 망상 조직(network)을 만드는 것이다. 이 과정을 이용하면 고온에서 용융과정을 거쳐 무기질 유리를 만드는 전통적인 방법과는 달리 상온에서 경도와 투명도, 화학적 안정도, 조절된 기공, 열전도도 등 좋은 성질의 균질한 무기질 산화물질을 만들 수 있는 장점이 있다. 생활성 유리 용액은 액상의 생활성 유리와 촉매, 용매 등을 포함하며, 생활성 유리 용액은 칼슘, 인 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 칼슘 성분과 인 성분을 포함함으로써 인체 골조직과 지지체간에 화학적 유사성을 갖도록 할 수 있다. 생활성 유리 용액은 생체 활성유리, 촉매, 용매, 칼슘 또는 인을 혼합하여 전자교반하여 제조할 수 있다. 생활성 유리는 테트라알킬 오르토실리케이트일 수 있다. 예를 들어, 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 또는 테트라메틸 오르토실리케이트일 수 있다. 또한 용매는 증류수 또는 메탄올일 수 있다. 촉매는 염산, 칼슘클로라이드 또는 트리에틸포스페이트(TEP)를 사용할 수 있다.

상기 생활성 유리 나노입자는 생활성 유리를 나노수준의 입자로 만든 것으로, 더 넓은 표면적과 더 많은 기공을 가져 생분해성 및 단백질 흡착능이 향상되게 된다. 일반적으로 생활성 유리 나노입자는 SiO₂ 및 CaO를 주성분으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 구리 생활성 유리 나노입자의 Si: Ca:Cu의 중량비는 80~90:5~15:1~10인 것이 바람직하다. Cu 이온은 항균 효과와 Ca과 골형성 시너지 효과, Si 이온과 혈관신생을 위한 시너지 효과를 가지며, 상기의 중량비율 범위에서 가장 안정한 3차원의 나노기공구조가 형성된다. 또한 Si 중량비가 90 이상일 경우, 소량의 칼슘으로 인해 생활성이 저해되거나, 소량의 구리로 인해 낮은 항균활성을 나타낼 수 있다. 또한, Ca의 중량비가 15 이상일 경우 다량의 칼슘으로 인해 나노입자의 형상이나 크기를 균일하게 만드는데 문제가 발생할 수 있다. 또한, Cu의 중량비가 10 이상일 경우 유리 구조의 연결이 감소되어 나노기공구조의 형상이 유지되기 어려울 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 구리 생활성 유리 나노입자는 5~7nm의 기공크기를 가진다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 구리 생활성 유리 나노입자는 비표면적이 650m²/g~850m²/g이다. 본원에서 사용되는 용어 비표면적은 분체, 입자체의 단위 중량 또는 단위 부피당 겉넓이를 의미한다. 비표면적은 또 분체의 입도를 나타내는 특성값으로서 이용된다. 1g의 분체가 갖는 표면적 Sw(cm²/g)로 나타내는 것이 가장 많지만, 단위 부피에 대한 표면적 Sv(cm²/cm³)로 나타내는 것도 있다. 입자가 작아지는데 따라 이 값은 커지며 계면 현상에 있어 중요한 값이 된다. 비표면적이 넓을수록 실제 나노입자의 표면적이 증가된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 구리 생활성 유리 나노입자는 기공 부피가 1.000cm³/g~1.300cm³/g이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 구리 생활성 유리 나노입자는 ζ 전위가 -14mV~-8 mV이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자를 분쇄하고 구운 나노입자 분말은 인산염 수용액과 혼합시켜 나노시멘트를 제조할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 상기 인삼염 수용액은 NaH₂PO₄ 이다_.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노시멘트는 NaH₂PO₄ 용액에 대해 상기 구리 생활성 유리 나노입자가 0.2 초과 0.4 미만의 중량비로 혼합되어 제조된다. 상기 구리 생활성 유리 나노입자가 NaH₂PO₄ 용액에 대해 0.2 이하의 중량비로 혼합되거나, 0.4 이상의 중량비로 혼합되는 경우 나노입자의 칼슘 이온과 포스페이트 이온 사이의 화학반응에 의해 증착되는 하이드록시아파타이트 결정이 생성되기 어렵거나 과다하게 생성되는 문제점이 있어, 시멘트화가 어렵다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노시멘트는 생체모방용액(SBF)에서 하이드록시아파타이트가 형성됨을 확인하여, 상기 나노시멘트가 인간의 생체 내에서 하이드록시아파타이트를 형성할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노시멘트는 Si 이온 20~25ppm/day, Ca 이온 17~22ppm/day, Cu 이온 10ppm/day이 분비되었으며, 상기 나노시멘트의 추출물이 1/8~1/32로 희석되는 경우, 치료적 효과를 발휘하여 혈관 신생 및 항균 효과를 가질 수 있다. 나노시멘트 추출물이 1/8 미만으로 희석되는 경우 세포독성이 나타나며, 1/32를 초과하여 희석되는 경우 치료적 효과를 발휘하기 어려울 수 있다.

희석된 Cu-BGn 나노시멘트 배지는 희석된 BGn 시멘트 배지보다 더 우수하거나 유사한 골생성 효과를 보였으며, Cu-BGn 나노시멘트는 세포 생체 활성 및 기타 생물학적 다기능성(골형성, 혈관신생, 항균 효과)을 나타내기 위한 생리화학적 특성을 갖도록 제작되었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 나노시멘트 제조 방법을 제공한다.

(a) 구리 이온 수용액을 생활성 유리 나노입자 합성 단계에 첨가하는 단계;

(b) 상기 (a)의 결과물을 교반, 침전시킨 후 건조시켜 구리 생활성 유리 나노입자를 수득하는 단계;

(c) 상기 구리 생활성 유리 나노입자를 분쇄하고 500℃~600℃에서 굽는 단계; 및

(d) 상기 (c)의 결과물인 구리 생활성 유리 나노입자의 분말이 인산염 수용액에 대해 0.2 초과 0.4 미만의 중량비로 혼합시킨 후 건조시키는 단계.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 Ca-Si 네트워트를 형성시키기 위해 550℃에서 10시간 동안 구운 후 60℃ 오븐에서 하룻밤 건조되었다. 온도가 500℃ 미만인 경우 Ca-Si 네트워트가 형성되기 어려우며, 600℃를 초과하는 경우 결정화 및 치밀화로 나노입자의 유리구조 생성에 문제가 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)는 NaH₂PO₄ 용액에 대해 상기 구리 생활성 유리 나노입자가 0.2 초과 0.4 미만의 중량비로 혼합되어 제조된다. 상기 구리 생활성 유리 나노입자가 NaH₂PO₄ 용액에 대해 0.2 이하의 중량비로 혼합되거나, 0.4 이상의 중량비로 혼합되는 경우 나노입자의 칼슘 이온과 포스페이트 이온 사이의 화학반응에 의해 증착되는 하이드록시아파타이트 결정이 생성되기 어렵거나 과다하게 생성되는 문제점이 있어, 시멘트화가 어렵다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노시멘트를 유효성분으로 포함하는 항균 및 신생혈관 촉진 효과를 갖는 경조직 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 경조직 재생용 조성물은 상기 나노시멘트를 1/16 내지 1/32로 희석한 것을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 나노시멘트는 in vitro 실험을 통해 골형성 관련 유전자 발현, ALP, ASP 염색을 통해 골 재생효과를 확인하고, HUVEC, 달걀 막의 혈관 신생을 통해 혈관 신생 효과를 확인하였으며, 상기 나노시멘트와 E.coli 또는 S.aureus를 배양하거나 나노시멘트와 E.coli 또는 S.aureus 및 rMSC 또는 HUVEC 공동배양을 통해 항균 효과를 확인하였다. 또한, 랫트를 대상으로 in vivo 실험을 수행하여, 생체 적합성을 확인하고, 골수염이 도입된 랫트에서 뼈 재생, 염증 감소효과를 확인하여 본 발명의 나노시멘트는 뼈의 재생 또는 뼈 수술이 필요한 환자에게 항생제 없는 유용한 경조직 재생용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노시멘트를 손상된 경조직에 처리하는 단계를 포함하는 경조직 재생 방법을 제공한다.

