KR102496721B1

KR102496721B1 - 그래핀 옥사이드를 포함하는 체내 주입형 하이드로겔

Info

Publication number: KR102496721B1
Application number: KR1020200134602A
Authority: KR
Inventors: 권일근; 이상진; 나하람; 허동녕; 이재서; 문호진
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2020-10-16
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2023-02-06
Also published as: KR20220050659A

Abstract

본 발명은 골 재생능을 가지는 체내 주입형 하이드로겔에 관한 것으로, 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 산화 히알루론산(oxidized hyaluronic acid) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide)로 구성된 하이드로겔의 비율을 한정하는 경우, 겔화 시간이 짧아져 체내 주입형 하이드로겔을 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 하이드로겔은 세포 독성이 거의 없고, 골 재생능이 뛰어나 치료가 필요한 환자에게 즉시 주입하여 사용될 수 있음을 확인하였다.
현재 골 재생을 위한 생체 재료는 독성 및 즉시 주입이 불가능 하다는 문제가 있어, 이러한 문제를 해결한 본 발명의 체내 주입형 하이드로겔은 단순 정형외과 분야뿐만 아니라, 치과, 피부과 및 외과 등의 치료분야에서도 유용하게 활용될 수 있다.

Description

그래핀 옥사이드를 포함하는 체내 주입형 하이드로겔 {Injectable hydrogel comprising graphene oxide}

본 발명은 하이드로겔에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 그래핀 옥사이드를 포함하여 우수한 골 재생능을 가지고, 체내에 즉시 주입이 가능하게 제조한 하이드로겔에 관한 것이다.

그래핀(Graphene)은 2004년 Dr. Geim과 Dr. Novoselov가 스카치 테이프를 이용하여 흑연으로부터 얻어낸 후, 그 뛰어난 전기적 성질 때문에 주목 받고 있었고, 상기 그래핀을 산화한 그래핀 옥사이드(Graphene oxide)(이하, GO) 또한, 그래핀의 대량생산을 위해서 또는 그 특유의 화학적 성질 때문에 마찬가지로 주목 받고 있었다. 그래핀 옥사이드는 산화시키는 과정에서 그래핀의 sp² 구조가 깨어져, 전기 전도도를 포함한 그래핀 고유의 물리적 특성이 사라지게 되나, 그래핀 옥사이드 자체가 수 많은 산소 작용기들을 가지고 있어, 반응성이 매우 높아 다른 물질과의 반응에 사용되거나, 유기물의 산화반응에 촉매로도 사용될 수 있어, 그 유용성에 대한 연구가 늘어나고 있다.

이러한 특성을 가진 그래핀과 그 유도체는 뼈 재생능 및 뛰어난 생체 적합성을 가지고 있기에, 최근 골 유도 및 임플란트와 관련된 분야에서 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 특히 그래핀 옥사이드는 세포 성장, 확장, 증식 및 심지어는 줄기 세포 분화와도 관련이 있다는 보고가 있어 더욱 주목 받고 있다. 기존에 사용되던 생체 합성 재료는 폴리 락트산(PLA), 폴리 글리콜산(PGA), 폴리 카프로락톤(PCL), 인산 칼슘, 하이드록시 아파타이트(HA), 유리-세라믹, 생체 활성 세라믹 및 생체 활성 유리 등이 사용되나, 이러한 기존의 재료들은 각각 다양한 수준의 생체 적합성, 생분해성 및 기계적 강도를 가지고 있으나, 이 3가지 필수적 특성이 모두 양호한 값을 가지는 물질은 없었다. 그래핀 옥사이드의 경우 이러한 문제점을 해결할 수 있을 정도로, 상기 3가지 특성에서 우수한 결과를 보여준다(Materials (Basel). 2018 Aug; 11(8): 1430.).

다만, 그래핀 옥사이드를 사용하여 실험을 진행하면서, 대부분의 시험관 내(in vitro) 실험에서는 그래핀 옥사이드와 접촉한 후 세포 생존력이 약간 감소하는 것으로 보고하고 있으며, GO와 함께 사용되는 재료 및 GO 시트의 압축 정도가 높아질수록 세포 생존력이 감소한다는 연구 결과가 있고, 이러한 기존의 골 재생 물질들은 환부에 주입 전 미리 제작해야 하는 문제점이 있어, 불균일한 부위의 골결손이 발생한 환자나, 즉시 주입이 필요한 응급 환자에게 적용할 수 없다는 문제점이 있었다. 따라서, 골 형성에 유용하게 사용될 수 있는 그래핀 옥사이드의 골 형성능을 유지하면서, 세포 독성이 개선된 체내 주입가능한 조성물의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명자들은 기존의 상기와 같은 문제점을 해결하고, 체내 주입이 가능한 그래핀 옥사이드를 포함하는 하이드로겔을 개발하기 위한 연구를 수행하여 구성성분을 최적의 비율 조합을 통해 제조하는 경우, 겔화 시간이 짧아 즉시 주입이 가능하며 골 재생능이 뛰어난 체내 주입형 하이드로겔을 얻을 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명은 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 산화 히알루론산(oxidized hyaluronic acid) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide)를 포함하는, 체내 주입형 하이드로겔을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 골 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 체내 주입형 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

(a) 히알루론산을 산화시키는 단계;

(b) 산화 히알루론산과 글라이콜 키토산을 혼합하여 하이드로겔을 제조하는 단계;및

(c) 상기 제조된 하이드로겔에 그래핀 옥사이드를 첨가하는 단계;를 포함하는, 체내 주입형 하이드로겔 제조방법.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 산화 히알루론산(oxidized hyaluronic acid) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide)를 포함하는, 체내 주입형 하이드로겔을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 글라이콜 키토산(glycol chitosan) 및 산화 히알루론산(oxidized hyaluronic acid)은 90:10 내지 50:50의 부피비로 혼합되어 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 하이드로겔은 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 하이드로겔은 자가 가교될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 그래핀 옥사이드(graphene oxide)는 8 μg 내지 100 μg 함량으로 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로겔을 포함하는 골 재생용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 체내 주입형 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.

(a) 히알루론산을 산화시키는 단계;

본 발명의 일구현예로, 상기 제조방법은 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 그래핀 옥사이드를 포함하는 하이드로겔은 우수한 골 재생능을 가지고 세포 독성이 적으며 체내 주입이 가능하게 제형화될 수 있으며, 겔화 시간이 짧아 이식전 미리 제작할 필요 없이, 환부가 불균일하거나, 즉시 골이식재가 필요한 응급환자에게 곧바로 체내 주입될 수 있기에, 골 재생 및 이식을 위한 생체 재료로 유용하게 이용될 수 있다.

