ES2883235T3 - Hidrogeles macroporosos inyectables - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para proporcionar un hidrogel macroporoso, que comprende los pasos de a) proporcionar una solución acuosa que comprenda un primer y un segundo soluto, en el que i) el primer soluto es un polímero que se puede entrecruzar seleccionado entre un derivado que se puede entrecruzar de un polietilenglicol (PEG) y un derivado que se puede entrecruzar de una polioxazolina (POx); y ii) el segundo soluto es un agente kosmotrópico polisacárido seleccionado del grupo que comprende hialuronano, mannuronano, carragenano, heparina, sulfato de condroitína, dextrano, hidroxipropil dextrano, pectina, alginato, goma gellan, celulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, almidón y hidroxipropilalmidón, en el que la concentración de dicho agente kosmotrópico polisacárido en dicha solución acuosa es de 0,1 a 50 % (p/v); y b) añadir a dicha mezcla un reactivo de entrecruzamiento capaz de entrecruzar dicho polímero que se puede entrecruzar, iniciando así simultáneamente la gelificación de dicho polímero que se puede entrecruzar y la separación de fases.

Description

DESCRIPCIÓN
Hidrogeles macroporosos inyectables
La presente invención se refiere a los hidrogeles macroporosos y a su uso en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.
Antecedentes de la invención
Los hidrogeles macroporosos son importantes en el campo de la ingeniería de tejidos porque tienen importantes ventajas sobre los materiales homogéneos en términos de propiedades mecánicas, estabilidad, propiedades de difusión/transporte de moléculas e invasión celular. Sin embargo, los procedimientos establecidos para formar hidrogeles macroporosos (lixiviación de sales, liofilización, formación de bolsas de gas) suelen requerir un templado previo del material en condiciones duras, seguido de la siembra de células; y no son inyectables, lo que induce un mayor traumatismo durante la eventual implantación en un paciente. Los pocos procedimientos descritos para producir hidrogeles inyectables compatibles con las células (por ejemplo, la fusión de micropartículas o la inclusión y degradación del porógeno) tienen, respectivamente, un paso de preprocesamiento muy pesada, para formar partículas de gel, o una lenta formación de poros debido a la lenta degradación del porógeno. También tienen un control limitado sobre el tamaño de los poros accesibles. También se han utilizado sistemas bifásicos para producir geles porosos, pero no en condiciones compatibles con la capacidad de inyección y la encapsulación celular.
El documento US2014343324 divulga biomateriales que comprenden redes / matrices poliméricas, que se forman haciendo reaccionar un primer polietilenglicol que tiene grupos nucleófilos con un segundo polietilenglicol que tiene grupos electrófilos.
El objeto de la presente invención es mejorar el estado de la técnica y proporcionar hidrogeles macroporosos inyectables y compatibles con los tejidos para su uso en medicina regenerativa. Este objeto se consigue con el objeto de las reivindicaciones independientes.
Términos y definiciones
En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término polialquiloxazolina (POx) se refiere a un polímero de un derivado alquílico (particularmente un metil-, etil- o propil-sustituido) de oxazolina u oxazina.
En el contexto de la presente memoria descriptiva, el polietilenglicol (PEG) se refiere a un polímero de fórmula general H-(O-CH2-CH2)n-OH (CAS No. 25322-68-3).
En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término PEG/POx en forma de estrella se refiere a los polímeros ramificados que consisten en varias (más de tres) cadenas lineales de PEG/POx conectadas a un núcleo central. El núcleo del polímero puede ser un solo átomo, una molécula o una macromolécula. Para enlazar las cadenas de polietilenglicol o de polialquiloxazolina son especialmente comunes pentaeritritol (CAS 115-77-5), 2-hidroximetil-1,3-propanediol (CAS 4704-94-3), dipentaeritritol (CAS126-58-9), tripentaeritritol (CAS 78-24-0), glicerol, tetrakis(bromometil)etileno (CAS 30432-16-7), 1,3,5 tribromofenilo, 1,3,5 trihidroxifenilo, silicio y fracciones de dialquilsilano.
En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término hialuronano (o sus sinónimos ácido hialurónico o hialuronato), abreviado HA, se refiere a un polímero de una unidad de repetición que comprende una fracción de ácido D-glucurónico y una fracción de N-acetilglucosamina en enlace alterno p-1,3 y p-1,4 de fórmula general.