본 발명은 신생혈관 형성 및 골 형성 효과가 있는 생활성 나노입자에 Cu 이온을 도핑하여 조직 재생뿐만 아니라 조직의 박테리아 감염에 대하여 항균 효과를 가지는 다기능성 나노입자, 이를 포함하는 나노시멘트 및 이의 제조 방법을 제공한다.

도 1은 구리 생활성 유리 나노입자(Cu-BGn) 및 나노시멘트 특성을 나타낸다. (a)는 Cu-BGn 나노입자의 TEM 및 FE-SEM 이미지를 나타내며, (b)는 설정 시간, 나노입자 및 NaH₂PO₄ 용액의 비율에 따른 Cu-BGn 시멘트화를 나타내며, (c)는 Cu-BGn 시멘트의 TEM 이미지를, 화살표는 나노 섬을 나타내며, (d)는 시멘트화 후 SBF 침지 시간에 따른 XRD 데이터를 나타내며, 침지시간에 따라 아파타이트 피크가 강해졌다. (e)는 시멘트화 후 FT-IR 데이터를 나타내며, 포스페이트 및 실리카 피크를 나타낸다. (f)는 SBF에 침지된 BGn 및 Cu-BGn 표면에 하이드록시아파타이트 형성을 나타내는 FE-SEM 이미지다.
도 2 (a)는 BGn 나노입자의 TEM, FE-SEM 이미지 및 EDS 결과이며, (b)는 Cu-BGn 나노입자의 EDS 결과이며, (c)는 두 나노입자(BGn 및 Cu-BGn)의 비정질 상을 나타낸 XRD 결과이며, (d)는 두 나노입자의 FT-IR 데이터, (e)는 두 나노입자의 N2 흡착/탈착 곡선이며, (F)는 두 나노입자의 요약된 BET 데이터 및 제타 전위 결과를 나타낸다.
도 3은 BGn 및 Cu-BGn 나노시멘트의 특성을 나타낸다. (a)는 BGn 시멘트의 TEM 이미지 및 EDS 결과이며, (b)는 Cu-BGn 시멘트의 EDS 결과이며, (c)는 BGn 시멘트의 XRD 데이터이며, (d)는 BGn 시멘트의 FT-IR 데이터이며, (e)는 BET 그래프(N2 흡착/탈착 곡선)이며, (f)는 나노시멘트 및 SBF 침지된 나노시멘트의 BET 결과를 나타낸다.
도 4는 BGn 및 Cu-BGn 나노시멘트의 방출된 이온량을 나타낸다. (a) BGn 시멘트에서 Si 이온이 지속적으로 방출되고 Ca이 3 일까지 빠르게 방출된 다음 천천히 방출되며, Cu 이온은 검출되지 않았다. (b)는 Cu-BGn 시멘트에서 Si 및 Ca 이온 방출 패턴은 BGn 시멘트와 유사하며 Cu 이온은 1 일까지 빠르게 방출된 후 천천히 방출되었다. (c)는 나노시멘트의 1일 동안 침지된 누적 이온량 및 희석된 나노시멘트 추출물의 이온량을 나타낸다. 적색 글자는 효과적인 이온 농도를 나타낸다.
도 5는 BGn 및 Cu-BGn 나노시멘트 이온 추출 배지에서 rMSC 세포 생존가능성 및 골생성 효과를 나타낸다. (a)는 BGn 및 Cu-BGn 나노시멘트 이온 추출 배지에서 2일 동안 rMSCs의 생존가능성을 나타내며(Ctrl=정상 성장 배지), (b)는 ALP 분석결과를 나타낸다. rMSC는 나노시멘트 이온 추출 배지로 3, 7, 14일 동안 배양하였다(CM=정상 성장 배지, OM=CM에 골분화 인자 추가, Cu=Cu-BGn 시멘트, BGn=BGn 시멘트, 각 시멘트는 24시간(10ea/10ml)동안 추출되고 1/16 및 1/32 희석된 것으로, 골분화 인자가 첨가되었다. (c)는 ARS 염색 결과를 나타내며, (d)는 3, 7, 10, 14일 동안 시멘트 이온 추출 배지로 세포를 배양한 결과 RUNX2 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR 결과로 나타낸다.
도 6은 BGn 및 Cu-BGn 나노시멘트의 ARS 염색을 나타낸다.
도 7은 BGn 및 Cu-BGn 나노시멘트 추출물의 HUVEC 및 달걀에 대한 혈관 신생 효과를 나타낸다. (a)는 시멘트 침지 배지에서 HUVECs의 생존, (b)는 HUVEC의 관형(tubular) 형성 결과, (c)는 CAM 분석 이미지, (d)는 혈관 전체 길이, 크기, 및 교차점(junction)에 대한 CAM 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 BGn 및 Cu-BGn 나노시멘트 추출 배지에서 HUVEC의 관 형성을 나타낸다. (a)는 6시간 배양시의 대표 이미지, (b)는 12시간 배양 시의 대표 이미지, (c-d) HUVEC 관 형성 데이터, (e) HUVEC 관 형성 실험의 개략도 및 사진을 나타낸다.
도 9는 E.coli와 S.aureus에 대한 나노시멘트의 항균 효과를 나타낸다. (a-b)는 나노시멘트 없이, BGn 나노시멘트와 함께, 또는 Cu-BGn 나노시멘트와 함께 배양한 E.coli과 S.aureus의 생존력을 프레스토블루에 의해 분석하여 나타낸다. (c)는 박테리아를 P/S를 함유한 배지, 일반 배지, BGn 시멘트 추출 배지 또는 Cu-BGn 추출 배지에서 6시간 동안 배양한 live/dead 염색 결과를 나타낸다. (d)는 나노시멘트 추출 배지에서 배양된 박테리아의 ICP 데이터를 나타낸다.
도 10은 live/dead 염색에 의해 rMSC, 박테리아 및 나노시멘트 침지 배지에서 나노시멘트의 항균 효과를 나타낸다. (a)는 모식도이다. (b)는 E.coli 유무에 따른 rMSC, (c)는 Cu-BGn 시멘트 추출물과 박테리아 공동배양에서 생존 세포의 비율을 나타낸다.
도 11은 live/dead 염색에 의해 HUVEC, 박테리아 및 나노시멘트 침지 배지에서 나노시멘트의 항균효과를 나타낸다. (a)는 E.coli 유무에 따른 HUVEC, (b)는 S.aureus 유무에 따른 HUVECs, (c-d)는 Cu-BGn 시멘트 추출물과 박테리아 공동배양에서 생존 세포의 비율을 나타낸다. 모든 데이터는 Cu-BGn 시멘트 추출된 배지가 박테리아를 억제하고 죽이는 것으로 나타났으며, 이로 인해 더 나은 HUVEC 생존력이 나타났다.
도 12는 나노시멘트의 피하 삽입 실험을 나타낸다 (a)는 BGn 시멘트 삽입 , (b)는 Cu-BGn 시멘트 삽입 실험 결과를 나타낸다(C=나노시멘트, M=근육).
도 13은 골수염 유도된 랫트에서 나노시멘트의 골재생 잠재력을 평가하기 위한 실험을 나타낸다. (a)는 랫트에서 골수염을 유도하는 개략도를 나타내며, (b)는 X선 이미지, (c)는 CT 이미지, (d)는 H&E 염색을 나타낸다(C=나노시멘트, M=근육).
도 14는 Cu-BGn 시멘트의 효과에 대한 개략도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다,

