JP5706691B2 - ハイドロゲルの製造方法，及びハイドロゲル - Google Patents

ハイドロゲルの製造方法，及びハイドロゲル Download PDF

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Description

本発明は，３次元網目構造のハイドロゲル，およびその製造方法などに関する。
従来，シーリングや癒着防止などの医療目的でポリマーを用いたゲルが使用されてきた。特表２０００−５０２３８０号公報には，多分岐ポリマーを混合して作製するゲルが開示されている。しかし，同公報で得られるゲルは，強度が弱く，膝軟骨，椎体，又は椎間板など生体内荷重部位へ適用することができない。
国際公開ＷＯ２００６／０１３６１２号パンフレットには，２種類のモノマーを混合するハイドロゲルの製造方法が開示されている。同パンフレットでは，２種類のモノマーを混合して多重網目構造を形成させることによりハイドロゲルを製造する。しかし，同パンフレットに開示されたハイドロゲルは，生体内荷重部位へ適用できるほど十分な強度ではない。
このように，現在，膝軟骨や椎間板（髄核）の手術に用いられているゲルは，強度が十分とはいえず，生体内に長期間導入して用いるとゲルの変性が起こる。そのため，荷重負荷がかかる部位へ使用すると定期的な手術が必要になるという問題があった。
特表２０００−５０２３８０号公報 国際公開ＷＯ２００６／０１３６１２号パンフレット
本発明は，高強度なハイドロゲル及びその製造方法を提供することを目的とする。
本発明は，分解速度の異なるハイドロゲルの製造方法を提供することを目的とする。
本発明は，溶液のｐＨ，溶液中のイオン強度，溶液中の緩衝液濃度を調整することで，高強度なハイドロゲルを製造することができるという知見に基づくものである。また本発明は，２種類の四分岐化合物を均一に分散させた後に，２種類の四分岐化合物を重合させることで，均一な高分子網目構造を有する高強度なハイドロゲルを製造することができるという知見に基づくものである。
本発明の第１の側面は，ハイドロゲルの製造方法に関する。本発明のハイドロゲルの製造方法は，第１の四分岐化合物と第１の緩衝液を含む第１の溶液と，第２の四分岐化合物と第２の緩衝液を含む第２の溶液とを混合する混合工程を含む。前記第１の四分岐化合物は，下記式（Ｉ）で表わされる。
Figure 0005706691
 前記式（Ｉ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一又は異なり，２５〜２５０の整数を示すものである。式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ１５−，−ＣＯ−Ｒ１５−，−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−，又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示す。ここで，Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
前記第２の四分岐化合物は，下記式（II）で表わされる。
Figure 0005706691
 前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，２０〜２５０の整数を示すものである。式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ２５−，−ＣＯ−Ｒ２５−，−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−，又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−を示す。ここで，Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ２６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ２７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
そして，第１の緩衝液のｐＨが６〜８，及び前記第１の緩衝液の濃度が２０〜２００ｍＭであり，前記第２の緩衝液のｐＨが５〜７．５，及び前記第２の緩衝液の濃度が２０〜２００ｍＭである。また第１の溶液のｐＨは，前記第２の溶液ｐＨよりも高いことが好ましい。このような２種類の四分岐化合物を用いることで，図１及び図２に示す反応が起こり，均一な網目構造を有するハイドロゲルを製造することができる。
上記のとおり，本発明の第１の四分岐化合物は，アミノ基を有する。酸性溶液中では，第１の四分岐化合物のアミノ基がカチオンの状態となりやすく，互いに反発しやすくなる（図２，図３Ａ）。そして，カチオン状態のアミノ基は，第２の四分子化合物の官能基（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ））と反応性が低下する（図２）。一方，第１の溶液のｐＨが高くなる（アルカリ性側に傾く）と，第１の四分岐化合物のアミノ基が−ＮＨ３ ＋から−ＮＨ２へと移りやすくなるので，第２の四分岐化合物との反応性が高くなる（図２）。しかし，第２の四分岐化合物は，溶液のｐＨが７以上になると，エステル結合が分解されやすくなり，第１の四分岐化合物との反応性が低下してくる。そのため，ゲル強度が弱くなってしまう。そのため，第１及び第２の緩衝液のｐＨを調節することで，第１及び第２の溶液のｐＨを調節でき，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物の反応速度を調節し，高強度なハイドロゲルを製造することができる。
また，後述する実施例で示されたとおり，緩衝液濃度が低すぎると，溶液中のｐＨ緩衝能が低下し，高強度のハイドロゲルを製造することができない。そして，緩衝液濃度が高すぎても，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物の混合を阻害するために，高強度のハイドロゲルを製造することができない。よって，後述する実施例で示されたとおり，緩衝液の濃度を２０ｍＭ〜２００ｍＭとすることで，均一構造を有する高強度なハイドロゲルを製造することができる。
よって，第１及び第２の緩衝液のｐＨ，溶液中の緩衝液濃度を上記のように調整することで，ハイドロゲルのゲル化までの時間（反応速度）を調整することができ，さらに均一構造を有する高強度なハイドロゲルを製造することができる。
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記第１の緩衝液は，リン酸緩衝液，またはリン酸緩衝生理食塩水のいずれか１つ又は２つ以上を含む。前記第２の緩衝液は，リン酸緩衝液，クエン酸・リン酸緩衝液，リン酸緩衝生理食塩水，またはクエン酸・リン酸緩衝生理食塩水のいずれか１つ又は２つ以上を含む。後述する実施例に示されたとおり，このような緩衝液を用いることで，均一構造を有する高強度なハイドロゲルを製造することができる。
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記混合工程後の混合溶液は，塩濃度が０〜１×１０２ｍＭがあげられ，１×１０−１〜１×１０２ｍＭであってもよい。混合溶液中の塩濃度が高いと，塩のアニオンが第１の四分岐化合物のカチオンと相互作用し，カチオン同士の反発が低減する。カチオン同士の反発が低減すると，２種類の四分岐化合物を均一に混合しにくくなる（図３Ａ，図３Ｂ）。２種類の四分岐化合物が均一に混合されていないと，均一な３次元構造を有するハイドロゲルが作製されず，ハイドロゲルの強度が弱くなる。後述する実施例でも示されたとおり，混合溶液中の塩濃度が高くなるとゲルの強度が弱くなる。よって，後述する実施例で示されたとおり，混合溶液中の塩濃度を上記濃度とすることで，塩のアニオンによる影響を受けず，２種類の四分岐化合物が均一に混合され，高強度のハイドロゲルを製造することができる。
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記第１の溶液は，前記ｐＨが６〜８で，前記第１の緩衝液が２０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸緩衝液である。前記第２の溶液は，前記ｐＨが５〜７．５で，前記第２の緩衝液が２０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸緩衝液，又は２０〜１００ｍＭのクエン酸・リン酸緩衝液のいずれかである。上記のとおり，第１の溶液のｐＨが高いと，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物が均一に混合しにくい。また，第２の溶液のｐＨが高すぎると，第２の四分岐化合物のエステルが分解されてしまう。第２の四分岐化合物のエステルが分解されると，四分岐化合物の末端の官能基が外れる。これにより，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物は結合することができなくなる。よって，作製されるハイドロゲルの強度が低下する。そのため，本発明のように，第１の溶液のｐＨを６〜８，第２の溶液のｐＨを５〜７．５とすることで，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物を効率よく均一に混合することができ，均一な３次元構造を有するハイドロゲルを製造することができる。また，後述する実施例に示されたとおり，緩衝液濃度が低すぎると，混合溶液中のｐＨ緩衝能が低い。一方，濃度が高すぎるとハイドロゲルの強度が低下する。そのため，第１及び第２の緩衝液濃度を，２０〜１００ｍＭとすることで，より高強度なハイドロゲルを効果的に製造することができる。