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El peso molecular de la unidad de repetición es de 379 g/mol. El hialuronano en el cuerpo puede superar las 2.500 unidades de repetición (n) por molécula. El hialuronano está referenciado en CAS No. 9004-61-9 (ácido), 9067-32-7 (sal sódica) y 31700-91-4 (sal potásica).
El mannuronano (MA) es un polímero lineal de residuos de p-D-manuronato unidos por enlaces (1-4) (CAS No. 6814­ 36-4).
Se entiende que cuando se utiliza en el presente documento, el término polímero para uno cualquiera de los polímeros recitados en el presente documento, puede implicar un polímero de los monómeros mencionados, algunos de los cuales están sustituidos por grupos reactivos para permitir el entrecruzamiento.
Los valores de masa molecular (peso molecular promedio en número), cuando se utilizan en el presente documento para definir polímeros u otras macromoléculas, se determinan mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) utilizando estándares casi monodispersos (índice de polidispersidad entre 1,0 y 1,1) del mismo polímero para la calibración, como se describe en detalle en Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography: Practice of Gel Permeation and Gel Filtration Chromatography' por Andre Striegel, Wallace W. Yau, Joseph J. Kirkland y Donald D. Bly, John Wiley & Sons, 2009salvo que se indique lo contrario. La masa de los estándares se mide mediante desorción/ionización láser asistida por matriz - espectroscopia de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término agente kosmotrópico se refiere a cualquier agente que en soluciones acuosas pueda formar sistemas difásicos con soluciones acuosas de PEG o POx.
Sumario de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para proporcionar un gel macroporoso, que comprende los pasos de
a) proporcionar una solución acuosa que comprenda un primer y un segundo soluto, en el que el primer soluto es un polímero que se puede entrecruzar seleccionado entre un derivado que se puede entrecruzar de un polietilenglicol (PEG) y un derivado que se puede entrecruzar de una polioxazolina (POx) y el segundo soluto es un agente kosmotrópico polisacárido seleccionado del grupo que comprende hialuronano, mannuronano, carragenano, heparina, sulfato de condroitína, dextrano, hidroxipropil dextrano, pectina, alginato goma gellan, celulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, almidón y hidroxipropilalmidón, en el que la concentración de dicho agente kosmotrópico polisacárido en dicha solución acuosa es de 0,1 a 50 % (p/v); y
b) añadir a esta mezcla un reactivo que se puede entrecruzar capaz de entrecruzar el polímero que se puede entrecruzar, iniciando así simultáneamente la gelificación del polímero que se puede entrecruzar y la separación de fases.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar se selecciona del grupo que comprende un polietilenglicol en forma de estrella, un copolímero dibloque de polietilenglicol y un copolímero tribloque de polietilenglicol; o del grupo que comprende una polimetiloxazolina, una polietiloxazolina, una polipropiloxazolina y una polibutiloxazolina; o el grupo que comprende una polioxazolina en forma de estrella y un copolímero de oxazolina, en particular un copolímero de 2-metil oxazolina y una 2-etil oxazolina con un ácido carboxílico o un alcohol que contenga oxazolina, en particular la 2-carboxietil oxazolina o la 2-hidroxietil oxazolina; o el grupo que comprende poli 2-metil oxazolina o poli 2-etil oxazolina parcialmente hidrolizados.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un polietilenglicol lineal.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un polietilenglicol en forma de estrella que tiene un núcleo de pentaeritritol y un peso molecular de 10 a 40 kg/mol, particularmente de aproximadamente 20 kg/mol (tal como el producto Sigma número JKA7025). En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un polietilenglicol en forma de estrella de 10 a 40 kg/mol que tiene un núcleo de dipentaeritritol (tal como el producto Sigma número JKA10034). En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un polietilenglicol en forma de estrella que tiene un núcleo de glicerol.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un copolímero dibloque de polietilenglicol que comprende un copolímero de polietilenglicol y polietileno (PE) o polilactida (PLA) o polilactida-co-glicolida (PLGA) o poli-£-caprolactona (PCL) o poliestireno.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un copolímero tribloque de polietilenglicol que comprende un copolímero de polietilenglicol y polipropilenglicol (PPG) o un copolímero de polietilenglicol y polilactidaco-glicolida (PLGA).
