CN117412782A - 一种具有多孔结构的水凝胶的制造方法 - Google Patents

一种具有多孔结构的水凝胶的制造方法 Download PDF

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Abstract

目的在于提供一种简单的具有μm级多孔结构的水凝胶材料的制造方法。一种具有多孔结构的水凝胶的制造方法，包括：工序a)，配制将化合物A溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂中的第一溶液；工序b)，配制将能够与化合物A化学交联的化合物B溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂的第二溶液；工序c)，将所述第一溶液和所述第二溶液混合，获得以300mM～1000mM的浓度包含一种以上碱金属盐的凝胶化溶液；以及工序d)，所述凝胶化溶液中的所述化合物A和化合物B在没有外部刺激的情况下形成化学交联，从而获得具有多孔结构的水凝胶，并且，所述化合物A和B中的任一方为在侧链或者末端共计具有两个以上亲核性官能团或者亲电子性官能团的、直链、3支链、4支链或者8支链聚乙二醇(PEG)。

Description

一种具有多孔结构的水凝胶的制造方法
技术领域
本发明涉及具有多孔结构的水凝胶的制造方法。
背景技术
近年来，由于具有其优异的保水能力以及生物相容性等特性，因此具有高分子网目结构的水凝胶是一种有望不仅用于人工组织或再生医学用支架材料、密封剂、防粘连材料、药物递送、隐形眼镜等医疗目的，而且还用于传感器或表面涂层材料等各种用途的材料(例如，非专利文献1)。特别是，对于再生医学用支架材料等的用途，需要开发具有μm级大小的多孔结构的高分子材料。
然而，以往，为了获得μm级多孔结构，需要使用自上而下的方法，例如使用光刻等对预先配制的水凝胶或高分子结构体进行微加工，或者使用不溶于溶剂的高分子原料来制作高分子材料。另一方面，当使用亲溶剂性高分子原料时，要么材料本身溶解在溶剂中，要么只能制作具有nm级小的多孔结构的水凝胶。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Sakai等，Macromolecules，41，5379-5384，2008
发明内容
发明所要解决的问题
因此，本发明的目的在于提供具有μm级多孔结构的水凝胶材料，以及提供适合于由亲溶剂性高分子材料制备这种水凝胶材料的制造方法。
用于解决问题的方案
本发明人为了解决所述问题而进行了深入研究，结果发现，可通过在高浓度碱金属盐存在下进行凝胶化反应，来发现可通过简单的方法形成具有μm级多孔结构的水凝胶，由此完成了本发明。这种水凝胶具有作为构成成分的高分子在制造过程中自发相分离而形成的海绵样三维网目结构(多孔结构)。
即，本发明的一方面提供：
<1>一种具有多孔结构的水凝胶的制造方法，其特征在于，包括：
a)配制将化合物A溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂中的第一溶液；
b)配制将能够与化合物A化学交联的化合物B溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂的第二溶液；
c)将所述第一溶液和所述第二溶液混合，获得以300mM～1000mM的浓度包含一种以上碱金属盐的凝胶化溶液；以及
d)所述凝胶化溶液中的所述化合物A和化合物B在没有外部刺激的情况下形成化学交联，从而获得具有多孔结构的水凝胶，
所述化合物A和B中的任一方为在侧链或者末端共计具有两个以上亲核性官能团或者亲电子性官能团的、直链、3支链、4支链或者8支链聚乙二醇(PEG)；
<2>根据上述<1>所述的制造方法，其特征在于，从配制所述凝胶化溶液到凝胶化溶液变成固体的时间为1秒以上；
<3>根据上述<1>或者<2>所述的制造方法，所述碱金属盐选自由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸钾、硫酸钠以及其任意组合组成的组；
<4>根据上述<1>～<3>中任一项所述的制造方法，所述水凝胶在405nm波长处的最大透射率为80％以下；
<5>根据上述<1>～<4>中任一项所述的制造方法，所述水凝胶包含范围为20g/L～250g/L的所述聚乙二醇；
<6>根据上述<1>～<5>中任一项所述的制造方法，在所述第一溶液和所述第二溶液的混合溶液中，当将所述碱金属盐在200mM条件下形成的水凝胶的平衡溶胀度设定为Qlow，将在任意浓度的所述碱金属盐存在下形成的所述水凝胶的平衡溶胀度设定为Q时，Q满足关系式Q≥1.1*Qlow；
<7>根据上述<1>～<6>中任一项所述的制造方法，在所述第一溶液和所述第二溶液的混合溶液中，当将所述碱金属盐在200mM条件下形成的水凝胶的伸长时的断裂应力设定为σlow，将任意浓度的碱金属盐存在下形成的所述水凝胶的伸长时的断裂应力设定为σ时，σ满足关系式σ≥1.5*σlow；
<8>根据上述<1>～<7>中任一项所述的制造方法，所述化合物A和B中的一个为PEG；另一个由选自由PEG、肽、蛋白质、壳聚糖、透明质酸、以及其衍生物组成的组中的一种以上构成；以及
<9>根据上述<1>～<8>中任一项所述的制造方法，所述工序d)中的所述外部刺激为光照射。
在另一方面上，本发明还涉及上述水凝胶的制造方法，提供：
<10>一种用于制作具有多孔结构的水凝胶的试剂盒，包括：
将化合物A溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂中的第一溶液；以及
将能够与化合物A化学交联的化合物B溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂中的第二溶液，
当混合所述第一溶液和所述第二溶液时的碱金属盐的总浓度在300mM～1000mM的范围内，
所述化合物A和B中的任一方为在侧链或者末端共计具有两个以上亲核性官能团或者亲电子性官能团的、直链、3支链、4支链或者8支链聚乙二醇(PEG)。
发明的效果
根据本发明的制造方法，通过调节高分子溶液中的碱金属浓度并仅混合该溶液，可容易且有效地获得具有μm级多孔结构的水凝胶。
由于根据本发明的制造方法得到的水凝胶形成海绵样μm级的三维网目结构(多孔结构)，因此可成为适合细胞浸润和粘附的材料。
附图说明
