KR20230095828A - 골시멘트 제조용 조성물 및 이로부터 제조된 골시멘트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포스포세린 및 코아세르베이트를 포함하는 것을 그 특징으로 함으로써, 대기 환경 뿐만 아니라 수중 환경에서도 압축 강도 또는 전단 강도 등 그 강도가 우수하고, 우수한 압축 탄성률로 인해 형태 변형이 용이하여 다양한 형태로의 적용이 가능한 골시멘트를 제조할 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물은 수중 환경에서 조성물 내 구성 성분들이 용출되는 것을 억제함으로써, 우수한 내구성이 유지되는 골시멘트를 제조할 수 있는 골시멘트 제조용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 골시멘트 제조용 조성물 및 이로부터 제조된 골시멘트에 관한 것이다.
인간의 골격은 206개의 뼈(bone)로 구성되어 있으며, 상기 뼈는 우리 몸을 지탱해주고, 뇌나 내장 등과 같은 중요한 장기를 보호함은 물론 각각이 독립적으로 움직이게 되어 있어 여러가지 운동의 수행이 가능하도록 한다.
의료 기술이 발전함에 따라 고령화 사회가 진전되면서 골다공증과 같은 질환의 발병률이 증가하고 있으며, 외부로부터의 물리적 충격에 의한 뼈 조직의 손상과 같은 사고의 발생률 역시 증가하고 있다. 이와 같이 손상된 뼈 조직을 수복하기 위하여 다양한 재료의 연구가 오랜 기간 동안 연구되어 왔다. 특히, 체내에서 유해한 성분을 용출하지 않고 친수성을 나타내는 재료인 알루미나(Al2O3)나 스테인레스 스틸(stainless steel) 또는 티탄(Ti) 등이 이러한 목적으로 연구 대상이 되어 왔다.
하지만, 이러한 재료들은 뼈와 화학적으로 직접 결합이 형성되지 않기 때문에, 뼈와의 결합능을 증진시키기 위해 재료 표면을 다공질로 형성하거나, 또는 재료 표면에 요철을 형성하는 등 부가적인 표면 개질을 통해 상기 재료 내부로 뼈의 내증식을 유도함으로써 물리적 결합을 형성시켜야 하지만, 이러한 결합이 달성되기까지는 2 내지 3개월 이상의 오랜 시간을 기다려야 하는 문제가 있다.
따라서, 이와 같은 문제를 극복하기 위해 임플란트(implant)를 주위의 뼈 조직에 고정시키기 위한 골시멘트의 개발이 필요한 실정이다. 골시멘트의 소재로는 복잡한 형성을 하고 있는 골 결손부를 보전하거나, 금속제 인공관절을 자연 골에 고정해야 하는 등의 경우에 적용하기 위해 일정 시간 동안은 유동성을 유지하면서 일정 시간이 지난 후 경화되어 주변 골 조직과 결합함으로써 뼈와 유사한 역학적 성질을 갖는 것이 바람직하다. 이와 같은 특성을 갖는 소재는 주사기를 통해 환부에 주입됨으로써, 손상부위가 매우 복잡한 경우나 접근이 용이하지 않은 부위 등 다양한 경우에 다양한 형태로써 활용이 가능한 이점이 있다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 공보 제10-1671585호에는 인산칼슘 화합물 및 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 포함하는 분말상과, 경화 촉진제를 포함하는 액상으로 구성되는 골시멘트 조성물에 대하여 개시되어 있다.
하지만, 이러한 골시멘트 조성물은 수중 환경에서 구성 소재가 이탈하는 등, 수중 저항성이 좋지 못해 내구성 감소 등의 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로, 대기 또는 수중 환경에서 압축 강도 또는 전단 강도 등의 강도가 우수하고, 수중 환경에서도 구성 성분의 이탈 없이 우수한 내구성을 갖는 골시멘트 제조용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 골시멘트 제조용 조성물을 포함함으로써 대기 또는 수중 환경에서의 강도가 우수하고, 수중 환경에서도 우수한 내구성을 유지하는 골시멘트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물은 포스포세린 및 코아세르베이트를 포함하는 것을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 골시멘트는 상기 골시멘트 제조용 조성물을 포함하는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명의 골시멘트 제조용 조성물은 대기 또는 수중 환경에서 강도가 우수하고, 압축 탄성률이 우수하여 다양한 형태로의 적용이 용이하며, 특히 수중 환경에서 구성 소재의 이탈 없이 우수한 내구성을 유지하는 이점이 있다.
본 발명의 골시멘트는 전술한 골시멘트 제조용 조성물을 포함함으로써, 강도가 우수하고 변형이 용이하여 다양한 형태로의 적용이 가능하며, 수중 환경에서 우수한 내구성을 유지하는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 실험예 1의 기계적 강도 실험에서 사용된 시편을 제조하기 위한 주형 및 완성된 시편의 이미지이다. 도 1의 (a)는 시편 제조를 위한 주형을 도시화한 것이며, 도 1의 (b)는 완성된 시편의 이미지이다.
도 2는 본 발명의 실험예 1의 실험 결과 중 비교예 및 실시예 1 내지 4의 실험 결과(실험 결과 1)를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실험예 1의 실험 결과 중 실시예 5 및 실시예 8의 실험 결과(실험 결과 1)를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실험예 1의 결험 결과 중 비교예, 실시예 3 및 9의 실험 결과(실험 결과 1)를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 실험예 1의 실험 결과 중 실시예 10 내지 실시예 31의 실험 결과(실험 결과 2)를 나타낸 도이다. 도 5의 (a)는 실시예 10 내지 실시예 20의 압축 강도 결과를 나타낸 도이며, 도 5의 (b)는 실시예 10 내지 실시예 20의 압축 탄성률 결과를 나타낸 도이고, 도 5의 (c)는 실시예 21 내지 실시예 31의 압축 강도 결과를 나타낸 도이며, 도 5의 (d)는 실시예 21 내지 실시예 31의 압축 탄성률을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 실험예 1의 실험 결과 중 실시예 32 내지 43의 실험 결과(실험 결과 3)를 나타낸 도이다. 도 6의 (a)는 실시예 32 내지 37의 압축 강도 결과이며, 도 6의 (b)는 실시예 32 내지 37의 압축 탄성률의 결과이고, 도 6의 (c)는 실시예 38 내지 실시예 43의 압축 강도 결과이며, 도 6의 (d)는 실시예 38 내지 실시예 43의 압축 탄성률 결과이다.
도 7은 본 발명의 실험예 2에서 사용된 알루미늄 시편의 구성도이다.
도 8은 본 발명의 실험예 2의 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 실험예 3의 시편 준비에서 사용된 주형의 이미지이다.
도 10은 본 발명의 실험예 3에서 사용된 길모어 니들의 이미지이다.