단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 히알루론산(HA)의 산화 방법과 산화된 히알루론산(oHA)의 산화도를 확인한 결과로서, 도 1의 a는 과요오드산 나트륨을 사용하여 히알루론산을 산화시키는 방법을 나타낸 화학식이고, 도 1의 b는 이렇게 산화된 히알루론산을 FT-IR을 통해 확인한 결과이며, 도 1의 c는 산화된 히알루론산을 H¹ NMR로 확인한 결과이다.
도 2는 체내 주입형 하이드로겔의 표면 형태를 관찰한 결과로서, 각각 SEM(a), EDS(b), AFM(c)으로 관찰한 결과와, 제타 포텐셜(d)을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 체내 주입형 하이드로겔의 구조와 머리뼈 결함(calvarial defect) 마우스 모델에 대한 실험 방법을 단순하게 나타낸 모식도이다.
도 4는 동결건조된 하이드로겔을 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰한 결과로서, 글라이콜 키토산/산화 히알루론산(gC/oHA) 하이드로겔(도 4의 a) 및 gC/oHA에 그래핀 옥사이드(GO)가 포함된 하이드로겔(도 4의 b)를 준비하여, SEM으로 단면도를 관찰한 결과이다(도 4의 c).
도 5는 하이드로겔의 기계적 특성을 확인한 결과로서, 도 5의 a는 점탄성을 확인한 결과이고, 도 5의 b는 열 안정성을 확인한 결과이며, 도 5의 c는 동결건조된 gC/oHAGO36이 PBS에서 24시간 담가 놓은 후 팽창한 정도를 사진으로 촬영해 확인한 결과이고, 도 5의 d는 다양한 구성 성분의 비율을 가진 하이드로겔 팽창 정도를 정량화한 결과이다.
도 6은 하이드로겔의 세포독성을 확인하기 위해, 하이드로겔을 처리한 세포 생존율을 측정한 결과로서, 도 6의 a는 3일간 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)(이하, hASCs)를 배양한 후, 세포의 생존 정도를 확인한 결과이며, 도 6의 b는 4일간 hASCs를 배양한 후, F-actin을 염색하여 세포 생존 정도를 확인한 결과이다.
도 7은 골 형성 분화능을 확인한 결과로서, ALP 염색을 통해 골 형성 분화능을 확인하여, 정량화 한 다음(도 7의 a), 촬영 및 100배 확대를 통해 골 형성 분화능이 일어나는지를 정밀하게 관찰 하였으며(도 7의 b), ARS 염색을 통해 골 형성 분화능도 관찰 하였다(도 7의 c).
도 8은 다양한 성분비로 구성된 하이드로겔의 처리시 hASCs의 골 형성 관련 인자의 발현을 확인한 결과로서, 도 8의 a는 RT-PCR을 통해, 골 형성 관련 인자인 COL1, OCN 및 BSP의 발현을 관찰한 결과이고, 도 8의 b는 면역 염색법을 활용하여 골 형성 관련인자인 RUNX2의 발현을 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 하이드로겔 중 gC/oHAGO72을 머리뼈 결함(calvarial defect) 마우스 모델에 주입한 뒤, 대조군 및 gC/oHA만 주입한 샘플과 골 형성능을 비교 관찰한 결과로서, 도 9의 a는 하이드로겔 주입 수술 과정을 나타낸 것이고, 도 9의 b는 상기 방법으로 주입된 마우스 모델을 micro-CT를 통해 관찰한 결과이고, 도 9의 c는 Masson`s trichrome 염색법을 사용하여 수술 부위를 조직학적으로 분석한 결과이며, 도 9의 d는 전체 조직에서 새로 형성된 골의 비율을 정량화하여 나타낸 결과이다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 그래핀 옥사이드를 포함하는 하이드로겔의 체내 주입을 위한 최적의 비율을 개발하였으며, 이렇게 제조된 하이드로겔은 겔화 시간이 짧아 주입 전 미리 형태를 제작할 필요 없이 환자의 체내에 곧바로 주입이 가능하고 우수한 골 재생능을 가지는 것을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 산화 히알루론산(oxidized hyaluronic acid) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide)를 포함하는, 체내 주입형 하이드로겔을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 히알루론산은 다양한 사슬 길이 및 전하 상태뿐만 아니라 다양한 화학적 변형을 가진 히알루론산 또는 히알루로난의 모든 변이체 및 변이체들의 조합을 포함하며, 히알루론산을 산화하여 산화 히알루론산을 얻는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 데스-마틴 페리오디난(Dess-martin periodinane, DMP) 또는 과요오드산 나트륨을 사용하는 방법일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하이드로겔은 체내 주입에 유리하도록 각 구성성분의 비율을 조절하여 겔화 시간, 분해 시간, 기계적 강도, 점탄성 등을 조절할 수 있고, 글라이콜 키토산 및 산화 히알루론산은 90:10 내지 50:50 부피비, 바람직하게 85:15 내지 60:40의 부피비. 보다 바람직하게 70:30의 부피비를 가지도록 구성될 수 있으며, 그래핀 옥사이드는 8 μg 내지 100 μg, 바람직하게는 12 μg 내지 84 μg, 가장 바람직하게는 18 μg 내지 72 μg의 함량으로 하이드로겔에 포함하는 것일 수 있다.

그래핀 옥사이드를 포함하는 상기 하이드로겔은 가교를 촉진하기 위한 가교제 또는 광학 개시제 등의 보조제 없이도, 단순히 혼합(mix)을 통해 자가 가교가 일어나 3차원 구조를 형성할 수 있다. 따라서 가교 보조제에 의한 독성문제가 없어 기존의 하이드로겔에 비해 상대적으로 안전하다. 또한, 상기 하이드로겔은 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 상기 하이드로겔의 겔화 시간, 세포 독성 및 골 재생능을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 하이드로겔의 구성 성분인 oHA(실시예 2-1 참조)의 산화도 및 GO(실시예 2-2 참조)의 특성을 각각 분석한 뒤, 하이드로겔의 구성성분인 oHA, gC 및 GO의 구체적인 비율을 달리하면서 혼합하여 다양한 비율의 gC/oHA/GO로 구성된 하이드로겔의 겔화 시간을 관찰하였고, 그 겔화 시간이 짧아, 사전에 구조를 제작할 필요 없이, 환자의 환부에 즉시 주입이 가능한 하이드로겔의 최적 비율을 확인하였다(실시예 3 참조),

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기와 같은 방법으로 제조한 하이드로겔의 특성을 확인하기 위해, 점탄성, 강도, 열 안정성, 팽윤도를 관찰하여 물리적 특성을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 다양한 구성성분 비율을 가지는 하이드로겔의 세포독성을 확인하여, 본 발명 하이드로겔의 생체 적용가능성을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명 하이드로겔이 실제 골 재생능을 가지는지 여부를 확인하기 위해, ALP, ARS, RT-PCR 및 면역 형광법 등을 통해 골 재생과 관련된 효과가 발생하는지를 시험관 내(in vitro)에서 확인하였고(실시예 6 참조), 실제 머리뼈 결함이 있는 마우스 모델에 하이드로겔을 이식하여 생체 내(in vivo)에서도 골 재생 효과가 있는지 확인하였다(실시예 7 참조).