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un copolímero de polietilenglicol que comprende al menos 50 % de PEG y al menos otro polímero seleccionado entre PCL, PPG y PLGA.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es una polioxazolina que comprende un copolímero aleatorio de una metiloxazolina o etiloxazolina con carboxietiloxazolina, y los ácidos carboxílicos están sustituidos con fracciones reactivas, particularmente sustituidos con una o más fracciones reactivas seleccionadas del grupo que consiste en un tiol, una vinilsulfona, una maleimida, un péptido sustrato de la transglutaminasa, una tiramina, una dopamina, un acrilato, un metacrilato, un éster vinílico, un alquino, una azida, un aldehido y una acrilamida, más particularmente del grupo que consiste en un tiol, una vinilsulfona, una maleimida, un acrilato y un metacrilato.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es una polioxazolina en forma de estrella polimerizada a partir de un iniciador de tetrakis(bromometil)etileno. En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es una polioxazolina en forma de estrella polimerizada a partir de un iniciador de 1,3,5-tribromofenilo.
En ciertas realizaciones, cualquiera de los polímeros de polioxazolina en forma de estrella mencionados en el presente documento está terminado con un grupo hidroxilo, amino o ácido carboxílico, que en ciertas realizaciones adicionales está además sustituido con una o varias fracciones reactivas como se especifica en el presente documento, particularmente seleccionados entre un tiol, una vinilsulfona, una maleimida, un péptido sustrato de la transglutaminasa, una tiramina, una dopamina, un acrilato, un metacrilato, un éster vinílico, un alquino, una azida, un aldehído y una acrilamida. En ciertas realizaciones alternativas, las polioxazolinas en forma de estrella se terminan directamente con motivos reactivos apagando la polimerización de la oxazolina con el grupo que se puede entrecruzar deseado.
En ciertas realizaciones, la polioxazolina lineal se hidroliza parcialmente para eliminar entre el 1 y el 40% de sus cadenas laterales (por ejemplo, la liberación de acetato de la poli(2-metil-2-oxazolina), mediante la ebullición en agua en presencia de un ácido o una base, y las aminas secundarias liberadas se sustituyen con fracciones reactivas.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar comprende una fracción reactiva seleccionada del grupo que comprende acrilato, metacrilato, acrilamida, éster de vinilo, maleimida, sulfona de vinilo, alquino, azida, aldehído, tiramina, dopamina y fracciones de tiol. La fracción reactiva se añade al final de las cadenas de un polímero en forma de estrella, o en aproximadamente el 5 al 25 % de las cadenas laterales de un polímero lineal.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar comprende como una fracción reactiva péptidos de sustrato de transglutaminasa, específicamente péptidos de sustrato del factor XIII de coagulación sanguínea, más específicamente péptidos que contienen las secuencias FKGG y NQEQVSPL.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar está modificado con vinilsulfona y el reactivo de entrecruzamiento es una molécula enlazadora corta que comprende dos fracciones de tiol (-SH), particularmente una molécula que comprende dos grupos SH separados por una cadena de alquilo o heteroalquilo que comprende de dos a diez átomos de carbono o hetero, o un péptido que comprende dos bloques de aminoácidos de cisteína.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar está modificado con vinilsulfona y dicho reactivo de entrecruzamiento se selecciona del grupo que comprende un polímero hidrofílico sustituido con fracciones de tiol, particularmente fracciones de tiol primario, en particular un polietilenglicol en forma de estrella que comprende fracciones de tiol primario (-CH2SH) o un polietilenglicol lineal que comprende fracciones de tiol primario (-CH2SH), y un péptido que contiene de dos a cien, en particular de dos a veinte, más particularmente de cuatro a dieciséis aminoácidos, en el que dos de dichos aminoácidos son cisteínas particularmente un péptido susceptible de ser escindido por endopeptidasas, más particularmente metaloproteinasas de matriz, aún más particularmente un péptido de la secuencia de aminoácidos GCRD-GPQGIWGQ-DRCG o GCRE-GPQGIAGQ-ERCG.