图1为表示在碱金属盐浓度200mM、PEG浓度100g/L的条件下的凝胶化样子的图像。
图2为表示在碱金属盐浓度400mM、PEG浓度100g/L的条件下的凝胶化样子的图像。
图3为在不同总碱金属盐浓度下制备的水凝胶(PEG浓度：20、50、80、100g/L)的图像。
图4为显示在不同总碱金属盐浓度下制备的水凝胶(PEG浓度：20、50、80、100g/L)在405nm处的透射率的图。
图5为表示水凝胶刚制备后的样子(上排、比例尺10mm)及其共焦显微镜像(下排、比例尺20μm)的图像。
图6为表示在水中平衡状态下的水凝胶样子(上排、比例尺10mm)及其共焦显微镜像(下排、比例尺20μm)的图像。
图7为表示在各总碱金属盐浓度下配制的水凝胶的平衡溶胀度的图。
图8为表示在各总碱金属盐浓度下配制的水凝胶的伸长时的断裂应力的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。本发明的范围并不限定于这些说明，除了以下的例子以外，在不脱离本发明的主旨的范围内，可以适当地变形而实施。
(1)水凝胶的制造方法
本发明的制造方法为一种具有多孔结构的水凝胶的制造方法，其特征在于，包括以下工序a)-d)：
a)配制将化合物A溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂中的第一溶液；
b)配制将能够与化合物A化学交联的化合物B溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂的第二溶液；
c)将所述第一溶液和所述第二溶液混合，获得以300mM～1000mM的浓度包含一种以上碱金属盐的凝胶化溶液；以及
d)所述凝胶化溶液中的所述化合物A和化合物B在没有外部刺激的情况下形成化学交联，从而获得具有多孔结构的水凝胶。
另外，所述化合物A和B中的任一方为在侧链或者末端共计具有两个以上亲核性官能团或者亲电子性官能团的、直链(即，2支链)、3支链、4支链或者8支链聚乙二醇(PEG)。
根据本发明的制造方法得到的水凝胶具有作为构成成分的高分子在制造过程中自发相分离而形成的海绵样三维网目结构(多孔结构)(以下，有时将该结构称为“海绵样多孔结构”)。其特点在于，其网目尺寸为远大于传统水凝胶获得的nm量级的μm量级。在该水凝胶中，在形成多孔结构的空隙中未观察到高分子单元。即，水凝胶作为一个整体不具有两个以上高分子密度显著不同的区域。并且，由于空隙中没有高分子单元，当水凝胶因受外力而被压缩时，可以像所谓的普通海绵一样排出水。并且，在本发明的制造工序中，所使用的一部分或全部高分子单元在规定时间后自发性地变成非亲溶剂性的。从此时间点开始，非亲溶剂性高分子单元将交联，其结果获得非亲溶剂性高分子作为构成成分的相分离结构。
在本说明书中，“凝胶”是指一般为在高粘度失去流动性的高分子的分散体系，在储能模量G’和损耗模量G”中具有G’≥G”的关系的状态。特别是，当凝胶中所包含的溶剂为水性溶剂时，将该凝胶称为“水凝胶”。
下面，对构成本发明的水凝胶的化合物A和B以及在各种工序中的各种条件进行说明。
1-a.化合物A和B(凝胶构成成分)
作为用于形成本发明的水凝胶的成分的化合物A和B典型地为亲溶剂性高分子种类，即，当凝胶为水凝胶时，该化合物A和B可使用亲水性高分子种类。只要该高分子种类能够在没有外部刺激的情况下在溶液中通过凝胶化反应(交联反应等)形成水凝胶，则可根据最终水凝胶的用途和形状等使用该技术领域中公知的那些。更详细地，在最终水凝胶中，优选能够通过高分子种类相互交联而形成网目结构，特别是，可形成三维网目结构的高分子单元。
作为用作化合物A和B的亲水性高分子可优选为具有聚乙二醇骨架或者聚乙烯骨架的高分子。作为具有聚乙二醇骨架的高分子，代表性地可列举具有2支链、3支链、4支链或者8支链等多个聚乙二醇骨架支链的高分子种类，特别是，优选具有四个聚乙二醇骨架支链的高分子种类。由该4支链聚型乙二醇骨架组成的凝胶通常被称为Tetra-PEG凝胶，通过分别在末端具有活性酯结构等亲电子性官能团和氨基等亲核性官能团的两种四支链高分子间的AB型交叉末端偶联反应而构建网目结构网络(Matsunaga等，Macromolecules、Vol.42、No.4、pp.1344-1351、2009)。并且，可通过混合各高分子溶液的单纯的两种液体即可简单地现场制备Tetra-PEG凝胶。只要利用Tetra-PEG技术，就还可以在水凝胶配制过程中通过调节pH或离子强度来控制凝胶化时间。由于所得到的水凝胶以PEG为主要成分，因此生物相容性也优异。
只要能够相互交联形成凝胶，也可以利用除聚乙二醇骨架以外的高分子，例如，也可以利用甲基丙烯酸甲酯等具有聚乙烯骨架的高分子。
在本发明的制造方法中，所述化合物A和B中的任一方为在侧链或者末端共计具有两个以上亲核性官能团或者亲电子性官能团的、直链、3支链、4支链或者8支链聚乙二醇(PEG)。
在优选的方式中，所述化合物A和B中的一个为PEG；另一个可以由选自由PEG、肽、蛋白质、多糖类组成的组中的一种以上构成。作为蛋白质例如可列举明胶、白蛋白等。作为多糖类，例如可列举壳聚糖、透明质酸、其衍生物等。
在所述化合物A和B中，除PEG之外的分子分子量没有特别限制。另一方面，作为PEG的分子量，可列举2×103～100×103Da；优选为5×103～40×103Da；更优选为10×103～20×103Da。由于PEG的分子量越大越容易有相分离的倾向，因此当分子量过大时，则在交联反应前的溶液状态下可能会发生相分离，这是不优选的。在本发明中，可通过将化合物A和B的分子量保持在规定范围内并将下述碱金属盐浓度保持在规定范围内来获得具有多孔结构的水凝胶。
在典型的方式中，化合物A和B中任意一个都可以为PEG。在这种情况下，所述化合物A为在侧链或者末端中共计具有两个以上亲核性官能团的第一高分子单元，所述化合物B可以为在侧链或者末端中共计具有两个以上亲电子性官能团的第二高分子单元，使这两种类型的高分子种类反应并交联的手段是合适的。其中，亲核性官能团和亲电子性官能团的总数优选为5个以上。这些官能团优选存在于末端。并且，第一高分子单元的含量可大于第二高分子单元的含量，或者第二高分子单元的含量也可大于第一高分子单元的含量。
存在于高分子单元的亲核性官能团可列举硫醇基(-SH)(也称为巯基)、氨基等，本领域技术人员可以适当使用公知的亲核性官能团。优选地，亲核性官能团为硫醇基或者氨基。亲核性官能团可以相同或不同，但优选相同。通过具有相同的官能团，与形成交联键的亲电子性官能团的反应性变得均匀，更容易获得具有均匀的立体结构的水凝胶。
