KR20210069556A

KR20210069556A - 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물 및 이를 이용한 하이드로겔의 제조방법

Info

Publication number: KR20210069556A
Application number: KR1020200130196A
Authority: KR
Inventors: 김청수; 구희범; 최현수; 권순민; 박창희
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2020-10-08
Publication date: 2021-06-11

Abstract

본 발명은 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물, 이를 가교하여 제조된 하이드로겔 및 상기 하이드로겔을 이용한 필러에 관한 것으로, 비독성 폴리머인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 백본으로 구성되는, 4-암 PEG 폴리머의 말단 그룹을 각각 아지드(azide) 및 DBCO로 변형시킨 4-암 폴리에틸렌 글리콜-N₃ 및 4-암 폴리에틸렌 글리콜-디벤조사이클로옥틴을 유효성분으로 포함하는 것으로, 독성이 거의 없으며, 생체 내 안정성이 우수하다. 또한, 간단한 혼합에 의해 촉매 사용 없이도 클릭 화학을 통해 안정한 하이드로겔을 형성할 수 있으며, 이를 이용하여 제조되는 하이드로겔은 성대 질환 치료하기 위한 시술에 필러로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물 및 이를 이용한 하이드로겔의 제조방법{COMPOSITION HYDROGEL FOR TREATING VOCAL CORD AND MANUFACTURING METHED FOR HYDROGEL USING THE SAME}

본 발명은 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물 및 이를 이용한 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.

후두의 주요 기능 중 하나는 성대(vocal fold)의 접촉에 의한 발성 및 기도를 보호하는 것이다. 성대 마비(vocal cord paralysis), 부전 마비(paresis), 성대위축(vocal fold atrophy) 및 노인성 후두(presbylaynx)와 같은 여러 병리학적 상태는 성문 부전증(glottal insufficiency)을 유발한다. 음성 치료법(Voice therapy)은 중증 성문 부전증을 치료하기 위한 첫 단계이지만, 대부분의 경우 추가적인 치료가 필요하다.

성대주입술(Injection laryngoplasty)은 가장 잘 이용되는 치료방법으로 1911년 브루닝(Bruening)이 파라핀을 성대에 주입하면서 처음 소개되었다. 성대주입술은 후두주입성형술을 포함하는 개념이고, 성대조직 내에 공간을 채울 수 있는 물질을 주입하여 성대 폐쇄 부전을 교정하고 성대 진동을 복원하여 음성을 개선하며 호흡의 안정을 확보하고 음식 및 침의 흡인을 막는 치료방법이다. 성대 주입술은 수술적 치료방법과 비교하여 비용과 안전성에서 이점이 있어 자주 활용된다. 성대 주입술을 위한 다양한 유형의 물질들이 소개되어왔으나, 통상적으로 일시적 성대주입 물질로는 히알루론 산(Hyaluronic acid)이 사용되고 있으며, 영구적 성대주입 물질로는 칼슘 하이드록시아파타이트(Calcium Hydroxyapatite; CaHA)가 사용되고 있다. 다양한 연구들이 12개월 이상 CaHA을 주입하는 경우 성문 부전의 치료에 효과가 있음을 보고하고 있으나, CaHA의 이동, 염증 발생 및 초기 부피 감소와 같은 몇 가지 합병증이 발생하는 것으로 알려져 있다.

성대 확장이 성공적으로 이루어지기 위해서는, 주입 물질이 이상적으로 다음과 같은 특성을 가져야 한다. 첫째, 주사기를 이용하여 주입 가능해야 하고, 둘째, 목적하는 기간 동안 부피를 안정적으로 유지해야 하며, 셋째, 인체에 무독성이어야 하고, 넷째, 적은 양으로도 성대 확장을 달성할 수 있어야 한다.

하이드로겔(Hydrogel)은 상당한 양의 수분을 함유하는 폴리머 덩어리로 그 형태를 유지할 수 있다. 지금까지, 다양한 종류의 하이드로겔이 개발되어 왔으며, 조직 공학 및 약물 전달과 같은 생화학 분야에 적용되어 왔다. 생체에 적합하고 열감응성으로 겔화가 가능한 플로로닉 F127(Pluronic F127) 하이드로겔이 필러로 사용되었다(Kwon et al., Vocal Fold Augmentation with Injectable Polycaprolactone Microspheres/Pluronic F127 Hydrogel: Long-Term In Vivo Study for the Treatment of Glottal Insufficiency, 2014). 그러나 이 경우 겔화에 사용되는 폴리머를 25 wt% 정도로 많은 양을 사용해야 한다.