本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記混合工程後の混合溶液は，混合直後から３０秒後までの平均ｐＨは，６〜８である。上記のとおり，本発明の第１の四分岐化合物は，アミノ基を有する。アミノ基は，ｐＨが８以下の溶液中では９５％以上がカチオンの状態で存在し，互いに反発し合う（図３Ａ）。そして，カチオン性のアミノ基は，第２の四分岐化合物の官能基（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基）と反応しない（図２）。そのため，混合開始時から混合３０秒後の混合溶液のｐＨを６〜８としておくことで，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物とが局所的に結合することを防ぎ，溶液中に両化合物を均一に分散させることができる（図３Ａ）。その後，５％程度存在する非カチオン性のアミノ基（−ＮＨ２）がＮＨＳと反応するに伴って，第１の四分岐化合物のアミノ基の平衡状態が−ＮＨ３ ＋から−ＮＨ２へと移り，第２の四分岐化合物との反応が進行する（図２）。このように混合後の溶液のｐＨを調整することで，ＮＨＳと反応しうる非カチオン性のアミノ基の分率を５％程度に保つことにより，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物が不均一に混合すること効果的に防ぐことができ，最終的な反応率を上昇させ，均一な高強度なハイドロゲルを製造することができる。
本発明の第２の側面は，第１の四分岐化合物と第１の緩衝液とを含む第１の溶液と，第２の四分岐化合物と第２の緩衝液とを含む第２の溶液とを混合する混合工程を含む，製造方法で製造されたハイドロゲルに関する。前記第１の四分岐化合物は，下記式（Ｉ）で表わされる。
Figure 0005706691
 前記式（Ｉ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一又は異なり，２５〜２５０の整数を示すものである。式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ１５−，−ＣＯ−Ｒ１５−，−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−，又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示す。ここで，Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。前記第２の四分岐化合物は，前記一般式（II）で表わされる。
Figure 0005706691
 前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，２０〜２５０の整数を示すものである。式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ２５−，−ＣＯ−Ｒ２５−，−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−，又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−を示す。ここで，Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ２６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ２７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
前記第１の緩衝液のｐＨが６〜８，及び前記第１の緩衝液の濃度が２０〜２００ｍＭであり，前記第２の緩衝液のｐＨが５〜７．５，及び前記第２の緩衝液の濃度が２０〜２００ｍＭである。前記第１の溶液のｐＨは，前記第２の溶液ｐＨよりも高いほうが好ましい。
後述する実施例で示されたとおり，本発明の製造方法を用いて製造したハイドロゲルは，生体軟骨をしのぐ強度を有する。また，後述する実施例で示されたとおり，本発明のハイドロゲルは細胞毒性を示さない。よって，本発明のハイドロゲルによれば，骨，軟骨，若しくは椎間板の欠損部，又は骨，軟骨，若しくは椎間板の変性部の治療に効果的に用いることができる。
本発明の第３の側面は，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物とを，モル比０．８：１〜１．２：１で含むハイドロゲルに関する。前記第１の四分岐構造化合物は，下記一般式（Ｉ）で表わされる。
Figure 0005706691
 前記式（Ｉ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一又は異なり，２５〜２５０の整数を示すものである。式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ１５−，−ＣＯ−Ｒ１５−，−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−，又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示す。ここで，Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。前記第２の四分岐構造化合物は，前記一般式（II）で表わされる。
Figure 0005706691
 前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，２０〜２５０の整数を示すものである。式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ２５−，−ＣＯ−Ｒ２５−，−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−，又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−を示す。ここで，Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ２６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ２７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
前記ハイドロゲルの中性子散乱の散乱曲線は，オルンシュタイン−ゼルニケ（ＯＺ）関数でフィッティングされる。後述する実施例で示されたとおり,本発明のハイドロゲルの中性子散乱測定値群から得られる散乱曲線は，ＯＺ関数で表わされる曲線にフィッティングする。すなわち，本発明のハイドロゲルは，均一なゲル構造を有する。このような均一なゲル構造を有することで，ハイドロゲルは高強度になり，膝軟骨や椎体や椎間板など荷重負荷がかかる生体部位において好適に使用することができる。
本発明の第３の側面の好ましい態様は，圧縮破断強度が１０〜１２０ＭＰａである上記に記載のハイドロゲルである。後述する実施例で示されたとおり，本発明のハイドロゲルは，生体軟骨強度（１０ＭＰａ）を超える強度を有する。よって，膝軟骨や椎体など荷重負荷がかかる生体部位において好適に使用することができる。
本発明の第４の側面は，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物と第３の四分岐化合物とを，モル比０．３〜０．７：０〜０．６５：０〜０．６５で含むハイドロゲルに関する。本発明のハイドロゲルの第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物と第３の四分岐化合物のモル比は，モル比０．３〜０．７：０．１〜０．６５：０．１〜０．６５であってもよい。前記第１の四分岐化合物は，前記式（Ｉ）で表わされる。前記式（Ｉ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一又は異なり，５０〜６０の整数を示すものである。前記式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，同一又は異なるＣ１〜Ｃ７アルキレン基である。前記第２の四分岐化合物は，前記式（II）で表わされる。前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，４５〜５５の整数を示すものであり，前記式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は同一又は異なる−ＣＯ−Ｒ２５−（Ｒ２５はＣ１〜Ｃ７アルキレン基を示す）である。前記第３の四分岐化合物は，前記式（II）で表わされ，前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，４５〜５５整数を示すものであり，Ｒ２１〜Ｒ２４は同一又は異なるＣ１〜Ｃ７アルキレン基である。後述する実施例で示されたとおり，このようなモル比のハイドロゲルとすることで，高強度でありながら，分解速度を調整することができる。よって，本発明のハイドロゲルは，分解速度を調節することにより，ハイドロゲルを導入した部位での再生速度に合わせてハイドロゲルを分解させることができる。よって，骨，軟骨，若しくは椎間板の欠損部，骨，軟骨，若しくは椎間板の変性部に好適に使用することができる。
本発明によれば，高強度なハイドロゲル及びその製造方法を提供できる。
本発明は，分解速度の異なるハイドロゲルを提供することができる。
図１は，ハイドロゲルの構造を示す図面である。 図２は，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物の反応状態を示す図面である。 図３は，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物の溶液中での分布を概略的に示した図面である。図３Ａは，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物が溶液中で均一に混合している状態を示す図面である。図３Ｂは，塩アニオンによって，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物の溶液中の分布が不均一になることを示す図面である。 図４は，ＴＡＰＥＧとＴＮＰＥＧのモル比率（ｒ）を０．３３〜３．０の範囲で混合したゲルの圧縮弾性率（ｋＰａ）を示す図面に替わるグラフである。 図５は，ＴＡＰＥＧとＴＮＰＥＧのモル比率０．６〜１．４の範囲で混合したゲルの破断歪み（％）及び破断強度（ＭＰａ）を示す図面に替わるグラフである。 図６は，ハイドロゲルの圧縮破断強度測定の結果を示す図面に替わるグラフである。 図７は，ハイドロゲルの中性子散乱測定結果を示す図面に替わるグラフである。 図８は，ハイドロゲルを埋植したマウス背部の図面に替わる写真である。 図９は，ハイドロゲルを埋植したイヌ膝軟骨の図面に替わる写真である。図９Ａ〜図９Ｃは，手術後２か月後の埋植部を示す図面に替わる写真である。図９Ｄ〜図９Ｆは，手術後４か月後の埋植部を示す図面に替わる写真である。 図１０は，ハイドロゲルを埋植したブタ椎間板の図面に替わる写真である。図１０Ａは，ハイドロゲルを埋植中の図面に替わる写真である。図１０Ｂは，ハイドロゲルを埋植後の椎間板を示す図面に替わる写真である。 図１１は，ゲルの分解速度を示す図面に替わるグラフである。 図１２は，ハイドロゲル存在下でのＮＩＨ３Ｔ３,ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１,ＡＴＤＣ５の各細胞における細胞増殖活性を示す図面に替わるグラフである。図１２中，縦軸は，細胞の増殖活性（吸光度値）を示す。図１２Ａは，ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖活性結果を示す。図１２Ｂは，ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖活性結果を示す。図１２Ｃは，ＡＴＤＣ５細胞の増殖活性結果を示す。