作为存在于高分子单元中的亲电子性官能团，可使用马来酰亚胺基、活性酯基。活性酯基可列举N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)基或磺基琥珀酰亚胺基等。本领域技术人员可以适当地使用其他公知的亲电子性官能团。优选地，亲电子性官能团为马来酰亚胺基。亲电子性官能团可以相同或不同，但优选相同。通过具有相同的官能团，与形成交联键的亲核性官能团的反应性变得均匀，更容易获得具有均匀的立体结构的水凝胶。
除了所述亲核性官能团和亲电子性官能团的组合之外，还可以适当地使用本领域技术人员公知的共价键形成反应，例如叠氮化物和炔烃的环加成反应、或被称为点击化学的其他反应等。
在末端具有亲核性官能团的高分子单元的优选非限制性具体例，例如可列举具有四个聚乙二醇骨架支链且由在末端具有硫醇基的下式(I)表示的化合物。
化学式1
n11～n14可以相同或不同。n11～n14的值越接近，立体结构越均匀，强度越高。因此，为了获得高强度的水凝胶，优选相同。如果n11～n14的值过高，则凝胶的强度变弱，如果n11～n14的值过低，则由于化合物的空间位阻而难以形成凝胶。因此，n11～n14可列举11～569的整数值；优选为28～228；更优选为56～114。而且，其分子量可列举2×103～100×103Da；优选为5×103～40×103Da；更优选为10×103-20×103Da。
在上述式(I)中，R11～R14为连接官能团与核心部分的连接位点。R11～R14可以相同或不同，但为了制造具有均匀的立体结构的高强度水凝胶而优选相同。R11～R14表示C1-C7亚烷基、C2-C7亚烯基、-NH-R15-、-CO-R15-、-R16-O-R17-、-R16-NH-R17-、-R16-CO2-R17-、-R16-CO2-NH-R17-、-R16-CO-R17-、R16-NH-CO-R17-或者-R16-CO-NH-R17-。其中，R15表示C1-C7亚烷基。R16表示C1-C3亚烷基。R17表示C1-C5亚烷基。
其中，“C1-C7亚烷基”是指能够具有支链的碳原子数为1以上且7以下的亚烷基，是指直链C1-C7亚烷基或者具有一个或者多个支链的C2-C7亚烷基(包含支链的碳原子数为2以上且7以下)。C1-C7亚烷基的实例为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基。C1-C7亚烷基的实例可列举-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-CH(CH3)-、-(CH2)3-、-(CH(CH3))2-、-(CH2)2-CH(CH3)-、-(CH2)3-CH(CH3)-、-(CH2)2-CH(C2H5)-、-(CH2)6-、-(CH2)2-C(C2H5)2-、以及-(CH2)3C(CH3)2CH2-等。
“C2-C7亚烯基”为在链上具有一个以上双键的状或者支链状且碳原子数为2～7个的亚烯基，例如，可列举具有通过从所述亚烷基中除去相邻碳原子上的2～5个氢原子而形成的二价基团。
另一方面，在末端具有亲电子性官能团的高分子单元的优选非限制性具体例可列举例如具有四个聚乙二醇骨架支链且在末端具有马来酰亚胺基的由下式(II)表示的化合物。
化学式2
在上述式(II)中，n21～n24可以相同或不同。n21～n24的值越接近，水凝胶的立体结构越均匀，强度越高，因此是优选的，优选相同。如果n21～n24的值过高，则凝胶的强度变弱，如果n21～n24的值过低，则由于化合物的空间位阻而难以形成凝胶。因此，n21～n24可列举11～569的整数值；优选为28～228；更优选为56～114。作为本发明的第二四支链化合物的分子量，可列举2×103～100×103Da；优选为5×103～40×103Da；更优选为10×103～20×103Da。
在上述式(II)中，R21～R24为连接官能团与核心部分的连接位点。R21～R24可以相同或不同，但为了制备具有均匀的立体结构的高强度凝胶而优选相同。在式(II)中，R21～R24相同或不同，并表示C1-C7亚烷基、C2-C7亚烯基、-NH-R25-、-CO-R25-、-R26-O-R27-、-R26-NH-R27-、-R26-CO2-R27-、-R26-CO2-NH-R27-、-R26-CO-R27-、-R26-NH-CO-R27-、或者-R26-CO-NH-R27-。其中，R25表示C1-C7亚烷基。R26表示C1-C3亚烷基。R27表示C1-C5亚烷基。
在本说明书中，亚烷基以及亚烯基可以具有一个以上任意取代基。作为该取代基，例如可列举烷氧基、卤素原子(可以为任意的氟原子、氯原子、溴原子或碘原子)、氨基、单或而取代的氨基、取代的甲硅烷基、酰基、或者芳基等，但不限于此。当烷基具有两个以上取代基时，他们可以相同或不同。这同样适用于包含烷基的其他取代基(例如，烷氧基、芳烷基等)的烷基部分。
并且，在本说明书中，当将某个官能团定义为“可以具有取代基”时，取代基的种类、取代位置、以及取代基的数量没有特别限制，当具有两个以上取代基时，它们可以相同或不同。作为取代基，例如可列举烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、氧代基等，但不限于此。这些取代基中还可以存在另外的取代基。
1-b.各工序中的各种条件
第一溶液以及第二溶液中所使用的碱金属盐可优选地选自由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸钾、硫酸钠以及其任意组合组成的组。第一溶液以及第二溶液中的至少一个包含该碱金属盐。
如果第一溶液及第二溶液的碱金属盐浓度过高，则会发生非预期性相分离，这是不优选的。第一溶液中碱金属盐的浓度范围为0～1000mM；优选为0～500mM；更优选为0～450mM。类似地，第二溶液中碱金属盐的浓度范围为0～1000mM；优选为0～500mM；更优选为0～450mM。典型地，第一溶液及第二溶液中任意一个或两者中碱金属盐浓度的下限值可以为0.01mM。
混合第一溶液和第二溶液而得到的凝胶化溶液(凝胶化前的混合溶液)中碱金属盐的浓度范围为300～1000mM；优选为350～500mM；更优选为400～450mM。如果碱金属盐的浓度低于该范围，则交联的高分子单元不能相分离，不会形成多孔结构。另一方面，如果碱金属盐的浓度太高，则在高分子单元交联之前在溶液状态下发生相分离，这是不优选的。