(a) 히알루론산을 산화시키는 단계;

본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체를 더 포함할 수 있다. 예를들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 개체의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 투여는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 비 경구 주입으로서 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다.

또한, 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 대상 환자의 골 재생에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 재생 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 골에 결함이 발생할 가능성이 있거나, 또는 결함이 발생한 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 결함이 발생한 뼈를 재생할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 시약, 배지 및 실험방법

1-1. 시약 및 배지

히알루론산 나트륨(Sodium hyaluronate)(Mw ¼ 1000 kDa)은 Humedix(Anyang, Korea)에서 구매했으며, 글라이콜 키토산(Glycol chitosan)(이하, gC)(≥60% titration), 과요오드산 나트륨(sodium periodate)(NaIO₄, ACS reagent, ≥99.8%), 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol)(Reagent-Plus®, ≥99%) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide)(4 mg/ml, dispersion in H2O)(이하, GO)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, hASCs) 및 GM 배지(exclusive Growth Medium)와 보충물(supplement)는 CEFO Co. Ltd(Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다. DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium), DPBS 버퍼 식염수(Dulbecco's phosphate buffered saline), 우태혈청(fetal bovine serum, FBS), trypsin- EDTA 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)은 Gibco BRL(Invitrogen Co. Ltd, Carlsbad, CA, USA)에서 구매한 것을 사용하였다. 본 발명에서 사용된 분화 배지(osteogenic medium)는 10% 우태혈청을 포함하는 DMEM 배지, 1%의 페니실린-스트렙토마이신, 10 mM의 베타-글리세로인산나트륨 수화물(b-glycerol phosphate disodium salt hydrate)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 300 mM의 아스크로브산(ascorbic acid)(Sigma-Aldrich) 및 0.1 mM의 덱사메타손(dexamethasone)(Sigma-Aldrich)으로 구성된 것을 사용하였다. EZ-Cytox(enhanced cell viability assay kit)는 Dogen(Seoul, Korea)에서 구입한 것을 사용 하였으며, 탈이온수(Deionized-distilled water, DDW)는 ultrapure water system (Puris-Ro800; Bio Lab Tech., Korea)에서 구입하여 사용하였다. 그 외의 다른 시약 및 용매들은 분석 등급(analytical grade)이며, 추가적인 정제 없이 사용하였다.

1-2. 분석 장비

그래핀 옥사이드(GO)의 원소 조성의 형태는 15kV의 가속 전압에서 에너지 분산 X-선 분석(energy dispersive X-Ray analysis) 및 주사 전자 현미경(SEM)을 통해 조사하였다. SEM을 통한 분석을 수행하기 전에 샘플들은 백금으로 스퍼터 코팅 되었으며, 표면은 실온에서 원자력 현미경(atomic force microscopy, AFM)(Park-System XE-100, Korea)을 사용하여 실온에서 10 X 10 μm²영역을 스캔하였다. GO의 평균 직경 및 제타 전위는 ELSZ-2000 입자 분석기(ELSZ-2000 particle analyzer)(Otsuka Electronics Co., Ltd., Osaka. Japan)를 사용하여 실온에서 기록하였다. 푸리에 변환 적외선 분광법(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)(Perkin-Elmer)는 oHA와 HA의 흡수대역을 구별하기 위해서 500에서 4000 cm^-1까지 측정하였다. H¹ NMR 분석을 위해서는 동결건조된 oHA(50mg)을 중수소 산화물(deuterium oxide, D₂O)(1 ml)에 넣어 용해시키고, NMR 튜브에 넣었다. 이렇게 준비한 샘플을 H¹ NMR 분광계(AVANCE-400 MHz, Bruker, Germany)로 분석하였다.

1-3. 통계적 분석 방법

모든 데이터는 ± 표준오차로 표시되며, Bonferroni의 Bonferroni의 다중 비교 시험 (팽윤 비율 및 ALP 활성)의 일원 분석, Dunnett의 다중 비교 시험 (생체 내 BT / TV), 본 페로니의 다중 비교 시험(팽창도 및 ALP 활성도)은 Graph Pad Prism version 5.01(Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 분석하였고, *P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001은 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다.

실시예 2. 하이드로겔 구성성분의 특성 확인

2-1. 산화된 히알루론산의 특성 확인

① 히알루론산(hyaluronic acid)은 과요오드산 나트륨(sodium periodate, NaIO4)을 활용하여 산화하였다. 구체적으로, 3.8 g의 히알루론산을 360 ml의 탈이온수(DDW)에 녹이고 실온에서 모두 용해될 때까지 저어주었고, 1.068 g의 과요오드산 나트륨은 40 ml의 탈이온수에 30분 동안 용해 시킨 후, 상기 히알루론산 용액을 첨가하였다. 과요오드산 나트륨 용액은 빛으로부터 보호(light protection)되면서 적가되었고, 반응은 실온의 암흑조건에서 일정한 교반을 통해 진행되었다. 24시간이 지난 후, 1 ml의 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol)을 혼합용액에 첨가하여 반응하지 않은 과요오드산을 제거 하였으며, 에틸렌 글라이콜 첨가 30분이 지난 뒤에, 용액을 투석막(dialysis membranes)(Spectrum Spectra, Spectra/Por 4 dialysis tubing, 12-14 K MWCO)을 통해 투석 시켜 잔류 화학물질을 제거하였다. 건조된 산화 히알루론산(oxidized hyaluronic acid)(이하, oHA)는 정제된 용액을 동결 건조하여 수득하였다.