이에, 본 발명은 제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm PEG-제1 작용기) 및 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm PEG-제2 작용기)을 포함하는 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 성대 질환 치료용 주사제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 4개의 암(arm)에 아자이드가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-암 PEG-N₃) 및 4개의 암에 디벤조사이클로옥틴이 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-암 PEG-DBCO) 분말을 증류수에 각각 용해시키는 단계; 및 증류수에 용해된 4-암 PEG-N₃ 용액 및 4-암 PEG-DBCO 용액을 혼합하는 단계;를 포함하는 성대 질환 치료용 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm PEG-제1 작용기) 및 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm PEG-제2 작용기)을 포함하는 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 제1 작용기는 아자이드(Azide; N₃) 또는 테트라진(Tetrazine)이고, 상기 제2 작용기는 사이클로옥틴(Cyclooctyne; OCT), 모노플루오리네이티드 사이클로옥틴(monofluorinated cyclooctyne; MOFO), 디플루오리네이티드 사이클로옥틴(Difluorinated cyclooctyne; DIFO), 사이클로옥텐(Cyclooctene), 디벤조사이클로옥틴(Dibenzocyclooctyne; DBCO), 및 바이사이클로노닌(Bicyclononyne; BCN) 중 어느 하나인 것일 수 있으며, 바람직하게 상기 제1 작용기는 아자이드이고, 상기 제2 작용기는 디벤조사이클로옥틴일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜은 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 암(arm)에 아자이드가 도입된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜은 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 암(arm)에 디벤조사이클로옥틴이 도입된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜과 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜을 1 : 2 내지 2 : 1의 중량비로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성대 질환은 성대마비(vocal cord paralysis), 성대위축(vocal fold atrophy), 성대반흔(vocal fold scar), 성대구증(sulcus vocalis) 및 성문폐쇄부전(glottis incompetence)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 성대 질환 치료용 주사제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 주사제는 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 제1 작용기와 제2 작용기의 가교결합에 의하여 하이드로겔을 형성하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 4개의 암(arm)에 아자이드가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-암 PEG-N₃) 및 4개의 암에 디벤조사이클로옥틴이 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-암 PEG-DBCO) 분말을 증류수에 각각 용해시키는 단계; 및 증류수에 용해된 4-암 PEG-N₃ 용액 및 4-암 PEG-DBCO 용액을 혼합하는 단계;를 포함하는 성대 질환 치료용 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO 분말은 1 : 2 내지 2 : 1의 중량비인 것일 수 있다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 하이드로겔 조성물의 하이드로겔화 공정 및 기계적 특성을 시험하고, 이를 동물 모델을 이용하여 생체적합성과 성대 질환 치료 효과를 확인하였다.

