CN117771443A

CN117771443A - 一种可生物降解、可注射骨水泥及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117771443A
Application number: CN202310415081.0A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 伍自涵; 刘昌胜; 岳述荣
Original assignee: East China University of Science and Technology; Shanghai Rebone Biomaterials Co Ltd
Current assignee: East China University of Science and Technology; Shanghai Rebone Biomaterials Co Ltd
Priority date: 2023-04-18
Filing date: 2023-04-18
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明提供了一种可生物降解、可注射骨水泥及其制备方法和应用，用于制备可注射骨水泥的组合物包含液相组分和固相组分，其中所述液相组分为聚酯高分子或聚酯高分子与催化剂的混合物；所述固相组分为磷酸钙盐或磷酸钙盐与显影剂的混合物。所述可注射骨水泥通过聚酯高分子、磷酸钙盐、显影剂经交联反应形成，可注射、可生物降解。本发明的生物安全的骨水泥可在复杂组织缺损部位高度契合，固化过程无明显放热现象，具有良好的显影效果，其形成的多孔结构能促进骨组织修复，提高修复质量，是一种具有临床应用前景的骨组织修复材料。

Description

一种可生物降解、可注射骨水泥及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及材料科学及医学领域，具体涉及一种体内环境自交联与水化增强的可通过注射形成的骨水泥及其制备方法和应用。特别是用于复杂结构的骨组织缺损修复的填充材料。

背景技术

由于疾病、意外伤害、自然灾害等原因造成的骨缺损情况与日俱增，这不仅使得骨组织修复材料市场需求巨大，同时对现有的修复材料在手术操作、力学性能与生物活性上具有越来越高的要求。其中，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥、磷酸钙(CPC)骨水泥等可注射型材料在临床上应用最为广泛。然而，他们在实际临床应用中普遍存在各自的问题亟需解决。其中，PMMA骨水泥反应过程中放热造成的高温(约70℃)、游离单体存在毒性、骨水泥本身的生物惰性以及过高的模量等缺点大大地影响了其组织修复效果。而CPC骨水泥虽具有良好的组织相容性与骨传导性，但其力学性能太差，遇水容易溃散等问题使其仅仅能独立应用于牙颌骨修复领域，绝大多数还是与PMMA混合使用。鉴于天然骨中钙磷无机物和有机胶原的紧密网状结构及其力学强度，活性有机高分子的引入对于骨修复材料的设计具有重大意义。另一方面，在复杂形状的骨损修复需求上，可注射骨水泥满足微创治疗的需求。基于上述，通过生物制造策略仿生地设计一种具有高弹性、高强度的有机无机复合可注射骨水泥，用以全方位满足不同复杂骨缺损修复的需求具有重大的临床意义。

发明内容

本发明的目的就是提供一种生物亲和、体内原位水化与成孔、高生物活性、可通过注射形式形成的骨水泥。

在本发明的第一方面，提供了一种可注射骨水泥组合物，所述可注射骨水泥组合物包含：

液相组分，所述液相组分为聚酯高分子或聚酯高分子与催化剂的混合物；

固相组分，所述固相组分为磷酸钙盐或磷酸钙盐与显影剂的混合物。

在另一优选例中，所述的聚酯高分子和催化剂的质量比为1：0.00001～0.5，较佳为1：0.00005～0.002或0.0001～0.0005，更佳为1：0.0001～0.001。

在另一优选例中，所述的磷酸钙盐与显影剂的质量比为1:9～9:1，较佳为2:8～8:2、3:7～7:3、3:7～5:5或4:6～6:4。

在另一优选例中，所述的显影剂和所述的PEGS-OH通过化学键结合。

在另一优选例中，所述可注射骨水泥组合物还包含交联剂，所述交联剂为二异氰酸酯类交联剂。

在另一优选例中，所述交联剂为L-赖氨酸二异氰酸酯LDI、六亚甲基二异氰酸酯，甲苯二异氰酸酯。

在另一优选例中，所述的聚酯高分子和交联剂的质量比为1：0.25～2，优选1：0.25～0.5，更优选1：0.3～0.4，较佳为1：0.365。

在另一优选例中，所述聚酯高分子为多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯PEGS-OH，LDI中异氰酸酯基团的物质的量为PEGS-OH中羟基物质的量的0.5-2倍。

在另一优选例中，LDI中异氰酸酯基团的物质的量为PEGS-OH中羟基物质的量的1-1.5倍，较佳为1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4倍。

在另一优选例中，所述液相组分与固相组分的质量比为0.5:9.5-5:5。

在另一优选例中，所述液相组分与固相组分的质量比为1:9-9:1，较佳为2:8。

在另一优选例中，所述聚酯高分子选自：聚癸二酸甘油酯、聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯、多羟基聚乙二醇、多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯PEGS-OH，

其中，多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯PEGS-OH的结构单元如式Ia或式Ib所示：

其中，式Ia中，m₁为1-20的整数，n₁为5-60的整数；

式Ib中，m₂为1-20的整数，n₂为5-60的整数。

在另一优选例中，式Ia中，m₁为2-18的整数、5-15的整数、2-8的整数、8-10的整数。在另一优选例中，n₁为10-50的整数、20-40的整数、30-50的整数、8-35的整数。