En ciertas realizaciones, el peso molecular del polímero que se puede entrecruzar es de 1.000 a 1.000.000 g/mol, particularmente de 10.000 a 40.000 g/mol.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un polímero lineal de 50 a 1.000 monómeros de longitud, particularmente de 75 a 500 monómeros, aún más particularmente de 100 a 300 monómeros, más particularmente de 150 monómeros de longitud.
En ciertas realizaciones, la concentración del polímero que se puede entrecruzar en la solución acuosa es del 0,2 % al 50 % (p/v), particularmente del 0,5 % al 10 % (p/v).
En ciertas realizaciones, la solución acuosa comprende del 0,5 % al 3 % (p/v) de dicho derivado que se puede entrecruzar de un polietilenglicol o del 1 % al 10 % (p/v) de dicho derivado que se puede entrecruzar de una polioxazolina.
El agente kosmotrópico es un agente kosmotrópico polisacárido seleccionado del grupo que comprende hialuronano, mannuronano, carragenano, heparina, condroitín sulfato, dextrano, hidroxipropil dextrano, pectina, alginato, goma gellan, celulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, almidón, hidroxipropil almidón, y en el que particularmente dicho polisacárido se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 1.000 g/mol a 10.000.000 g/mol, más particularmente 10.000 g/mol a 2.000.000 g/mol, aún más particularmente 100.000 g/mol a 1.000.000 g/mol, aún más particularmente aproximadamente 150.000 g/mol.
La concentración del agente kosmotrópico polisacárido en la solución acuosa es del 0,1 % al 50 % (p/v), particularmente del 0,1 % al 5 %, incluso más particularmente del 0,35 % al 0,5 % (p/v).
En ciertas realizaciones, la solución acuosa comprende de 0,1 % a 1 % de hialuronano, en particular aproximadamente 0,4 % de hialuronano, o de 0,5 % a 5 % de mannuronano, en particular aproximadamente 2% de mannuronano, o de 0,1 % a 10 % de dextrano o una mezcla de los mismos.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es 20.000 g/mol de PEG-vinilsulfona de 4 brazos, el polisacárido es el mannuronano, y el reactivo de entrecruzamiento es un péptido escindible por la metaloproteinasa de la matriz, particularmente un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos GPQGIWGQ. En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es 20.000 g/mol de PEG-vinilsulfona de 4 brazos, el polisacárido es mannuronano, y el reactivo de entrecruzamiento es el péptido GCRD-GPQGIWGQ-DRCG.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un derivado de acrilato, metacrilato, acrilamida, éster de vinilo o maleimida, y se utiliza un iniciador de radicales para desencadenar la gelificación tras el calentamiento o la exposición a la luz. En particular, el PEG-diacrilato lineal o el PEG-dimetacrilato de 1 a 10 kg/mol o el POx-diacrilato o el POx-dimetacrilato de 1 a 10 kg/mol en presencia de un iniciador radical activado por la luz.
En ciertas realizaciones, el iniciador radical es Irgacure 2959 en concentraciones de 0,01 % a 1 % (p/v), particularmente de 0,025 % a 0,1 % (p/v), y se utiliza luz azul a casi UV para desencadenar el entrecruzamiento , particularmente luz a unos 365 nm y 10 mW/cm2
En ciertas realizaciones, el iniciador de radicales es 2,2-dimetil-2-fenil-acetofenona, particularmente en presencia de N-vinil pirolidona, o acilfosfinato de litio, o rosa bengala en presencia de una amina tal como trietanolamina en presencia de N-vinil pirolidona.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un péptido derivado del sustrato de la transglutaminasa, y se añade una transglutaminasa para provocar la gelificación. En particular, los PEG con forma de estrella terminados con péptidos que contienen las secuencias FKGG y NQEQVSPL se entrecruzan con la adición del factor de coagulación sanguínea XIII activado por la transglutaminasa.