本発明の第１の側面は，ハイドロゲルの製造方法に関する。本発明のハイドロゲルの製造方法は，第１の四分岐化合物と第１の緩衝液を含む第１の溶液と，第２の四分岐化合物と第２の緩衝液を含む第２の溶液とを混合する混合工程を含む。
ハイドロゲルとは，多量の水を含んだ親水性の高分子を含むゲル状の物質である。本発明のハイドロゲルは，２種類以上の四分岐化合物から製造される。
本発明の第１の四分岐化合物として，下記式（Ｉ）で表わされる化合物があげられる。
Figure 0005706691
式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ１５−，−ＣＯ−Ｒ１５−，−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−，又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示す。ここで，Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一でも又は異なってもよい。ｎ１１〜ｎ１４の値が近いほど，ハイドロゲルは均一な立体構造をとることができ，高強度となる。このため，高強度のハイドロゲルを得るためには，同一であることが好ましい。ｎ１１〜ｎ１４の値が高すぎるとハイドロゲルの強度が弱くなり，ｎ１１〜ｎ１４の値が低すぎると化合物の立体障害によりハイドロゲルが形成されにくい。そのため，ｎ１１〜ｎ１４は，２５〜２５０の整数値があげられ，３５〜１８０が好ましく，５０〜１１５がさらに好ましく，５０〜６０が特に好ましい。そして，本発明の第１の四分岐化合物の分子量としては，５×１０３〜５×１０４Ｄａがあげられ，７．５×１０３〜３×１０４Ｄａが好ましく，１×１０４〜２×１０４Ｄａがより好ましい。
上記式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，官能基と第１の四分岐化合物のコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ１１〜Ｒ１４は，それぞれ同一でも異なってもよいが，均一な立体構造を有する高強度なハイドロゲルを製造するためには同一であることが好ましい。Ｒ１１〜Ｒ１４は，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ１５−，−ＣＯ−Ｒ１５−，−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−，又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示す。ここで，Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
ここで，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基とは，分岐を有してもよい炭素数が１以上７以下のアルキレン基を意味し，直鎖Ｃ１−Ｃ７アルキレン基又は１つ又は２つ以上の分岐を有するＣ２−Ｃ７アルキレン基（分岐を含めた炭素数が２以上７以下）を意味する。Ｃ１−Ｃ７アルキレン基の例は，メチレン基，エチレン基，プロピレン基，ブチレン基である。Ｃ１−Ｃ７アルキレン基の例は，−ＣＨ2−，−(ＣＨ2)2−，−(ＣＨ2)3−，−ＣＨ(ＣＨ3)−，−(ＣＨ2)3−，−(ＣＨ(ＣＨ3))2−，−(ＣＨ2)2−ＣＨ(ＣＨ3)−，−(ＣＨ2)3−ＣＨ(ＣＨ3)−，−(ＣＨ2)2−ＣＨ(Ｃ2Ｈ5)−，−(ＣＨ2)6−，−(ＣＨ2)2−Ｃ(Ｃ2Ｈ5)2−，及び−(ＣＨ2)3Ｃ(ＣＨ3)2ＣＨ2−などが挙げられる。
「Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基」とは，鎖中に１個若しくは２個以上の二重結合を有する状又は分枝鎖状の炭素原子数２〜７個のアルケニレン基であり，例えば，前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の２〜５個を除いてできる二重結合を有する２価基が挙げられる。
なお，リンカー部と第１の四分岐化合物のコア部分との結合がエステル結合となるとき，第１の四分岐化合物は生体内において分解されやすくなる。それに対して，リンカー部位と第１の四分岐化合物のコア部分との結合がエーテル結合となるとき，第１の四分岐化合物は生体内において分解されにくくなる。すなわち，Ｒ１１〜Ｒ１４によって，第１の四分岐化合物の分解性が変化する。よって，このような第１の四分岐化合物を用いることで，製造されるハイドロゲルの分解速度を制御することも可能になる。分解速度を制御したハイドロゲルを製造する場合，上記式（Ｉ）で表わされる２種以上の化合物を用いてもよい。エーテル結合となるＲ１１〜Ｒ１４として，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基が好ましく，エチレン基，プロピレン基，及びブチレン基が好ましい。
なお，上記式（Ｉ）で示したように，本発明の第１の四分岐化合物の官能基はアミノ基である。本発明のハイドロゲルは，求電子性を有する第１の四分岐化合物の官能基と，求核性を有する第２の四分岐化合物の官能基とが化学反応により結合して高強度な立体構造になる。
上記式（Ｉ）で表わされる第１の四分岐化合物の第１の溶液中濃度は，１０ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬがあげられる。四分岐化合物濃度が，低すぎるとゲルの強度が弱くなり，四分岐化合物濃度が高すぎるとハイドロゲルの構造が不均一になりゲルの強度が弱くなる。そのため，２０〜４００ｍｇ／ｍＬが好ましく，５０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬがより好ましく，１００〜２００ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。
本発明の第２の四分岐化合物としては，下記式（II）で表わされる化合物があげられる。
Figure 0005706691
 前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一でも又は異なってもよい。ｎ２１〜ｎ２４の値は近いほど，ハイドロゲルは均一な立体構造をとることができ，高強度となるので好ましく，同一である方が好ましい。ｎ２１〜ｎ２４の値が高すぎるとハイドロゲルの強度が弱くなり，ｎ２１〜ｎ２４の値が低すぎると化合物の立体障害によりハイドロゲルが形成されにくい。そのため，ｎ２１〜ｎ２４は，５〜３００の整数値があげられ，２０〜２５０が好ましく，３０〜１８０がより好ましく，４５〜１１５がさらに好ましく，４５〜５５であればさらに好ましい。本発明の第２の四分岐化合物の分子量としては，５×１０３〜５×１０４Ｄａがあげられ，７．５×１０３〜３×１０４Ｄａが好ましく，１×１０４〜２×１０４Ｄａがより好ましい。
上記式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は，官能基と第２の四分岐化合物のコア部分をつなぐリンカー部位である。Ｒ２１〜Ｒ２４は，それぞれ同一でも異なってもよいが，均一な立体構造を有する高強度なハイドロゲルを製造するためには同一であることが好ましい。式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ２５−，−ＣＯ−Ｒ２５−，−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−，又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−を示す。ここで，Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す。Ｒ２６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示す。Ｒ２７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
なお，リンカー部位と第２の四分岐化合物のコア部分との結合がエステル結合となるとき，第２の四分岐化合物は生体内において分解されやすくなる。それに対して，リンカー部位と第２の四分岐化合物のコア部分との結合がエーテル結合となるとき，第２の四分岐化合物は生体内において分解されにくくなる。すなわち，Ｒ２１〜Ｒ２４によって，第２の四分岐化合物の分解性が変化する。よって，このような第２の四分岐化合物を用いることで，作製されるハイドロゲルの分解速度を制御することも可能になる。エーテル結合となるＲ２１〜Ｒ２４として，好ましくはＣ１−Ｃ７アルキレン基であり，Ｃ２−Ｃ６アルキレン基が好ましく，Ｃ３−Ｃ５アルキレン基がより好ましい。エステル結合となるＲ２１〜Ｒ２４としては，−ＣＯ−Ｒ２５（Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す）又は−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２５−であり，より好ましくは−ＣＯ−Ｒ２５（Ｒ２５はＣ３−Ｃ５アルキレン基を示す）である。
なお，上記式（II）で示したように，本発明の第２の四分岐化合物の官能基はＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基である。上記のとおり，本発明のハイドロゲルは，求電子性を有する第１の四分岐化合物の官能基と，求核性を有する第２の四分岐化合物の官能基とが化学反応により結合して高強度な立体構造になる。第２の四分岐化合物の官能基が同一であることによって，第１の四分岐化合物の官能基との反応性が均一になり，均一な立体構造を有する高強度のハイドロゲルを得やすくなる。