실시예 1. 구리 생활성 유리 나노입자(Cu-BGn)의 제조 및 특성

1-1. Cu-BGn 나노입자 및 시멘트의 제조

구리 질산염은 Cu-BGn 나노입자를 만들기 위해 생활성 유리 나노입자(BGn) 합성 중 첨가되었다. 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB; Sigma Aldrich)은 탈이온수(DW)에 용해되고, 암모늄 하이드록사이드(NH₄OH, 28.0% NH₃ in water ≥99.99% metal basis), 무수 에틸 알코올(C₂H₅OH; C₂H₆O, 99.5%, Daejung, Siheung-si, Republic of Korea), 칼슘 나이트레이트 테트라하이드레이트(Sigma Aldrich), 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS; Sigma Aldrich) 및 구리 질산염이 첨가되었다. 이 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 아세톤으로 침전시켰다. 건조된 Cu-BGn은 10,000rpm, 3분에서 원심분리에 의해 수득되었고, 60℃ 오븐에서 하룻밤 건조하였다. 이 Cu-BGn은 분쇄되고 Cu-BGn에서 Ca-Si 네트워크를 만들기 위해 10시간 동안 550℃에서 구워진후 60℃ 오븐에서 하룻밤 건조하였다. Cu-BGn 시멘트 형태를 만들기 위해, 나노입자 샘플이 2.5% NaH₂PO₄ 액체와 분말/액체(P/L) 비율 0.3으로 혼합되고, 디스크 형상 프레임(3 x 6 mm(D x H))으로 모양을 형성하고, 습한 수조에서 하룻밤 동안 건조되었다. 분말/액체(P/L) 비율은 0.3으로 최적화되어 설정시간 70분 미만에서 적절한 시멘트화를 나타낸다(도 1b). P/L 비율이 0.4 및 0.5인 경우 시멘트화가 되지 않았다. BGn 시멘트 및 Cu-BGn 시멘트에 대한 P/L 비율도 0.3으로 결정하였고, 설정시간 ~80분임을 나타낸다.

그 결과, 큰 기공을 갖는 BGn 나노입자(Ca 15wt%) 및 실리카 기반 Cu-BGn 나노입자(Cu 5wt% 및 Ca 10wt%)가 제조되었으며, 10~15 wt%의 Ca를 함유하는 큰 기공(0.5cm³/g 이상)을 갖는 나노입자는 시멘트화를 위한 최적의 나노분말을 제공하였으며, 시멘트화 과정을 통해 BGn 나노시멘트 및 Cu-BGn 나노시멘트를 제조하였다.

1-2. Cu-BGn 나노시멘트의 특성 확인

나노입자 및 나노시멘트의 나노 구조 형태는 필드 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, Sigma 500, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다. 나노입자 및 나노시멘트의 이온 비율은 고해상도 투과 전자 현미경(HR-TEM; JEM-3010, Jeol, Tokyo, Japan) 및 필드 방출 투과 전자 현미경(FE-TEM; JFM-F200, Jeol)에 의한 각 현미경의 에너지 분산 분광법(EDS; Thermo Noran System 7, Thermo Fisher, MA, USA)에 의해 조사하였다. 나노시멘트의 메조 다공성 특성은 N₂ 흡착/탈착 곡선을 기반으로 하는 Brunauere Emmette Teller(BET)에 의해 측정되었으며, 기공 부피는 Barrett Joyner Halenda(BJH) 방법에 의해 측정되었으며, 기공 사이즈는 평균 기공 사이즈 측정에 의해 측정하고, 표면적은 BET 방법에 의해 계산되었다. 나노입자들의 표면 전하는 레이저 도플러 전기 영동 계측기(Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK)에 의해 측정되었다. 나노입자들 및 나노시멘트의 위상은 X선 회절(XRD; Ultima IV Rigaku, Japan)로 분석되었다. X선을 40Ma와 40kV에서 Cu Kα 방사선을 사용하여 생성하였다. 데이터는 회절각 10에서 80까지 0.02^o의 스텝 크기와 2.0^o/분의 스캐닝 속도로 얻었다. 화학적 결합 구조는 현미경 푸리에 형질적외선 분광법(Microscope FT-IR; FT-IR Frontier&Spotlight 400, Perkin Elmer, MA, USA)의 감쇠된 총 반사도(ATR)에 의해 조사되었다.

BGn 또는 Cu-BGn 나노시멘트로부터 방출되는 이온(Si, Ca 및 Cu)의 농도는 21일 동안 측정하였다. 각 디스크 형태 샘플은 1 ml Tris-HCl 버퍼(pH 7.4, 37℃)당 10개를 침지하고 다른 시간에서(1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일 및 21일) 37℃ 습한 수조에서 배양하고, 배지는 새로운 튜브로 옮겨지고 13,000rpm에서 3분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상청액은 새로운 튜브로 옮기고 질산 용액 1 방울이 첨가되었다. 수집된 샘플은 유도성 결합된 플라즈마 원자 방출 분광법(ICP-AES; Optima 4300 DV, Optima, Perkin-Elmer, USA)에 의해 분석되었다.