En ciertas realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar es un derivado de la tiramina o de la dopamina, y se utiliza peroxidasa de rábano picante con peróxido de hidrógeno para desencadenar el entrecruzamiento. Alternativamente, o se utiliza un iniciador de oxígeno singlete fotosensible, tal como rosa de bengala, eosina-Y, azul de metileno, o riboflavina combinada con la exposición a la luz visible en el visible o cerca del UV. En particular, se utilizan concentraciones de riboflavina de 1 a 100 pmol/l y de rosa de Bengala, eosina-Y o azul de metileno de 0,01 a 1 % (p/v) y se exponen a luz UV/visible cercana para provocar la gelificación. La peroxidasa de rábano picante se utiliza de 0,1 a 10 unidades/ml con 0,01 a 1 mmol/l de peróxido de hidrógeno, particularmente 1 unidad/ml con 0,1 mmol/L de peróxido de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, la solución acuosa se caracteriza por tener un pH de 7,0-8,0, en particular aproximadamente 7,4; y la adición de dicho agente de entrecruzamiento se produce entre 20 °C y 40 °C, en particular aproximadamente 37 °C.
En ciertas realizaciones, se añade una célula, particularmente una célula de mamífero, a la solución acuosa antes del entrecruzamiento.
En ciertas realizaciones, la mezcla acuosa se pasa a través de una jeringa 10 segundos a15 minutos después de la adición del agente entrecruzamiento y/o se observa un gel sólido macroporoso 1-60 minutos después de la adición del agente de entrecruzamiento.
En ciertas realizaciones, el agente de entrecruzamiento y el polímero que se puede entrecruzar se cargan por separado en una jeringa de doble barril, con el agente kosmotrópico a cada lado, y los dos barriles se mezclan al inyectarse, lo que resulta en la formación de un gel sólido macroporoso después de 1-30 min.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un hidrogel macroporoso, caracterizado porque está compuesto por un polímero entrecruzado, en el que dicho polímero entrecruzado es un derivado de un polietilenglicol o un derivado de una polioxazolina; y presenta macroporos interconectados caracterizados por un tamaño de 200 nm a 1.000 pm, particularmente caracterizados por un tamaño de 500 nm a 100 pm; y el gel se caracteriza además por un pH de 7,0 a 8,0, particularmente de manera aproximada 7,4.
En ciertas realizaciones, el gel está hecho de uno cualquiera de los polímeros mencionados anteriormente como polímeros que se puede entrecruzar.
En ciertas realizaciones, el hidrogel macroporoso es transparente; y su rigidez es de 1-500.000 Pa, específicamente 10-10.000 Pa, específicamente 10-1.000 Pa, incluso más específicamente 50-500 Pa.
En ciertas realizaciones, el hidrogel macroporoso comprende una célula viable.
En ciertas realizaciones, el hidrogel macroporoso comprende una neurona que comprende neuritas funcionales y conectadas sinápticamente.
En ciertas realizaciones, el hidrogel macroporoso se utiliza en un procedimiento de tratamiento de lesiones nerviosas o de la médula espinal, en el que dicho gel se injerta o se gelifica in situ en el lugar de la lesión, con o sin un conducto de soporte adicional.
En ciertas realizaciones, el hidrogel macroporoso se utiliza para apoyar la regeneración de tejidos. En particular, el hidrogel macroporoso se precultiva con o sin células y se injerta, o el hidrogel macroporoso se gelifica in situ en el lugar de la lesión con o sin células, para favorecer la regeneración. Más concretamente, las neuronas, las células madre neurales, las células progenitoras neurales, los astrocitos, los oligodendrocitos, los fibroblastos, las células endoteliales, los osteocitos, los condrocitos, las células madre mesenquimales o los mioblastos se encapsulan en el gel que se entrega en el nervio, la médula espinal, la piel, el hueso, el cartílago o el disco intervertebral.