본 발명에 따른 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물은 비독성 폴리머인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 백본으로 구성되는, 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 말단 그룹을 상호 가교 반응이 가능한 제1 작용기와 제2 작용기로 변형시킨 것을 유효성분으로 포함하는 것으로, 독성이 거의 없으며, 생체 내 안정성이 우수하다. 또한, 간단한 혼합에 의하여 촉매를 사용하지 않고도 안정한 하이드로겔을 형성할 수 있으며, 이를 이용하여 제조되는 하이드로겔은 성대 질환 치료하기 위한 시술에 주사제로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO를 이용한 PEG 하이드로겔의 제조과정을 개략도로 나타낸 것이다.
도 2는 증류수에 녹인 4-암 PEG-N₃및 4-암 PEG-DBCO와 이들을 혼합하여 제조한 PEG 하이드로겔의 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO의 처리 후 NIH3T3 세포의 세포 생존력을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 2% PEG 하이드로겔의 시간 및 진동 주파수에 따른 유동학적 특성 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 4% PEG 하이드로겔의 시간 및 진동 주파수에 따른 유동학적 특성 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 생체 내 안정성을 시험하기 위해 마우스에 PEG 하이드로겔 및 CaHA-CMC를 피하 주사한 후 1 개월 뒤 주입 부위를 관찰한 사진이다.
도 7은 마우스에 PEG 하이드로겔 및 CaHA를 피하 주사한 후 1 개월 뒤 PEG 하이드로겔과 CaHA의 부피를 비교한 그래프이다.
도 8은 마우스에 피하 주사된 PEG 하이드로겔의 H&E 염색 이미지를 도시한 것이다.
도 9는 생체 내 안정성을 시험하기 위해 래트에 PEG 하이드로겔 및 CaHA-CMC를 후두에 주사한 후 1 개월 뒤 주입 부위를 관찰한 사진이다.
도 10은 래트의 성대에 주사된 PEG 하이드로겔의 H&E 염색 이미지를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 PEG 하이드로겔을 토끼 모델의 성대에 주입한 후, 이에 대한 치료 효과를 내시경 검사를 통하여 확인한 사진이다.
도 12는 토끼 모델의 성대 주름에 PEG 하이드로겔을 주입한 후, 성대 사이의 거리를 측정한 사진이다.
도 13은 토끼 모델의 성대에 본 발명에 따른 PEG 하이드로겔과 및 CaHA를 각각 주입하고, 성대가 진동할 때 성대가 중심에서 벌어지는 거리인 최대(Max) 진폭과 최소(Min) 진폭을 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따른 PEG 하이드로겔을 주입한 토끼 모델의 후두를 적출하여 표본을 제작한 후 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 CaHA를 주입한 토끼 모델의 후두를 적출하여 표본을 제작한 후 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm PEG-제1 작용기) 및 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm PEG-제2 작용기)을 포함하는 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물을 제공한다.

상기 제1 작용기는 아자이드(Azide; N₃)이고, 상기 제2 작용기는 디벤조사이클로옥틴(Dibenzocyclooctyne; DBCO)인 것일 수 있다.

상기 아자이드는 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 암(arm)에 도입될 수 있다.

상기 디벤조사이클로옥틴은 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 암(arm)에 도입될 수 있다.

상기 조성물은 제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜과 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜이 1 : 2 내지 2 : 1의 중량비로 포함될 수 있다.

상기 성대 질환은 성대마비(vocal cord paralysis), 성대위축(vocal fold atrophy), 성대반흔(vocal fold scar), 성대구증(sulcus vocalis) 및 성문폐쇄부전(glottis incompetence)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물은 각 성분 별로 분말형태로 보관되다, 사용 전 증류수와 같은 액체에 용해시킨 후 혼합하여 주사제로 활용할 수 있다.

상기 주사제는 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 제1 작용기와 제2 작용기의 가교결합에 의하여 하이드로겔을 형성할 수 있다.

상기 성대 질환 치료용 주사제는 주사 등의 장치에 의하여 생체 내로 주입될 수 있다.

상기 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO 분말은 1 : 2 내지 2 : 1의 중량비로 이용될 수 있다.

본 발명자들은 실시예를 통하여 본 발명에 따른 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물 및 이를 이용하여 제조된 하이드로겔이 독성이 거의 없으며(실시예 2), 생체 내에서 안정하고(실시예 4 및 5), 성대 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있음(실시예 6)을 실험적으로 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 4-암 PEG-N ₃ , 4-암 PEG-DBCO 및 이를 이용한 하이드로겔의 합성

1-1. 재료

4-암 PEG-NH₂ (MW : 10kDa)는 레이산 바이오(Laysan Bio, 미국)로부터 구입하였다. DBCO-PEG5-NHS 및 아지드-PEG4-NHS는 클릭 케미스트리 툴즈(Click Chemistry Tools, 미국)에서 구입하였다. N,N-디아이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine; DIPEA)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 미국)에서 구입하였다. 99.9% 에틸 알코올은 덕산(한국)에서 구입하였다. 칼슘 하이드록시 아파타이트(CaHA) 마이크로스피어 (35 ± 10μm)와 카르복시 메틸셀룰로오스 (CMC) 겔을 담체로 함유하는 필러인 래디어스(Radiesse, Merz North America, inc, 미국)가 대조군으로 사용되었다.