도 11은 본 발명의 실험예 3의 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 실험예 4의 실험 결과를 나타낸 도이다. 도 12의 (a)는 실시예 1,3 및 9의 수중 저항성을 확인한 실험 결과이고, 도 12의 (b)는 종래 골시멘트의 수중 저항성을 확인한 실험 결과이다.
도 13은 본 발명의 실험예 4의 실험 결과 중 실시예 46 내지 49의 실험 결과 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실험예 1의 실험 결과 중 비교예 및 실시예 1 내지 4의 실험 결과(실험 결과 1)를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실험예 1의 실험 결과 중 실시예 5 및 실시예 8의 실험 결과(실험 결과 1)를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실험예 1의 결험 결과 중 비교예, 실시예 3 및 9의 실험 결과(실험 결과 1)를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 실험예 1의 실험 결과 중 실시예 10 내지 실시예 31의 실험 결과(실험 결과 2)를 나타낸 도이다. 도 5의 (a)는 실시예 10 내지 실시예 20의 압축 강도 결과를 나타낸 도이며, 도 5의 (b)는 실시예 10 내지 실시예 20의 압축 탄성률 결과를 나타낸 도이고, 도 5의 (c)는 실시예 21 내지 실시예 31의 압축 강도 결과를 나타낸 도이며, 도 5의 (d)는 실시예 21 내지 실시예 31의 압축 탄성률을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 실험예 1의 실험 결과 중 실시예 32 내지 43의 실험 결과(실험 결과 3)를 나타낸 도이다. 도 6의 (a)는 실시예 32 내지 37의 압축 강도 결과이며, 도 6의 (b)는 실시예 32 내지 37의 압축 탄성률의 결과이고, 도 6의 (c)는 실시예 38 내지 실시예 43의 압축 강도 결과이며, 도 6의 (d)는 실시예 38 내지 실시예 43의 압축 탄성률 결과이다.
도 7은 본 발명의 실험예 2에서 사용된 알루미늄 시편의 구성도이다.
도 8은 본 발명의 실험예 2의 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 실험예 3의 시편 준비에서 사용된 주형의 이미지이다.
도 10은 본 발명의 실험예 3에서 사용된 길모어 니들의 이미지이다.
도 11은 본 발명의 실험예 3의 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 실험예 4의 실험 결과를 나타낸 도이다. 도 12의 (a)는 실시예 1,3 및 9의 수중 저항성을 확인한 실험 결과이고, 도 12의 (b)는 종래 골시멘트의 수중 저항성을 확인한 실험 결과이다.
도 13은 본 발명의 실험예 4의 실험 결과 중 실시예 46 내지 49의 실험 결과 나타낸 도이다.
본 발명에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따른 골시멘트 제조용 조성물은 포스포세린 및 코아세르베이트를 포함하는 것을 그 특징으로 함으로써, 대기 환경 뿐만 아니라 수중 환경에서도 압축 강도 또는 전단 강도 등 그 강도가 우수하고, 우수한 압축 탄성률로 인해 형태 변형이 용이하여 다양한 형태로의 적용이 가능한 골시멘트를 제조할 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물은 수중 환경에서 조성물 내 구성 성분들이 용출되는 것을 억제함으로써, 우수한 내구성이 유지되는 골시멘트를 제조할 수 있는 이점이 있다.
상기 포스포세린(phosphoserine, pSer)은 세린의 베타-하이드록실기가 인산 에스터화한 화합물로서, 세린 생합성의 중간물질이다. 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물은 상기 포스포세린을 포함함으로써, 이를 포함하는 조성물로 제조된 골시멘트의 물리적 강도가 보다 향상될 수 있으며, 압출 탄성률이 보다 향상됨으로써 이를 포함하는 조성물로 제조된 골시멘트를 적용 부위 등에 따라 다양한 형태로 적용하기 용이한 이점이 있다. 특히, 본 발명에 따른 골시멘트 제조용 조성물은 실제 해면골(cancellous bone)과 유사하거나 또는 그 이상의 압축 탄성률을 나타내어 생체의 뼈와 유사한 변형률을 가지는 효과가 존재한다.
상기 코아세르베이트(coacervate)는 유기물이 모인 액체 방울 형태를 의미하는 것으로, 유기물들이 물 분자를 붙여 콜로이드 입자 상태로 존재하다가 서로 모여 막이 생기면 코아세르베이트가 형성된다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 코아세르베이트는 칼슘 폴리포스페이트 또는 칼슘 폴리아크릴산을 포함하는 것일 수 있다. 이와 같이, 상기 코아세르베이트가 칼슘 폴리포스페이트 또는 칼슘 폴리아크릴산을 포함하는 경우, 이를 포함하는 조성물로 제조된 골시멘트의 수분 저항성이 향상되는 이점이 있다. 이 때, 상기 수분 저항성이라 함은 수중 환경에서 조성물 내 각 구성성분이 용출되는 현상 없이 골시멘트의 적용 형태가 그대로 유지되는 것을 의미한다. 즉, 상기 수분 저항성은 또한 수중 환경에서의 골시멘트의 내구성이 우수하다는 것을 의미할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물은 상기 포스포세린 및 코아세르베이트를 함께 포함함으로써, 대기환경에서는 물론이고 수중환경에서도 압축강도 또는 전단 강도 등의 강도가 우수하고, 압축 탄성률이 향상됨으로써 이를 적용하는 부위 및 그 형태에 따라 다양한 형태로의 적용이 용이한 이점이 있으며, 특히 수중 환경에서 조성물 내 각 구성성분의 이탈 없이 그 형태가 유지되는 등의 수중 저항성이 우수한 골시멘트를 제조할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 골시멘트 제조용 조성물은 전술한 구성 성분 외에 인산칼슘 또는 홍합접착단백질을 더 포함할 수 있다.
상기 인산칼슘은 척추동물의 뼈 또는 치아 등의 주성분으로 주로 칼슘, 인, 산소의 3원소로 구성된 화합물이다. 본 발명의 일 실시형태에 따라 상기 골시멘트 제조용 조성물이 상기 인산칼슘을 더 포함하는 경우 압축 강도 또는 전단 강도 등 기계적 강도가 보다 우수한 골시멘트를 제조할 수 있는 이점이 있다.