在工序c)的混合过程中，如果各溶液的温度过高，则在交联反应开始之前可能会发生非预期性相分离，并且，如果温度过低，则各溶液的流动性可能变差并且难以处理。因此，优选将温度控制在10～40℃；更优选控制在25～35℃；进一步优选控制在25℃。例如，第一溶液以及第二溶液可在设定为与各溶液温度相同的温度的恒温浴中混合。进一步，化合物A与B之间的交联反应开始后，溶液温度有一定程度的变化也是可以接受的。例如，可将第一溶液以及第二溶液直接注射到体内环境中，例如活体内，可在原位形成多孔水凝胶。
在工序d)中的术语“在没有外部刺激的情况下”是指仅通过混合第一溶液和第二溶液而不施加外部光刺激或热刺激来进行凝胶化。优选地，外部刺激为光刺激。
在工序c)以及d)中，从配制所述凝胶化溶液到凝胶化溶液变成固体的时间优选为1秒以上。由此，能够确保用于混合第一溶液和第二溶液的时间。如果比这快，则由于混合不顺利，容易形成不均匀的水凝胶，因此这是不优选的。从另一观点来看，凝胶化溶液变成固体的时间优选为5秒以上。在这种情况下，通过将凝胶化溶液作为液体倒入模具中或通过填充导注射器后直接注射到环境中，可以将多孔水凝胶在所需位置成型成所需样子。
1-b.水凝胶的物理性质等
如上所述，根据本发明的制造方法得到的水凝胶的特征在于具有μm量级的多孔结构。其孔径根据总碱金属盐浓度等的条件而变化，但作为一例，大小可以为1～500μm，从水凝胶的机械特性的观点来看，优选为1～100μm。可通过各种方法来观察该孔和其大小，但作为一例，可通过将荧光色素与构成水凝胶的高分子色素结合之后获得共焦显微镜像来进行测量。在本发明的水凝胶中，在形成多孔结构的空隙中基本上观察不到高分子单元。即，水凝胶作为一个整体不具有两个以上高分子的密度显著不同的区域。并且，由于空隙中基本上不存在高分子单元，因此当水凝胶受到外力被压缩时，他可以像所谓的普通海绵一样排出水。
并且，本发明的水凝胶中的含量没有特别限制，但在优选的方式中，包含20g/L～250g/L范围的聚乙二醇。
本发明的水凝胶具有比凝胶化前的高分子单元的透射率还低的透射率。这是因为，在本发明的水凝胶中，作为构成成分的高分子在制造过程中自发地发生相分离。因此，就像不良溶剂性高分子在溶剂中发生相分离一样，导致呈现浑浊而不是完全透明。优选地，本发明的水凝胶在405nm处的波长范围内具有80％以下的最大透射率。在该透射率表现出与几乎透明的普通水凝胶完全不同的特性。
优选地，在所述第一溶液和所述第二溶液的混合溶液中，将所述碱金属盐在200mM的条件下形成的所述水凝胶的平衡溶胀度设定为Qlow，将任意浓度的所述碱金属盐存在下形成的所述水凝胶的平衡溶胀度设定为Q时，Q满足关系式Q≥1.1*Qlow。
并且，本发明的水凝胶的特征还在于其伸长时的断裂应力。具体地，在所述第一溶液和所述第二溶液的混合溶液中，当将所述碱金属盐在200mM条件下形成的所述水凝胶的伸长时的断裂应力设定为σlow，将任意浓度的碱金属盐存在下形成的所述水凝胶的伸长时的断裂应力设定为σ时，σ满足关系式σ≥1.5*σlow。
本发明的水凝胶可根据其用途加工成各种形状，例如薄膜。这种加工可使用该技术领域中已知的任意手法。例如，在薄膜的情况下，例如，在凝胶化溶液具有完全固化前的流动性的状态下，可通过在玻璃等平面基板上进行涂敷等手法来获得薄膜。
实施例
下面，将通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限于此。进一步，在以下的实施例中，虽然使用高分子浓度的g/L单位，但相当于1g/L＝0.1重量百分比。
1.通用材料的配制
使用磷酸缓冲液(PB)作为各实验的高分子溶液的缓冲液。PB包含碱金属盐磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。PB可以通过通常报道的方法来配制，但本发明根据Kurakazu等人的报告(Macromolecules2010，43，8，3935-3940)来配制成pH7.4。此时，通过在0～1000mM的范围内改变溶质的摩尔浓度(碱金属盐浓度)来调节缓冲液的缓冲能力。
2.使用了四支链聚乙二醇(PEG)的水凝胶的配制
作为原料高分子，使用末端具有-SH基的Tetra-PEG-SH(四巯基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100SH)以及末端具有琥珀酰亚胺基Tetra-PEG-OSu(四琥珀酰亚胺基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100HS)。重均分子量(Mw)均为10000。
第一溶液的配制
将Tetra-PEG-SH溶解在磷酸缓冲液(PB)中。此时，将PB的碱金属盐浓度设定为0～1000mM中任一浓度。将PEG的浓度设定为20～250g/L中任一浓度。
第二溶液的配制
将Tetra-PEG-OSu溶解在PB中。此时，将PB的碱金属盐浓度设定为0～1000mM中任一浓度。将PEG的浓度设定为20～250g/L中任一浓度。
比较例1
将所述第一溶液(碱金属盐浓度200mM、PEG浓度100g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度200mM、PEG浓度100g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为100g/L的PEG和浓度为200mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置10分钟。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成透明固体(图1)。即使用手指压缩，所得透明水凝胶也不会排出水。这是(酒井等人，Macromolecules2008，41，14，5379-5384)中报道的现有的PEG水凝胶制备工艺，可获得透明水凝胶是预期的结果。
比较例2
将所述第一溶液(碱金属盐浓度200mM、PEG浓度250g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度200mM、PEG浓度250g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为250g/L的PEG和浓度为200mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成透明固体。即使用手指压缩，所得透明水凝胶也不会排出水。表明：与比较例1相比，即使单纯地增加PEG浓度，也无法获得多孔结构。