생체 내 모방 환경에서 Cu-BGn 나노시멘트 및 BGn 나노시멘트에 대한 하이드록시아파타이트 형성을 조사하기 위해, 각 샘플은 10mL의 모의 체액(SBF; Na⁺ 142.0, K⁺ 5.0 mM, Ca²⁺ 2.5 mM, Mg²⁺ 1.5 mM, Cl^- 147.8 mM, HCO₃ ^- 4.2 mM, HPO₄ ^2- 1.0 mM, SO₄ ^2- 0.5 mM) 37℃, pH7.4에 침지되었다. 특정 시점(3일, 7일 및 14일) 샘플을 수집하고 DW로 수회 세척하고, FE-SEM, XRD 및 FT-IR에 의해 하이드록시아파타이트 형성을 분석하였다.

Cu-BGn 나노입자 및 BGn 나노입자의 TEM 및 SEM 이미지는 모두 구형 및 고다공성 구조로 약 160nm의 크기를 가지며(도 1a 및 도 2a). TEM-EDS에 의해 검사된 준비된 나노입자의 조성은 Cu-BGn과 BGn에서 중량비는 Si:Ca=83.8:16 및 Cu-BGn은 Si:Ca:Cu=84.4:10.0:5로 나타났다(도 2a, b). 두 나노입자의 실리케이트 유리의 위상은 XRD에 의해 측정된 바와 같이 2θ~ 20~25^o에서 넓은 비정질 피크로 나타났다(도 2c). FT-IR 스펙트럼은 810cm^-1에서 피크를 보였으며, 이는 실리케이트 유리의 주요 화학 결합인 Si-O-Si 화학결합에 해당되는 것이다(도 2d). BGn 및 Cu-BGn의 비표면적, 기공 부피 및 기공 크기를 N₂ 흡착/탈착 곡선 측정 및 BET 방법으로 측정하여 BGn 및 Cu-BGn 나노입자는 유사한 물리적 특징을 가짐을 확인하였다(도 2 e,f).

시멘트화를 위해 나노입자를 2.5wt% NaH₂PO₄와 혼합한 후 즉시 촬영된 Cu-BGn의 TEM 이미지는 표면에 BGn과 유사하게 형성된 나노섬(적색 화살표)을 나타냈으며, 비정질 네트워크에 기반한 Si-Ca-(P)-Cu를 형성하기 위한 나노시멘트의 전형적인 침전 현상을 나타낸다(도 1c 및 도 3). Ca 및 Si 이온이 나노입자에서 방출되고 방출된 이온이 수용액의 과포화 상태를 일으켜, 나노입자 표면에 방출된 이온의 재침전을 가속화하여 나노 섬을 나타낸다. TEM-EDS에 의해 확인된 바와 같이, 시멘트화 전후의 다른 원자비는 방출된 이온에 의한 시멘트화 기작을 지지한다. BGn과 Cu-BGn의 초기 Si/Ca 원자 비율은 83.8/16.2 및 84.4/10.0인 반면 시멘트화된 BGn은 81.0/14.5, Cu-BGn은 83.7/8.5 이었다. Cu-BGn의 경우, Cu 이온의 원자값도 5.5에서 3.4로 감소하였고, 이는 Si, Ca 및 (Cu) 이온이 시멘트화 중에 방출되었음을 나타낸다(도 2a, b 및 도 3a,b).

SBF 침지 전후에 XRD, FT-IR 및 BET에 의해 나노시멘트의 특성을 추가로 조사하였다. 나노시멘트는 나노 분말과 유사한 비정질 XRD 패턴을 나타냈으며(도 1d 및 도 3 c, D0 데이터), 2θ ~ 29^o 및 32^o에서 새로운 추가 피크는 방해석(CaCO₃)과 인회석을 각각 나타낸다. 나노시멘트에서 새롭게 나타난 피크는 시멘트화 동안 결정상을 형성하기 위해 구리 및 포스페이트 이온이 관여할 수 있음을 나타낸다.

두 나노시멘트의 FT-IR 스펙트럼은 각각 Si-O-Si, PO₄ ^3-, P-O-P 및 PO₄ ^3-에 해당하는 550, 600, 870 및 960cm^-1의 새로운 밴드를 나타냈다(도 1e 및 도 3d, D0 데이터).

나노시멘트의 메조 다공성 특성은 나노 분말에 비해 상대적으로 감소했다. 표면적은 ~40%, 기공 부피는 60~87% 감소하였으나, 여전히 넓은 표면적(330.132 및 305.619m²/g)과 큰 기공 부피(0.766 및 0.876cm³/g)를 각각 갖는다. 또한, 나노시멘트 내 나노 분말 사이의 공간으로 인해 나노시멘트의 평균 기공 크기가 ~70% 이상 증가했다(9.57nm 및 9.766nm)(도 3f, SBF D0 데이터).

다음으로, 나노시멘트를 SBF에 침지하여 아파타이트 형성 능력을 14일 동안 조사하였다. 14일 샘플을 대표적으로 나타낸 Fe-SEM 이미지는 나노시멘트 표면의 구조가 SBF 침지 후 아파타이트 나노크리스탈 구조의 변경으로 인해 크게 변화되는 것을 나타낸다(도 1f). 두 나노시멘트에서 아파타이트 나노결정의 크기는 수백 nm 미만이고, 이는 잘 알려진 생활성 골 시멘트(CPC, 수μm) 보다 훨씬 작다. 하이드록시아파타이트(HA) 나노 결정의 XRD 분석 위상은 증가하는 결정 피크를 침지 시간 동안 2θ ~ 25^o 및 32^o에서 나타냈다(도 1d, 도 3).

SBF 침지 후 FT-IR 스펙트럼은 비침지된 시멘트와 비슷한 패턴을 보였다 (550cm-1: Si-O-Si, 600 & 960cm^-1: PO₄ ^3-, 및 870cm^-1: P-O-P), 하지만 일반적으로 Si-Ca-(P) 기반 나노시멘트 표면에 나쁘게 결정화된 HA의 증착으로 인해 피크가 감소된다(도 1e, 도 3d).

SBF에서 아파타이트의 형성은 BGn의 나노입자 형태에서 관찰되었다. 따라서 나노시멘트에 아파타이트 형성도 유사하게 추론된다. HA 나노결정의 성장과 함께 두 나노시멘트는 넓은 표면적(290~350m²/g), 큰 기공 볼륨(0.57~0.87cm³/g) 및 큰 기공 크기(7.9~12.3nm)를 SBF 침지 14일 동안 유지하였으며, 표면적 및 기공 부피는 SBF 침지 시간이 증가함에 따라 점차 감소하는 것으로 기록되었다(도 3e, f). 이 두 나노시멘트의 메조 다공성 특성은 경조직 형성 동안 생물학적 분자와의 다양한 작용을 의미한다.