상기 인산칼슘은 예를 들면, 모노칼슘 포스페이트 일수화물(monocalcium phosphate monohydrate, Ca(H2PO4)2ㆍH2O, MCPM), 모노칼슘 포스페이트 무수화물(monocalcium phosphate anhydrous, Ca(H2PO4)2, MCPA), 디칼슘 포스페이트 이수화물(dicalcium phosphate dihydrate, CaHPO4ㆍ2H2O, DCPD), 디칼슘 포스페이트 무수물(dicalcium phosphate anhydrous, CaHPO4, DCPA), 옥타칼슘 포스페이트(octacalcium phosphate, Ca8(HPO4)2(PO4)4ㆍ5H2O, OCP), α-트리칼슘 포스페이트(α- tricalcium phosphate, α-Ca3(PO4)2, α-TCP), β- tricalcium phosphate, β-Ca3(PO4)2, β-TCP), 무정형 칼슘 포스페이트(amorphous calcium phosphate, CaxHy(PO4)zㆍnH2O, n=3~4.5, 15∼~20% H2O, ACP), 칼슘-결핍 히드록시 아파타이트(calcium-deficient hydroxy apatite, CDHA), 히드록시 아파타이트(hydroxyapatite, Ca5(PO4)3(OH) 또는 Ca10(PO4)6(OH)2, HA), 플루오로 아파타이트(fluorapatite, Ca5(PO4)3F 또는 Ca10(PO4)6F2, FA) 및 테트라칼슘 포스페이트(tetracalcium phosphate, Ca4(PO4)2O, TTCP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 인산칼슘은 α-트리칼슘 포스페이트(α- tricalcium phosphate, α-Ca3(PO4)2, α-TCP) 및 디칼슘 포스페이트 무수물(dicalcium phosphate anhydrous, CaHPO4, DCPA)을 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물이 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP) 및 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA)을 더 포함하는 경우, 조직(특히, 경조직)과의 친화성 및 물리적 강도(압축 강도 또는 전단 강도)가 보다 향상된 골시멘트를 제조할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 골시멘트 제조용 조성물이 인산칼슘을 더 포함하는 경우 포스포세린 및 코아세르베이트만을 포함하는 경우에 비하여 현저히 향상된 경화 능력을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 상기 골시멘트 제조용 조성물이 인산칼슘으로서 α-트리칼슘 포스페이트 및 디칼슘 포스페이트 무수물을 모두 포함하는 경우 α-트리칼슘 포스페이트만을 포함하거나 또는 디칼슘 포스페이트 무수물만을 포함하는 경우에 비하여 현저히 향상된 경화 능력을 나타낼 수 있다. 보다 구체적인 일 예로, 상기 골시멘트 제조용 조성물이 인산칼슘으로서 α-트리칼슘 포스페이트만을 포함하는 경우 경화 시간이 극단적으로 빨라지면서 골시멘트로 적용하기 어려운 정도로 저하된 강도를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 골시멘트 제조용 조성물이 전술한 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP)를 더 포함하는 경우, 상기 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP) 및 포스포세린의 몰비는 1:0.05 내지 1:1일 수 있으며, 바람직하게는 1:0.1 내지 1:0.35일 수 있고, 보다 바람직하게는 1:0.15 내지 1:0.3일 수 있다. 이와 같이, 상기 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP) 및 포스포세린의 몰비가 전술한 범위 내로 포함되는 경우, 압축 강도 또는 전단 강도 등의 물리적 강도 또는 압축 탄성률이 보다 향상된 골시멘트를 제조할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 골시멘트 제조용 조성물이 전술한 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP)를 더 포함하는 경우, 상기 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP)의 입자 크기는 그 직경이 10 내지 100㎛일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 80㎛일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 10 내지 50㎛일 수 있고, 가장 바람직하게는 10 내지 25㎛일 수 있다. 골시멘트의 경우 상기 골시멘트가 적용되는 부위의 형상에 맞춰 골시멘트를 다양한 형태로 변형시킬 필요가 있어 경화 속도를 적절하게 조절하는 것이 중요한데, 상기 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP)의 입자 크기가 전술한 범위 내로 포함되는 경우, 이를 포함하는 골시멘트의 경화 속도를 적정 수준으로 조절하는 것이 가능하다. 상기 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP)의 입자 크기가 상기 범위 미만일 경우 이를 포함하는 골시멘트의 경화 속도가 가속화됨으로써 골시멘트의 형태를 조작하는 것이 어려울 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 경화 속도가 지연됨으로써 골시멘트 경화에 너무 오랜 시간이 소요되어 효율성이 저하될 수 있다.
상기 홍합접착단백질(mussel adhesive protein, MAP)은 홍합의 족사에서 유래한 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)에서 유래한 홍합접착단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 홍합접착단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1(서열번호 1), fp-2(서열번호 4), fp-3(서열번호 5), fp-4(서열번호 6), fp-5(서열번호 7), 및 fp-6(서열번호 8)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 2종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 홍합접착단백질은 국제공개번호 제 WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합접착단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 홍합접착단백질은 fp-151(서열번호 9), fp-131(서열번호 10), fp-353(서열번호 11), fp-153(서열번호 12) 및 fp-351(서열번호 13)로 이루어진 군에서 선택된 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 홍합접착단백질은 fp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 fp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 variant 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 홍합접착단백질은 fp-151의 변이체(서열번호 15)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 서열번호 15의 단백질 서열은 서열번호 9와 대비하여 링커 서열 등이 제외된 서열이다. 구체적으로, 서열번호 14로 표시되는 fp-1 변이체 서열 사이에 서열번호 16으로 표시되는 Mgfp-5의 서열을 융합한 융합 단백질 서열이다. 보다 더 구체적으로, 본 발명의 홍합접착단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 전술한 홍합접착단백질들의 특성을 유지할 수 있는 보존적 아미노산 서열을 포함하는 범위에서 상기 홍합접착단백질은 변형될 수 있다.
즉, 실질적으로 동등한 효과를 나타내는 상기 서열번호들의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 90%이상, 즉, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열은 또한 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것; 홍합접착단백질의 표면에 카테콜 유도체가 도입된 것; 또는 이들 모두를 포함하는 것일 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것이 바람직할 수 있으며, 전체 티로신 잔기의 10 내지 100%가 카테콜 화합물로 변환된 것이 바람직할 수 있다. 대부분의 홍합접착단백질의 전체 아미노산 서열에서 티로신이 차지하는 비중은 약 1 내지 50 %일 수 있다. 홍합접착단백질 내의 티로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 카테콜 화합물인 도파(DOPA)로 변환될 수 있다.
그러나 대장균에서 생산된 홍합접착단백질은 티로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 티로신을 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 홍합접착단백질에 포함된 티로신 잔기를 도파로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며 이를 본 발명에서는 특별히 한정하지 않는다.
상기 카테콜 화합물은 디하이드록시기를 포함하는 화합물로, 가교작용을 통해 홍합접착단백질에 접착력을 부여하는 화합물을 의미한다. 일 예를 들어 상기 카테콜 화합물은 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 o-퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 홍합접착단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합접착단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 변환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합접착단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 변환된 것일 수 있다.
상기 홍합접착단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본 발명에 포함된다.