本発明の第２の溶液中に含まれる第２の四分岐化合物濃度は，１０ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬがあげられる。四分岐化合物濃度が，低すぎるとゲルの強度が弱くなり，四分岐化合物濃度が高すぎるとハイドロゲルの構造が不均一になりゲルの強度が弱くなる。そのため，２０〜４００ｍｇ／ｍＬが好ましく，５０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬがより好ましく，１００〜２００ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。
本発明のハイドロゲルの製造方法において第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物は，モル比０．８：１〜１．２：１で混合することができる。本発明の第１の四分岐化合物は，求電子性官能基（アミノ基）を有する。一方，本発明の第２の四分岐化合物は，求核性官能基（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）基）を有する。本発明の第１又は第２の四分岐化合物の官能基はそれぞれ１：１で反応しうる。よって，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物の混合モル比は１：１に近いほど好ましい。後述する実施例で示されたとおり，本発明のハイドロゲルの第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物との混合モル比は，０．９〜１：１．１〜１が好ましい。後述する実施例で示されたとおり，本発明の製造方法では，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物との混合モル比が０．８：１〜１．２：１であれば，軟骨（１０ＭＰａ）を超える強度のゲルを製造することができる。
本発明において，分解速度を制御するためのハイドロゲルの製造方法では，２又は３種以上の四分岐化合物を用いる。上記したとおり，本発明は，各末端に求核性官能基を有する四分岐化合物と各末端に求電子性官能基を有する四分岐化合物が０・８〜１．２の混合モル比で結合することで高強度なハイドロゲルを作ることができる。また，上記したとおり，四分岐化合物のコア部分とリンカー部位の結合がエステル結合であるとき，四分岐化合物の分解が進む。そして，四分岐化合物のコア部分リンカー部位の結合がエーテル結合であるとき，四分岐化合物は分解されず安定状態のままである。よって，各末端に求核性官能基を有する四分岐化合物と各末端に求電子性官能基を有する四分岐化合物が０．８〜１．２のモル比で混合すれば，求核性官能基を有する四分岐化合物又は求電子性官能基を有する四分岐化合物は，それぞれエステル結合又はエーテル結合を含むことができる。この場合，求核性官能基を有する四分岐化合物，又は求電子性官能基を有する四分岐化合物は，それぞれ２種類以上の四分岐化合物であってもよい。当業者であれば，適宜エステル結合又はエーテル結合を含む割合，求核官能基を有する四分岐化合物と求電子性官能基を有する四分岐化合物のどちらにどの結合を用いるかなど適宜調整することができる。
本発明の好ましい態様は，第１の溶液，又は第２の溶液に緩衝液を含み，それぞれの溶液のｐＨを調整する。本発明において緩衝液とは，溶液中のｐＨが大幅に変化することを妨げる能力（ｐＨ緩衝能）を有する液をいう。本発明の緩衝液としては，例えば，リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液，クエン酸・リン酸緩衝液，酢酸緩衝液，ホウ酸緩衝液，酒石酸緩衝液，トリス緩衝液，トリス塩酸緩衝液，リン酸緩衝生理食塩水，又はクエン酸・リン酸緩衝生理食塩水があげられる。本発明の製造方法において，第１の緩衝液と第２の緩衝液は，同じでも異なってもよい。また，第１の緩衝液及び第２の緩衝液は，それぞれ２種以上の緩衝液を混合して用いてもよい。本発明の緩衝液の濃度はそれぞれ２０ｍＭ〜２００ｍＭである。後述する実施例に示したとおり，緩衝液濃度が低い場合には，緩衝液のｐＨ緩衝能が低く，ｐＨの制御が適切に行われない。一方，緩衝液濃度が高すぎる場合には，緩衝液成分が，ハイドロゲル形成を妨げる。そのため，本発明の緩衝液の濃度としては，２０ｍＭ〜１００ｍＭが好ましい。本発明の緩衝液のｐＨは，酸性度及びアルカリ度が強すぎると，均一構造を有するハイドロゲルが形成されない。そのため，本発明の緩衝液のｐＨは，第１の緩衝液のｐＨが６〜８，第２の緩衝液のｐＨが５〜７．５である。
本発明の第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物は，混合工程で混合される。本発明の混合工程としては，第１の溶液に第２の溶液を添加して混合する工程，第２の溶液に第１の溶液を添加して混合する工程，第１の溶液と第２の溶液とを等モルずつ混合する工程があげられる。本発明の製造方法において，第１の溶液又は第２の溶液の添加速度，混合速度は特に限定されず，当業者であれば適宜調整することができる。
本発明の混合工程は，たとえば国際公開ＷＯ２００７／０８３５２２号パンフレットに開示されたような二液混合シリンジを用いて行うことができる。混合時の二液の温度は，特に限定されず，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物がそれぞれ溶解され，それぞれの液が流動性を有する状態の温度であればよい。温度が低すぎると化合物が溶解されにくく，または溶液の流動性が低くなり，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物が均一に混ざりにくい。一方，温度が高すぎると第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物の反応性を制御しにくくなる。そのため，本発明の製造工程において，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物を混合するときの溶液の温度としては，１℃〜１００℃が挙げられ，５℃〜５０℃が好ましく，１０℃〜３０℃がより好ましい。本発明の混合工程において，二液の温度は異なってもよいが，温度が同じである方が，二液が混合されやすいので好ましい。
本発明の製造方法において，混合工程によって得られる混合溶液は，塩濃度が０〜１×１０２ｍＭであることが好ましく，１×１０−１〜１×１０２であってもよい。後述する実施例で示されたとおり，混合溶液中の塩濃度が高くなると,混合溶液中のイオン強度が上昇する。イオン強度が上昇すると，正に帯電したアミノ基同士の静電反発が遮断されるため，四分岐化合物が均一に混合しなくなる（図３Ｂ）。そのため，混合溶液中の塩濃度が高くない方が好ましい。そのため，混合溶液の塩濃度は，１００ｍＭ以下であることが好ましく，５０ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
また，本発明の製造方法において，第２の四分岐化合物は加水分解しないよう安定に存在することが好ましい。このためには,混合前の第２の四分岐化合物の溶液のｐＨは５〜６.５であることが好ましい。また，混合後の溶液においては，不均一な混合を防ぐために，第１の四分岐化合物の９５〜９９％は第２の四分岐化合物との結合能を有するカチオン性のアミノ基の状態で存在することが好ましい。このような工程を経るためには，混合直後の溶液のｐＨは６〜８であることが望ましい。このため，本発明の製造方法において，第１の溶液のｐＨは，第２の溶液のｐＨよりも高い方が好ましい。溶液のｐＨは，市販のｐＨメーターを用いるなど公知の方法で測定することができる。このように,混合後のｐＨを６〜８に保ち，ＮＨＳと反応可能な非カチオン性のアミノ基を５％以下に保つことにより，均一で強固なハイドロゲルを製造することが可能になる。なお，本明細書において混合開始とは，第１の溶液と第２の溶液とが接したときからをいう。
このように混合後にｐＨを高くする方法としては，ｐＨが７．５以上で８．０以下の第１の緩衝液を含む第１の溶液と，ｐＨ５．０以上で６.５以下の第２の緩衝液を含む第２の溶液とを混合する方法があげられる。本発明の第１及び第２の溶液は，緩衝液を含むので，異なるｐＨの溶液によって急激にｐＨが変化することがない。当業者であれば，第１及び第２の溶液のそれぞれのｐＨは，第１及び第２の溶液に含まれる第１の緩衝液及び第２の緩衝液の種類，濃度等を適宜調整して，混合後のｐＨを変化させることができる。
本発明の第２の側面は，上記方法で製造されたハイドロゲルに関する。上記のとおり本発明の製造方法で製造されたハイドロゲルは，高強度であり，溶液のｐＨを調整することによって，ゲル化の時間を調整することができる。このように本発明のハイドロゲルは，ゲル化までの時間を調節することができるので，導入部に適合した形状を作りやすい。そのため，後述するように，本発明のハイドロゲルは，膝軟骨手術や椎間板手術など，生体において荷重負荷がかかる骨，軟骨，又は椎間板の整形外科的手術において，骨，軟骨，若しくは椎間板の欠損部補填物質，又は骨，軟骨，若しくは椎間板の変性部補填物質として好適に用いることができる。整形外科手術において，本発明のハイドロゲルは，上記した二液混合シリンジを用いて，患部に直接投与してもよいし，あらかじめ導入する部位の型に合わせてハイドロゲルを形成して形成後のハイドロゲルを患部に導入してもよい。
本発明の第３の側面は，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物とをモル比０．８：１〜１．２：１で含む，ハイドロゲルに関する。上述したとおり，第１の四分岐化合物の求電子性官能基と第２の四分岐化合物の求核性官能基は１：１で反応しうる。よって，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物のモル比は１：１に近いほど好ましい。後述する実施例で示されたとおり，本発明の第３の側面のハイドロゲルの第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物とのモル比は，０．８：１〜１．２：１であり，０．９〜１：１．１〜１が好ましい。後述する実施例で示されたとおり，本発明の製造方法では，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物との混合モル比が０．８：１〜１．２：１であれば，軟骨（１０ＭＰａ）を超える強度のゲルを製造することができる。このような製造方法で製造されるハイドロゲルは，ハイドロゲルの中性子散乱の散乱曲線が，オルシュタイン−ゼルニケ（ＯＺ）関数でフィッティングすることができる。これにより，ハイドロゲルの構造が均一であることを評価することができる。