1-2. 4-암 PEG-N ₃ 및 4-암 PEG-DBCO의 합성

하이드로겔을 제조하기 위한 조성 물질로 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO를 제조하였다.

4-암 PEG-NH₂의 아민기를 아민-NHS 커플링 반응을 이용하여 DBCO-PEG5-NHS 에스터(DBCO-PEG5-NHS ester)의 NHS 에스터기와 결합시켰다. 우선 4-암 PEG-NH₂ 20 mg을 증류수 1 ml에 용해시키고 DBCO-PEG5-NHS 에스터 8.33 mg을 에틸 알코올 1 ml에 용해시켰다. 두 용액을 6.96 ㎕의 DIPEA로 혼합하였다. 혼합된 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반한 다음, 4-암 PEG-DBCO를 수득하였다. 미반응 DBCO-PEG5-NHS 에스터를 증류수, 50% 에탄올 및 100% 에탄올에 하루 동안 투석하여 제거하였다. 미반응 DBCO-PEG5-NHS 에스터가 제거된 용액을 분말을 수득할 때까지 완전히 동결 건조하였다.

1-3. PEG 하이드로겔 합성

성대 확장을 위한 충전제로 이용될 수 있는 하이드로겔을 제조하기 위한 상기 실시예 1-2에 따라 제조된 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO를 혼합하여 가교시킴으로써, 하이드로겔(이하, PEG 하이드로겔)을 제조하였다. 도 1에 본 발명에 따른 PEG 하이드로겔의 제조과정을 개략도로 나타내었다.

하이드로겔의 특성을 살펴보기 위해, 폴리머 농도가 2 및 4 wt%가 되도록 2종류의 PEG 하이드로겔(이하, 각각 2% PEG 하이드로겔 및 4% PEG 하이드로겔)을 제조하였다.

겔화 전의 두 폴리머(4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO)는 물에 용해될 수 있다. 4-암 PEG-DBCO 및 4-암 PEG-N₃ 분말을 wt%에 따라 각각 증류수에 용해시켰다. 제조된 4-암 PEG-DBCO 용액과 4-암 PEG-N₃ 용액을 혼합하였다. 혼합 용액은 5 분 내로 PEG-하이드로겔로 변화하였다. 도 2에 도시한 바와 같이 두 용액을 간단히 혼합하면 하이드로겔이 형성되는 것을 확인할 수 있었다.

1-4. 4-암 PEG-N ₃ 및 4-암 PEG-DBCO의 혼합 중량비에 따른 하이드로겔 합성

상기 실시예 1-2.에 따라 제조된 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO의 혼합 중량비에 따른 PEG 하이드로겔의 형성 여부를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

4-암 PEG-N₃ : 4-암 PEG-DBCO (중량비)	겔화
1 : 7	X
1 : 3	X
1 : 2	O
1 : 1	O
2 : 1	O
3 : 1	X
7 : 1	X

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO은 1 : 2 내지 2 : 1의 중량비의 범위에서 혼합될 경우 PEG 하이드로겔의 형성할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 세포 생존력 시험

상기 실시예 1-2에 따라 제조된 4-암 PEG-N₃ 또는 4-암 PEG-DBCO의 생체 내 독성 여부를 확인하기 위하여 세포 생존력 시험을 수행하였다.

세포 생존력을 측정하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 수행하였다. 세포 생존력 시험에는 NIH3T3 세포를 사용하였다. 웰당 8 × 10³ 개의 세포를 96-웰 플레이트로 옮기고 24 시간 동안 배양하였다. DPBS (pH 7.4)를 사용하여 세척한 후, 배양 배지에 용해된 4-암 PEG-N₃ 또는 4-암 PEG-DBCO를 24 시간 동안 세포에 처리하였다. 세척 후, MTT 용액을 플레이트의 모든 세포에 처리하고 2 시간 동안 배양하였다. MTT 용액을 제거한 후, DMSO 100 ㎕를 세포에 부었다. 시너지 H1 하이브리드 다중 모드 판독기(synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader, Biotek Instruments, Inc., USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 이로부터 세포 생존력을 계산하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 4-암 PEG-N₃ 또는 4-암 PEG-DBCO 모두 NIH3T3 섬유 아세포를 사용한 세포 생존력 테스트에서 10mg/ml까지 독성을 거의 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예３： PEG 하이드로겔의 겔화 및 유동학적 특성 분석

변형-제어 레오미터(Strain-controlled rheometer, ARES G2, TA Instruments)를 사용하여 상기 실시예 1-3에 따라 제조된 PEG-하이드로겔의 유동학적 특성을 분석하였다.