② 본 발명 체내 주입형 하이드로겔에 적합한 최적의 산화도를 가지는 oHA를 찾고자, 상기와 같은 방법으로 수득된 oHA에 TNBS 분석을 통한 산화도 분석을 수행하였다. 산화도 측정을 위해 우선, 5% w/v의 oHA(200 μL)를 1 %의 수성 트리클로로 아세트산(aqueous trichloroacetic acid)에 있는 30 mM의 tert-butyl carbazate(t-BC, 200 μL)과 혼합하였고, 24시간이 경과한 뒤, 100 μL의 혼합액을 ep-tube로 옮겼다. 그 후, 1 ml의 TNBS 용액(0.1 M의 붕산염 완충액(borate buffer)안에 0.01%, PH 8)을 ep-tube에 첨가하고, 1시간동안 반응시킨 뒤 0.5 N의 히알루론산을 넣고 반응을 중단하였다. 100 μL 만큼을 96-웰 프레이트(96-well plate)로 옮겼고, 흡광도를 UV1650PC spectrophotometer(Shimadzu, Japan)로 측정한 결과, 334 nm으로 측정되었다. 수성 t-BC(3-30 mM)은 표준 검량선(standard calibration curve)으로 사용되었으며, 실험은 3회 반복하여 수행하였다.

상기와 같이 준비한 산화 히알루론산(oHA)의 실질적인 산화도(알데히드기의 형성 수준) 측정은 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR), H¹ NMR 및 TNBS 분석을 통해 수행되었다. 히알루론산의 산화는 도 1의 a에 나타낸 바와 같이 과요오드산 나트륨의 처리의해 일어날 수 있는데, 히알루론산과 산화된 히알루론산은 도 1의 b에 나타낸 바와 같이, 스펙트럼이 매우 유사하여 구분이 쉽지 않으나, FT-IR를 확대하여 관찰하면, 산화된 히알루론산은 1730 cm^-1 부분에서 새로 형성된 피크(peak)가 있는 것을 확인할 수 있었는데, 이 피크는 산화 반응에 의해 새로 추가된 알데히드의 C=O 이중결합을 의미하기에 산화 여부를 확인할 수 있었다. H¹ NMR 분석을 통해 산화된 히알루론산을 관찰한 경우에는, 도 1의 c에 나타낸 바와 같이, 산화된 히알루론산은 5.0 ppm(빨간색 별표)에서 3 개의 피크를 보여줘 알데히드기를 포함하고 있음을 확인하였다. 이렇게 측정된 산화 히알루론산의 산화도를 정량화 했을 때, 그 값은 29.31 ± 2.32%로 확인되었다. 이 정도의 산화도는 하이드로겔 매트릭스를 형성하기에 적합한 양으로서, 알데히드기가 히알루론산의 백본(backbone)에 완전히 도입된 것을 확인하였고, 산화 히알루론산이 수용성 글라이콜 키토산과 반응하여 수성 하이드로겔을 형성할 수 있음을 확인했다.

2-2. 그래핀 옥사이드의 특성 확인

그래핀 옥사이드(GO)를 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰한 결과, 도 2의 a에서 나타낸 바와 같이, 불규칙한 층 구조를 확인하여, 주름진 마이크로스케일 표면 형태를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. EDS를 통해 GO의 원소조성을 확인한 결과, GO는 에폭시, 카르복실기, 하이드록시 및 전기적 음성 작용기를 포함하고 있기에 도 2의 b에 나타낸 바와 같이, 탄소와 수산화물을 포함하고 있는 것을 확인하였다. AFM 분석을 통해 GO의 얇은 조각(flake)을 확대하여 관찰한 경우에도, 도 2의 c에 나타낸 바와 같이, SEM 이미지 결과와 동일한 약간의 주름이 있는 매끄러운 표면을 관찰할 수 있었다. GO의 제타 전위값을 측정한 결과, 도 2의 d에 나타낸 바와 같이, 음의 제타 전위값을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 그래핀 옥사이드가 전기적 음성 작용기를 포함하고 있기 때문으로 추정된다.

실시예 3. 즉시 주입이 가능한 체내 주입형 하이드로젤의 제조

하이드로겔 매트릭스(hydrogel matrix)를 형성할 수 있는 최적의 조건을 찾기 위해, 글라이콜 키토산/산화 히알루론산(gC/oHA)의 부피비 달리하여 실험을 수행하였고, 이를 위해 1.0 wt%의 글라이콜 키토산과 3.0 wt%의 산화 히알루론산을 실온에서 PBS에 각각 용해 시켰다. 다양한 부피비의 gC/oHA(85:15, 80:20, 75:25, 70:30)를 패트리 접시에서 혼합하였고, 이렇게 형성된 체내 주입형 하이드로겔(글라이콜 키토산 및 산화 히알루론산으로 구성)은 총 부피를 300ml로 맞추어 준비 하였다. 겔화 시간(gelation time)은 잔류하고 있는 물(residual water)이 없는 완전한 겔(gel)의 형성 시간을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

Abbreviation	Sample groups	Gelation time (sec)
gC/oHA1	1% gC85 : 3% oHA15	47.0 ± 1.1
gC/oHA2	1% gC80 : 3% oHA20	36.2 ± 1.0
gC/oHA3	1% gC75 : 3% oHA25	26.9 ± 0.6
gC/oHA4	1% gC70 : 3% oHA30	24.7 ± 0.6

상기 측정을 기반으로 추가 실험을 위해 가장 양호한 겔화 시간(24.7 ± 0.6)을 보여주었던 70:30 부피비의 gC/oHA를 준비하였다. 상기 하이드로겔에 그래핀 옥사이드(이하, GO)의 첨가를 위해 4 mg/ml의 GO 용액(Sigma-Aldrich에서 제공한 바와 같이 1 X, 4 mg/mL로 표시된 용액)를 PBS에서 다양한 농도로 희석하여 희석된 GO를 준비하였다. 예를 들어 gC/oHA4GO36은 100ml의 GO용액을 900ml의 PB에 넣어서, 0.4 mg/ml 농도로 만들고, 이를 활용하여 GO/oHA 용액을 제작하였다. GO를 포함하는 3.0 wt% oHA 용액을 만들기 위해 30 mg의 oHA 건조 분말을 완전히 용해될 때까지 강한 와류(voltex)하에서 용해시켰다. 마지막으로 GO 희석 용액과 상기 oHA 용액을 섞은 후에, gC 210ml를 혼합하여 실온에서 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 것을 확인하였다. 이러한 방식으로 제조한 하이드로겔(300 mL)은 도 3에서 나타낸 바와 같이, 36 μg의 GO를 3차원적 매트릭스 구조에 포함하고 있는 것으로 확인 되었다. gC/oHA4GO18 및 gC/oHA4GO72 또한, GO 희석 비율만 달리하여 동일한 공정에 의해 제작하였고, 각각의 겔화 시간을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.