Tris-buffer 1mL, 37℃ 내 나노시멘트(30mg)의 방출된 이온은 21일 동안 ICP-AES에 의해 분석되었다(도 4a, b). 누적 이온 방출 패턴은 두 나노시멘트에서 Si 이온이 21일까지 점진적으로 방출된 것으로 나타났다. 그러나, Ca 이온은 1일까지 초기 기간에 급속히 방출되었고, 방출 속도는 점차 감소하였다. 21일 동안 Si 및 Ca 이온의 방출 결과는 유사하였으며 Cu-BGn 나노시멘트 및 BGn 나노시멘트에서 각각 Si: 545.96ppm 및 517.31ppm 및 Ca: 457.18ppm 및 362.08ppm였다. Cu 이온은 Cu-BGn 시멘트에서 최대 220.77ppm(~10ppm/day) 방출되었고, Cu 이온의 방출 패턴은 첫날 급속히 방출된 후 점차 감소하는 Ca 이온과 유사했다. 하루에 시멘트로부터 방출되는 이온은 Si는 20~25ppm/day, Ca는 17~22ppm/day로서, 골형성 및 혈관신생에 대한 치료 용량을 상회하였으며, 추출물은 치료적 이온의 유효 농도를 찾기 위해 1/256까지 희석되었으며, 시멘트 추추출물의 1/8~1/32배 희석은 방출이온이 치료적 농도 범위 내로 확인되었다(도 4c). 또한, Cu 이온의 치료적인 범위 내에서 혈관신생 및 항균효과와 같은 중요한 생물학적 효과가 있다. 추가적으로, 나노시멘트의 1/128 희석으로부터 방출되는 Cu 이온 농도(~0.1ppm 매일)는 항균 효과를 나타내는 구리 이온 농도(매일 0.05ppm), 보다 높았으며 혈관 신생 농도(20ppm)의 범위 내였다. 결과적으로, CuBGn 시멘트는 세포 생체 활성 및 기타 생물 학적 다기능성(골형성, 혈관신생, 항균 효과)을 나타내기 위한 생리화학적 특성을 갖도록 제작되었다.

실시예 2. Cu-BGn 나노시멘트의 시험관 내 실험

2-1. Cu-BGn 나노시멘트의 세포독성

rMSCs(기본 배양) 및 HUVECs(PCS-100-010, ATCC, Manassas, VA, USA)은 정상 성장 배지와 함께 96 웰 플레이트에 10⁴ 세포/웰로 분주되고, 10개의 BGn 시멘트와 10개의 Cu-BGn 시멘트가 각 세포 배지 10ml에 침지되었다. 24시간 후 상기 시멘트 추출 배지는 0.2μm 필터로 여과하고 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 및 1/256 배로 희석하고, 이들 희석된 배지로 세포 생존가능성을 분석했다. 각 웰의 배지는 상기 희석된 시멘트 추출 배지, rMSC 성장 배지 및 HUVEC 성장 배지(CM=대조군)로 변경된 후, 세포 생존율은 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo molecular technologies, Rockville, MD, USA)으로 1일 및 2일에 측정하였다. 모든 실험은 각 조건에 대해 3개의 복제 샘플을 테스트했다.

그 결과, CCK 분석에 의해 측정된 세포 생존율은 특정 희석 농도(1/4~1/256 희석)에서 1일 또는 2일에 유의하게 증가한 반면, 고농도 추출물(1 및 1/2 희석)은 세포 독성을 나타냈다(도 5a). BGn 시멘트 추출물과 비교하여 Cu-BGn 시멘트 추출물은 1일째 1/4에서, 2일째 1/4~1/8 희석에서 유의미한 세포독성 증가를 나타냈다(P<0.05). 1/16 및 1/32 희석 조건은 추가 분화 연구를 위해 선택되었으며, 이 농도는 배양 2일 동안 세포 독성 없는 것으로 보고된 치료적 범위 내였다.

2-2. Cu-BGn 나노시멘트의 골 형성 능력

Cu-BGn 나노시멘트의 골 형성 능력을 조사하기 위해, rMSC와 함께 qRT-PCR에 의한 RUNX2 유전자 발현 및 알리자린 레드 S(ARS) 염색 및 알칼리성 포스파타제 (ALP) 분석을 수행하였다.

qRT-PCR을 통한 골형성 관련 유전자(RUNX2)의 발현 분석

rMSC는 rMSC 성장 배지를 가진 6웰 플레이트에 8x10⁴/웰 분주되었고, 24시간 후, 배지는 샘플 배지(CM=rMSC 성장 배지, OM=골형성 인자 포함 배지, Cu-BGn시멘트 1/16 추출 배지, Cu-BGn 시멘트 1/32 추출 배지, BGn 시멘트 1/16 추출 배지 및 BGn 시멘트 1/32 추출 배지)(CM을 제외한 모든 매체는 골형성 인자를 포함)로 변경되었다. 3일, 7일, 10일, 14일 배양 후 각 샘플 세포의 RNA는 Ribospin^TM kit (GeneAll Biotechnology, Seoul, Republic of Korea)에 의해 추출하였으며, RNA 샘플은 AccuPower RT PreMix(Bioneer, Daejeon, Republic of Korea)를 사용한 Veriti^TM 96-Well Fast Thermal Cycler(Thermo Fisher)에 의해 cDNA로 변경되었다. 역전사 이후, 룬트 관련 전사 인자 2(RUNX2), 골형성 관련 유전자는 Nuclease-free water(GeneAll Biotechnology), 50 mM MgCl₂(Bioline, London, UK), 2X SensiMix SYBR Hi-Rox(Bioline), Oligo-dT Primers(Qiagen, Hilden, Germany), Random hexamer(Qiagen), RUNX2 프라이머 및 하우스키핑 유전자로 사용되는 GAPDH를 사용한 정량 실시간 폴리머 연쇄 반응(qRT-PCR)에 의해 분석되었다 (프라이머 서열: RUNX2 forward 5'-CCGTAGAGAGCAGGGAAGACA- 3', reverse 5'-GGTGCCAGGAATGA TCACAGT-3', GAPDH forward 5'-CCATTCTT CCACCTTTGATG-3', reverse 5'-CT GTTGCTGTAGCCATATTC-3).

알칼리성 포스파타아제(ALP) 활성에 의한 골형성 능력 측정

rMSC는 상기 유전자(RUNX2)의 발현 분석과 동일한 조건으로 배양하였고, 샘플 세포는 1X PBS로 세척하고 -80℃에서 3일째, 7일, 14일째에 동결되었다. 이들 세포의 알칼리성 인산염(ALP) 활성은 ALP 키트(Alkaline Phosphatase Assay Kit, ab83369, Abcam, Cambridge, UK)로 프로토콜에 따라 측정하였다. 정상화하기 위해, dsDNA 양은 동일한 샘플을 PicoGreen^TM dsDNA quantitation assay kit(Invitrogen^TM)로 측정하였고, ALP 결과는 각 dsDNA 양에 의해 나누어졌다.

알리자린 레드-S(ARS) 염색에 의한 골형성 능력 측정

rMSC는 상기 유전자(RUNX2)의 발현 분석과 동일한 조건으로 배양하고 21일 및 28일째에 4% PFA로 고정하였다. 염색 전에, 샘플을 DW로 2회 세척하고, 40mM, pH4.2 알리자린 레드 S(ARS, Sigma Aldrich) 용액으로 염색한 다음, 어두운 곳에서 30분 동안 배양하였다. 염색 후, 샘플을 4회 이상 세척하고 스캐너로 플레이트를 스캔하였다(Epson, Nagano, Japan). 정량화를 위해, 10% w/v 세틸피리디늄 염화물(CPC, Sigma Aldrich)과 인산나트륨(pH7 용액)을 사용하여 샘플을 처리하고 왕복식 진탕기(DLAB, SK-R1807-E, Beijing, China)에 두었다. 30분 후, ARS 추출용액을 96웰 플레이트로 옮기고 550nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.