实施例1
将所述第一溶液(碱金属盐浓度400mM、PEG浓度100g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度400mM、PEG浓度100g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为100g/L的PEG和浓度为400mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置10分钟。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体(图2)。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。这直接表明该水凝胶具有普通海绵中常见的多孔结构。该结果是由于碱金属盐以浓度高于之前报道的凝胶制备过程中的浓度的方式存在而导致水凝胶中的PEG发生相分离的。
实施例2
将所述第一溶液(碱金属盐浓度1000mM、PEG浓度100g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度0mM、PEG浓度100g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为100g/L的PEG和浓度为500mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。
类似地，将所述第一溶液(碱金属盐浓度0mM、PEG浓度100g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度1000mM、PEG浓度100g/L)在空的离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为100g/L的PEG和浓度为500mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到吐出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当使用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。
这些结果表明：碱金属盐不必包含在第一溶液或者第二溶液两者中，只要存在于最终的凝胶化溶液(混合)中就足够了。
实施例3
将所述第一溶液(碱金属盐浓度1000mM、PEG浓度100g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度1000mM、PEG浓度100g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为100g/L的PEG和浓度为1000mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当使用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。由此确认：即使在相对较高的碱金属盐浓度下也形成多孔结构。
实施例4
将所述第一溶液(碱金属盐浓度600mM、PEG浓度20g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度600mM、PEG浓度20g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为20g/L的PEG和浓度为600mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。可以确认即使在相对较低的PEG浓度(例如20g/L)中也可以多孔化。
实施例5
在实施例5中，将与磷酸缓冲液(PB)中所含的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠不同的碱金属盐的硫酸钾(K2SO4)预先追加到PB中。具体地，将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有10mM碱金属盐浓度的PB中，使得K2SO4浓度变成500mM。此时，PB浓度为10mM及K2SO4浓度为500mM的总碱金属盐浓度变成510mM。将包含所得K2SO4的液体用作PB，将PEG以100g/L浓度溶解在其中，以制备第一溶液和第二溶液。将由此配制的第一溶液(总碱金属盐浓度510mM、PEG浓度100g/L)和所述第二溶液(总碱金属盐浓度510mM、PEG浓度100g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为100g/L的PEG和浓度为510mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。该结果表明：多孔结构的形成不依赖于碱金属盐的种类。
实施例6
在实施例6中，将与PB中所含的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠不同的碱金属盐的硫酸钾(K2SO4)预先追加到PB中。具体地，将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的PB中，使得K2SO4浓度变成100mM。此时，PB浓度为200mM及K2SO4浓度为100mM的总碱金属盐浓度变成300mM。将包含所得K2SO4的液体用作PB，将PEG以250g/L浓度溶解在其中，以制备第一溶液和第二溶液。将由此配制的第一溶液(总碱金属盐浓度300mM、PEG浓度250g/L)和所述第二溶液(总碱金属盐浓度300mM、PEG浓度250g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为250g/L的PEG和浓度为300mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。该结果表明：只要PEG浓度(例如250g/L)高，则即使总碱金属盐浓度为300mM时也可以诱导多孔结构。
3.使用了二支链PEG和四支链PEG的水凝胶的配制