在另一优选例中，式Ib中，m₂为2-18的整数、5-15的整数、2-8的整数、8-10的整数。在另一优选例中，n₂为10-50的整数、20-40的整数、30-50的整数、8-35的整数。

在另一优选例中，所述的聚酯高分子的数均分子量为3.0-100.0kDa，优选6.0-50.0kDa，更优选7.0-20.0kDa。

在另一优选例中，所述的聚酯高分子的分散系数为1.1-2.0，优选1.2-1.7；

在另一优选例中，所述的聚酯高分子，在一个结构单元中，平均包含至少2个-OH。

在另一优选例中，所述催化剂为有机金属类催化剂。

在另一优选例中，所述磷酸钙盐选自：磷酸四钙、磷酸二氢钙、磷酸三钙中的一种或两种以上的混合物。

在另一优选例中，所述显影剂选自含碘类造影剂。

本发明的第二方面，提供一种可注射骨水泥，所述可注射骨水泥由第一方面中所述的可注射骨水泥组合物的液相组分和固相组分以及任选的交联剂混合得到。

在另一优选例中，将所述的液相组分和固相组分进行充分均匀的混合，得到白色面团状浆料；将所述的交联剂与上述浆料均匀混合，得到所述的可注射骨水泥。

在另一优选例中，所述的骨水泥填入注射器注射器中，并注射至相关部位，从而固化形成骨水泥。

在另一优选例中，所述的可注射骨水泥注射时的储存模量为10³-4×10⁴Pa，优选10⁴Pa。在另一优选例中，所述的可注射骨水泥注射时的损耗模量为2×10³-4×10⁵Pa，优选10⁴Pa。储存模量不高于损耗模量，满足可注射要求。

在另一优选例中，液相组分和固相组分混合后，在25℃-40℃，更佳为35℃-37℃；最佳为37℃与交联剂进行混合。

其中液相组份、固相组分以及交联剂同前所述。

在另一优选例中，所述的骨水泥的固化时间为15～120min，优选15～30min，例如17min、20min、26min。

在另一优选例中，所述的骨水泥的固化时间可通过催化剂的量进行调节。

在另一优选例中，所述的骨水泥在25～40℃固化，优选37℃。本发明的骨水泥，具有生物亲和、体内原位水化与成孔、高生物活性、可通过注射形式形成等特征。

本发明的第三方面，提供一种用于制备第二方面所述的可注射骨水泥的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的液相组分；

(b)第二容器，以及位于所述容器内的固相组分。

(c)第三容器，以及位于所述容器内的交联剂。

在第一容器中，所述的液相组分以粘稠液体的形式存在；在第二容器，所述的固相组分以粉末的形式存在；在第三容器，所述的交联剂以液体的形式存在。

其中液相组份、固相组分以及交联剂同前所述。

本发明的第四方面，提供第三方面所述的可注射骨水泥的用途，用于：

(i)制备组织缺损填充材料；

(ii)制备引导组织再生的材料；

(iii)制备医疗美容材料；

(iv)3D打印基质材料；

(v)生长因子或药物的负载基质或载体。

在另一优选例中，用于制备治疗脊柱融合性骨折的材料。

在本发明的第五方面，提供了一种填充组织缺损和/或引导组织再生的方法，所述方法包括将本发明第二方面所述的可注射骨水泥施用于需治疗的部位。

在本发明的第六方面，提供了一种负载生长因子和/或药物和/或细胞的方法，所述方法包括将本发明第二方面所述的可注射骨水泥与所述需负载的生长因子和/或药物和/或细胞进行混合。

在本发明的第七方面，提供了一种3D打印复合支架的的方法，所述方法包括将本发明第二方面所述的可注射骨水泥作为3D打印基质材料使用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明中多羟基PEGS高分子的合成路线(A)；多羟基PEGS高分子的核磁共振氢谱图(B)；多羟基PEGS高分子(PEGS-OH，下)与缩聚制备的支化PEGS高分子(PEGS，上)的傅里叶变换红外光谱图(C)；不同PEG嵌段分子量的多羟基PEGS高分子的分子量随反应时间变化规律(D)。

图2显示了本发明中有机相与无机相在不同比例下的混合状态(A)；不同比例有机无机混合后的傅里叶变换红外光谱图(B)；不同比例有机无机混合后的流变曲线图(C)；不同比例有机无机混合后的热重图谱(D)。

图3显示了本发明中不同交联剂含量的压缩曲线图(A)；前60％应变下，不同交联剂含量的压缩曲线图(B)；不同交联剂含量的傅里叶变换红外光谱图(C)；37℃下，不同交联剂含量的流变曲线图(D)；37℃下，不同催化剂含量的流变曲线图(E)；25℃下，催化剂含量0.01％时的流变曲线图(F)。

图4显示了本发明中可注射骨水泥的细胞毒性柱状图(A)；不同水化时间的压缩曲线图(B)；不同交联剂含量的循环压缩曲线图(C)；本发明中骨水泥的微观形貌示意图(D)。

图5显示了本发明中骨水泥注射后温度随时间的变化(A)；骨水泥注射后10min内温度随时间的变化折线图(B)；骨水泥经挤出能形成复杂的形状(C)；骨水泥在水流的冲击下不溃散(D)。