“ハイドロゲルの中性子散乱の散乱曲線が，オルンシュタイン−ゼルニケ（ＯＺ）関数でフィッティングされる”とは，ハイドロゲルの中性子散乱測定値群から表わされる近似曲線が，「ガウス（Ｇａｕｓｓ）関数で表わされる理論曲線と，ＯＺ関数で表わされる理論曲線とを組み合わせた曲線」ではなく，「ＯＺ関数で表わされる理論曲線」に相関することをいう。ハイドロゲルの中性子散乱測定値群から表わされる近似曲線が，ＯＺ関数で表わされる理論曲線と相関することは，曲線フィッティングで評価することができる。具体的には，中性子散乱測定で得られた測定値群で表わされる近似曲線に，ＯＺ関数で表わされる理論曲線を，重なりが最も大きくなるように重ね合わせた時，重なりの程度（フィッティングの程度）が，８０％以上であればよく，より好ましくは９０％以上である。このように２本の線を重ね合わせて，フィッティングの程度を算出する方法は，公知であり，当業者であれば適宜行うことができる。
本発明の第３の側面の好ましい態様は，圧縮破断強度が１０ＭＰａ以上のハイドロゲルである。本発明のハイドロゲルの圧縮破断強度は，公知の測定機器を用いて，公知の方法で調べることができる。圧縮破断強度測定機器としては，たとえば，Ｉｎｓｔｒｏｎ社製の圧縮試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ ３３６５）があげられる。圧縮破断強度とは，ゲル試料に圧縮荷重を加えた時に，ゲル試料が破断する最大応力のことをさす。圧縮破断強度は，円柱状のゲル試料に対して，１軸荷重をかけた時の圧縮力をその軸に垂直な断面積で割った値で表わすことができる。本発明のハイドロゲルは，生体軟骨の圧縮破断強度を超える１０ＭＰａ以上であることが好ましい。このような圧縮破断強度を有するハイドロゲルを用いることで，高負荷がかかる骨欠損部や骨変形部に好適に用いることができる。
本発明のハイドロゲルは，高強度であり，ゲル化までの時間を調整できるので，生体内荷重部位である膝軟骨や椎間板などに，骨，軟骨，若しくは椎間板の欠損部，又は骨，軟骨，若しくは椎間板の変形部に好適に使用することができる。また，本発明のゲルは，溶液のｐＨを調整することで，ゲル化までの時間を調整することが可能である。また，国際公開ＷＯ２００７／０８３５２２号パンフレットに開示されたような二液混合シリンジを用いれば，オンサイト（ｏｎ ｓｉｔｅ）でのゲル注入が可能になる。よって，ゲルを本発明のハイドロゲルは，整形外科手術などにおいて新しい治療方法を提供することができる。現在の膝軟骨や椎間板を補強する手術では，皮膚を切開し，患部を開口してゲルを導入している。それに対して，本発明のハイドロゲルは，椎間板造影方法を用いたゲルの投与が可能になる。椎間板造影方法とは，後側方向より椎間板用針を用いてゲルを注入する方法である。このように，皮膚切開を行わず，椎間板髄核へゲルを注入することができるので，患者の体への負担を少ない低侵襲手術を行うことができる。このように本発明のハイドロゲルは，短期間的には椎間板の力学的特性を有し，長期間的には椎間変性に対する予防効果が期待される有用な新規物質である。
また，本発明のハイドロゲルは，椎間板切除術（ＬＯＶＥ法）又は内視鏡的髄核摘出術後にオンサイトでゲルを注入してもよい。本発明のハイドロゲルは，オンサイトで注入し，ゲル化までの時間を調整することができる。そのため，患部の形状に適合した状態でゲル化させるように，人為的に調整することができる。よって，術後の早期回復が期待でき，さらに術後の椎間板変性を予防することができる。
さらに，本発明のハイドロゲルは，ヘルニアモデルとしても使用することができる。ヘルニアモデルとしては，腰椎前側方アプローチで後腹膜の後方より侵入し椎体前面を展開し，１８Ｇ（ゲージ）又は２０Ｇ（ゲージ）針と１０ｍＬシリンジを用いて髄核を吸引後，ゲルを注入し経過を観察することができる。
すなわち，本発明は，第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物とをモル比０．８：１〜１．２：１で含むハイドロゲルを用いる骨，軟骨，又は椎間板の欠損部治療方法；第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物とをモル比０．８：１〜１．２：１で含むハイドロゲルを用いる骨，軟骨，又は椎間板の変形部治療方法をも提供する。本発明のハイドロゲルは，短期間的には椎間板の力学的特性を有し，長期間的には椎間変性に対する予防効果が期待される。
［実施例１］
〈四分岐化合物の作製〉
２つの四分岐化合物ＴＡＰＥＧ（テトラアミン−ポリエチレングリコール）とＴＮＰＥＧ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ））は，末端にヒドロキシル基を有するＴＨＰＥＧ（テトラヒドロキシル−ポリエチレングリコール）をそれぞれアミノ化，スクシンイミジル化することによって得た。
ＴＨＰＥＧの作製
開始剤のペンタエリスリトール（０．４５７２ｍｍｏｌ，６２．３ｍｇ）をＤＭＳＯ／ＴＨＦ（ｖ／ｖ＝３：２）５０ｍＬの混合溶媒に溶解させ，メタル化剤にカリウムナフレン（０．４１５７ｍｍｏｌ，１．２４ｍｇ）を用い，エチレンオキシド（２００ｍｍｏｌ，１０．０ｍＬ）を加え，約２日間，Ａｒ存在下，６０℃で加熱攪拌した。反応終了後，ジエチルエーテルに再沈殿させ，濾過により沈殿物を取り出した。さらに，ジエチルエーテルで３回洗浄し，得られた白色固体を減圧乾燥することにより，２０ｋのＴＨＰＥＧを得た。
ＴＡＰＥＧの作製
ＴＨＰＥＧ（０．１９３５ｍｍｏｌ，３．８７ｇ，１．０ｅｑｕｉｖ）をベンゼンに溶解させ，凍結乾燥した後，ＴＨＦ６２ｍＬに溶解させ，トリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．１９３５ｍｍｏｌ，３．８７ｇ，１．０ｅｑｕｉｖ）を加えた。別のナスフラスコにＴＨＦ３１ｍＬとメタンスルホニルクロライド（ＭｓＣｌ）（０．１９３５ｍｍｏｌ，３．８７ｇ，１．０ｅｑｕｉｖ）を加え，氷浴につけた。ＴＨＰＥＧ，ＴＥＡのＴＨＦ溶液にＭｓＣｌのＴＨＦ溶液を約１分間かけて滴下し，３０分間氷浴中で攪拌した後，室温で１時間半攪拌した。反応終了後，ジエチルエーテルに再沈殿させ，濾過により沈殿物を取り出した。さらに，ジエチルエーテルで３回洗浄し，得られた白色固体をナスフラスコに移し，２５％アンモニア水２５０ｍＬを加え，４日間攪拌した。反応終了後，エバポレーターにより溶媒を減圧留去し，水を外液に２，３回透析を行い，凍結乾燥することにより，白色固体のＴＡＰＥＧを得た。作製したＴＡＰＥＧの化学式は式（Ｉａ）に示した。式（Ｉａ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，ＴＡＰＥＧの分子量が約１０，０００（１０ｋＤａ）のとき５０〜６０であり，分子量が約２０，０００（２０ｋＤａ）のとき１００〜１１５であった。
Figure 0005706691
ＴＮＰＥＧの作製
ＴＨＰＥＧ（０．２３９５ｍｍｏｌ，４．７９ｇ，１．０ｅｑｕｉｖ）をＴＨＦに溶解させ，０．７ｍｏｌ／ｌグルタル酸／ＴＨＦ溶液（４．７９０ｍｍｏｌ，６．８５ｍＬ，２０ｅｑｕｉｖ）を加え，Ａｒ存在下，６時間攪拌した。反応終了後，２−プロパノールに滴下し，遠心分離機に３回かけた。得られた白色固体は３００ｍＬナスフラスコに移し，エバポレーターにより溶媒を減圧留去した。残渣をベンゼンに溶解させ，不溶物を濾過によって取り除いた。得られた濾液を凍結乾燥により溶媒を除去することで，末端がカルボキシル基で修飾された白色固体のＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを得た。このＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（０．２１６５ｍｍｏｌ，４．３３ｇ，１．０ｅｑｕｉｖ）をＴＨＦに溶解させ，Ｎ−ハイドロスクシンイミド（２．５８９ｍｍｏｌ，０．２９９ｇ，１２ｅｑｕｉｖ），Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルスクシンイミド（１．７３２ｍｍｏｌ，０．２６９ｍＬ，８．０ｅｑｕｉｖ）を加え，３時間，４０℃で加熱攪拌した。反応終了後，エバポレーターにより溶媒を減圧留去した。クロロホルムに溶解させ，飽和食塩水で３回抽出し，クロロホルム層を取り出した。さらに，硫酸マグネシウムで脱水，濾過を行った後，エバポレーターにより溶媒を減圧留去した。得られた残渣のベンゼン凍結乾燥を行い，白色固体のＴＮＰＥＧを得た。作製したＴＮＰＥＧの化学式は式（IIａ）に示した。式（IIａ）中，ｎ２１〜ｎ２４は，ＴＮＰＥＧの分子量が約１０，０００（１０ｋ）のとき４５〜５５であり，分子量が約２０，０００（２０ｋ）のとき９０〜１１５であった。

Figure 0005706691
［実施例２］
〈ゲルの強度に与える溶媒種の効果〉
ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）（１０ｋ），ＴＮＰＥＧ（IIａ）（１０ｋ）をそれぞれ１００ｍｇ／ｍＬの濃度で純水，リン酸緩衝液（ｐＨ７．４），リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），生理食塩水に溶解させた。調整後，得られた溶液を速やかに二液混合し，３７℃でゲル化させ，ゲル化後のゲル強度を測定した。強度としては，直径１５ｍｍ，高さ７．５ｍｍの円筒状サンプルに直径２ｍｍの進入棒を進入させ，９８％まで進入させた際の圧力を用いた。
結果，すべてのゲルは１００％の変形においても破断せず，高い変形に対しても破断しないでゲルであるといえる。ゲル化速度に関しては，純水中が最も早く数十秒でゲル化した。その後，リン酸緩衝液，ＰＢＳと続き，生理食塩水は最も遅く５分程度であった。ゲル強度の結果を表１に示した。
Figure 0005706691