作为原料高分子，使用末端具有-SH基的Linear-PEG-SH(直链巯基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：DE-100SH)以及末端具有琥珀酰亚胺基的Tetra-PEG-OSu(四琥珀酰亚胺基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100HS)。重均分子量(Mw)均为10000。
第一溶液的配制
将Linear-PEG-SH溶解在磷酸缓冲液(PB)中。此时，将PB的碱金属盐浓度设定为400mM。将PEG浓度设定为200g/L。
第二溶液的配制
将Tetra-PEG-OSu溶解在PB中。此时，将PB的碱金属盐浓度设定为400mM。将PEG浓度设定为100g/L。
实施例7
将所述第一溶液(碱金属盐浓度400mM、PEG浓度200g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度400mM、PEG浓度100g/L)在空离心管中以相同的体积比混合。将该混合液用作包含浓度为150g/L的PEG和浓度为400mM的碱金属盐的凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。该结果表明：多孔结构的形成不依赖于构成水凝胶的高分子的支链数量。
4.使用了四支链PEG和肽的水凝胶的配制
作为原料高分子之一，使用末端具有琥珀酰亚胺基的Tetra-PEG-OSu(四琥珀酰亚胺基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100HS)。重均分子量(Mw)为10000。其中，作为与Tetra-PEG-OSu的反应的物质，使用作为一种肽的三赖氨酸(Lys-Lys-Lys、Sigma-Aldrich)。三赖氨酸的分子量为02.53g/mol。
第一溶液的配制
将三赖氨酸溶解在磷酸缓冲液(PB)中。此时，将PB的碱金属盐浓度设定为400mM。将三赖氨酸浓度设定为16.10g/L。
第二溶液的配制
将Tetra-PEG-OSu溶解在PB中。此时，将PB的碱金属盐浓度设定为400mM。将PEG浓度设定为100g/L。
实施例8
将所述第一溶液(碱金属盐浓度400mM、三赖氨酸浓度16.10g/L)和所述第二溶液(碱金属盐浓度400mM、PEG浓度100g/L)在空离心管中以相同的体积比混合，用作凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。该结果表明：如果第一溶液或者第二溶液中任意一个由PEG构成，则可以获得多孔结构体。
5.使用了四支链PEG和蛋白质的水凝胶的配制
作为原料高分子之一，使用末端具有琥珀酰亚胺基的Tetra-PEG-OSu(四琥珀酰亚胺基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100HS)。重均分子量(Mw)为10000。其中，作为与Tetra-PEG-OSu反应的物质，使用一种蛋白质明胶(nippi有限公司、商品名：APAT)。根据制造商的标称值，明胶的分子量约为60000g/mol。
第一溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的磷酸缓冲液(PB)中，使得K2SO4浓度变成500mM。此时，包括PB浓度为200mM及K2SO4浓度为500mM的总碱金属盐浓度变成700mM。将明胶溶解在该液体中。将明胶浓度设定为24g/L。
第二溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的PB中，使得K2SO4浓度变成500mM。此时，PB浓度为200mM及K2SO4浓度为500mM的总碱金属盐浓度变成700mM。将Tetra-PEG-OSu溶解在该液体中。将PEG浓度设定为100g/L。
实施例9
将第一溶液(总碱金属盐浓度700mM、明胶浓度24g/L)和所述第二溶液(总碱金属盐浓度700mM、PEG浓度100g/L)在空离心管中以相同的体积比混合，用作凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至玻璃瓶中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入玻璃瓶中的凝胶化溶液静置24小时。当玻璃瓶倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。该结果表明：当通过PEG交联蛋白质获得水凝胶时也可以提供多孔结构体。
6.使用了四支链PEG和多糖的水凝胶的配制
作为原料高分子之一，使用末端具有琥珀酰亚胺基的Tetra-PEG-OSu(四琥珀酰亚胺基聚乙二醇；SINOPEG公司、商品名：4-arm PEG-SC)。重均分子量(Mw)为10000。其中，作为与Tetra-PEG-OSu反应的物质，使用多糖。多糖中包括壳聚糖或透明质酸等，但在这里以壳聚糖为例(圣克鲁斯生物技术公司、商品名：羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan))。
第一溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的磷酸缓冲液(PB)中，使得K2SO4浓度变成0-500mM。此时，PB浓度为200mM及K2SO4浓度为0～500mM的总碱金属盐浓度变成200～700mM。将壳聚糖溶解在该液体中。将壳聚糖浓度设定为60g/L。
第二溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的PB中，使得K2SO4浓度变成0～500mM。此时，包括200mMPB和0～500mMK2SO4的总碱金属盐浓度变成200～700mM。将Tetra-PEG-OSu溶解在该液体中。将PEG浓度设定为120g/L。
比较例3
将所述第一溶液(总碱金属盐浓度200mM、壳聚糖浓度60g/L)和所述第二溶液(总碱金属盐浓度200mM、PEG浓度120g/L)在空离心管中以相同的体积比混合，用作凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至由特氟龙(teflon)制造而成的容器中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入由特氟龙(teflon)制造而成的容器的凝胶化溶液静置24小时。当由特氟龙(teflon)制造而成的容器倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成透明固体。即使用手指压缩所得透明水凝胶也不会排出水。