전술한 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물에 포함될 수 있는 모든 구성은 고형분(powder, P) 및 액상성분(Liquid, L)으로 분류될 수 있다. 전술한 각각의 구성들 중 고형분은 포스포세린, 인산칼슘 및 홍합접착단백질을 포함하며, 액상성분은 코아세르베이트를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 고형분 및 액상성분의 비인 P/L(w/v)는 0.5 내지 10, 0.5 내지 3, 1 내지 3일 수 있다. 특히, 코아세르베이트로 칼슘 폴리포스페이트를 포함하는 경우 상기 P/L(w/v)는 바람직하게는 1.5 내지 3일 수 있으며, 코아세르베이트로 칼슘 폴리아크릴산을 포함하는 경우 상기 P/L(w/v)는 바람직하게는 1.5 내지 2.5일 수 있다. 이와 같이 상기 골시멘트 제조용 조성물 내 상기 고형분 및 액상성분의 비가 바람직한 범위 내로 포함될수록 강도가 보다 우수한 골시멘트를 제조할 수 있는 이점이 있다. 또한, 상기 범위 내에서 고형분 및 액상성분의 비를 다양하게 조절함으로써, 물리적 강도 및 압축 탄성률의 원하는 수준으로 적절하게 조절할 수 있다. 구체적으로, 상기 물리적 강도의 경우 전술한 범위의 고형분 및 액상성분의 비를 만족하는 범위 내에서 그 비율이 조절되는 경우 30MPa 이상 또는 60MPa 이상의 다양한 압축 강도를 갖는 골시멘트를 제조할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 다른 양태는 전술한 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물을 포함하는 골시멘트에 관한 것으로, 상기 골시멘트는 전술한 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물을 포함함으로써, 강도가 우수하고 변형이 용이하여 다양한 형태로의 적용이 가능하며, 수중 환경에서 우수한 내구성을 유지하는 이점이 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 골시멘트는 이에 한정되는 것은 아니나 일 예를 들면, 손상된 뼈 조직의 수복이나 인공관절을 뼈에 고정하기 위해 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 골시멘트는 경조직 접착용일 수 있다. 이 때, 상기 경조직 접착용 골시멘트는 생체 내 경조직에 대한 접착을 유도하는 물질을 의미하는 것으로, 이에 한정되는 것은 아니나 일 예를 들면, 치과용, 의료용 조직 접착제로서 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당 업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다. 이하의 실시예 및 비교예에서 함량을 나타내는 "%" 및 "부"는 특별히 언급하지 않는 한 중량 기준이다.
제조예 1: 코아세르베이트의 제조
제조예 1-1: CaPP 코아세르베이트의 제조
증류수 1L 당 CaCl2(calcium chloride dihydrate, junsei사 제) 294.02g을 용해시켜, 1M 농도의 CaCl2 용액을 제조하였다. 또 다른 증류수에 증류수 1L 당 4g의 소듐 폴리포스페이트(sodium polyphosphate, supelco사 제)를 녹여 4mg/ml 농도의 NaPP용액을 제조하였다. 상기 CaCl2 용액과 상기 NaPP용액을 부피비 2:8로 혼합한 뒤 10000xg, 4℃의 조건에서 20분 동안 원심 분리시켜 CaPP 코아세르베이트를 제조하였다.
제조예 1-2: CaPAA 코아세르베이트의 제조
증류수 1L 당 CaCl2(calcium chloride dihydrate, junsei사 제) 294.02g을 용해시켜, 1M 농도의 CaCl2 용액을 제조하였다. 또 다른 증류수에 증류수 0.9L 당 100g의 폴리아크릴산(poly(acrylic acid), sigma-aldrich사 제)을 용해시켜 10% 농도의 PAA용액을 제조하였다. 상기 CaCl2 용액과 상기 PAA용액을 부피비 2:8로 혼합한 뒤 10000xg, 4℃의 조건에서 20분 동안 원심 분리시켜 CaPAA 코아세르베이트를 제조하였다.
제조예 2: 입자별 사이즈가 다른 α-TCP의 제조
α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP, α-tricalcium phosphate, Wako사 제, 일본) 파우더를 70g 정량한 후, 충격 분쇄기(impact mill, Fritsch사 제)를 이용하여 분쇄하였다. 이 때, 상기 충격 분쇄기로 분쇄할 때 균형을 맞추기 위해 지르코니아 포트(zirconia jar) 한 쌍을 준비하여, 상기 준비된 각각의 포트에 상기 정량한 α-TCP 파우더 및 2mm 지르코니아 볼(zirconia ball)을 넣고 모두 무게를 70g으로 동일하게 맞췄다. 상기 지르코니아 포트의 고무패킹과 뚜껑을 잘 고정한 뒤, rpm, 시간(millimg-pause time), 반복 횟수(repetition)등의 조건을 하기 실험 조건과 같이 설정하여 α-TCP를 분쇄하였다. 이와 같이 분쇄된 α-TCP를 체 진동기(sieve shaker)로 옮긴 후 38, 25, 10, 5㎛의 체(sieve)를 순서대로 쌓아 입자 크기별로 분류하고, 건조 오븐(dry oven)에서 3일 동안 건조시켰다.
[실험 조건]
분쇄 종류: wet grinding
용매(mL): 이소프로판올(isopropanol, 대정화금사 제) 100mL
RPM: 140
시간(milling-pause) 및 반복 횟수(repetition): 총 1시간(15분씩 4회 반복)
제조예 3: 티로신 잔기가 도파(DOPA)로 변형된 홍합접착단백질(mMAP)의 제조
5 L 비커에 아세트산나트륨(Sodium Acetate) 12.3067 g, 아스코르브산(Ascorbic acid) 13.2115 g 및 붕산 1.8553 g 을 2500 ml의 증류수 및 마그네틱바와 함께 투입한 후 500 rpm 이상으로 교반하여 50mM 아세트산나트륨 완충액(Sodium Acetate Buffer)을 제조하였다. 그런 다음, 7.5 M NaOH를 이용하여 pH 5.5로 적정한 후 정제수를 이용하여 3 L 부피를 맞췄다. 그런 다음, 홍합접착단백질(MAP, ㈜네이처글루텍) 6.0067 g, mTyr-CNK 스톡(㈜네이처글루텍, 농도: 5.12 ㎎/ml) 11.72 ml 및 0.001M CuSO4 0.3 ml를 상기 5 L 비커에 추가로 투입한 후, 호일을 이용하여 빛을 차단한 상태에서 500 rpm, 상온 조건에서 교반하였다. 60 분이 경과하였을 때 상기 5 L 비커에 0.5 N HCl 농도가 되도록 35.0 내지 37.0% HCl을 처리한 후 빛을 차단하지 않은 상태에서 300 rpm, 상온 조건에서 5시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 종이 필터를 이용하여 불순물을 제거함으로써, 티로신 잔기가 도파(DOPA)로 변형된 홍합접착단백질(mMAP)을 제조하였다.