图6显示了本发明中不同显影剂含量的骨水泥在X射线下的显影效果(A)；不同显影剂含量的骨水泥在离体羊脊柱内的显影效果(B)；不同状态下骨水泥的力学性能对比(C)；添加60％碘海醇作为显影剂后的流变曲线(D)；添加60％碘海醇作为显影剂后的固化时间(E)。

图7显示了本发明中骨水泥对比PMMA的组织修复CT照片(A)；骨水泥对比PMMA修复骨缺损后的骨形态(B)；骨水泥修复后的骨面积(C)；骨水泥修复后的骨体积比(D)；骨水泥修复后的骨小梁分离度(E)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种具备优异的力学性能，体内快速固化，水化的同时形成多孔结构的可通过注射方式形成的骨水泥。

具体地，所述的骨水泥引入了可生物降解的多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)作为骨水泥的有机相，以磷酸钙盐为无机相，构建了基于异氰酸酯与羟基交联的有机无机复合可注射骨水泥体系。所述骨水泥注射性能优良，可在体内环境下快速固化成型，且交联过程温和，无明显放热，对宿主生物体无明显毒性，为骨缺损的填充与骨组织的引导再生提供了可能。

本发明的骨水泥不仅具有优异的力学性能和生物活性，以及良好的细胞相容性和骨引导性，而且具备理想的组织修复效果和临床适用性，使得该材料的植入无需开放性手术，方便了医生操作的同时减少了患者的痛苦，为微创治疗组织再生技术提供了新的可选择材料和设计思路。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“PEG”、“聚乙二醇”可互换使用。

如本文所用，术语“PGS”、“聚癸二酸甘油酯”可互换使用。

如本文所用，术语“PEGS”、“PEG化聚癸二酸甘油酯”、“聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯”、“PEGS高分子”可互换使用。

如本文所用，术语“CPC”、“磷酸钙盐”可互换使用。

如本文所用，术语“LDI”、“L-赖氨酸二异氰酸酯”可互换使用。

如本文所用，术语“PEGS-OH”、“多羟基PEGS”可互换使用。

如本文所用，术语“T-9”、“辛酸亚锡”、“2-乙基己酸亚锡”可互换使用。

如本文所用，术语“C7P3”、“C8P2”、“C9P1”中，C代表CPC，7、8、9指CPC的质量是骨水泥总质量的70％、80％、90％，P代表PEGS-OH，3、2、1指PEGS-OH的质量占骨水泥总质量的30％、20％、10％。

如本文所用，术语“L1.5”、“L1.25”、“L1.0”中L代表L-赖氨酸二异氰酸酯LDI，1.5、1.25、1指LDI中异氰酸酯的物质的量是PEGS中羟基物质的量的1.5倍、1.25倍、1.0倍。

多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)

本发明中多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)具有式Ia或式Ib所示的结构：

式Ia中，m₁为1-20的整数，n₁为5-60的整数；

式Ib中，m₂为1-20的整数，n₂为5-60的整数。

本发明中，如图1中A所示制备多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)。其中，左图示出式Ia所示的PEGS-OH的合成。

具体地，所述多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯的制备方法包括如下步骤：

(a1)在氩气的氛围保护下，将摩尔比为1∶1的二酸和二缩水甘油酯溶于溶剂中(其中二酸可为癸二酸、分子量250Da的羧基化PEG或分子量600Da的羧基化PEG；二缩水甘油酯可为癸二酸二缩水甘油酯或分子量500Da的聚乙二醇二缩水甘油酯)，加入摩尔比为0.6mol％的双四正丁基氢氧化铵盐催化剂(其中铵盐的羧酸部分可为癸二酸、分子量250Da的羧基化PEG或分子量600Da的羧基化PEG)，在90-120℃(更佳地100℃)反应1-3天；

(b1)将步骤(a1)的产物于于乙醚中沉降后，在室温下真空干燥6-12小时(更佳地10-12小时)，得到多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯高分子PEGS-OH。

在另一优选例中，所述制备方法还包括步骤；

(c1)透析纯化步骤(b1)获得的PEGS-OH得到纯化的PEGS-OH。

本发明的骨水泥

骨水泥是一类能在组织缺损部位起到支撑作用的生物医用材料。本发明提供了一种生物亲和、体内水化与成孔、可通过注射形式形成的骨水泥。

如本文所用，术语“可注射骨水泥”、“本发明的骨水泥”、“PEGS/CPC骨水泥”、“有机无机复合骨水泥”可互换使用。

本发明所述的骨水泥通过液相组分、固相组分和任选的交联剂经混合反应形成；所述液相组分为聚酯高分子或聚酯高分子与催化剂的混合物；所述固相组分为磷酸钙盐或磷酸钙盐与显影剂的混合物。

在另一优选例中，所述的液相组分包括多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯与2-乙基己酸亚锡；

所述的固相组分包括磷酸四钙和无水磷酸钙；

所述的交联剂包括L-赖氨酸二异氰酸酯。

所述的显影剂包括碘海醇。

在一优选实施方式中，以多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)为有机相，磷酸钙盐(CPC)为无机相，碘海醇为显影剂，在2-乙基己酸亚锡(T-9)的催化作用下，通过L-赖氨酸二异氰酸酯(LDI)交联固化并以注射器注射的方式注射至相关部位从而得到具有一定力学性能的骨水泥材料。