실험 결과

dsDNA로 정규화된 ALP 활성은 3일에서부터 14일까지 증가하였다. 두 나노시멘의 1/16 및 1/32 희석 추출물은 분화 배지 대조군과 비교하여 ALP 활성을 상당히 향상시켰다(도 5b). ARS 염색으로 밝혀진 rMSC 세포 광물화는 실험군 사이의 차이를 분명히 보여주었다. 21일 및 28일 배양에서 BGn에 비해 1/32 Cu-BGn 시멘트 추출물에서 ARS 염색이 유의하게 향상되어 개선된 칼슘 침착을 나타내었다(도 5c 및 도 9).

골 형성 전사 마커로서 RUNX2 유전자 발현은 Cu-BGn 시멘트 추출 그룹(특히 1/16 및 1/32 추출)에서 BGn와 비교하여 7, 10 및 14 일에 향상되었다(도 5d). 전체적으로 Cu-BGn 시멘트는 추출물에서 Ca 및 Si 이온의 농도가 높고 골 형성을 위한 구리이온의 상승적 역할로 인해 BGn 시멘트와 비교하여 줄기 세포 생존력 및 분화 마커 측면에서 유사하거나 더 높은 골 형성을 유도하였다.

2-3. Cu-BGn 나노시멘트의 혈관 신생 능력

HUVEC 관 형성에 의한 혈관 신생 분석

HUVEC의 관(tubular) 형성을 분석하기 위해, 24웰 플레이트는 100% Matrigel로 코팅하고 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 배양한 다음 5x10⁴ HUVEC를 HUVEC 성장 배지, Cu-BGn 시멘트 추출(1/16 및 1/32) 배지 및 BGn 시멘트 추출 (1/16 및 1/32) 배지에 분주하였다. 6시간 및 12시간 후, 세포는 광학 현미경(IX71 and DP72, Olympus, Tokyo, Japan)으로 촬영하고, ImageJ의 혈관 신생 분석기를 통해 관전체 길이, 마디(node) 수, 평균 메쉬 및 메쉬 크기를 분석하였다.

CAM 분석에 의한 혈관 신생 분석

수정란이 도착했을 때, 안정을 위해 습한 조건에서 병아리 인큐베이터에 머물렀다. 3일 후, 달걀의 상단에 작은 구멍을 만든 후 달걀의 3mL 알부민은 주사기에 의해 제거되고, 구멍은 흰색 붕대(테이프)로 차단되었다. 다시 3일 후, 달걀의 상부에 약 5mm의 구멍을 만들고 샘플 나노시멘트를 삽입하고, 달걀 껍질조각으로 덮고 붕대(테이프)를 부착하였다. 병아리와 혈관을 성장시키기 위해 4 일을 기다린 다음 달걀의 상단을 부수고 혈관이 형성된 달걀껍질 막과 달걀 막을 제외한 달걀의 내부의 모든 것을 제거하였다. 달걀 껍질을 4% 파라포름알데히드(4% PFA, T & I)로 채우고 며칠 후 4% PFA를 모두 제거하고 건조시켰다. 마지막 단계는 달걀을 둥근 칼날을 사용하여 수작업으로 자르고 달걀 껍질막의 혈관은 현미경(JSZ-7XT, Samwon, Seoul, Republic of Korea), Canon relay 렌즈(NDPL-2(2X), Canon)를 사용한 디지컬 카메라(Canon EOS-1d, Cannon, Tokyo, Japan)로 촬영하였다. 총 길이, 총 크기 및 샘플 사진의 총 교차점은 Angio Quant 프로그램에 의해 측정되었다.

실험 결과

Cu-BGn 나노시멘트의 CCK 세포 생존력 분석 결과 1~1/4 희석 추출물로 심각한 세포 독성(10~70%)을 나타냈고 1/8 이상의 희석 배지는 ~90% 세포 생존율을 나타냈다(도 7a). 1/16 및 1/32 희석 조건을 Matrigel에서 추가 관형 형성 연구를 위해 선택하였다. Cu-BGn 나노시멘트 및 BGn 나노시멘트의 서로 다른 희석 조건에서 HUVEC의 관형 형성을 보여주었으며, 두 나노시멘트 추출물이 교차점(junction) 수, 메쉬 및 마디 수, 평균 메쉬 크기 및 총 길이 측면에서 관 형성을 크게 향상시켰다(도 7 및 도 8). 특히, Cu-BGn 나노시멘트 1/16 희석 군에서 BGn 나노시멘트에 비해 총 길이(6 시간에서) 및 평균 메쉬 크기(12 시간에서)가 유의하게 증가하였다. 평균 메쉬 크기가 지속적으로 증가하는 동안 특정 시점이 지남에 따라 모든 관형 파라미터가 증가하기 시작했다(도 8f). Matrigel에서 HUVEC의 이러한 전형적인 관 형성과 함께, 초기 및 후기 파지에서의 주요 세관 파라미터는 HIF-α 활성을 통한 구리 이온의 혈관 형성 역할에 의한 상승 작용 및 추출물 내 높은 실리케이트 농도로 인해 대조군 및 BGn과 비교하여 Cu-BGn 시멘트에서 증가하였다. 마지막으로, 혈관 신생을 평가하는 CAM 분석법에 의해 혈관 신생 효과를 평가하였다. 나노시멘트는 CAM 표면에 이식하고 신 혈관 형성을 무작위로 시각화하고(도 7c) 총 세관 길이, 크기 및 교차점(n=β)에 의해 정량화 하였다. Cu-BGn 나노시멘트는 Cu 이온으로 인해 BGn 나노시멘트 보다 총 길이, 크기 및 교차점 수준이 상당히 높았다. 이 결과는 또한 Si와 Cu 이온이 혈관 신생을 상승적으로 촉진할 수 있음을 시사한다.