本発明において反応速度は極めて重要である。反応が早すぎると，四分岐化合物同士が均一に混合される前に溶液の粘度が高くなってしまい均一な網目構造を得ることができない。一方，遅すぎると分解性の活性エステル部位が加水分解してしまうために，最終的な反応率が低くなる。よって，純水中で作製したものは，混合前にゲルが形成されてしまうために，網目構造が不均一になり，強度が減少していると考えられる。すなわち，純水中で作製したものは，混合前にゲルが形成されてしまうために，網目構造が不均一になり，強度が減少していると考えられる。一方で，生理食塩水中で作製したものは，反応中に活性エステル部位が加水分解したために，反応率が低下し，強度が減少していると考えられる。そのために，中間的な反応速度を有するリン酸緩衝液，ＰＢＳにおいては反応率が高く，力学強度も上昇したと考えられる。
［実施例３，比較例１］
〈ゲル化強度及びゲル化時間に与える溶媒ｐＨの効果〉
ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）（１０ｋ），ＴＮＰＥＧ（IIａ）（１０ｋ）をそれぞれ１００ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝液（ｐＨ６．０，７．４（以上，実施例３），９．０（比較例１）），クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０，７．４（以上，実施例３），９．０（比較例１））に溶解させた。調整後，得られた溶液を速やかに二液混合し，３７℃でゲル化させ，ゲル化後のゲル強度を測定した。強度としては，直径１５ｍｍ，高さ７．５ｍｍの円筒状サンプルに直径２ｍｍの進入棒を侵入させ，９８％まで侵入させた際の圧力を用いた。
結果，すべてのゲルは，１００％の変形においても破断しなかった。ゲル化速度はｐＨが高いほど早く，ｐＨ９．０では１分以内，ｐＨ６．０では５分程度でゲル化した。その結果を表２に示した。
Figure 0005706691
この結果，中間的な反応速度を示すｐＨの溶媒を使用したときに，高い強度を持つハイドロゲルが得られた。ｐＨ７．４付近が最適値であると考えられる。また，クエン酸緩衝液はリン酸緩衝液と比べて，ｐＨ７付近での緩衝能力が低く，ｐＨ制御がうまくいかなかったために，このような結果になったと考えられる。よって，ｐＨ７付近で高い緩衝能力を有するリン酸緩衝液が最も適していると考えられる。
［実施例４］
〈ゲル強度及びゲル化時間に与える緩衝液濃度の効果〉
ＴＡＰＥＧ（１０ｋ），ＴＮＰＥＧ（１０ｋ）をそれぞれ１００ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，２ｍＭ，２０ｍＭ，１００ｍＭ，２００ｍＭ），クエン酸緩衝液（ｐＨ７．４，２ｍＭ，２０ｍＭ，１００ｍＭ，２００ｍＭ）に溶解させた。調整後，得られた溶液を速やかに二液混合し，３７℃でゲル化させ，ゲル化後のゲル強度を測定した。強度としては，１５ｍｍ，高さ７．５ｍｍの円筒状サンプルに直径２ｍｍの侵入棒を侵入させ，９８％まで侵入させた際の圧力を用いた。
結果，すべてのゲルは１００％の変形においても破断しなかった。ゲル化速度は緩衝液濃度が高いほど低かったが，すべてのゲルは１〜２分程度でゲル化した。その結果を表３に示した。
Figure 0005706691
その結果，反応速度はあまり変化しなかったことにより，緩衝液濃度は反応速度には大きく影響しないと考えられる。しかしながら，ゲル強度は緩衝液濃度が２０ｍＭから１００ｍＭのあたりで高い値を示した。緩衝液濃度が低い場合いは，緩衝液の緩衝限界が低くｐＨの制御ができなかったために，ゲル化速度が速くなり，それにより均一な構造が得られなかったと考えられる。すなわち，四分岐化合物が１００ｍｇ／ｍＬの場合，緩衝液の濃度を２０ｍＭ以上にすれば，溶液を適切なｐＨに保つことができる。それに対して，高濃度側で強度が低下した理由は，四分岐化合物が均一に混合されなかったためであると考えられる。ｐＨ７付近においては，アミノ基はプロトン化し正電荷を帯びているために，アミノ基同士は反発する。この反発によって，ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）の混合が促進されると考えられる。緩衝液濃度が高い場合には，イオン強度が高いため，アミノ基同士の反発が遮断され，混合状態が均一にならなかったために，均一な構造になったと考えられる。
［実施例５］
〈ゲル強度及びゲル化時間に与える塩濃度の効果〉
ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）（１０ｋ），ＴＮＰＥＧ（IIａ）（１０ｋ）をそれぞれ１００ｍｇ／ｍＬの濃度で塩化ナトリウム濃度，０ｍＭ，５０ｍＭ，１００ｍＭ，２００ｍＭ溶解させた水溶液及びリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，２０ｍＭ）に溶解させた。調整後，得られた溶液を速やかに二液混合し，３７℃でゲル化させ，ゲル化後のゲル強度を測定した。強度としては，直径１５ｍｍ，高さ７．５ｍｍの円筒状サンプルに直径２ｍｍの侵入棒を侵入させ，９８％まで侵入させた際の圧力を用いた。
結果，すべてのゲルは１００％の変形においても破断しなかった。ゲル化速度はイオン強度が高いほど低かった。また，純水のものは反応速度が高く１分以内でゲル化した。それに対して，リン酸緩衝液を用いたものは，１〜２分程度でゲル化した。その結果を表４に示した。
Figure 0005706691
純水を用いた場合，リン酸緩衝液を用いた場合，共に，塩濃度が高い場合にはゲルの強度が減少した。これは，イオン強度の上昇により，アミノ基同士の静電反発が遮断され四分岐化合物同士の混合状態が不均一になったためであると考えられる。
［実施例６］
〈ゲル作製溶媒の最適化実験〉
ＴＡＰＧＥ（Ｉａ）（１０ｋ），ＴＮＰＥＧ（IIａ）（１０ｋ）の両方をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，５０ｍＭ），及びＴＡＰＥＧ（Ｉａ）のみをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，５０ｍＭ），ＴＮＰＥＧ（IIａ）のみをクエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ５．８，５．０ｍＭ）にそれぞれ１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。調整後，得られた溶液を速やかに二液混合し，３７℃でゲル化した。ゲル形状は直径１５ｍｍ，高さ７．５ｍｍの円筒形に成形し，ゲルの圧縮弾性率を測定した。
結果，ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，５０ｍＭ），ＴＮＰＥＧ（IIａ）をクエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ５．８，５０ｍＭ）に溶解させて作製した方が，ゲルの弾性率は高かった。その結果を表５に示した。
Figure 0005706691
ｐＨが高い状態では，ＴＮＰＥＧ（IIａ）の活性エステル部位は加水分解し，反応に寄与しなくなる。ＴＮＰＥＧ溶液のｐＨのみを下げたことにより，加水分解を抑制することが可能となり最終的な反応率が向上したと考えられる。
［実施例７］
〈ＴＡＰＥＧとＰＮＰＥＧの混合比率検討〉
ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）（分子量約１０ｋ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）（分子量約１０ｋ）（前駆物質の全量＝６００ｍｇ）をそれぞれｐＨ７．２およびｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸緩衝液（１０ｍＬ）に一定全量溶解した。ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）のモル比率を０．３３〜３．０の範囲になるように，等液量の各化合物溶液を室温下で混合し，ゲル化は２時間，直径１５ｍｍ，高さ７．５ｍｍの円筒形上に成形した。圧縮試験は機械的試験装置（Instron Corporation製（INSTRON３３６５）を用いて，速度０．７５ｍｍ／ｍｉｎで行った。結果を図４及び図５に示した。
図４は，ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）のモル比率（ｒ）を０．３３〜３．０の範囲で混合したゲルの圧縮弾性率（ｋＰａ）を示す図面に替わるグラフである。図５は，ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）のモル比率０．６〜１．４の範囲で混合したゲルの破断歪み（％）及び破断強度（ＭＰａ）を示す図面に替わるグラフである。図４及び図５の結果より，圧縮弾性率および破断強度の最大値は，ｒ＝１．０のときであり，等モルの四分岐化合物が互いに反応していることを示された。そして１成分が過剰又は不足するとゲルが弱くなることが示された。さらに圧縮弾性率の値は，成分が過剰又は不足であっても，ｒが逆数同士ではほぼ同一であり，圧縮弾性率は同様に減少した。このことは，網目構造が類似していることを示唆している。このような化学量論性および対称性が高いゲル化プロセスは前例がなく，ハイドロゲルの均一な網目構造を形成していると考えられる。四分岐化合物の最適量および最適比が，均一な網目構造を形成するのに必要であることが示された。
図４及び図５より，ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）のモル比率が０．６〜１．４の間では，破断強度０．８ＭＰａ以上のゲルが得られることが示された（図５）。そして，モル比０．８〜１．２では圧縮弾性率が約４０ｋＰａ（図４）となり，破断強度が約１ＭＰａ（図５）と高強度になり，生体材料としても好適に使用されうることが示された。よって，本発明のハイドロゲルは，ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）とをモル比０．６：１〜１．４：１，好ましくは０．８：１〜１．２：１の範囲で有することにより，均一な網目構造を有するハイドロゲルが形成されることが示された。
［実施例８］
〈圧縮破断強度の測定〉