Abbreviation	Sample groups	Gelation time (sec)
gC/oHA4GO18	1% gC70 : 3% oHA30 + GO (18ug)	22.3 ± 0.5
gC/oHA4GO36	1% gC70 : 3% oHA30 + GO (36ug)	20.5 ± 1.0
gC/oHA4GO72	1% gC70 : 3% oHA30 + GO (72ug)	18.1 ± 0.9

상기 겔화 시간 측정 결과를 토대로, gC/oHA4GO36 또는 gC/oHA4GO72가 겔화 시간이 각각 20.5 ± 1.0 및 18.1 ± 0.9로 측정되어 우수한 겔화 시간을 보여주었고, 이를 통해 70:30으로 부피비를 한정한 gC/oHA 용액에 GO를 첨가한 본 발명의 체내 주입형 하이드로겔은 별도의 사전 제작과정 없이도 체내에 즉시 주입 가능하다는 사실을 확인하였다.

실시예 4. 체내 주입형 하이드로겔의 특성 확인

4-1. 체내 주입형 하이드로겔의 생체상 구조 및 단면 확인

하이드로겔의 형성 및 구조를 관찰하기 위해, 글라이콜 키토산(gC) 용액을 실온에서 산화 히알루론산(oHA) 용액과 혼합하거나(도 4의 a), 산화 히알루론산/그래핀 옥사이드(oHA/GO) 용액과 혼합(도 4의 b)하여 하이드로겔을 준비하였다. 혼합하는 경우 추가적인 물질의 부가 없이도, 단순한 혼합(mix)을 통해 자동으로 가교되어 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. oHA의 양이 증가함에 따라 겔화 시간이 점차 감소하여 겔이 빠르게 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 oHA의 알데히드기가 gC의 아민기와 반응하여 겔의 형성을 돕기 때문인 것으로 보이며, 이렇게 생성된 하이드로겔에 GO를 첨가하는 경우에 균일한 형태를 유지하나, 겔화 시간은 더 감소하는 것을 실시예 2-3의 실험에서 확인할 수 있었고, 이러한 겔화 작용은 실온에서 일어나기에, 생체에서도 동일한 정도의 겔화 속도를 보일 것으로 예상된다.

이어서, 동결 건조된 gC/oHA 하이드로겔 및 gC/oHA/GO 하이드로겔의 단면 형태를 주사 전자 현미경(SEM)을 통해 시각화 하여 형태학적 차이를 관찰하였다. 그 결과, 도 4의 c에 나타낸 바와 같이, 모든 하이드로겔 샘플은 3차원 네트워크와 상호 연결된 기공 구조를 가지고 있었으며, gC/oHA 하이드로겔은 불균일한 기공 구조를, gC/oHA/GO 하이드로겔은 균일한 기공 구조를 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, GO의 함량이 증가함에 따라 전반적인 기공의 크기가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 GO가 포함된 하이드로겔이 GO가 없는 하이드로겔보다 더 안정적인 네트워크 형태의 구조를 가지고 있다는 것을 확인하였다.

4-2. 체내 주입형 하이드로겔의 형태 및 물리적 특성 확인

체내 주입형 하이드로겔의 구성성분의 함량에 따른 물리적 특성(점탄성, 강도, 열 안정성, 팽윤도)을 확인하기 위해, 다양한 비율을 가진 하이드로겔에 대해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

① 하이드로겔을 동결 건조하여 단면을 주사 전자 현미경(scanning electron microscope, SEM)(NOVA Nano SEM-200, FEI Company, Hillsboro, OR, USA)을 통해 관찰하였다. 모든 샘플들은 아르몬 기체하에서 스퍼터 코팅기(sputter coater)(SCD 005, BAL-TEC, Los Angeles, CA, USA)를 사용하여 백금(120초 동안 30mA)으로 스퍼터 코팅 되었다. SEM 이미지는 10kV의 가속전압에서 얻었다. 점탄성 특성(viscoelastic properties)은 MCR 92 rheometer(Anton-Paar, Graz, Austria)로 측정하여 각 샘플의 각도 진동수(angular frequency)와 복합 점도(complex viscosity) 수치를 얻었다. 모든 샘플은 측정을 위해 디스크 형태로 준비하였고, 진동수 의존적 점탄성 거동(frequency-dependant viscoelastic behaviour)을 조사 위해 8 mm 직경의 플레이트 플레이트 형상(plate-plate geometry)와 1 mm의 갭이 있는 회전 레오미터(rotating rheometer)를 사용하였다. 샘플의 저장 탄성계수(storage elastic modulus, G`)와 손실 탄성 계수(loss modulus, G``)가 측정되었으며, 진동수 스윕(frequency sweep)은 0.1-4.0 Hz 범위에서 1%의 일정한 변형률 하에서 수행되었다. G` 및 G``의 공식은 하기와 같은 방정식을 사용하여 계산하였다.

방정식:

,

동적 레오미터(dynamic rheometer)로 준비한 하이드로겔의 점탄성을 측정하였다. 우선 gC/oHA의 점탄성을 확인해본 결과, gC/oHA의 물리적 강성은 oHA의 양을 늘려줌에 따라 점차 증가하여, 단단한 하이드로겔을 형성하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 가장 짧은 겔화 시간을 보여준 gC/oHA의 70:30 부피비를 선택하여 고정하였고, GO의 비율을 달리 하여 gC/oHA/GO의 점탄성 특성을 관찰 하였고, 그 결과를 도 5의 a에 나타내었다. 점탄성 특성을 확인한 결과, G`(저장 탄성 계수)값과 G``(손실 탄성 계수)값 사이에 어떠한 교차(cross over)도 나타나지 않음을 확인하여, 체내 주입형 하이드로겔이 우수한 안정성을 가진 고도로 교차 결합하고 있는 고체 구조임을 확인하였다. 체내 주입형 하이드로겔의 GO 함량을 증가시키는 경우에 G`값은 GO 함량의 증가에 따라 점진적으로 증가하나, G``값은 큰 변화를 보여주지 않는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 통해 GO 함량을 증가시키는 경우에 GO는 고분자 다리를 형성 및 하이드로겔의 고분자 매트릭스와 수소결합을 통한 상호작용을 통해 하이드로겔의 강도를 증가시킬 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

② 열 중량 분석(Thermogravimetric analysis, TGA)은 하이드로겔 매트릭스 내부에 GO의 존재를 확인하기 위해 TGA Q5000IR(TA Instruments, USA)를 사용하여 수행하였으며, 분석은 질소 기체 하에서 1분당 10 ℃의 가열속도로 25 ℃ - 800 ℃의 범위에서 수행하였다. 하이드로겔의 열 안정성 및 GO의 존재를 확인하기 위해 TGA 분석을 추가로 수행하였다. 그 결과, 도 5의 b에 나타낸 바와 같이, 110 ℃에서 물의 휘발에 의한 초기 질량 감소가 일어나고, 180 ℃이상에서 하이드로겔의 열에의한 분해가 일어나기 시작하여 270 ℃부터 열 분해가 감소하는 것을 관찰할 수 있었는데, GO의 함량에 따른 열 안정성을 비교한 결과, GO의 함량이 커질수록 열 안정성이 증가하여 잔류 중량이 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 기존에 밝혀진 바와 같이 GO가 고분자 측쇄의 이동성을 감소시키기 때문인 것으로 보인다.