所述的液相组分与固相组分的质量比为1～3：9～7，优选2：8。

在另一优选例中，所述的磷酸钙盐和所述的PEGS-OH通过物理混合结合。

本发明所述的PEGS-OH和所述的交联剂通过PEGS-OH的羟基和LDI的异氰酸酯基团之间的加成反应结合。

本发明所述的骨水泥的力学性能和流变性能可通过多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯与磷酸钙盐的质量比进行调节和优化。

本发明所述的骨水泥的凝胶时间和细胞毒性可通过调控催化剂含量进行优化。

在另一优选例中，所述的聚酯高分子和交联剂的质量比可用于调节所述骨水泥的的模量、流变性能与孔含量。

在另一优选例中，所述的聚酯高分子和催化剂的质量比可用于调节所述骨水泥的的流变性能、固化时间与细胞毒性。

在另一优选例中，所述的显影剂和无机物磷酸钙盐的质量比可用于调节所述骨水泥的体内显影效果与模量。

本发明所述的骨水泥的显影效果可通过调控显影剂含量进行优化。

所述的骨水泥具有以下一个或多个特征：

(1)压缩模量在10～280MPa之间，优选在80～100MPa之间；

(2)37℃下，固化时间在15～120min之间，优选在15～30min之间；

(3)25℃下，操作期时间大于120min。

所述的可注射骨水泥的细胞毒性为空白组的85％。

所述的可注射骨水泥的在5000N压力下不碎裂掉渣。

所述的可注射骨水泥的表面具有大小不一的多孔结构。

所述的可注射骨水泥在水流冲击下不溃散。

所述的可注射骨水泥的固化过程无明显放热现象。

本发明的骨水泥的制备方法

本发明提供了一种PEGS-OH/CPC复合骨水泥的制备方法，包括如下步骤：

(i)提供多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯(PEGS-OH)、磷酸钙盐(CPC)、碘海醇、2-乙基己酸亚锡(T-9)、L-赖氨酸二异氰酸酯(LDI)；

(ii)向PEGS-OH高分子中加入T-9催化剂，并混合均匀得到液相；

(iii)CPC粉末与碘海醇混合均匀，得到固相；

(iv)将固相与液相混合均匀，并加入LDI交联剂，混合均匀，得到骨水泥浆料。

将上述骨水泥浆料转移到注射器料筒内，即可注射入缺损部位，体内固化形成骨水泥。

在所述步骤(i)中，PEGS-OH(聚合物)分子量为12000Da，2-乙基己酸亚锡(T-9)分子量为405.12g/mol，L-赖氨酸二异氰酸酯(LDI)分子量为226.23g/mol。

在所述步骤(ii)中，催化剂T-9用量为0.1～0.01％。

在所述步骤(iii)中，CPC与碘海醇的质量比为3～9:1～7。

在所述步骤(iv)中，液固投料质量比为1～3:9～7；LDI中异氰酸酯基团的物质的量为PEGS-OH羟基物质的量的1.5倍、1.25倍、1.0倍；反应温度为37℃，反应时长为15～30min。

所述可注射骨水泥的固化时间随着催化剂含量的增加而缩短，固化时间在15～120min可调，骨水泥的压缩模量随CPC含量的增加而增强，初始压缩模量在10～35MPa可调。

本发明的主要优点包括：

1)本发明所述的骨水泥具有优异的可注射性和力学强度；

2)本发明所述的骨水泥的混合物可通过注射至所需部位原位固化，其固化时间在15-120min之间可调节；

3)本发明所述的骨水泥的流变性能、注射性能、力学性质和细胞行为可通过对其组分含量进行改变来实现调控和优化；

4)本发明所述的骨水泥可自由填充缺损部位，可在缺损处高度契合；

5)本发明所述的骨水泥具有可生物降解性；

6)本发明所述的骨水泥具有良好的显影效果；

7)本发明所述的骨水泥交联过程温和，无明显放热；

8)本发明所述的骨水泥中无机物CPC为骨组织的引导再生提供了可能；

9)本发明所述的骨水泥所具备的微创属性让其在临床应用上具有可观的前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.多羟基PEGS的合成

(a)取4.68mL的环氧丙醇和18.9mL三乙胺溶解于100mL甲苯中。在氩气氛围下，加入三口烧瓶中，并常温搅拌使其混合均匀；

(b)取6.08mL癸二酰氯溶解于8mL甲苯中，在氩气氛围下添加入恒压漏斗中；

(c)将反应装置转移至-15℃乙醇浴，并打开恒压漏斗的活塞，使(b)中癸二酰氯溶液滴加入(a)中混合溶液中。该反应中癸二酰氯相对于环氧丙醇的摩尔含量为50％，即反应的酰氯与羟基的摩尔比为1：1。

(d)反应6小时后，抽滤除去三乙胺盐酸盐，并旋蒸除去溶剂。通过柱层析纯化得到癸二酸二缩水甘油酯。

(e)在充满氩气氛围的手套箱中，称取2.39g癸二酸二缩水甘油酯、2.5g羧基化PEG，溶于DMF中，在100℃下加热搅拌1-3天。

(f)将预聚产物通过乙醇溶解-超纯水透析操作进行纯化，除去未反应的单体和小分子，得到纯化的多羟基PEGS高分子。

通过使用不同分子量的羧基化PEG(数均分子量分别为250Da、500Da、600Da)得到不同的多羟基PEGS高分子，分别命名为PEGS₂₅₀-OH、PEGS₅₀₀-OH、PEGS₆₀₀-OH。同时，使用相同方法制备了不含PEG组分的PGS-OH和不含癸二酸组分的PEG-OH。