分子量２０，０００のＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）を１６０ｍｇ／ｍＬの濃度で１００ｍＭのリン酸緩衝溶液，クエン酸・リン酸緩衝溶液に溶解させ，二液を混合した結果，１分程度で無色・透明なハイドロゲルが形成された。直径７ｍｍ，高さ３．５ｍｍの円筒状のサンプルを作製し，圧縮試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ）を用いて圧縮強度試験を行った。その結果を図６に示した。図６の縦軸は応力［ＭＰａ］をしめし，横軸はハイドロゲルの歪み［％］を示す。この結果，このハイドロゲルは，９０％以上の歪みを与えても破断することなく，また，１００ＭＰａを超える応力にも耐えることができた。この値は，従来のハイドロゲルの強度はおろか，生体軟骨の破断応力である１０ＭＰａをはるかに凌駕する値であり，関節軟骨を始め，高負荷のかかる椎間板などへの応用も可能であると考えられる。
［実施例９］
〈中性子散乱測定による網目構造の均一性解析〉
分子量１０，０００のＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）を様々な濃度で５０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４），クエン酸・リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．８）に溶解させ，二液を混合することでハイドロゲルを作製した。得られたハイドロゲルに対して，構造における不均一性を解析するために，中性子散乱測定を行った。その結果を図７に示した。
図７中，「ガウス＋ＯＺ」は，通常のハイドロゲル（例：ＰＴＨＦ（Ｕ１０２））の散乱曲線を示し，ポリマーの熱揺らぎに起因するオルンシュタイン−ゼルニケ（ＯＺ）関数と系内に存在する不均一性からの過剰散乱を表すガウス（Ｇａｕｓｓ）関数の足し合わせで書くことができる。図７中「ガウス」は，ゲルが不均一のときの過剰散乱を表すガウス関数曲線を示す。図７中「ＯＺ」は，ゲルが均一なときの中性子散乱を表すＯＺ関数曲線を表す。図７中「ハイドロゲル」は，本発明のハイドロゲルを示す。図７に示したように，通常のハイドロゲルにおいて，ガウス関数の寄与は小角領域における曲線の立ち上がりに見られる。それに対して本発明のハイドロゲルから得られた錯乱関数はガウス関数の寄与は一切存在せず，ＯＺ関数のみで記述することが可能であった。このような実験結果は，これまでに得られたいかなるハイドロゲルにおいても観察されておらず，当ハイドロゲルがこれまでにない非常に均一な構造を有していることを強く支持するものである。この著しい均一性は，ハイドロゲルの有する高い機械的強度に強く寄与していると考えられる。
［実施例１０］
〈マウス背部への皮下埋植試験〉
分子量２０，０００のＴＡＰＥＧ（Ｉａ）とＴＮＰＥＧ（IIａ）を１６０ｍｇ／ｍＬの濃度で１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４），クエン酸・リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．８）に溶解させた。得られた溶液を二液混合シリンジにロードし，Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部へ注入した。その後，マウス皮下において，ゲル化が起こったことを触診により確認した。埋食後１ヶ月でマウスを解剖し，埋植部の組織観察を行った。埋植部の写真を図８に示した。結果，一切の炎症反応や毒性反応は見られなかった。
［実施例１１］
〈イヌ膝軟骨への埋植試験〉
関節軟骨疾患への適用の試験をするために，イヌ膝軟骨に直径３ｍｍの欠損を作製し，二液混合シリンジを用いてオンサイトでゲルを作製した。手術後２ヶ月・４ヶ月で解剖し，埋植部を観察した。その結果を図９に示した。図９Ａ〜図９Ｃは，手術後２か月後の埋植部を示し，図９Ｄ〜図９Ｆは，手術後４か月後の埋植部を示す。結果，患部にハイドロゲルは残っており，炎症反応や毒性反応は見られなかった。
［実施例１２］
〈ブタ椎間板への埋植試験〉
椎間板用充填剤としての適用の試験をするために，ブタの椎体より髄核を抽出し，その空隙に二液混合シリンジを用いてハイドロゲルを作製した。椎体内の髄核を除いた空隙部においてハイドロゲルの作製は可能であった。その結果を図１０に示した。図１０Ａは，埋植中の写真を示し，図１０Ｂは，埋植後の椎間板の写真を示す。
［実施例１３］
〈ゲルの分解速度の検討〉
ゲルの分解速度を検討するために，ＴＡＰＥＧ（Ｉａ）（下記式（Ｉａ）），ＴＮＰＥＧ（IIａ）（下記式（IIａ）），及びＴＮＰＥＧ（IIｂ）（下記式（IIｂ））の３種類の四分岐化合物を用いた。
式（Ｉａ）中，ｎ１１〜ｎ１４は５０〜６０であり，分子量は約１０，０００（１０ｋ）であった。
Figure 0005706691
式（IIａ）中，ｎ２１〜ｎ２４は４５〜５５であり，分子量は約１０，０００（１０ｋ）であった。
Figure 0005706691
式（IIｂ）中，ｎ２１〜ｎ２４は４５〜５５であり，分子量は約１０，０００（１０ｋ）であった。
Figure 0005706691
上記３種類の化合物をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，２０ｍＭ）に溶解して６０ｍｇ／ｍＬとした。それぞれの組み合わせと混合の比率を表６に示した。下記表６の比率にしたがって，それぞれを混合し，ゲルを作製した。
Figure 0005706691
作製した３種類のゲルの力学的強度の比較結果を表７に示した。
Figure 0005706691
表５の結果からわかるように，３種類のハイドロゲルは，破断歪み，破断強度，圧縮弾性率はほぼ同じであった。これらのゲルを用いて，ゲルの分解速度の検討を行った。作製した３種類のゲルを，３７℃の疑似体液中に静置し，ゲルの膨潤率を測定した。その結果を図１１に示した。縦軸は膨潤率，横軸は静置した日数を示す。膨潤率が高ければ高いほど，ゲルが分解されたことを示す。図１１に示されたとおり，パターン２はある程度膨潤後，膨潤率は一定であった。すなわちほとんど分解されないことが示された。パターン１は日数の経過とともに膨潤率が上昇し，ゲルが分解されることが示され，図１１には示していないが２か月後には完全に分解された。パターン３はパターン１とパターン２の中間的な挙動を示した。このことから，ＴＮＰＥＧ（IIａ）ＴＮＰＥＧ（IIｂ）の混合比を変えることで，ゲルの分解速度をコントロールできることが示された。
［実施例１４］
〈ハイドロゲル存在下での細胞増殖活性の検討〉
マウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３，マウス軟骨前駆細胞株ＡＴＤＣ５，マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１をそれぞれ１２ｗｅｌｌプレートに４０，０００個／２ｍＬ／ｗｅｌｌで播種し，２４時間培養した。なお，培養培地は，Dulbecco’s Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ）(Ｓｉｇｍａ社製)に，１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地を用いた。各種細胞を２４時間培養後，培養培地を新鮮な培地に交換した。その後，培養液の０．２５％ｖｏｌ/ｖｏｌ,０．５％ｖｏｌ/ｖｏｌ,１．０％ｖｏｌ/ｖｏｌに相当するハイドロゲルをトランスウェルを使用して培養液中に浸漬し，２４時間培養した。なお，ハイドロゲルは，表６中，パターン２の組み合わせのものを用いた。各細胞に関して，Cell counting kit-8（Ｗａｋｏ社製）を使用して，細胞増殖活性を測定した。細胞増殖活性は，各ｗｅｌｌの吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定することで調べた。その結果を図１２に示した。
図１２は，ハイドロゲル存在下でのＮＩＨ３Ｔ３,ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１,ＡＴＤＣ５の各細胞における細胞増殖活性（ｎ＝６）を示す図面に替わるグラフである。図１２中縦軸は，細胞の増殖活性（吸光度測定値）を示す。図１２Ａは，ＮＩＨ３Ｔ３の結果を示す。図１２Ｂは，ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の結果を示す。図１２Ｃは，ＡＴＤＣ５の結果を示す。その結果，ゲル非存在下とゲル存在下を比較しても，各細胞の何れにおいても細胞増殖活性には大きな変化はなかった。また，ゲルの量を増加させても細胞増殖活性には，大きな変化はなかった。従って，ハイドロゲルは様々な細胞に対して細胞毒性を示さないことが明らかとなった。よって，本発明のハイドロゲルは生体材料として好適に使用することができることが示された。
本発明は，医療産業において広く利用されうる。

Claims (10)

  1. ハイドロゲルの製造方法であって，
    第１の四分岐化合物と第１の緩衝液を含む第１の溶液と，第２の四分岐化合物と第２の緩衝液を含む第２の溶液とを混合する混合工程とを含み，
    前記第１の四分岐化合物は，
    下記式（Ｉ）で表わされ，
    Figure 0005706691
     前記式（Ｉ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一又は異なり，２５〜２５０の整数を示すものであり，
    前記式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，それぞれ同一又は異なり，
    Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ１５−，−ＣＯ−Ｒ１５−，−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−，又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示し，
    ここで，Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し，
    Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し，
    Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し，
    前記第２の四分岐化合物は，
    下記式（II）で表わされ，
    Figure 0005706691