실시예 및 비교예: 골시멘트 제조용 조성물의 제조
하기 표 1 내지 표 6의 각 구성들을 23±1℃, 상대습도 40% 이상의 조건에서 최소 2시간 이상 보관한 후, 혼합하여 조성물을 제조하였다.
| pSer1) (mg) |
Coa2) (㎕) |
인산칼슘 (mg) |
MAP4) (mg) |
mMAP5) (mg) |
Cya6) (㎕) |
|||
| CaPP2-1) | CaPAA2-2) | α-TCP3-1) | DCPA3-2) | |||||
| 비교예 | - | - | - | - | - | - | - | 204 |
| 실시예 1 | 33.3 | 204 | - | 310 | 65.6 | - | - | - |
| 실시예 2 | 33.3 | - | 204 | 310 | 65.6 | - | - | - |
| 실시예 3 | 33.3 | 204 | - | 310 | 65.6 | 1 | - | - |
| 실시예 4 | 33.3 | - | 204 | 310 | 65.6 | 1 | - | - |
| 실시예 5 | 33.3 | 204 | - | 310 | 65.6 | - | - | - |
| 실시예 6 | 33.3 | 171 | - | 310 | - | - | - | - |
| 실시예 7 | 33.3 | - | 204 | 310 | 65.6 | - | - | - |
| 실시예 8 | 33.3 | - | 171 | 310 | - | - | - | - |
| 실시예 9 | 33.3 | 204 | - | 310 | 65.6 | - | 2 | - |
| 1) Phosphoserine(sigma-aldrich 사 제) 2) Coacervate 2-1) 상기 제조예 1-1의 CaPP 코아세르베이트, Calcium polyphosphate, CaCl2 + sodium polyphosphate, 수분: 35%, 칼슘: 11%, 인산염: 54% 2-2) 상기 제조예 1-2의 CaPAA 코아세르베이트, Calcium poly(acrylic acid), CaCl2 + sodium poly(acrylic acid), 수분: 72%, 칼슘: 2% 3-1) α-tricalcium phosphate(Wako사 제, 일본) 3-2) Dicalcium phosphate(Sigma-aldrich사 제) 4) Mussel Adhesive Protein, 홍합접착단백질(㈜네이처글루텍사 제) 5) 상기 제조예 3의 DOPA modification Mussel Adhesive Protein, 도파 변형된 홍합 홍합접착단백질(㈜네이처글루텍사 제) 6) Cyanoacrylate(loctite사 제) |
||||||||
| pSer1) (mg) |
Coa2) | (㎕) | 인산칼슘 (mg) |
MAP4) (mg) |
몰 비5) | ||
| CaPP2-1) | CaPAA2-2) | α-TCP3-1) | DCPA3-2) | ||||
| 실시예 10 | 9.25 | 192.425 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.05 |
| 실시예 11 | 18.5 | 197.05 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.1 |
| 실시예 12 | 27.75 | 201.675 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.15 |
| 실시예 13 | 33.33 | 204.465 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.18 |
| 실시예 14 | 37 | 206.3 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.2 |
| 실시예 15 | 46.27 | 210.935 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.25 |
| 실시예 16 | 55.52 | 215.56 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.3 |
| 실시예 17 | 66.3 | 220.95 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.35 |
| 실시예 18 | 93.9 | 234.75 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.5 |
| 실시예 19 | 161 | 268.3 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.87 |
| 실시예 20 | 185 | 280.3 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1:1 |
| 실시예 21 | 9.25 | - | 192.425 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.05 |
| 실시예 22 | 18.5 | - | 197.05 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.1 |
| 실시예 23 | 27.75 | - | 201.675 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.15 |
| 실시예 24 | 33.33 | - | 204.465 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.18 |
| 실시예 25 | 37 | - | 206.3 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.2 |
| 실시예 26 | 46.27 | - | 210.935 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.25 |
| 실시예 27 | 55.52 | - | 215.56 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.3 |
| 실시예 28 | 66.3 | - | 220.95 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.35 |
| 실시예 29 | 93.9 | - | 234.75 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.5 |
| 실시예 30 | 161 | - | 268.3 | 310 | 65.6 | 1 | 1:0.87 |
| 실시예 31 | 185 | - | 280.3 | 310 | 65.6 | 1 | 1:1 |
| 1) Phosphoserine(sigma-aldrich 사 제) 2) Coacervate 2-1) 상기 제조예 1-1의 CaPP 코아세르베이트, Calcium polyphosphate, CaCl2 + sodium polyphosphate, 수분: 35%, 칼슘: 11%, 인산염: 54% 2-2) Calcium poly(acrylic acid), CaCl2 + sodium poly(acrylic acid), 수분: 72%, 칼슘: 2% 3-1) α-tricalcium phosphate(Wako사 제, 일본) 3-2) Dicalcium phosphate(Sigma-aldrich사 제) 4) Mussel Adhesive Protein, 홍합접착단백질(㈜네이처글루텍사 제) 5) α-TCP 대 pSer의 몰비 |
|||||||
| pSer1) (mg) |
Coa2) (㎕) |
인산칼슘 (mg) |
MAP4) (mg) |
P/L 비율5) (w/v) |
|||
| CaPP2-1) | CaPAA2-2) | α-TCP3-1) | DCPA3-2) | ||||
| 실시예 32 | 33.33 | 817.86 | - | 310 | 65.6 | 1 | 0.5 |
| 실시예 33 | 33.33 | 408.93 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1 |
| 실시예 34 | 33.33 | 272.62 | - | 310 | 65.6 | 1 | 1.5 |
| 실시예 35 | 33.33 | 204.47 | - | 310 | 65.6 | 1 | 2 |
| 실시예 36 | 33.33 | 163.57 | - | 310 | 65.6 | 1 | 2.5 |
| 실시예 37 | 33.33 | 136.31 | - | 310 | 65.6 | 1 | 3 |
| 실시예 38 | 33.33 | - | 817.86 | 310 | 65.6 | 1 | 0.5 |
| 실시예 39 | 33.33 | - | 408.93 | 310 | 65.6 | 1 | 1 |