G'(저장 모듈러스) 및 G"(손실 모듈러스)는 1%의 전단 변형률 및 25℃의 온도에서 0.1 내지 100 Hz의 진동 주파수 스위프(oscillatory frequency sweeps)로 측정되었다. 1 N으로 축력(axial force)을 설정하고 직경 25mm의 평행판을 사용하였다. 측정에 사용된 샘플의 부피는 250 ul이다. 그 결과를 도 4(2% PEG 하이드로겔) 및 도 5(4% PEG 하이드로겔)에 나타내었다.

유동학적 특성 분석 결과, 2% PEG 하이드로겔(도 4)과 4% PEG 하이드로겔(도 5)의 G′및 G″ 값은 일정하게 나타났다, G'(저장 모듈러스)는 진동 주파수 및 시간이 증가함에 따라 모든 범위에서 G"(손실 모듈러스)보다 높게 나타났다. 이는 2% 및 4% PEG 하이드로겔이 모두 성공적으로 형성되었음을 의미한다.

4% PEG 하이드로겔은 2% PEG 하이드로겔보다 높은 G′값을 나타내었으며, 이는 2% PEG 하이드로겔보다 4% PEG 하이드로겔이 더 단단한 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 따라서, 추가적인 동물 시험에서는 안정성이 더 높은 4% PEG 하이드로겔을 사용하였다.

실시예 4: 마우스를 이용한 하이드로겔의 생체 안정성 시험

상기 실시예 1-3에 따라 제조된 PEG 하이드로겔의 생체 안정성에 대하여 평가하였다. 대조군으로 칼슘 하이드록실아파타이트-카르복시메틸 셀룰로오스(calcium hydroxylapatite-carboxymethyl cellulose; CaHA)를 사용하였다.

체중 22 내지 24 g의 총 28마리의 수컷 C57BL/6 마우스(다물 사이언스, 한국)를 사용하여 시험을 진행하였다. 시험 시작 전까지 12/12 시간의 명/암 주기에서 마우스를 23 내지 25℃의 실온 및 40 내지 60%의 상대 습도로 유지하고 표준 펠렛 식이 방법으로 사육하였다. 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.

PEG 하이드로겔 및 CaHA 처리를 위해 28마리의 마우스를 각각 14마리씩 두 그룹으로 나누었다. 4% PEG 하이드로겔 200 μl를 26G 바늘을 이용하여 마우스의 등쪽으로 피하 주사(n = 14)하였다. 대조군인 CaHA는 4% PEG 하이드로겔과 동일한 양으로 주사(n = 14)되었다. 주사 후 1 개월 뒤(4% PEG post 1 mon), 마우스를 경추 탈구로 안락사시켰다. 육안 관찰을 위하여 주사 부위를 제모하였다. 이어서, 조직학적 검사를 위하여 주사 부위를 분리하였다. 잘라낸 부위에서의 하이드로겔과 조직을 관찰한 후 H&E 염색 후 분석하였다. 그 결과를 도 6 내지 8에 도시하였다.

도 6은 생체 내 안정성을 시험하기 위해 마우스에 PEG 하이드로겔 및 CaHA를 피하 주사한 후 1 개월 뒤 주입 부위를 관찰한 사진이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 피하 주사된 PEG 하이드로겔은 둥근 모양을 형성하고 주위에 퍼지지 않은 것으로 나타났지만, CaHA는 평평하게 퍼져서 여러 덩어리로 분리되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

도 7은 마우스에 PEG 하이드로겔 및 CaHA를 피하 주사한 후 1 개월 뒤 PEG 하이드로겔과 CaHA의 부피를 비교한 그래프이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 피하 주사 후 1 개월 뒤 측정된 PEG 하이드로겔의 부피는 215 ± 13.2 ul로 CaHA의 165 ± 11.9 ul보다 유의(P <0.05)하게 더 큰 것으로 나타났다.