其中，使用数均分子量为250Da的羧基化PEG得到的PEGS₂₅₀-OH的数均分子量为12175Da，分散性系数为1.61。

所得多羟基PEGS高分子的核磁共振氢谱如图1中B所示，峰位置符合PEGS氢原子的理论结构。且在化学位移3.00ppm处，没有观察到环氧官能团的出峰，说明所有的环氧官能团被反应消耗完全，反应彻底。

所得多羟基PEGS高分子的傅里叶变换红外光谱如图1中C所示，其在3500cm^-1处的羟基峰强度相比于通过聚乙二醇、癸二酸、甘油直接混合缩聚得到的PEGS有明显的增强，说明本发明的多羟基PEGS高分子的羟基含量明显多于缩聚得到的PEGS。

图1中D显示了通过凝胶渗透色谱对不同PEG嵌段分子量的多羟基PEGS高分子的分子量随反应时间的变化图，结果表明，PEGS-OH数均分子量随着反应时间的延长而增加，且受PEG嵌段分子量影响不明显，均在12kDa左右。

实施例2.多羟基PEGS的合成

(a)称取1.95g癸二酸(0.01mol)和20g(0.07mol)四丁基氢氧化铵(25wt％水溶液)加入到100mL的95％乙醇中，在55℃下搅拌反应30min，然后在40℃下旋蒸除去乙醇，最后冻干得到产物癸二酸二(四丁基氢氧化铵)酯(TBAS)；

(b)在氮气氛围保护下称取20.23g癸二酸(0.1mol)，50.00g聚乙二醇二缩水甘油醚和0.41g步骤(a)的产物TBAS，将上述原料共混溶解至180mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，在100℃下搅拌反应72h；

(c)用截留分子量为3500Da的透析袋透析纯化步骤(b)的产物得到纯化的线性多羟基PEGS。

实施例3.PEGS-OH/CPC比例的探索及表征

探索聚酯高分子PEGS-OH与磷酸钙盐CPC在不同比例下的复合情况。

采用实施例2的方法制备PEGS-OH。称取PEGS-OH、CPC，使其质量比分别符合1:9、2:8、3:7，混合均匀，形成骨水泥浆料(C7P3、C8P2、C9P1)。

如图2中A所示，随着无机相含量的增多，骨水泥浆料逐渐变稠，当CPC:PEGS-OH为9:1的时候已经呈现粉末状态，失去液体的流动性，当CPC:PEGS-OH为8:2时具备可注射性但不会肆意流动，为最好的状态。

采用溴化钾压片法对上述浆料进行傅里叶变换红外光谱测试。从图2中B中可以看出，无机相的磷酸根基团与PEGS-OH的羟基、亚甲基、羰基以及醚键都有对应出峰。

通过旋转流变仪测试其流变性能随频率的变化，旋转流变仪使用过程包括以下步骤：

(a1)打开旋转流变仪(美国Thermo Hakke)，设定不同温度(37℃、25℃)并控温，频率设定在10Hz，应变设定在1.0％；

(b1)配比不同复合比例的骨水泥浆料(C7P3、C8P2、C9P1)；

(c1)将(b1)中骨水泥浆料装填于注射器的针筒内待用；

(d1)利用(c1)中注射器向20mm直径的钢制平行板上快速注射，并立即开始进行测试；

(e1)记录储存模量(G’)与损耗模量(G”)随时间的变化。

从图2中C中可以看出，损耗模量大于储存模量说明具有流动性，C8P2组储存模量与损耗模量相当，说明介于液体与固体之间，为适宜的可注射态。

采用上述相同的方法制备C7P3、C8P2、C9P1骨水泥浆料后，向各组中均加入56μL的交联剂LDI。搅拌均匀后，放入37℃烘箱过夜，令其固化。待骨水泥固化后，通过热天平对其进行热重分析。从图2中D中可以看出，骨水泥有机无机含量符合理论投料比，多出约6％的有机物质量为交联剂LDI。

结果表明，当CPC:PEGS-OH质量比为8:2时，骨水泥具有最适宜的可注射性。

实施例4.交联剂与催化剂含量的探究与表征

为了考察骨水泥的在压缩时的力学性能，本研究对不同交联剂含量的骨水泥进行了压缩性能的考察。

称取PEGS-OH 200mg以及CPC 800mg，混合均匀后，分别向上述浆料中加入交联剂LDI 56μL(L1.0组)、70μL(L1.25组)、84μL(L1.5组)。充分搅拌后，将其填入直径10mm，深6mm的聚四氟乙烯圆柱形阴模中。待其在37℃烘箱中过夜固化后，利用万能试验机对圆柱形骨水泥样品进行压缩测试。每组待测样品设五个平行样。压缩测试时压缩速率为10mm/min，直至力达到5000N，记录应力应变曲线。结果如图3所示。从图3中A可以看出，随交联剂含量的增加，骨水泥力学性能下降，这是由于多出的交联剂与周围水份发生反应形成多孔结构所致，但L1.25与L1.0差异不太大，兼具了力学性能的同时又得到了利于组织修复的多孔结构。图3中B为图3中A在前60％应变下的压缩曲线图，代表着骨水泥的初始模量，其趋势与图3中A一致。