| 실시예 40 | 33.33 | - | 272.62 | 310 | 65.6 | 1 | 1.5 |
| 실시예 41 | 33.33 | - | 204.47 | 310 | 65.6 | 1 | 2 |
| 실시예 42 | 33.33 | - | 163.57 | 310 | 65.6 | 1 | 2.5 |
| 실시예 43 | 33.33 | - | 136.31 | 310 | 65.6 | 1 | 3 |
| 1) Phosphoserine(sigma-aldrich 사 제) 2) Coacervate 2-1) 상기 제조예 1-1의 CaPP 코아세르베이트, Calcium polyphosphate, CaCl2 + sodium polyphosphate, 수분: 35%, 칼슘: 11%, 인산염: 54% 2-2) 상기 제조예 1-2의 CaPAA 코아세르베이트, Calcium poly(acrylic acid), CaCl2 + sodium poly(acrylic acid), 수분: 72%, 칼슘: 2% 3-1) α-tricalcium phosphate(Wako사 제, 일본) 3-2) Dicalcium phosphate(Sigma-aldrich사 제) 4) Mussel Adhesive Protein, 홍합접착단백질(㈜네이처글루텍사 제) 5) 고형분(Powder, P / sPer + α-TCP + DCPA + MAP) 대 액상성분(Liquid, L / Coa)의 비, 결과 값은 소수점 둘째 또는 첫째 자리에서 반올림 |
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| pSer1) (mg) |
Coa2) (㎕) |
인산칼슘 (mg) |
|||
| CaPP2-1) | α-TCP3-1) | α-TCP 입자(x) 크기 (㎛) |
DCPA3-2) | ||
| 실시예 44 | 33.33 | 204 | 310 | 10 ≤ x ≤ 25 | 65.6 |
| 실시예 45 | 33.33 | 204 | 310 | 5 ≤ x < 10 | 65.6 |
| 1) Phosphoserine(sigma-aldrich 사 제) 2) Coacervate 2-1) 상기 제조예 1-1의 CaPP 코아세르베이트, Calcium polyphosphate, CaCl2 + sodium polyphosphate, 수분: 35%, 칼슘: 11%, 인산염: 54% 3-1) 상기 제조예 2의 α-TCP, α-tricalcium phosphate 3-2) Dicalcium phosphate(Sigma-aldrich사 제) |
|||||
| pSer1) (mg) |
Coa2) (㎕) |
인산칼슘 (mg) |
MAP4) (mg) |
ZrO2 5) |
|||
| CaPP2-1) | α-TCP3-1) | DCPA3-2) | mg | 중량%5-1) | |||
| 실시예 46 | 33.3 | 204 | 310 | 65.6 | 1 | 0 | 0 |
| 실시예 47 | 33.3 | 204 | 310 | 65.6 | 1 | 40.89 | 10 |
| 실시예 48 | 33.3 | 204 | 310 | 65.6 | 1 | 81.78 | 20 |
| 실시예 49 | 33.3 | 204 | 310 | 65.6 | 1 | 122.67 | 30 |
| 1) Phosphoserine(sigma-aldrich 사 제) 2) Coacervate 2-1) 상기 제조예 1-1의 CaPP 코아세르베이트, Calcium polyphosphate, CaCl2 + sodium polyphosphate, 수분: 35%, 칼슘: 11%, 인산염: 54% 3-1) 상기 제조예 2의 α-TCP, α-tricalcium phosphate 3-2) Dicalcium phosphate(Sigma-aldrich사 제) 4) Mussel Adhesive Protein, 홍합접착단백질(㈜네이처글루텍사 제) 5) ZrO2 조영제 5-1)골시멘트 제조용 조성물 내 ZrO2의 중량% |
|||||||
| pSer1) (mg) |
Coa2) (㎕) |
인산칼슘 (mg) |
MAP4) (mg) |
|||
| CaPP2-1) | CaPAA2-2) | α-TCP3-1) | DCPA3-2) | |||
| 실시예 50 | 49.95 | 306 | - | 465 | 98.4 | 1.5 |
| 실시예 51 | 49.95 | - | 306 | 465 | 98.4 | 1.5 |
| 1) Phosphoserine(sigma-aldrich 사 제) 2) Coacervate 2-1) 상기 제조예 1-1의 CaPP 코아세르베이트, Calcium polyphosphate, CaCl2 + sodium polyphosphate, 수분: 35%, 칼슘: 11%, 인산염: 54% 2-2) 상기 제조예 1-2의 CaPAA 코아세르베이트, Calcium poly(acrylic acid), CaCl2 + sodium poly(acrylic acid), 수분: 72%, 칼슘: 2% 3-1) α-tricalcium phosphate(Wako사 제, 일본) 3-2) Dicalcium phosphate(Sigma-aldrich사 제) 4) Mussel Adhesive Protein, 홍합접착단백질(㈜네이처글루텍사 제) |
||||||
실험예 1: 기계적 강도 실험
시편 제조
상기 비교예 또는 실시예에서 제조된 각각의 조성물을 사용하여 기계적 강도 실험을 위한 시편을 제작하였다. 상기 비교예 또는 실시예에서 제조된 각각의 조성물을 제조한지 1분 이내에 도 1과 같은 형태의 높이 (6 ± 0.1)㎜ 및 내부 원의 직경 (3 ± 0.1)㎜의 주형 내부에 주입한 후 1시간 동안 23℃의 온도 및 상대습도 40%의 조건에서 1시간 동안 건조시킴으로써 실험용 시편을 제작하였다. 이와 같이 제조된 시편을 23℃의 항온항습기에서(이하, '대기' 라고 함) 혹은 37℃의 PBS(Phosphate Buffered saline) 용액 내(수중)에서(이하, '수중'이라고 함) 24시간 동안 보관하였다.
실험 방법
상기 시편의 기계적 강도는 골시멘트의 측정 규격인 ASTM F451-16을 기반으로 평가하였다.
구체적으로, 상기 제조된 각각의 시편을 20mm/min의 크로스헤드 속도로 측정하여 하중변형 곡선을 나타내거나, 시편이 깨지면 기기의 작동을 중단하였다. 상기 제조된 각각의 시편에 대하여 균열을 일으킨 힘의 값 또는 2% 오프셋 하중 또는 최고 하중을 기록하고, 상기 하중 값을 상기 시편의 단면적으로 나누어 MPa 단위의 압축강도(Compressive sterngth)로 표시하였으며, 상기 각 시편의 파열 시점까지 변형된 변형률을 구하여 압축강도를 변형률로 나눔으로써 압축탄성률(Compressive modulus, Young's modulus) 값을 산출하였다.
실험 결과 1: 구성별 조합에 따른 압축 강도의 비교
도 2를 참고하면, 본 발명에서 제시한 바와 같이 코아세르베이트(Coa)를 포함하는 실시예 1 내지 4의 경우, 코아세르베이트(Coa)를 포함하지 않는 비교예 보다 대기 중 압축 강도뿐만 아니라 수중 환경에서의 압축 강도 또한 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 본 발명에서 바람직한 일 실시형태로서 제시한 바와 같이, 홍합접착단백질(MAP)을 더 포함하는 실시예 3 및 4의 경우, 홍합접착단백질(MAP)을 포함하지 않는 실시예 1 및 2에 비하여 압축강도가 보다 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 3을 참고하면, 본 발명에서 제시한 바람직한 일 실시형태인 포스포세린, 코아세르베이트(CaPP 또는 CaPAA), α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP) 및 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA)를 포함하는 실시예 5(CaPP) 및 7(CaPAA) 각각은 디칼슘 포스페이트 무수물(DCPA)를 포함하지 않는 실시예 6(CaPP) 및 8(CaPAA) 각각에 비하여 대기 중 압축 강도뿐만 아니라, 수중 환경에서의 압축 강도 또한 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4를 참고하면, 홍합접착단백질(MAP)과 더불어 도파 변형된 홍합접착 단백질(mMAP)을 포함하는 경우(실시예 3 및 9) 모두 비교예 보다 대기 중 압축 강도 뿐만 아니라, 수중 환경에서도 압축 강도의 저하 정도가 감소함을 확인할 수 있었다.