③ 평형 팽창 비율(the equilibrium swelling ratio, %)는 체내 주입형 하이드로겔을 동결건조 시키고, 37 ℃의 PBS에 24시간 동안 침지시킨 뒤, 모든 하이드로겔을 PBS에서 제거 하였으며, 과량의 물은 Kimwipes^TM를 사용하여 흡수한 다음, 하이드로겔의 팽창 비율을 측정하였다. 하이드로겔의 평형 팽창 비율은 하기와 같은 식을 사용하여 계산되었다.

평형 팽창 비율(%) = (W₂₄ - W_d)/W_d X 100

상기 하이드로겔 중 gC/oHAGO36 모델을 사진 촬영하여 팽윤도를 관찰한 결과, 도 5의 c에 나타낸 바와 같이, PBS에서 24시간이 지난 후, 팽윤이 일어난 것을 확인하였으며, 도 5의 d에 나타낸 바와 같이, 다른 그룹에 대해서도 팽윤이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 다만, GO의 비율이 증가함에 따라, GO가 가지고 있는 극성 작용기에 의해 고분자 사실과의 상호작용이 증가되어 팽윤의 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 실험결과들을 토대로, 하이드로겔에 GO를 첨가하는 것이 본 발명 하이드로겔의 기계적 특성 및 안정성 등의 모든 측면에서 향상을 가져온다는 사실을 분명히 확인할 수 있었다.

실시예 5. 체내 주입형 하이드로겔의 세포 독성 확인

5-1. 세포 생존율 측정

하이드로겔의 세포 독성을 확인하기 위해, 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)(이하, hASCs)를 37 ℃의 온도의 5% CO₂ 인큐베이터의 GM에서 배양하였다. 배양 후, hASCs는 1,106개의 세포/웰 또는 겔(n ¼ 3)에서 다양한 비율의 GO를 함유하는 gC/oHA4에 캡슐화 되었고, 그 후에 24 웰 배양 플레이트에 분주하여 배양하였다. 배양 1일 및 3일 후, 하이드로겔에 캡슐화 되어 있는 hASCs를 DPBS로 3회 세척한 후, EZ-Cytox 용액을 처리하였다.

상기와 같이 준비한 하이드로겔에 포함된 hASC의 생존력을 배양일에 따라 측정한 결과, 도 6의 a에 나타낸 바와 같이, 세포의 생존율은 GO의 함량이 증가함에 따라 감소하는 경향이 있으나, 1일 및 3일차 결과에서 나타나 있듯이 생존율의 차이가 크지 않은 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 통해 겔화 시간이 짧은 본 발명의 하이드로겔이 큰 독성의 문제 없이 활용될 수 있다는 사실을 확인하였다.

5-2. F-actin 염색을 통한 세포 생존 확인

hASCs는 배양을 위해 37 ℃의 온도의 5% CO₂ 인큐베이터의 GM에서 배양하였고, 배양 후 다양한 비율의 GO를 함유하는 gC/oHA4에 캡슐화시킨 뒤, 13 ø 공초점 접시(confocal dish)에 분주하였다. 배양 4일 후, 모든 샘플들은 DPBS로 3회 세척하고, 실온에서 20분 동안 포름알데히드(formaldehyde)를 통해 고정시켰다. 고정된 샘플을 다시 DPBS로 3회 세척한 뒤, DPBS에서 0.1%의 Tween 20(Yakuri Pure Chemicals CO., LTD., Japan)를 사용하여 투과화(permeabilized) 하였다. 샘플들은 DPBS로 3회 세척한 뒤, DPBS에 1:200의 비율로 희석된 Rhodamine Phalloidin(R415, Invitrogen, USA)을 사용하여 40분 동안 염색되었다. 염색된 샘플은 디지털 카메라(IX71, OLYMPUS, Japan)가 있는 형광 현미경(fluorescence microscope)으로 관찰되었다.

상기와 같은 방법을 통해 배양 4일차에 F-actin 염색을 수행한 결과, 도 6의 b에 나타낸 바와 같이, 다양한 비율의 하이드로겔에서 모두 유사한 수준의 세포수를 보여 주었기에, 하이드로겔에서 GO의 함량을 늘리는 경우에도, 세포 생존율에 큰 차이가 나지 않음을 다시 한번 확인할 수 있었다.

실시예 6. 체내 주입형 하이드로겔의 시험관 내(in vitro) 골 재생능 확인

6-1. 알칼리성 포스파타아제(Alkaline phosphatase, ALP) 활성 확인

골 형성 효능을 판단하기 위해, ALP의 활성을 측정하는 실험을 수행하였다. hASCs는 1,106개의 세포/웰 또는 겔(n ¼ 3)에서 다양한 비율의 GO를 함유하는 gC/oHA4에 캡슐화 하였고, 그 후 24 웰 배양 플레이트로 분주되었다. hASCs은 OM(osteogenic medium)과 함께 배양되었으며, 3일 마다 한번씩 OM을 교체해 주었다. 배양 7일 후, 샘플들을 DPBS로 3회 세척하고 얼음 위에서 1시간 동안 RIPA 용해 및 추출 완충액(RIPA lysis and extraction buffer)(89,901, Thermo Scientific??, USA)으로 용해시킨 후, 그룹별 용해물은 마이크로 튜브에 수집하였다. 상청액은 수집된 뒤, pNPP 이나트륨염 6수화물(pNPP disodium salt hexahydrate)(Sigma-Aldrich, USA)과 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응은 50 mL의 1 M 수산화나트륨(NaOH)을 첨가해 종결시켰고, pNP의 생성은 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험은 3회 반복하여 수행하였다.