实施例10
将第一溶液(总碱金属盐浓度600mM、壳聚糖浓度60g/L)和所述第二溶液(总碱金属盐浓度600mM、PEG浓度120g/L)在空离心管中以相同的体积比混合，用作凝胶化溶液。将1mL凝胶化溶液放入连接至27G注射针头(内径0.22±0.03)的2.5mL注射筒中，排出至由特氟龙(teflon)制造而成的容器中。通过目视确认从凝胶化溶液的配制完成到排出完成至少5秒内的凝胶化溶液为液体。此后，在没有特别的外部刺激的情况下，将装入由特氟龙(teflon)制造而成的容器的凝胶化溶液静置24小时。当由特氟龙(teflon)制造而成的容器倾斜时，凝胶化溶液失去流动性，变成白色固体。当用手指压缩所得水凝胶时，观察到排出水的样子。该结果表明：当通过PEG交联多糖获得水凝胶时也可以提供多孔结构体。
7.水凝胶的透射率测量
作为原料高分子，使用末端具有-SH基的Tetra-PEG-SH(四巯基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100SH)以及末端具有琥珀酰亚胺基的Tetra-PEG-OSu(四琥珀酰亚胺基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100HS)。重均分子量(Mw)均为10000。
第一溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的磷酸缓冲液(PB)中，使得K2SO4浓度变成0～300mM中任一浓度。此时，PB浓度为200mM及K2SO4浓度为0～300mM的总碱金属盐浓度变成200～500mM。将Tetra-PEG-SH溶解在该液体中。将PEG浓度设定为20～100g/L中任一浓度。
第二溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的PB中，使得K2SO4浓度变成0～300mM中任一浓度。此时，PB浓度为200mM及K2SO4浓度为0～300mM的总碱金属盐浓度变成200～500mM。将Tetra-PEG-OSu溶解在该液体中。将PEG浓度设定为20～100g/L中任一浓度。
将具有相同总碱金属盐浓度和PEG浓度的一对第一溶液(总碱金属盐浓度200～500mM、PEG浓度20～100g/L)和所述第二溶液(总碱金属盐浓度200～500mM、PEG浓度20～100g/L)在空管中以相同的体积比混合，用作凝胶化溶液。将各凝胶化溶液以每孔200μL倒入到96孔微板中，并在25℃下静置24小时。此后，在拍摄各孔中形成的水凝胶的照片的情况下(图3)，使用Perkinelmer ARVO X3测量各孔的透射率(图4)。图3中肉眼看到的白色浊度与图4中的透射率有很好的相关性。发现：在PEG浓度为50g/L以上的情况下，当总碱金属盐浓度为400mM以上时，透射率远低于80％，形成白色浑浊的多孔结构。即使PEG浓度为20g/L时，也在总碱金属盐浓度为450mM以上的情况下确认到白色浑浊。在透射率为80％以上的水凝胶中，用手指压缩也未排出水。另一方面，观察到所有白色浑浊的水凝胶在用手指压缩时排出水的样子。这些结果表明：即使当PEG浓度较低时也可以通过提高总碱金属盐浓度来实现多孔化。
8.水凝胶的微观结构观察和溶胀度测量
作为原料高分子，使用末端具有-SH基的Tetra-PEG-SH(四巯基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100SH)以及在末端具有琥珀酰亚胺基的Tetra-PEG-OSu(四琥珀酰亚胺基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100HS)。重均分子量(Mw)均为10000。
第一溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的磷酸缓冲液(PB)中，使得K2SO4浓度变成0～300mM中任一浓度。此时，PB浓度为200mM及K2SO4浓度为0～300mM的总碱金属盐浓度变成200～500mM。Tetra-PEG-SH溶解在该液体中。将PEG浓度设定为100g/L。将溶解在二甲基亚砜中至浓度为1mg/mL的Alexa FluorTM 594C5马来酰亚胺(Maleimide)以Tetra-PEG-SH液的1vol％的量追加添加到已配制的Tetra-PEG-SH溶液中。
第二溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的PB中，使得K2SO4浓度变成0～300mM中任一浓度。此时，PB浓度为200mM及K2SO4的浓度为0～300mM的总碱金属盐浓度变成200～500mM。将Tetra-PEG-OSu溶解在该液体中。将PEG浓度设定为100g/L。
将具有相同总碱金属盐浓度和PEG浓度的一对第一溶液(总碱金属盐浓度200～500mM、PEG浓度100g/L)和所述第二溶液(总碱金属盐浓度200～500mM、PEG浓度100g/L)在空管中以相同的体积比混合，用作凝胶化溶液。将各凝胶化溶液倒入到由聚四氟乙烯制成的圆柱形模具(直径15mm、高度7mm)中并在25℃下静置24小时。此后，从模具中取出水凝胶。将该状态定义为刚制备后，拍摄各水凝胶的照片(图5的上排)。接下来，使用激发波长为590nm、荧光波长为617nm的共焦显微镜LSM 800(ZEISS)拍摄各水凝胶的共焦显微镜像(图5下排)。随后，将水凝胶浸渍于磷酸缓冲生理盐水(富士胶片和光纯药有限公司)中24小时。将该状态定义为平衡状态，再次拍摄各水凝胶的照片(图6上排)。类似地，还拍摄各水凝胶的共焦显微镜像(图6下排)。即使在平衡状态也保持白色浑浊状态和多孔结构。发现：在高总碱金属盐浓度下，以μm量级形成多孔结构，其结构即使在水中也能长时间保存。