실험결과 2: α-TCP 및 pSer의 몰비에 따른 압축 강도 및 압축 탄성률 비교
도 5를 참고하면, 본 발명에서 제시한 바람직한 일 실시형태인 α-트리칼슘 포스페이트(α-TCP) 및 포스포세린(pSer)의 몰비가 1:0.05 내지 1:1을 만족하는 경우(실시예 10 내지 실시예 20 및 실시예 21 내지 31) 압축 강도 및 압축 탄성률이 모두 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 본 발명에서 제시한 상기 몰비의 바람직한 범위인 1:0.1 내지 1:0.35를 만족하는 경우(실시예 11 내지 17 및 실시예 22 내지 28) 압축 강도 및 압축 탄성률이 보다 우수하고, 상기 몰비가 1:0.15 내지 1:0.3(실시예 12 내지 16 및 실시예 23 내지 27)을 만족하는 경우 압축 강도 및 압축 탄성률이 보다 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
실험 결과 3: P/L 비율에 따른 압축 강도 및 압축 탄성률의 비교
도 6을 참고하면, 본 발명에 따른 CaPP 코아세르베이트를 포함하는 골시멘트 제조용 조성물은, 본 발명에서 제시한 바람직한 일 실시형태인 고형분(powder, P) 및 액상성분(liquid, L)의 비(P/L(w/v))가 바람직한 범위인 1.5 내지 3을 만족하는 경우(실시예 34 내지 37) 상기 범위를 벗어나는 경우(실시예 32 내지 33)보다 압축 강도 및 압축 탄성률이 보다 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, CaPAA 코아세르베이트를 포함하는 골시멘트 제조용 조성물은, 본 발명에서 제시한 바람직한 일 실시형태인 고형분(powder, P) 및 액상성분(liquid, L)의 비(P/L(w/v))가 바람직한 범위인 1.5 내지 2.5을 만족하는 경우(실시예 40 내지 42) 상기 범위를 벗어나는 경우(실시예 38 내지 39 및 실시예 43) 보다 압축 강도 및 압축 탄성률이 보다 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 전단 강도 실험
시편 준비
도 7과 같이 2.5 × 8 × 0.2 cm의 알루미늄 시편을 준비하였다. 스테인리스 트레이에 상기 알루미늄 시편을 넣고, 상기 알루미늄 시편이 잠길 정도로 5%(w/v) NaOH 수용액을 넣고, 5분 동안 혼합하여 반응시켰다. 그 후, 상기 알루미늄 시편을 물로 5번 세척하여 잔류하고 있는 NaOH를 제거하였다. 상기 NaOH가 제거된 알루미늄 시편을 다시 스테인리스 트레이에 넣고, 상기 알루미늄 시편이 잠길 정도로 30%(v/v)의 HNO3 수용액을 넣어 3분 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 알루미늄 시편을 물로 5번 세척함으로써 잔류하는 HNO3를 제거하였으며, 23℃, 상대습도 50%의 항온항습기에 넣고 완전히 건조시켰다.
실험 방법
상기 비교예 또는 실시예에서 제조된 조성물을 상기 준비된 시편 상에 도포하였다. 상기 도포된 면과 또 다른 알루미늄 시편을 중첩시킨 후, 고정판에 시편을 놓고 중첩된 부분 위에 2N의 고정추를 올려 고정시켰다. 상기 도포된 조성물을 대기(23℃, 상대습도 50%의 항온항습기) 또는 수중(37℃, in 1X PBS) 조건에서 1시간 동안 경화시켰다. 이와 같이 경화된 시편(조성물이 도포된)을 MTS grip에 걸어 5mm/min의 속도로 'Failure'가 될 때까지 로드(load)를 가하였다. 전단 응력(shear stress, MPa) 값을 최대, 최소, 평균, 표준편차 값까지 확보하여 'Failure' 양상을 기록하였다.
실험결과
도 8을 참고하면, 본 발명에서 제시한 바와 같이 코아세르베이트(Coa)를 포함하는 경우(실시예 1, 3 및 9)가 코아세르베이트(Coa)를 포함하지 않는 경우(비교예) 보다 전단 응력이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 같은 종류의 코아세르베이트(Coa)를 포함하는 경우(실시예 1, 3 및 9)끼리 비교하였을 때 홍합접착단백질(MAP 또는 mMAP)을 더 포함하는 경우(실시예 3 및 9)가 홍합접착단백질을 포함하지 않는 경우(실시예 1)보다 전단 강도가 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 실험 결과를 통해, 본 발명의 골시멘트 제조용 조성물은 우수한 전단 강도로 인해 골결손부에 적용하였을 때 이탈하지 않고 장시간 온전하게 유지될 수 있으며, 특이하게도 대기보다 수중 환경에서 전단 강도가 향상되어 수중 환경에서의 접착력이 우수함을 확인하였다.
실험예 3: 경화 시간 평가
시편 준비
상기 비교예 또는 실시예에서 제조된 조성물을 도 9와 같이 내부 원의 높이(판의 두께)가 1㎜이고, 직경이 10㎜가 되는 주형에 채운 후 평평한 아크릴판을 이용해 표면을 긁어냄으로써 주형에 맞는 시편을 제조하였다.
실험 방법
경화 시간을 평가하기 위해 도 10과 같은 길모어 니들(초결침(Φ2.12, 113.4g), 종결침(Φ1.06, 453.6g))를 사용하였다. 상기 시편 준비 과정에서, 주형에 조성물을 채운 직후 시간을 기준으로 15초 당 한번씩 상기 길모어 니들의 초결침(초기경화시간)을 5초 동안 올려두어 자국(압흔)이 남는지 확인하였다. 초결침을 올려두었음에도 압흔이 남지 않았을 때 종결침으로 실험을 진행하였으며, 종결침(최종경화시간)을 사용하였음에도 압흔이 남지 않는 때의 시간을 측정하여 기록하였다. 시편은 각 조성물 당 5개씩 제조하여 실험을 진행하였으며, 5개 시편의 평균 경화시간을 구하여 최종 실험 결과로 기재하였다.