     前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，２０〜２５０の整数を示すものであり，
    前記式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ２５−，−ＣＯ−Ｒ２５−，−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−，又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−を示し，
    ここで，Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し，
    Ｒ２６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し，
    Ｒ２７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し，
    前記第１の緩衝液は，ｐＨが６〜８，及び濃度が２０〜２００ｍＭであり，
    前記第２の緩衝液は，ｐＨが５〜７．５，及び濃度が２０〜２００ｍＭである，
    ハイドロゲルの製造方法。
  2. 前記Ｒ１１〜Ｒ１４は，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基であり，
    前記Ｒ２１〜Ｒ２４は，−ＣＯ−Ｒ２５−（Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示す）である，
    請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記Ｒ１１〜Ｒ１４は，Ｃ２−Ｃ４アルキレン基であり，
    前記Ｒ２１〜Ｒ２４は，−ＣＯ−Ｒ２５−（Ｒ２５はＣ２−Ｃ４アルキレン基を示す）である，
    請求項１に記載の製造方法。
  4. 前記第１の緩衝液は，
    リン酸緩衝液，又はリン酸緩衝生理食塩水のいずれか１つ又は２つを含み，
    前記第２の緩衝液は，
    リン酸緩衝液，クエン酸・リン酸緩衝液，リン酸緩衝生理食塩水,又はクエン酸・リン酸緩衝生理食塩水のいずれか１つ又は２つ以上を含む，
    請求項１に記載の製造方法。
  5. 前記混合工程後の混合溶液は，
    塩濃度が１×１０−１〜１×１０２ｍＭである，
    請求項１に記載の製造方法。
  6. 前記第１の緩衝液は，
    前記ｐＨが６〜８である２０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸緩衝液であり，
    前記第２の緩衝液は，
    前記ｐＨが５〜７．５である２０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸緩衝液，又は前記ｐＨが５〜７．５である２０〜１００ｍＭのクエン酸・リン酸緩衝液のいずれかである，
    請求項１に記載の製造方法。
  7. 第１の四分岐化合物と第１の緩衝液を含む第１の溶液と，第２の四分岐化合物と第２の緩衝液とを含む第２の溶液とを混合する混合工程を含み，
    前記第１の四分岐化合物は，
    下記式（Ｉ）で表わされ，
    Figure 0005706691
     前記式（Ｉ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一又は異なり，２５〜２５０の整数を示すものであり，
    前記式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，それぞれ同一又は異なり，
    Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ１５−，−ＣＯ−Ｒ１５−，−Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−，又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示し，
    ここで，Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し，
    Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し，
    Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し，
    前記第２の四分岐化合物は，
    下記式（II）で表わされ，
    Figure 0005706691
     前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，２０〜２５０の整数を示すものであり，
    前記式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ２５−，−ＣＯ−Ｒ２５−，−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−，又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−を示し，
    ここで，Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し，
    Ｒ２６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し，
    Ｒ２７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し，
    前記第１の緩衝液は，
    ｐＨが６〜８，及び濃度が２０〜２００ｍＭであり，
    前記第２の緩衝液は，
    ｐＨが５〜７．５，及び濃度が２０〜２００ｍＭである，
    ハイドロゲルの製造方法により製造されたハイドロゲル。
  8. 第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物とを，モル比０．８：１〜１．２：１で含む
    ハイドロゲルであって，
    前記第１の四分岐構造化合物は，
    下記式（Ｉ）で表わされ，
    Figure 0005706691
     前記式（Ｉ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一又は異なり，２５〜２５０の整数を示すものであり，
    前記式（Ｉ）中，Ｒ１１〜Ｒ１４は，それぞれ同一又は異なり，
    Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ１５−，−ＣＯ−Ｒ１５−，
    −Ｒ１６−Ｏ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ１６−ＣＯ−Ｒ１７−，又は−Ｒ１６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ１７−を示し，
    ここで，Ｒ１５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し，
    Ｒ１６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し，
    Ｒ１７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し，
    前記第２の四分岐構造化合物は，
    前記式（II）で表わされ，
    Figure 0005706691
     前記式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，２０〜２５０の整数を示すものであり，
    前記式（II）中，Ｒ２１〜Ｒ２４は，それぞれ同一又は異なり，Ｃ１−Ｃ７アルキレン基，Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基，−ＮＨ−Ｒ２５−，−ＣＯ−Ｒ２５−，−Ｒ２６−Ｏ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＮＨ−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−Ｒ２７−，−Ｒ２６−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒ１７−，−Ｒ２６−ＣＯ−Ｒ２７−，又は−Ｒ２６−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２７−を示し，
    ここで，Ｒ２５はＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し，
    Ｒ２６はＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し，
    Ｒ２７はＣ１−Ｃ５アルキレン基を示し，
    前記ハイドロゲルの中性子散乱の散乱曲線が，オルンシュタイン−ゼルニケ関数でフィッティングされる，
    ハイドロゲル。
  9. 圧縮破断強度が１０〜１２０ＭＰａである，
    請求項８に記載のハイドロゲル。
  10. 第１の四分岐化合物と第２の四分岐化合物と第３の四分岐化合物とを，モル比０．３〜０．７：０．１〜０．６５：０．１〜０．６５で含むハイドロゲルであって，
    前記第１の四分岐化合物は，下記式（Ｉ）で表わされ，
    Figure 0005706691
     式（Ｉ）中，ｎ１１〜ｎ１４は，それぞれ同一又は異なり，５０〜６０の整数を示すものであり，Ｒ１１〜Ｒ１４は，同一又は異なるＣ１〜Ｃ７アルキレン基であり，
    前記第２の四分岐化合物は，下記式（II）で表わされ，
    Figure 0005706691
     式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，４５〜５５を示すものであり，Ｒ２１〜Ｒ２４は，同一又は異なる−ＣＯ−Ｒ２５−（Ｒ２５はＣ１〜Ｃ７アルキレン基を示す）である，
    前記第３の四分岐化合物は，前記式（II）で表わされ，
    式（II）中，ｎ２１〜ｎ２４は，それぞれ同一又は異なり，４５〜５５の整数を示すものであり，Ｒ２１〜Ｒ２４は，同一又は異なるＣ１−Ｃ７アルキレン基である，
    ハイドロゲル。
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