另外，对上述方法制备的圆柱形骨水泥样品通过溴化钾压片法进行红外检测。从图3中C可以看到，在波数2200cm^-1处，未见异氰酸酯的红外出峰，说明异氰酸酯已反应完毕，形成了聚氨酯或者聚脲。

同样按上述方法制备PEGS-OH:CPC质量比为2:8下的L1.0、L1.25、L1.5三组骨水泥浆料。并在浆料搅匀后，立即放入控温37℃的旋转流变仪进行流变测试。图3中D中随时间的流变图说明，在37℃下，不添加催化剂，骨水泥固化时间约120min，且交联剂含量对其影响不大。

按照2-乙基己酸亚锡与PEGS-OH高分子质量比为0.1％、0.05％、0.001％在PEGS-OH高分子中加入催化剂2-乙基己酸亚锡，并混合均匀。随后按上述同样的方法制备C8P2L1.25骨水泥浆料。并在浆料搅匀后，立即放入控温37℃的旋转流变仪进行流变测试。图3中E说明，在37℃下，一旦有催化剂加入，骨水泥固化时间减少到了15～30min，固化时间明显缩短，考虑到催化剂添加量从0.01％到0.1％对固化时间的影响不算太大，以及催化剂可能带来的毒性，故选择0.01％为最佳量。

此外，采用旋转流变仪检测催化剂2-乙基己酸亚锡含量为0.1％、0.05％、0.001％的C8P2L1.25骨水泥浆料在25℃下的流变性能。从图3中F可以看到，即使有催化剂的加入，骨水泥仍能保持120min以上的浆料状态，不固化，操作期的延长，方便医生在手术过程中应对突发事件，有利于该骨水泥在市场上的拓展应用。

结果表明，当异氰酸酯物质的量为羟基物质的量的1.25倍，以及催化剂质量为骨水泥质量的0.01％时，骨水泥能在37℃下30min内固化，且具有良好的可注射性与力学性能。

实施例5.本发明骨水泥的细胞毒性、力学性能与表面形貌的表征

为了评价骨水泥的细胞相容性，本研究采用小鼠成纤维细胞(L929)与骨水泥共培养的方式对其在1d(天)、3d、7d的细胞毒性进行了考察。

称取含0.01％(质量比)催化剂T-9的PEGS-OH 200mg以及CPC 800mg，混合均匀后，向上述浆料中加入交联剂LDI 70μL(L1.25)。充分搅拌后，将其填入直径10mm，深6mm的聚四氟乙烯圆柱形阴模中。待其在37℃下充分固化后，利用紫外辐照灭菌，并接种上L929细胞，进行共培养。在第1d、3d、7d参照国标GB/T 16886.5-2017，对样品进行MTT实验，以检测骨水泥的细胞毒性。图4中A的细胞毒性结果说明，在T-9含量为骨水泥总质量0.01％的情况下，骨水泥细胞毒性为空白组的85％，大于70％的国标要求。且阴性对照与阳性对照复合理论结果。

按上述方法制备C8P2L1.25骨水泥圆柱形样品，并将该样品分别在37℃的环境下，浸泡在超纯水中1、3、6、12小时。随后烘干样品，利用万能试验机进行压缩测试。压缩测试时压缩速率为10mm/min，直至力达到5000N，记录应力应变曲线。从图4中B可以看到，在37℃时，骨水泥的力学性能随水化时间的延长而得到增强(初始模量由原本的5MPa随水化时间的延长而上升，水化12小时后，初始模量达到15MPa)，说明本发明的骨水泥在注射入人体以后会在人体内水的存在下进一步得到增强，实现CPC组分的水化。分别制备C8P2L1.0、C8P2L1.25、C8P2L1.5骨水泥圆柱形样品，通过万能试验机测试其循环压缩性能。压缩测试时压缩速率为10mm/min，直至应力达到12MPa，再以10mm/min的速率释放应力到0MPa，以此为一个循环，循环10次。图4中C表明，与现有的刚性骨水泥材料(PMMA与CPC)不同，本发明的骨水泥由于PEGS-OH组分为弹性高分子而具有优异的弹性，在10次循环压缩下，骨水泥具有较好的回复性能，这是刚性材料所不具备的。填充材料的刚性是导致二次骨折的原因，而弹性材料能在应力过载时通过形变储存应力，从而避免了因材料模量与组织不匹配而造成的二次骨折。

按上述方法制备C8P2L1.25骨水泥圆柱形样品，并将该样品通过导电胶粘于SEM样品台上，喷金处理后，利用扫描电子显微镜观察骨水泥的表面形貌。从图4中D则可以明显地看到，骨水泥表面的孔结构非常明显，这是由于多余的LDI与周围的水份反应形成聚脲，从而释放出CO₂所导致的。并且，骨水泥上能观察到非常明显的CPC存在，而在所形成的孔内，表面呈现较为光滑的状态，这是由于聚脲的形成发生在高分子内部所导致的结果。