2-4. Cu-BGn 나노시멘트의 항균 효과

나노시멘트의 항균 효과

E.coli(Escherichia coli, gram-negative, ATCC 25922, ATCC) 및 S.aureus (Staphylococcus aureus, gram-positive, ATCC 6583, ATCC)가 항균 검사를 위해 선정되었다. 각 박테리아 스톡은 해동되었고, 이들 스톡 각 100μL은 9.9mL의 대두성분을 트립신으로 처리한 배지(TSB, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)를 혼합하고 1시간 동안 배양하였다. 다음으로, E.coli 수를 최적화하기 위해, E.coli 수가 계산되고, 프레스토블루(The PrestoBlue?? Cell Viability Reagent, life technology, Madison, WI, USA) 100uL가 다양한 농도의 24 웰 플레이트의 E.coli(5x10⁷, 5x10⁶, 5x10⁵, 5x10⁴ 및 5x10³ CFU/ml)에 처리되었다. 약 1, 3, 4, 5, 6시간 후, 웰 플레이트는 디지털 카메라(V30 digital phone camera, LG, Seoul, Republic of Korea)에 의해 촬영되었고, 각 웰 컬러를 시간에 따라 비교한 후(붉은 색은 E.coli증식을 의미함) E.coli 5x10⁵ CFU/ml 농도가 추가 연구를 위해 선택되었다. 다음으로, α-MEM 배지 1ml, 100μL의 5x10⁶ CFU/ml E.coli(최종농도 5x10⁵ CFU/ml를 만들기 위함), 및 100μL 프레스토블루가 24웰 플레이트에 순차적으로 첨가되었고, Cu-BGn 나노시멘트와 BGn 나노시멘트가 1웰당 1개가 첨가되었다. 마지막으로, OD(570nm 및 600nm)는 6~8시간까지 매시간 측정하고 프레스토블루 프로토콜로 OD 비를 계산하였다. 나노시멘트 삽입 실험은 S.aureus와 함께 반복하였다.

나노시멘트 추출 배지의 항균 효과

각각 10개의 나노시멘트를 1일 동안 10mL α-MEM 배지에 침지하고, 시린지 및 0.2μm 필터로 여과시켰다. 다음으로, TSB 배지에 용해시킨 5x10⁶ CFU/ml 박테리아 10μm을 나노시멘트 추출 배지 100μl에 첨가하고 약 6시간 동안 배양하였다. 이어서, live/dead 염색(LIVE/DEAD?? Cell-Mediated Cytotoxicity Kit, for animal cells, Invitrogen^TM, Carlsbad, CA, USA)을 수행하였다. ICP 시료를 만들기 위해, 상기와 동일한 방법으로 박테리아를 배양하고 원심분리에 의해 수집하고, 수집된 박테리아를 70% 산화질소로 전처리하고 건조시켰다. 각 샘플을 1ml DW로 희석하고 70% 산화 질소 1 방울을 첨가하였다.

rMSC 또는 HUVEC과 박테리아 공동 배양

준비된 100μL의 10⁴ rMSCs 또는 HUVECs는 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주했다. 하룻밤 후 희석된 Cu-BGn 나노시멘트 추출 배지 100μL 로 배지를 변경하고. TSB 제재에 용해된 5x10⁶CFU/ml 박테리아 10μL가 추가되거나 대조군 세포에는 TSB 10μL가 100μL의 성장 배지에 첨가되었다. 약 1시간 30분 내지 5시간 30분 후, live/dead 염색을 수행하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 약 10 내지 20분 배양하였다. 그리고, 세포는 디지털 현미경(CELENA® S, Logos Biosystems, Anyang-Si, Republic of Korea)에 의해 촬영되었고, 살아있는 세포와 죽은 세포 수를 계산하였다.

실험 결과

Cu-BGn 나노시멘트는 골형성 자극 및 혈관신생과 함께, Cu 이온의 방출 프로필에 기초하여 항균 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 박테리아 배양 배지 내 나노시멘트 추출물이 박테리아 균주에 첨가되었을 때, 박테리아의 생장이 프레스토블루 분석법에 의해 검출되었으며, 여기서 화학물질은 살아있는 미생물 환원효소(reductase) 및 시간에 따른 푸른색에서 적색으로의 색 변화에 의해 처리되었다. Cu-BGn 나노시멘트에서 배양 4시간 후 항균 효과를 확인하였다(도 9a, b). 두 박테리아 종 모두에서 BGn 나노시멘트는 어떠한 항균 효과를 나타내지 않았다. 따라서 Cu-BGn 나노시멘트의 항균 효과는 Cu 이온의 방출 및 이의 항-세균성장 활성에 기인한다. 다음으로, Cu-BGn 나노시멘트의 항균 기작을 밝히기 위해, live/dead 염색이 항생제 없는 세포 배양 배지에서 6시간 배양 후 수행되었다(도 9c). 완전형 막을 가진 많은 녹색 착색 살아있는 박테리아는 BGn 나노시멘트 추출물 조건에서 나타난 반면, Cu-BGn 나노시멘트에서 손상된 막을 갖는 붉은색 사멸 박테리아가 확인되어 Cu 이온이 막 파열을 통한 박테리아를 사멸시킴을 나타냈다.

Cu 이온이 항균 효과를 위해 박테리아에 들어갔는지 여부를 조사하기 위해 E.coli 및 S.aureus 박테리아를 2.5시간 동안 추출물로 배양하고, ICP-AES에 의한 세포 내 이온을 분석하기 위해 수집하였다. Cu 이온은 Cu-BGn 나노시멘트-추출물 처리군에서만 검출되었고(도 9d), 이는 박테리아가 Cu 이온을 취하였다는 것을 의미한다.

박테리아 감염 상태에서 Cu-BGn 나노시멘트의 Cu 이온의 효과를 밝히기 위해, 세포-박테리아-나노시멘트(Cu-BGn) 공동 배양이 세포(rMSC 또는 HUVEC) 및 박테리아 균주(E.coli, S.auresus, 5x10⁵/mL,도 10a)와 함께 짧은 시간(1.5~5.5시간) 동안 수행되었다. 긴 배양은 박테리아 오염된 상태에서 모든 세포를 사멸시켰기 때문에 나노시멘트의 효과를 시각화하기 위해 공동배양 시간은 개별적으로 최적화되었다. E-coli-rMSC 공동 배양 시스템은 Cu-BGn 나노시멘트 추출물이 없는 경우 모든 rMSC를 사멸시킨 반면 Cu-BGn 나노시멘트 추출물의 추가는 박테리아 사멸 효과를 가져 추출물 농도 증가에 비례해 최대 80%까지 세포 생존능력을 확보했다(0 & 1/16 < 1/8 & 1/4 < 1/2 < 1, 도 10b, c). HUVEC(4시간) 공동배양 조건에서 유사한 세포 생존율 패턴이 관찰되었다 E.coli 또는 S.aureus 오염 조건하에서 나노시멘트는 추출물 농도의 증가에 대해 HUVEC 생존을 확보하였다(0 < 1/8 < 1).

실시예 3. Cu-BGn 나노시멘트의 생체 내(in vivo) 실험

3-1. 나노시멘트의 피하 삽입

모든 나노시멘트는 E.O 가스 멸균된 나노입자 및 0.2μm 필터로 여과된 2.5wt% NaH₂PO₄ 용액으로 만들어졌고, 시멘트화 후, E.O 가스로 다시 살균하였다. 수술 전에, 랫트에 케타민(80mg/kg) 및 자일라진(10mg/kg)을 마취를 위해 근육 내 주입하였다. 두 종류의 나노시멘트는 6주령의 수컷 SD 랫트에 피하 이식하고 2 및 4주 후에 나노시멘트를 수확하고 랫트는 주위 조직을 채취하기 위해 희생되었다. 수확된 샘플을 4% 완충된 포름알데히드로 침지하고 RapidCal^TM 용액(BBC chemical Co., Stanwood, WA, USA)으로 석회질을 제거하였다. 석회질 제거 후, 샘플을 탈수시키고 미리 데운 파라핀 용액에 내장하고 건조시켰다. 샘플은 5μm 두께로 절단하고, 파라핀을 제거하고 헤마톡신 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 이미지는 광학 현미경(IX71 및 DP72, 올림푸스)에 의해 포착되었다.