도 8은 마우스에 피하 주사된 PEG 하이드로겔의 H & E 염색 이미지를 도시한 것이다. 도 8에서 붉은색 화살표와 *은 주사 부위를 표시한 것이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 피하 주사 시 PEG 하이드로겔 주위에 이물 반응은 나타나지 않는 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 본 발명에 따른 PEG 하이드로겔은 피하 주사 시 생체 안정성이 우수함을 확인할 수 있다.

실시예 5: 래트를 이용한 하이드로겔의 생체 안정성 시험

상기 실시예 1-3에 따라 제조된 PEG 하이드로겔의 생체 안정성을 대하여 평가하였다.

후두 부위에서의 하이드로겔의 안정성을 평가하기 위해 4마리의 스프라그-둘리 래트(Sprague-Dawley rat)를 사용하였다. 시험 시작 전까지 12/12 시간의 명/암 주기에서 마우스를 23 내지 25℃의 실온 및 40 내지 60%의 상대 습도로 유지하고 표준 펠렛 식이 방법으로 사육하였다. 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.

케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride, 100 mg/kg) 및 자일라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride, 10 mg/kg)를 복강 내 주사하여 모든 래트를 마취시켰다. 각 래트를 주문 제작 플랫폼에서 반 수직(semi-vertical) 자세로 배치하였다. 소아 내시경을 이용하여 후두를 시각으로 관찰하면서 150 μl의 양으로 4% PEG 하이드로겔을 23G 바늘로 피열연골(arytenoid cartilage)의 한쪽 측면에 주사하였다. 주사 후 1 개월 뒤(4% PEG post 1mon), 조직학적 검사를 위하여 후두를 적출하였다. 잘라낸 부위에서의 하이드로겔과 조직을 관찰한 후 H&E 염색 후 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다. 도 9는 생체 내 안정성을 시험하기 위해 래트에 PEG 하이드로겔을 후두에 주사한 후 1 개월 뒤 주입 부위를 관찰한 사진이다. 도 10은 래트의 성대에 주사된 PEG 하이드로겔의 H&E 염색 이미지를 도시한 것이다. 도 9 및 10에서 붉은색 화살표 및 *은 4% PEG 하이드로겔의 주사 부위를 표시한 것이다.

도 9 및 10에 나타난 바와 같이, 후두 주사 시 PEG 하이드로겔 주위에 이물 반응은 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 시험 결과, 본 발명에 따른 PEG 하이드로겔은 후두 주사 시 생체 안정성이 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 토끼를 이용한 성대 질환 치료 시험

상기 실시예 1-3에 따라 제조된 PEG 하이드로겔의 필러로서 치료 효능을 평가하기 위해, 우측 성대 마비 모델을 제조하여 성대 주입 효과를 확인하였다.

본 시험을 위하여 체중 3.0 kg의 뉴질랜드 흰 토끼(New Zealand white rabbit) 16마리를 사용하였다. 모든 토끼를 두 그룹(PEG 그룹 및 CaHA 그룹)으로 나누었다. 자일라진(xylazine, Rompun 10 mg/kg; 바이엘, 독일)으로 예비약을 투여한 후, 모든 토끼에게 케타민(ketamine) 50 mg/kg을 근육 내 투여하여 마취시켰다. 각 토끼를 등이 바닥에 닿도록(dorsal recumbency) 눕히고, 목 부분을 제모한 후, 목의 중심선 부위를 수직 절개하였다. 갑상선과 기관이 보이도록 띠 근육(Strap muscle)을 해부하여, 갑상선 협부(isthmus of thyroid gland)를 분리하였다. 갑상선 중앙부에 있는 갑상선 하부 동맥 주위에서 우측 반회 후두신경(right recurrent laryngeal nerve)이 확인되었다. 우측 반회 후두신경(right recurrent laryngeal nerve)을 절단한 후, 내시경 검사를 실시하였다. 그 결과, 우측 성대 마비가 확인되었다.