由此可见，本发明的骨水泥具有合格的细胞毒性，可通过水化在体内实现力学性能的增强，并具有一定的弹性与不规则的孔结构，是一类良好的有利于组织修复的生物材料。

实施例6.本发明的骨水泥的反应温度以及抗溃散性能的表征

为了评价本发明的骨水泥固化时的反应温度，本研究采用红外热相机对骨水泥固化过程中反应温度和环境温度的变化进行了考察。同时，为表征骨水泥的抗溃散性能，本研究将固化后具有一定形状的骨水泥置于水流冲击下进行观察。

具体地，称取含0.01％(质量比)催化剂T-9的PEGS-OH 200mg以及CPC 800mg，混合均匀后，向上述浆料中加入交联剂LDI 70μL(L1.25)。充分搅拌后，将其填入5mL的注射器中，通过注射器将骨水泥挤出注射，并用红外热相机进行拍摄，记录注射后不同时间下骨水泥的温度变化。

图5中A示出利用红外热像仪考察骨水泥在固化时的反应温度，可以看出，本发明的骨水泥在刚挤出时，由于剪切力做功导致其温度略微高于周围环境温度(27.4℃：26.4℃)，而在10分钟后，其温度由于热交换，接近于周围环境温度(26.6℃：26.3℃)。

图5中B则反应了本发明的骨水泥在注射后10分钟内与环境的温度变化折线图。骨水泥在注射后温度一直呈下降趋势，向环境温度接近，且未观察到任何升温放热现象发生。而目前临床使用最多的PMMA骨水泥，其固化放热一直是一个难以解决的问题。其固化温度能高达70℃，在人体内甚至能将局部组织烫伤，而本发明的骨水泥固化不放热，具有更大的竞争力。

按上述同样的方法制备C8P2L1.25骨水泥，并通过注射器挤出，书写成“华理”字样。待其在37℃下固化后，将“华理”字样的骨水泥置于自来水龙头下用水冲击，以观察其抗溃散性能。图5中C说明本发明的骨水泥具有良好的成型性，能适应复杂的缺损。而图5中D，将图C中书写的文字经水冲洗，文字没有任何变形，说明PEGS-OH的存在为CPC组分提供了良好的内聚力，解决了CPC骨水泥的溃散问题。

结果表明，本发明的骨水泥具有良好的可注射性与生物相容性，其能实现体内的水化以增强力学性能，且固化不放热，遇水不溃散，是一种优良的组织修复材料。

实施例7.本发明的骨水泥显影效果的表征

为了评价骨水泥在体内的显影效果，以便用于临床脊柱修复手术，本研究采用X射线仪，将骨水泥置于X射线下进行拍摄。

按碘海醇质量占CPC与碘海醇总质量20％、30％、40％、50％、60％、70％的比例事先将CPC与碘海醇进行混合。随后，称取含0.01％(质量比)催化剂T-9的PEGS-OH 200mg以及CPC与碘海醇的混合物800mg，混合均匀后，向上述浆料中加入交联剂LDI 70μL(L1.25)。充分搅拌后，将其填入直径10mm，深6mm的聚四氟乙烯圆柱形阴模中。制备得到不同碘海醇含量的C8P2L1.25骨水泥圆柱形样品。将该样品放置于X射线仪下，考察其显影效果。图6中A的结果表明，在X射线下，随着碘海醇含量的增加，骨水泥显影越来越明显。

按上述方法配置碘海醇质量占CPC与碘海醇固相总质量50％、60％、70％的C8P2L1.25骨水泥浆料，并注射入制造了缺损的离体山羊脊柱中。将该注射了骨水泥的羊脊柱放置于X射线仪下，模拟考察骨水泥在体内的显影效果。从图6中B可以明显的看到，骨水泥能良好地填充入羊脊柱的缺损，并在X射线下具有明显的显影效果。显影衬度随碘海醇含量的增加而加深。

按上述方法配置碘海醇60％的C8P2L1.25骨水泥圆柱形样品(PEGS-OH/CPC+60％iohexol)，并与水化12h的C8P2L1.25骨水泥(PEGS-OH/CPC hydrated)、未水化的C8P2L1.25骨水泥(PEGS-OH/CPC)以及普通的CPC骨水泥(CPC)压缩性能进行比较。压缩测试时压缩速率为10mm/min，直至力达到5000N，记录应力应变曲线。图6中C则为不同状态下骨水泥的力学性能对照，说明碘海醇的加入对骨水泥的力学性能有了明显的提升。这是由于碘海醇不仅作为显影剂，还通过化学反应与骨水泥的有机相发生了共价结合而造成的。

图6中D为对含60％碘海醇的骨水泥流动性进行检测的结果，旋转流变仪使方法及参数设置如下：

(a1)打开旋转流变仪(美国Thermo Hakke)，设定不同温度为25℃并控温，频率设定在0.1～10Hz，应变设定在1.0％；

(b1)配制含60％碘海醇的骨水泥浆料(C8P2L1.25)；

(c1)将(b1)中骨水泥浆料装填于注射器的针筒内待用；

(e1)记录储存模量(G’)与损耗模量(G”)随频率的变化。

结果表明，浆料的损耗模量大于储存模量，处于流动态，且随频率的上升，有一定增稠效果。

图6中E为对含60％碘海醇的骨水泥的固化时间进行表征的结果。旋转流变仪使方法同上，参数设置为：温度37℃，频率0.1Hz，应变1.0％，记录储存模量(G’)与损耗模量(G”)随时间的变化。由结果可知，骨水泥固化时间约为21min，碘海醇的加入对其固化时间没有显著影响。