감염된 골 재생에서 나노시멘트의 생체 내 효능을 평가하기 전에, Cu-BGn 나노시멘트의 생체 적합성은 2 및 4주 동안 랫트의 피하 조직에서 관찰되었다. Cu-BGn 나노시멘트는 BGn 나노시멘트와 유사한 생체 적합성을 나타냈다(도 12). 대식세포 및 호중구와 같은 많은 염증세포가 2주에 각 나노시멘트 주변에서 검출되었는데, 이는 생채 재료에 대한 전형적인 외부 신체 반응이었으며, 심각한 염증은 없었다. 4주에서 무딘 가장자리를 가진 나노시멘트의 일부 분획(fraction)이 두 나노시멘트에서 검출되어, 시간이 지남에 따라 나노시멘트의 분해를 나타내었다. 4주에서 전형적인 염증 반응이 심한 염증 없이 검출되었다. 종합하면, Cu-BGn 나노시멘트는 BGn 나노시멘트와 유사한 생체 적합성 및 생분해 능력을 가졌으며, 이는 박테리아 오염 상황에서 골을 재생하는 데 사용될 수 있다.

3-2. 나노시멘트의 골수염 랫트 삽입

마취 후, 9주 수컷 랫트의 경골 뼈를 0.6mm 직경의 핸드 드릴로 드릴링하고 골수염 발생을 위해 구멍을 통해 S.aureus 10⁷CFU/10μl로 감염시켰다. 다음으로, Cu-BGn 또는 BGn 나노입자로 처리하고 피브린 실란트(Tisseel, Baxter, IL, USA)로 구멍을 덮었다. 3주 후, 쥐를 희생시키고, X 선, μ-CT 이미지 및 히스토 염색 시료에 의해 뼈를 관찰하였다.

그 결과, S.aureus가 있는 모든 그룹에서, X 선 이미지는 시간의 변화에 따른 뼈의 저하를 나타냈다(도 13b, c). 시간 서열 X선은 2주부터 시작된 뼈의 분해를 나타냈다(도 13b). 희생 3 주에, Cu-BGn 나노시멘트는 BGn 및 sham 실험군에 비해 낮은 골 저하(골 부피 및 밀도)를 μ-CT에 의해 나타냈다(도 13c). H&E 염색 이미지는 BGn 나노시멘트 뿐만 아니라 sham 실험군에서 새로운 뼈 침착없이 결함 주위에서 심한 염증성 세포를 나타낸 반면 Cu-BGn 나노시멘트는 결함 주위에 낮은 염증성 세포를 나타냈다(도 13d). 비록 Cu-BGn 나노시멘트는 박테리아 감염이 없는 음성 대조군 수준으로 염증을 제거할 수는 없었지만 Cu-BGn 나노시멘트에서 염증 수준은 다른 그룹보다 현저하게 감소하고 새로운 뼈 형성이 발생하여, 세균 오염 조건 하에서 Cu-BGn 나노시멘트의 뼈 재생 잠재력을 나타냈다. 희생 시간(3주)에서 골수에 박테리아 존재를 평가할 때, 어떠한 박테리아 군주도 Cu-BGn 나노시멘트 그룹에서 검출되지 않아 Cu-BGn 나노시멘트의 효과를 지지하였다. 신규한 다기능 Cu-BGn 나노시멘트는 박테리아 살해에 의한 박테리아 염증을 감소시킬 뿐만 아니라 방출된 다중 이온의 치료적 효과로 인해 생체 내에서 뼈를 재생한다.

Claims (11)

1. 구리 생활성 유리 나노입자(Cu-BGn, copper-bioactive glass nanoparticle)를 포함하는 나노시멘트로서, 상기 나노시멘트는 마그네슘, 칼슘 및 인산 이온을 포함하는 생체모방용액(SBF) 내에서 하이드록시아파타이트를 침착시킬 수 있고,
   상기 나노시멘트로부터 추출되는 나노시멘트 추출물은 1/16 내지 1/32로 희석된 것으로, 8 내지 18 μg/ml의 Ca 이온 농도, 4 내지 10 μg/ml의 Si 이온 농도 및 3 내지 8 μg/ml의 Cu 이온 농도를 포함하는 것인, 나노시멘트.
2. 제1항에 있어서, 상기 구리 생활성 유리 나노입자의 Si:Ca:Cu의 중량비는 80~90:5~15:1~10인 것인, 나노시멘트.
3. 제1항에 있어서, 상기 구리 생활성 유리 나노입자는 5~7nm의 기공크기를 가지는 것인, 나노시멘트.
4. 제1항에 있어서, 상기 구리 생활성 유리 나노입자는 비표면적이 650m²/g~850m²/g인 것인, 나노시멘트.
5. 제1항에 있어서, 상기 구리 생활성 유리 나노입자는 기공 부피가 1.000cm³/g~1.300cm³/g인 것인, 나노시멘트.
6. 제1항에 있어서, 상기 구리 생활성 유리 나노입자는 제타 전위가 -14mV~-8 mV인 것인, 나노시멘트.
7. 제1항에 있어서, 상기 나노시멘트는 NaH₂PO₄ 용액에 대해 상기 구리 생활성 유리 나노입자가 0.2 초과 0.4 미만의 중량비로 혼합되어 제조되는 것인, 나노시멘트.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노시멘트 제조 방법에 있어서,
   (a) 구리 이온 수용액을 생활성 유리 나노입자 합성 단계에 첨가하는 단계;
   (b) 상기 (a)의 결과물을 교반, 침전시킨 후 건조시켜 구리 생활성 유리 나노입자를 수득하는 단계;
   (c) 상기 구리 생활성 유리 나노입자를 분쇄하고 500℃~600℃에서 굽는 단계; 및
   (d) 상기 (c)의 결과물인 구리 생활성 유리 나노입자의 분말이 인산염 수용액에 대해 0.2 초과 0.4 미만의 중량비로 혼합시킨 후 건조시키는 단계;를
   포함하며,
   상기 나노시멘트로부터 추출되는 나노시멘트 추출물은 1/16 내지 1/32로 희석된 것으로, 8 내지 18 μg/ml의 Ca 이온 농도, 4 내지 10 μg/ml의 Si 이온 농도 및 3 내지 8 μg/ml의 Cu 이온 농도를 포함하는 것인, 나노시멘트 제조 방법.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노시멘트를 유효성분으로 포함하는 항균 및 신생혈관 촉진 효과를 갖는 경조직 재생용 조성물.
10. 삭제
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 나노시멘트를 인간을 제외한 동물의 손상 경조직에 처리하는 단계를 포함하는 경조직 재생 방법.

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