进一步地，将水凝胶的平衡溶胀度Q定义为(d_eq/d_0)3并绘制(图7)。其中，“d_eq”为平衡状态下的水凝胶的直径，“d_0”为刚制备后的水凝胶的直径。在截止到350mM的总碱金属盐浓度下，平衡溶胀度相对平坦，另一方面，在400mM以上的总碱金属盐浓度下，平衡溶胀度具有增加的趋势。具体地，如果将总碱金属盐浓度为200mM的值设定为Q_low，则在400mM以上的总碱金属盐浓度中变成1.1*Q_low以上的值。由于这与上述微观结构观察的结果非常吻合，因此认为所生成的多孔结构影响了该值。即，可从平衡溶胀度间接地判断微观多孔结构的存在。
9.水凝胶的伸长时的断裂应力的测量
作为原料高分子，使用末端具有-SH基的Tetra-PEG-SH(四巯基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100SH)以及末端具有琥珀酰亚胺基的Tetra-PEG-OSu(四琥珀酰亚胺基聚乙二醇；日油有限公司、商品名：PTE-100HS)。重均分子量(Mw)均为10000。
第一溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的磷酸缓冲液(PB)中，使得K2SO4浓度变成0～250mM中任一浓度。此时，PB浓度为200mM及K2SO4浓度为0～250mM的总碱金属盐浓度变成200～450mM。Tetra-PEG-SH溶解在该液体中。将PEG浓度设定为100g/L。
第二溶液的配制
将K2SO4作为固体添加并溶解在配制成具有200mM碱金属盐浓度的PB中，使得K2SO4浓度变成0～250mM中任一浓度。此时，PB浓度为200mMPB及K2SO4浓度为0～250mM的总碱金属盐浓度变成200～450mM。将Tetra-PEG-OSu溶解在该液体中。将PEG浓度设定为100g/L。
将具有相同总碱金属盐浓度和PEG浓度的一对第一溶液(总碱金属盐浓度200～450mM、PEG浓度100g/L)和所述第二溶液(总碱金属盐浓度200～450mM、PEG浓度100g/L)在空管中以相同的体积比混合，用作凝胶化溶液。将各凝胶化溶液倒入到以JIS K6251定义的哑铃形由硅胶制成的模具中在25℃下静置24小时。此后，从模具中取出水凝胶。使用Autograph AG-X plus(岛津制作所)对各水凝胶进行拉伸试验，记录断裂时的应力σ(伸长时的断裂应力)。对各水凝胶进行5次相同的试验，绘制平均值和其标准差(图8)。在截止到350mM的总碱金属盐浓度下，伸长时的断裂应力相对平坦，另一方面，在400mM以上的总碱金属盐浓度下，伸长时的断裂应力具有增加的趋势。具体地，如果将总碱金属盐浓度为200mM的值设定为σ_low，则在400mM以上的总碱金属盐浓度中变成1.5*σ_low以上的值。由于这与上述微观结构观察的结果非常吻合，因此认为所生成的多孔结构影响了该值。即，可从伸长时的断裂应力间接地判断微观多孔结构的存在。

Claims (10)

1.具有多孔结构的水凝胶的制造方法，其特征在于，包括：
a)配制将化合物A溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂中的第一溶液；
b)配制将能够与化合物A化学交联的化合物B溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂的第二溶液；
c)将所述第一溶液和所述第二溶液混合，获得以300mM～1000mM的浓度包含一种以上碱金属盐的凝胶化溶液；以及
d)所述凝胶化溶液中的所述化合物A和化合物B在没有外部刺激的情况下形成化学交联，从而获得具有多孔结构的水凝胶，并且，
所述化合物A和B中的任一方为在侧链或者末端共计具有两个以上亲核性官能团或者亲电子性官能团的、直链、3支链、4支链或者8支链聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，从配制所述凝胶化溶液到凝胶化溶液变成固体的时间为1秒以上。
3.根据权利要求1或者2所述的制造方法，其特征在于，所述碱金属盐选自由磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸钠、乙酸钠、硫酸钾、硫酸钠以及其任意组合组成的组。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其特征在于，所述水凝胶在405nm波长处的最大透射率为80％以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其特征在于，所述水凝胶包含范围为20g/L～250g/L的所述聚乙二醇。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其特征在于，在所述第一溶液和所述第二溶液的混合溶液中，当将所述碱金属盐在200mM条件下形成的水凝胶的平衡溶胀度设定为Qlow，将在任意浓度的所述碱金属盐存在下形成的所述水凝胶的平衡溶胀度设定为Q时，Q满足关系式Q≥1.1*Qlow。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其特征在于，在所述第一溶液和所述第二溶液的混合溶液中，当将所述碱金属盐在200mM条件下形成的水凝胶的伸长时的断裂应力设定为σlow，将任意浓度的碱金属盐存在下形成的所述水凝胶的伸长时的断裂应力设定为σ时，σ满足关系式σ≥1.5*σlow。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其特征在于，所述化合物A和B中的一个为聚乙二醇；另一个由选自由聚乙二醇、肽、蛋白质、壳聚糖、透明质酸以及其衍生物组成的组中的一种以上构成。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其特征在于，所述工序d)中的所述外部刺激为光照射。
10.一种用于制作具有多孔结构的水凝胶的试剂盒，其特征在于，包括：
将化合物A溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂中的第一溶液；以及
将能够与化合物A化学交联的化合物B溶解在以0～1000mM的浓度包含碱金属盐的水性溶剂中的第二溶液，
当混合所述第一溶液和所述第二溶液时的碱金属盐的总浓度在300mM～1000mM的范围内，
所述化合物A和B中的任一方为在侧链或者末端共计具有两个以上亲核性官能团或者亲电子性官能团的、直链、3支链、4支链或者8支链聚乙二醇。
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