实施例8.本发明的骨水泥组织修复效果的表征

为了评价骨水泥的体内组织修复效果，本研究选用大鼠股骨缺损修复模型，对比PMMA与本发明骨水泥的促骨再生能力。

选用500g左右的SD大鼠，实施麻醉后，将其股骨远端处被毛，切开皮肤，露出股骨髁。使用直径5mm的圆形环钻在股骨侧面制造一个缺损后待用。按碘海醇质量占CPC与碘海醇总质量60％的比例事先将CPC与碘海醇进行混合。随后，称取含0.01％(质量比)催化剂T-9的PEGS-OH 200mg以及CPC与碘海醇的混合物800mg，混合均匀后，向浆料中加入交联剂LDI70μL(L1.25)。充分搅拌后，将其注入上述股骨缺损中，随后缝合皮肤。其中，PMMA选用市售产品。

3个月后，通过过量麻醉处死大鼠，取出股骨样本，4％多聚甲醛溶液固定一周，随后进行CT检测，并拍摄股骨照片。图7中A对比了PMMA与骨水泥的骨修复效果，相较于空白组的大量空缺，PMMA与骨水泥皆能成功填补缺损部位，PMMA由于生物惰性，难以降解，故独立于骨组织存在，鲜有组织长入；而骨水泥组由于其良好的生物相容性，已与骨组织融为一体具有良好的骨修复效果。图7中B对比了是否使用骨水泥对骨组织形态的影响，可以明显看到，未使用骨水泥的空白组在术后出现了明显的黑色病变，为骨坏死状态，而使用了PMMA或骨水泥后，未观察到骨坏死出现，证明骨水泥的力学性能可以在缺损部位提供良好的支撑，防止了骨坏死发生。图7中C、D、E为部分CT量化结果，无论是骨面积、骨体积比还是骨小梁分离度，骨水泥都能获得与PMMA相近且远优于空白组的促修复效果，注意的是，PMMA由于其衬度过高，在CT量化分析时会被认为成密致骨。

由上述结果可知，骨水泥在骨缺损部位提供了有效支撑作用，防止了骨坏死的发生。同时其良好的生物相容性还有利于骨组织再生，最终能获得不亚于PMMA骨修复效果。

综上所述，本发明的可注射、可生物降解的高强度多孔骨水泥具有良好的注射性能，操作期长，能在37℃环境下快速固化，且固化过程不放热。同时，该骨水泥固化后具有高强度和弹性，遇水不溃散，体内显影效果能满足临床手术需求。另外，该骨水泥还可以通过调节PEGS-OH与CPC的比例调控骨水泥浆料的流变性能，通过调节碘海醇调节固化后的力学性能。其中，PEGS-OH:CPC:碘海醇的比例为2:3.2:4.8的样品具有合适的注射性以及最高的模量。因此，本发明的骨水泥可用于不规则的骨缺损，起到填充支撑作用的同时促进骨再生，是一种具有临床应用前景的可注射骨水泥材料。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种可注射骨水泥组合物，其特征在于，所述可注射骨水泥组合物包含：

2.如权利要求1所述的可注射骨水泥组合物，其特征在于，所述聚酯高分子选自：聚癸二酸甘油酯、聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯、多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯PEGS-OH，

其中，式Ia中，m₁为1-20的整数，n₁为5-60的整数；

式Ib中，m₂为1-20的整数，n₂为5-60的整数。

3.如权利要求1所述的可注射骨水泥组合物，其特征在于，所述催化剂为有机金属类催化剂。

4.如权利要求1所述的可注射骨水泥组合物，其特征在于，所述磷酸钙盐选自磷酸四钙、磷酸二氢钙、磷酸三钙中的一种或两种以上的混合物；

所述显影剂选自：碘海醇、碘帕醇。

5.如权利要求1所述的可注射骨水泥组合物，其特征在于，所述可注射骨水泥组合物还包含交联剂，所述交联剂为二异氰酸酯类交联剂。

6.如权利要求5所述的可注射骨水泥组合物，其特征在于，所述聚酯高分子为多羟基聚乙二醇化聚癸二酸甘油酯PEGS-OH，交联剂中异氰酸酯基团的物质的量为PEGS-OH中羟基物质的量的0.5-2倍。

7.如权利要求1所述的可注射骨水泥组合物，其特征在于，其中，所述液相组分与固相组分的质量比为0.5:9.5-5:5。

8.一种可注射骨水泥，其特征在于，所述可注射骨水泥由权利要求1中所述的可注射骨水泥组合物的液相组分和固相组分以及任选的交联剂混合得到。

9.一种用于制备权利要求8所述的可注射骨水泥的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的液相组分；

(b)第二容器，以及位于所述容器内的固相组分。

(c)第三容器，以及位于所述容器内的交联剂。

10.权利要求8所述的可注射骨水泥的用途，其特征在于，用于：

(i)制备组织缺损填充材料；

(ii)制备引导组织再生的材料；

(iii)制备医疗美容材料；

(iv)3D打印基质材料；

(v)生长因子或药物的负载基质或载体。