7일간 배양 후, 세포가 시드되어 있는 웰을 3.7%의 포름알데히드로 실온에서 30분 동안 고정시킨 후, DPBS로 부드럽게 세척하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 아질산 나트륨 용액(sodium nitrite solution), FRV-알칼리 용액 및 나프톨 AS-BI 알칼리 용액의 혼합물과 함께 배양하였다. 이렇게 염색된 세포가 파종된 웰을 DPBS로 2회 세척하고, 광학현미경(Olympus CKX41, JAPAN)으로 염색을 관찰하였다.

상기 ALP 활성 테스트를 통해 골 형성을 분석한 결과, 도 7의 a에 나타낸 바와 같이, gC/oHA4GO36에서 가장 높은 ALP 활성을 보여줌을 확인했으며, ALP 활성 테스트 결과를 100배 확대해서 관찰하였을 때에도, 도 7의 b에 나타낸 바와 같이, GO 함량이 높아질수록 GO 특유의 색(검은색) 때문에 정확한 분석이 힘들어 졌으나, 하이드로겔에 의해 골 형성 분화가 일어나는 것(하얀색 화살표)을 확인할 수 있었다.

6-2. 알자리딘 레드 S 염색 분석

하이드로겔에 캡슐화된 hASC의 칼슘 침착(calcium deposition)을 확인하여, 골 재생 정도를 확인하기 위해, hASCs는 1,106개의 세포/웰 또는 겔(n ¼ 3)에서 다양한 비율의 GO를 함유하는 gC/oHA4에 캡슐화 하였고, 그 후 24 웰 배양 플레이트로 분주 되었다. 14일 배양한 후, DPBS로 3회 세척하고 3.7% 포름알데히드로 실온에서 20분 동안 고정하였다. 고정된 샘플을 DPBS로 다시 세번 세척하고 40 mM 알리자린 레드 용액(Alizarin red S, ARS)(pH 4.2)를 20분 동안 처리하여 염색 하였다. 20분 경과 후, 용액을 제거하고 증류수로 세척한 뒤, 형광 현미경 디지털 카메라를 사용하여 샘플의 칼슘 침착을 확인하였다.

상기 ARS 염색을 통해 관찰한 결과, 도 7의 c에 나타낸 바와 같이, 골 형성 분화가 일어나는 것을 다시 한번 확인할 수 있었으나, ALP 분석과 마찬가지로 GO의 색(검은색) 때문에 상기 염색 분석이 정확하지 않을 우려가 있어, 추가적으로 RT-PCR 분석 및 형광 분석을 수행하였다.

6-3. 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)

복합 하이드로겔(composite hydrogel)에서 hASCs의 골 형성 관련 유전자 발현을 확인하기 위해, hASCs는 1,106개의 세포/웰 또는 겔(n ¼ 3)에서 다양한 비율의 GO를 함유하는 gC/oHA4에 캡슐화 하였고, 그 후 24 웰 배양 플레이트로 분주 되었다. 그 후, hASCs를 DPBS로 세척하고 총 RNA(total RNA)의 분리를 위해 TRIzol® Reagent(Invitrogen, USA)을 처리하였다. 상기와 같은 방법으로 분리된 RNA는 AccuPower® CycleScript?? RT PreMix & Master Mix (Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 되었으며, 합성된 cDNA에 2X QuantiSpeed SYBR mix(PhileKorea, Korea)를 사용한 뒤, 하기 표 3에 나타난 프라이머를 사용하여 분석하였다. 본 발명에서 PCR을 위해 사용된 프라이머는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서 구입한 것을 사용하였다.

② 체내 주입형 하이드로겔의 골 형성 분화능의 구체적인 분석을 위해, hASCs를 3주 동안 배양하면서 RT-PCR을 통해 hASCs의 골 분화와 관련이 있는 COL1, OCN 및 BSP의 발현을 관찰하였다. 그 결과 골 분화 초기 마커인 COL1이 도 8의 a에 나타낸 바와 같이, 1 주차 배양에서 매우 높은 수치를 나타내는 것을 확인하였고, 여러가지 비율의 하이드로겔 중에서도 gC/oHAGO36에서 가장 높은 COL1의 발현을 보여줌을 확인하였다.

Primer	Forward	Reverse
Collagen type I(COL1)	5`-CTGGCAGCCCTGGTGAAAAT-3`	5`-GGCAGCACCAGTAGCACC- 3`
osteocalcin (OCN)	5`-CATGAGAGCCCTCACACTCC-3`	5`-CTCTTCACTACCTCGCTGCC- 3`
Bone Sialoprotein (BSP)	5`-AAGACACCACAGAGACCGGA-3`	5`-CCCCTCGTATTCAACGGTGG-3`
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)	5`-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3`	5`-TCGCCCCACTTGATTTTGA-3`

6-4. 면역 형광법(Immunofluorescence, IF)

hASCs는 배양을 위해 37 ℃의 온도의 5% CO₂ 인큐베이터의 GM에서 배양되었고, 배양 후 다양한 비율의 GO를 함유하는 gC/oHA4에 캡슐화시킨 뒤, 13 ø 공초점 접시(confocal dish)에 분주하였다. 24시간의 배양 후, GM 배지를 OM 배지로 교체해 주었다. 하이드로겔에 캡슐화된 hASCs는 DPBS로 세척한 후, 실온에서 포름알데히드로 20분동안 고정되었다. 고정 후, DPBS로 3회 세척하였고, 세척된 샘플들을 PBS에 있는 0.1%의 Tween 20(Yakuri Pure Chemicals, Kyoto, Japan)로 10분 동안 처리하였다. 샘플들을 PBS의 1%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 4 ℃에서 30분동안 차단한 뒤, 전체 샘플에 1% 소혈청 알부민에 1:200으로 희석된 항-RUNX2 항체(ab215954; Abcam, Cambridge, UK)를 처리하였다(제조업자의 프로토콜을 따라 수행되었다). 그 후, 핵을 DAPI(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)로 염색하고, 캡슐화된 hASCs를 형광 현미경(Olympus IX71, Japan)으로 관찰하였다.

추가적인 면역형광 분석을 통해, 다양한 하이드로겔의 골 형성 분화능을 확인한 결과, 도 8의 b에 나타낸 바와 같이, 핵 매트릭스의 조정을 통해 골아 세포의 분화에서 중요한 역할을 하는 초기 골 형성 마커인 RUNX2가 GO를 함유하고 있는 하이드로겔, 그 중에서도 특히 gC/oHAGO36에서 가장 높은 발현을 보임을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 체내 주입형 하이드로겔을 이식하는 경우 뼈 형성을 촉진할 수 있다는 사실을 구체적으로 확인하였다.