실험 결과
도 11을 참고하면, 본 발명에서 제시한 바람직한 일 실시형태인 α-트리칼슘포스페이트(α-TCP)의 입자 크기가 직경 10 내지 25 ㎛를 만족하는 경우(실시예 44), 최종경화시간이 10분 이내인 것을 확인할 수 있었다. 이 때, 본 실험에서 초기경화시간(초결침)이라 함은 본 발명의 조성물을 혼합하고 주사하는 등의 조작을 실시할 수 있는 최대 시간을 의미하며, 최종경화시간(종결침)이라 함은 환부에 상기 조성물을 적용하였을 때 상기 조성물이 최종 경화되는 시간을 의미한다. 상기 최종경화시간이 10분을 넘어가게 되면, 경화되는 데 시간이 다소 증가함으로써 수술 또는 처치 시간이 증가될 수 있어 효율성이 저하될 수 있는 것으로 평가될 수 있다. 한편, 상기 최종경화시간이 6분 이하일 경우 골시멘트의 경화 속도가 가속화됨으로써 골시멘트의 형태를 조작하는 것이 어려울 수 있다. 이에 따라, α-TCP의 입자 크기가 직경 10 내지 25 ㎛를 만족하는 경우(실시예 44) 이를 벗어나는 경우(실시예 45) 대비 최적의 최종경화시간을 나타냄을 확인할 수 있다.
실험예 4: 수중 저항성 평가
실험 방법
25mL의 1X PBS가 담긴 패트리 디쉬를 준비하고, 상기 비교예 또는 실시예에서 제조된 조성물을 3mL 용량의 주사기에 충전시켜 1분 이내에 수중으로 3mL 이상 주사하였으며, 주사 직후 및 24시간 후의 경과를 관찰하여 그 결과를 도 12에 개시하였다.
실험 결과
도 12(a)를 참고하면, 본 발명의 조성물의 경우(실시예 1, 3 및 9) 주사 직후는 물론이고, 주사 후 24시간이 경과한 후에도 수중 환경에서 인산칼슘 입자의 이탈이 없는 것을 확인하였으며, 도 12(b)를 참조하면, 종래 인산칼슘으로 구성된 골시멘트, 사칼슘인산염(tetracalcium phosphate)과 포스포세린으로 구성된 골시멘트(revbio사, 한국 등록특허 공보 제10-1769805호 참고) 및 PMMA(polymethyl methacrylate)로 구성된 골시멘트는 모두 수중 환경에서 모노머가 녹아나오는 것을 확인할 수 있다. 이를 통하여 본 발명에 따른 골시멘트 제조용 조성물은 종래 골시멘트에 비하여 수중 저항성이 현저히 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 13을 참고하면, 본 발명에 따른 골시멘트 조성물은 조영제인 ZrO2가 포함되더라도(실시예 46 내지 49), 주사 직후 및 주사 후 24시간이 경과한 후에도 수중 환경에서 인산칼슘 입자의 이탈이 없는 것을 확인할 수 있다. 이를 통하여 본 발명에 따른 골시멘트 제조용 조성물은 조영물질을 포함하는 골시멘트로 응용 가능함을 확인할 수 있다.
실험예 5: 수중 분해도 평가
실험 방법
ISO DIS 18531 및 붕해도 시험법을 기반으로 정량적 수중저항성 평가 방법을 확보하였다.
100ml의 유리비커 및 10mesh로 이루어진 받침대의 무게를 측정하였다. 상기 100ml의 유리 비커에 증류수(DW)를 30ml 넣고 37℃, 습도 95 내지 100%의 항온항습기에 보관하였다. 상기 비교예 또는 실시예에서 제조된 조성물을 2 × 2 mm 보다 큰 사이즈로 준비하고 상기 10mesh로 제작된 받침대 위에 위치시켰다. 상기 받침대를 상기 100ml의 유리 비커에 위치시키되, 이 때, 상기 조성물은 모두 수중에 위치하도록 하였다. 이 후, 72시간 동안 37℃, 습도 95 내지 100%의 항온항습기에 보관한 후, 받침대를 꺼내어 유리 비커 속 잔여물이 제거되지 않도록 조심스럽게 용매를 제거하였다. 잔여물이 남은 유리 비커 및 받침대를 24시간 동안 60℃의 항온기에서 건조시켰다. 이와 같이 건조된 잔여물이 남은 유리 비커 및 조성물이 위치한 받침대를 상온에 순응시키고, 각각의 무게를 측정하였으며, 3회 이상 측정된 각 무게를 이용하여 하기 식 1과 같이 분해도를 계산하였으며 그 결과를 하기 표 7에 기재하였다.
[식 1]
분해도(%) = [(C-A)/{(C-A)+(D-B)}]*100
(상기 식 1에서, A는 실험 전 100ml의 유리비커의 무게이고, B는 실험 전 받침대의 무게이며, C는 실험 후 잔여물이 남은 유리 비커의 무게이고, D는 실험 후 조성물이 위치한 받침대의 무게를 의미한다.)
| 실시예 55 | 실시예 56 | ||
| A | 실험 전 유리비커 무게 (g) | 48.5501 | 47.9628 |
| B | 실험 전 받침대 무게 (g) | 1.257 | 1.1572 |
| C | 실험 후 잔여물이 남은 유리비커 무게 (g) | 48.5502 | 47.9659 |
| D | 실험 후 조성물이 위치한 받침대의 무게(g) | 1.5437 | 1.7532 |
| 분해도(%)1) | 0.034868 | 0.5174 | |
| 1) 분해도 계산 결과 값은 소수점 7번째 자리에서 반올림함 | |||
상기 표 7을 참고하면, 본 발명의 일 실시형태에 따른 골시멘트 제조용 조성물(실시예 50 및 실시예 51)의 경우 수중에서 이탈되는 물질의 비율이 1% 이하인 것으로 확인되었으며, 즉 이탈되는 인산칼슘 입자가 적고 수중 저항성 및 안정성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
Claims (8)
- 포스포세린 및 코아세르베이트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 골시멘트 제조용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 코아세르베이트는 칼슘 폴리포스페이트 또는 칼슘 폴리아크릴산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 골시멘트 제조용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 인산칼슘 또는 홍합접착단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 골시멘트 제조용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 인산칼슘은 α-트리칼슘 포스페이트 및 디칼슘 포스페이트 무수물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 골시멘트 제조용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 α-트리칼슘 포스페이트 및 포스포세린의 몰비는 1:0.05 내지 1:1인 것을 특징으로 하는, 골시멘트 제조용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 α-트리칼슘 포스페이트의 입자 크기는 그 직경이 10 내지 100㎛인 것을 특징으로 하는, 골시멘트 제조용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 고형분(powder, P) 및 액상성분(liquid, L)의 비인 P/L(w/v)가 0.5 내지 10인 것을 특징으로 하는, 골시멘트 제조용 조성물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 골시멘트.
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|---|---|---|---|---|
| KR101671585B1 (ko) | 2014-11-20 | 2016-11-01 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물 및 이의 제조를 위한 키트 |
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- 2022-12-16 KR KR1020220176943A patent/KR20230095828A/ko unknown
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| KR101671585B1 (ko) | 2014-11-20 | 2016-11-01 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 생활성 나노복합 인산칼슘 골시멘트 조성물 및 이의 제조를 위한 키트 |
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