우측 반회 후두신경을 절단 후 일주일 뒤, 모든 토끼를 동일한 방식으로 마취하였다. 0” 내시경을 이용하여 직접 관찰하면서 23G 긴 바늘을 이용하여 PEG 하이드로겔 0.05 ml를 우측 성대에 주사하였다. 주사 부위는 성대 돌기(vocal process) 우측 측면으로 하였다. 성대가 내측으로 전위되는 것을 관찰함으로써 정확한 주사 부위를 확정하였다. 동일한 방식으로, 래디어스(Radiesse) 0.15ml를 성대 우축부에 주사하였다. 주사 직후(Immediately)와 1 개월(1mon), 2 개월(2mon), 및 4 개월(4mon) 경과 후, 토끼의 성대를 강직형 내시경(rigid endoscope)을 이용하여 촬영하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 붉은색 선은 성대의 가장자리, 파란색 점선은 주입된 재료의 윤곽선, 주황색 선은 성대 돌기(vocal process)의 양쪽 끝을 연결한 선이다.

도 11에 도시된 바와 같이, 4% PEG 하이드로겔을 주사한 성대는 CaHA를 주사한 성대와 비교하여 상당한 부피 손실 없이 유지되는 것으로 나타났다. 그러나 CaHA를 주사한 성대는 주사 후 1 개월 뒤 현저하게 부피가 감소되는 것으로 나타났다.

주사 후 4 개월 경과 뒤, 기능분석을 위하여 각 그룹으로부터 토끼 4 마리를 안락사시킨 후 후두를 적출하였다. 성대를 더 잘 관찰하기 위하여, 성대의 상부 구조(supraglottic structure)를 제거하였다. 앞쪽으로는 성대의 전연합부에서 후방으로는 양측 피열연골의 중앙을 잇는 가상의 중앙선을 그었다. 중앙선에서 좌측 성대(정상부위)의 가장자리 까지의 거리와 우측 성대(주사부위)의 가장자리 까지의 거리를 측정하였다. Max는 진동 주기 동안 중앙선에서 각 성대 가장자리 까지의 최대 거리를 의미하고, Min은 최소 거리를 의미한다. 측정 결과를 도 12에 나타내었다.

발성이 이루어지는 동안 성대 내부로 주입된 정도를 측정하기 위하여, 절제된 기도의 아래에서 성대 주름 쪽으로 공기를 공급함으로써 인공적으로 성대 주름을 진동시켰다. 고속 비디오 카메라(X9PRO,MEGASPEED, 캐나다 : 초당 5000 프레임)를 이용하여 진동 이미지를 기록하였다. 얻어진 이미지 데이터를 TEMA 오토모티브(TEMA Automotive, IMAGE SYSTEMS, 스웨덴)를 이용하여 분석하였으며, 성대 주름 진동의 각주기 내에서 최대(Max) 거리와 최소(Min) 거리로 진폭을 분석하였다. 분석 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, PEG 및 CaHA 그룹 모두 PEG 하이드로겔 또는 CaHA가 주입된 우측 성대의 최대(Max) 및 최소(Min) 진폭이 좌측 성대와 비교할 때 감소함을 확인할 수 있으며, 특히, PEG 그룹의 진폭이 CaHA 그룹에 비하여 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 PEG 하이드로겔이 마비된 성대를 안정적으로 내전 시킬 수 있어 효과적인 치료방법을 제공할 수 있음을 알 수 있다.

(PEG 그룹: 우측 성대(Rt) max = 276.5 ± 3.249 Vs 좌측 성대(Lt) Max 663.6 ± 1.632; P <0.05, Rt Min = 141.2 ± 2.621 Vs Lt Min 387.2 ± 4.736; P <0.05)

(CaHA 그룹: Rt max = 630.5 ± 0.705 Vs Lt Max 742.3 ± 1.459; P <0.05, Rt Min = 537.6 ± 0.884 Vs Lt Min 598.4 ± 2.840; P <0.05).

PEG 및 CaHA 기의 오른쪽 성대(Rt)의 최대 및 최소 값을 비교할 때, PEG 기의 최대 및 최소 값이 상당히 감소되었다.

(PEG 그룹: Rt Max = 276.5 ± 3.249 Vs CaHA 그룹: Rt Max = 630.5 ± 0.705; P <0.05)

(PEG 그룹: Rt Min = 141.2 ± 2.621 Vs CaHA 그룹: Rt Min = 537.6 ± 0.884 : P <0.05) (도 10. C, D, E).