실시예 7. 체내 주입형 하이드로겔의 생체 내(in vivo) 골 재생능 확인

7-1. 두개골 결함 모델 마우스에서 체내 주입형 하이드로겔의 생체 내(in vivo) 이식

Sprague-Dawley(SD) 쥐(8 주령, 총 18마리)가 이번 실험에서 사용되었다. 동물 케어와 치료는 서울대학교 동물 실험 교육위원에서 정한 지침에 따라 수행되었다. 이 실험은 전임상 연구를 위한 Animal Research: Reporting In Vivo Experiments(ARRIVE) 지침을 준수하여 수행되었다. 동물 연구 프로토콜은 서울 대학교 실험 동물 자원 연구소(SNU-190115-1)의 승인을 받았다. 수술은 전신 마취하에 시행되었으며, 본 발명 하이드로겔(가장 겔화 시간이 짧은 것으로 확인한 gC/oHAGO72 하이드로겔을 사용하였다)의 골 형성능이 실제 생체 내에서도 작용하는지 여부를 확인하기 위해, 도 9의 a에 나타낸 바와 같이, 면도(shaving), 절개(incision), 하이드로겔 주입(implantation) 및 봉합(suture) 단계를 통해 쥐의 머리뼈 결함(calvarial defect) 모델에 하이드로겔을 이식하였다(빨간 화살표로 표시). 구체적으로, 머리뼈(calvarium) 위의 중간선 절개를 하였으며, 전층 피부 피판술(full-thickness flap)을 하였고, 멸균 식염수의 관개 하에, trephine bur를 사용하여 8 mm 임계 크기의 두개부 결함을 생성하였다. 수술 과정에서 본 발명의 하이드로겔은 응고 반응을 통해 이식과정에 발생하는 출혈도 효과적으로 줄일 수 있음을 확인하였다. 상기 실험 쥐들은 (1) Sham 그룹(결함만 생성한 그룹), (2) gC/oHA4 그룹, (3) gC/oHA4GO72 그룹으로 구성된 3개의 그룹으로 나누어 실험을 수행하였다(n ¼ 그룹당 4마리). 결함 병변을 형성한 후, 샴그룹을 제외한 그룹에 각각의 체내 주입형 하이드로겔을 도포하여 결함 부위를 채웠다. 절개 부위는 5-0의 chromic gut과 4-0의 silk로 봉합되었다. 모든 동물은 수술 2일 후, 세파졸린(cefazolin)(30 mg/kg)을 근육 내 투여 받았고, 수술 4주 후에 모두 희생시킨 뒤, 골 재생 정도를 확인하였다.

7-2. 하이드로겔 이식된 마우스 모델 조직의 현미경 및 조직학적 평가

희생된 마우스 모델의 수술부위를 포함한 조직들을 채취한 뒤, 10% 중화된 완충 포르말린 용액에 고정하였고, 그 뒤, SkyScan 1172(Sky-Scan) 스캐너를 사용하여 마이크로 CT (microcomputed tomography) 이미지를 촬영하였다. 광물화된 뼈 부피/결손 조직 부위(mineralized bone volume/defect tissue volume, BV/DV)는 낮은 회색 임계값(lower gray threshold)이 65인 컴퓨터 프로그램(CT-analyzer; SkyScan)에 의해 측정되었다. 샘플들은 파라핀에 있는 에탄올 용액에 의해 탈수가 진행되기 전에 2 주 동안 10% EDTA 용액으로 석회질을 제거하였다. 원형 결함(center of the circular defects)을 통해 5 마이크로 미터 두께의 관상 절편을 채취한 뒤, Masson`s trichrome stain으로 염색을 수행하였다. 이렇게 준비한 표본을 광학 현미경으로 관찰하여 조직학적 검사를 수행하였다.

micro-CT 및 조직학적 분석을 수행한 결과, micro-CT 결과는 도 9의 b에 나타낸 바와 같이, 하이드로겔을 주입하지 않은 쥐와 GO가 포함되지 않은 gC/oHA4만 주입한 쥐의 경우 거의 골 형성이 일어나지 않거나, 소량의 골 형성만 확인할 수 있었으나, gC/oHA4GO72를 주입한 쥐의 경우 가장자리에서 중앙 부분으로 상당한 정도의 골 형성이 일어났음을 확인할 수 있었다. 이는 도 9의 c에 나타낸 조직학적 분석결과에서도 마찬가지로 나타나는데, Masson`s trichrome 염색법으로 수술 부위를 염색한 후, 관찰한 결과, 단순히 하이드로겔을 주입하지 않은 쥐의 경우 거의 골형성이 일어나지 않았고, gC/oHA4만 주입한 쥐의 경우에도 매우 소량의 골 형성이 일어남을 관찰할 수 있으나, gC/oHA4GO72를 주입한 경우, 상당량의 골 형성이 일어남을 관찰할 수 있었고, 조직 부피당 새로 형성된 골 부피의 양을 도 9의 d와 같이 나타낸 결과, gC/oHA4GO72를 주입한 그룹에서 gC/oHA4를 주입한 그룹에 비해 통계적으로 유의한 골 형성 수준의 증가를 보여줌을 확인할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

글라이콜 키토산(glycol chitosan), 산화 히알루론산(oxidized hyaluronic acid) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide)를 포함하고,
상기 글라이콜 키토산(glycol chitosan) 및 산화 히알루론산(oxidized hyaluronic acid)은 80:20 내지 70:30의 부피비로 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 하는, 체내 주입형 하이드로겔.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 체내 주입형 하이드로겔.
제 1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 자가 가교되는 것을 특징으로 하는, 체내 주입형 하이드로겔.
제 1항에 있어서,
상기 그래핀 옥사이드(graphene oxide)를 하이드로겔 전체 중량에 대해서 8 μg 내지 100 μg의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 체내 주입형 하이드로겔.
하기의 단계를 포함하는, 제 1항의 체내 주입형 하이드로겔 제조방법:
(a) 히알루론산을 산화시키는 단계;
(b) 산화 히알루론산과 글라이콜 키토산을 혼합하여 하이드로겔을 제조하는 단계;및
(c) 상기 제조된 하이드로겔에 그래핀 옥사이드를 첨가하는 단계.
제 6항에 있어서,
상기 제조방법은 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기 세포(Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells)를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로겔 제조방법.
제 1항, 제3항 내지 제 5항 중, 어느 한 항의 하이드로겔을 포함하는, 골 재생용 약학적 조성물.