주사 후 4 개월 뒤, 조직학적 검사를 위하여 각 그룹에서 4 마리 토끼의 후두를 적출하였다. 적출된 후두를 파라핀 블록에 집어넣고 마이크로톰(microtome)을 사용하여 관상 축(coronal axis)을 따라 4 μm 두께로 절단하여 표본을 제조하였다. 표본을 표준 병리학 프로토콜에 따라 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하였다. 염색된 표본을 광학 현미경(Eclipse TE300; Nikon, 일본)을 이용하여 다양한 배율로 관찰하였다. 그 결과를 도 14(PEG 그룹) 및 도 15(CaHA 그룹)에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, PEG 그룹에 주사된 PEG 하이드로겔은 갑상피열근에서 이동하지 않고 주사 부위에 남아 있는 것으로 확인되었다. 림프구 세포(lymphoplasma cell)로 구성된 염증성 세포의 침윤은 주사된 PEG 하이드로겔에서 관찰되었으나, 주변 조직으로의 침윤은 일어나지 않은 것으로 확인되었고, 혈관염은 관찰되지 않았다.

그러나 도 15에 나타난 바와 같이, 주사된 CaHA는 인접한 근육 조직과 지방 조직으로 누출된 것으로 나타났다. CaHA는 인접한 근육 조직에 침착되었으며(파란색 화살표), 인접한 지방 조직에서는 혈관염(검은색 화살표)이 관찰되었다. 주입된 CaHA는 외부의 거대 세포로 구성된 과립을 형성하였으며, 혈관염이 주변 지방 조직에서 관찰되었다. 또한, 림프구 세포뿐만 아니라 호중구와 같은 염증성 세포도 관찰되었다.

이와 같은 결과로부터 PEG 하이드로겔이 CaHA 보다 이물질 반응이 낮음을 알 수 있다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm PEG-제1 작용기) 및 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-arm PEG-제2 작용기)을 포함하는, 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 제1 작용기는 아자이드(Azide; N₃) 또는 테트라진(Tetrazine)이고,
상기 제2 작용기는 사이클로옥틴(Cyclooctyne; OCT), 모노플루오리네이티드 사이클로옥틴(monofluorinated cyclooctyne; MOFO), 디플루오리네이티드 사이클로옥틴(Difluorinated cyclooctyne; DIFO), 사이클로옥텐(Cyclooctene), 디벤조사이클로옥틴(Dibenzocyclooctyne; DBCO), 및 바이사이클로노닌(Bicyclononyne; BCN) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜은 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 암(arm)에 아자이드가 도입된 것을 특징으로 하는, 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜은 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 4개의 암(arm)에 디벤조사이클로옥틴이 도입된 것을 특징으로 하는, 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 제1 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜과 제2 작용기가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜을 1 : 2 내지 2 : 1의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는, 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 성대 질환은 성대마비(vocal cord paralysis), 성대위축(vocal fold atrophy), 성대반흔(vocal fold scar), 성대구증(sulcus vocalis) 및 성문폐쇄부전(glottis incompetence)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 성대 질환 치료용 하이드로겔 조성물.
제 1 항에 따른 조성물을 포함하는, 성대 질환 치료용 주사제.
제 7 항에 있어서,
상기 주사제는 4-암 폴리에틸렌 글리콜의 제1 작용기와 제2 작용기의 가교결합에 의하여 하이드로겔을 형성하는 것을 특징으로 하는, 성대 질환 치료용 주사제.
4개의 암(arm)에 아자이드가 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-암 PEG-N₃) 및 4개의 암에 디벤조사이클로옥틴이 도입된 4-암 폴리에틸렌 글리콜(4-암 PEG-DBCO) 분말을 증류수에 각각 용해시키는 단계; 및
증류수에 용해된 4-암 PEG-N₃ 용액 및 4-암 PEG-DBCO 용액을 혼합하는 단계;를 포함하는 성대 질환 치료용 하이드로겔의 제조방법.
제 9 항에 있어서,
상기 4-암 PEG-N₃ 및 4-암 PEG-DBCO 분말은 1 : 2 내지 2 : 1 중량비인 것을 특징으로 하는, 성대 질환 치료용 하이드로겔의 제조방법.