Descripción detallada de la invención
En esta invención, se proporciona una solución acuosa de dos solutos. Se sabe que los dos solutos pueden formar un sistema bifásico acuoso. Las concentraciones de los dos solutos no son lo suficientemente altas como para generar una separación de fases, por lo que inicialmente son miscibles. Uno de los dos solutos es un polímero, que luego se entrecruza químicamente, lo que implica que el peso molecular del polímero aumenta con el tiempo, dando lugar a la formación de un gel. Pero en este procedimiento, el aumento del peso molecular desencadena la separación de fases, que en la mayoría de los casos se ve favorecida por los pesos moleculares más altos. Esto da lugar a la formación de poros dinámicos durante el procedimiento de gelificación. Este procedimiento es compatible con la inyección en un animal o en un paciente, y con la encapsulación de células. En las realizaciones típicas, el polietilenglicol (PEG) en forma de estrella o las polimetiloxazolinas (POx) se modifican con vinilsulfonas y se utilizan como polímero que se puede entrecruzar que formará la fase de gel en presencia de un agente de entrecruzamiento (molécula que contiene dos o más tioles). El segundo soluto es un agente kosmotrópico polisacárido que puede formar sistemas acuosos de dos fases con PEG y POx. El segundo soluto es un polisacárido tal como el hialuronano, el mannuronano y el dextrano. También se pueden combinar varios derivados de PEG/Pox o varios agentes kosmotrópicos. Estos tres componentes se mezclan, formando inicialmente una solución homogénea. Esta mezcla puede utilizarse para suspender células, y puede inyectarse o ponerse en forma en un molde o en un soporte de cultivo celular, ya que es una solución líquida homogénea. Con el progreso del entrecruzamiento, se desencadena la separación de fases, con una fase rica en polímeros entrecruzados (PEG/POx) y una fase rica en polisacáridos. Sólo la fase PEG/POx dará lugar a un gel, la fase de polisacáridos permanecerá líquida, creando así un hidrogel macroporoso.
En todas las realizaciones, el polímero que se puede entrecruzar comprende, ha sido modificado con, una fracción reactiva que puede ser entrecruzada.
El entrecruzamiento covalente se consigue a través de cualquier medio químico conocido por el técnico experto, incluyendo, pero sin limitarse a: la polimerización por radicales libres de metacrilatos, acrilatos, acrilamidas, ésteres de vinilo u otras moléculas que contengan eno; la adición de tiol-eno, la adición de Michael en otros aceptores tal como maleimidas o acrilatos. El tiol puede ser cualquier péptido o proteína que contenga varios tioles, típicamente pero no necesariamente introducidos a través de residuos de cisteína. El componente tiol puede ser también un polímero tiolado, tal como el PEG lineal o ramificado con extremos tiolados, o el POx con tioles en las cadenas laterales o en los extremos con forma lineal o ramificada. También puede utilizarse el entrecruzamiento enzimático mediante la oxidación de tiraminas o dopamina, o con una transglutaminasa. Otros medios clásicos serían la formación de bases de Schiff a partir de un aldehído o un grupo amino, la química catalizada por cobre o promovida por tensión de la azida-ina, la reacción de Diels alder, la cicloadición 2+2, la conjugación de la amina azida o hidrazida con ácidos carboxílicos activados por carbodiimida, y otros. El entrecruzamiento también puede producirse a través de interacciones no covalentes, tal como las interacciones hidrófobas (por ejemplo, plurónicas), o el reconocimiento específico (por ejemplo, estreptavidina-biotina).
Cualquier otro polisacárido o derivado de polisacárido podría utilizarse para el segundo soluto kosmotrópico, tales como los polisacáridos nativos/naturales ejemplificados por la pectina, el alginato, la goma gellan, la celulosa, el mannuronano, el hialuronano, el dextrano o los derivados de cualquiera de estos polisacáridos naturales anteriores. Estos polisacáridos se caracterizan por tener un peso molecular en el intervalo de 1.000 g/mol a 10.000.000 g/mol, particularmente de 10.000 g/mol a 2.000.000 g/mol, más particularmente de 100.000 g/mol a 1.000.000 g/mol, incluso más particularmente de aproximadamente 150.000 g/mol. La fase excluyente del polímero también puede ser un nuevo polímero polisacárido sintético, siempre que no se pierda la separación de fases.
El procedimiento de la invención es muy barato, fácil y rápido de usar y trivial a escala, lo que no es el caso de otros procedimientos. A diferencia de los procedimientos y geles de la técnica anterior, el procedimiento y los geles de la invención proporcionan simultáneamente todas las propiedades deseadas de un hidrogel macroporoso inyectable. Entre ellas se encuentran la biocompatibilidad con la encapsulación de células, la formación de poros in situ (incluso in vivo en un paciente, en teoría), la sintonización total del tamaño del macroporo en un intervalo muy amplio y la facilidad de manipulación. Además, el procedimiento también proporciona interconectividad de los poros, una perfecta transparencia del hidrogel, una excelente permisividad del hidrogel a la invasión celular y una mayor estabilidad.
El uso directo es el cultivo in vitro en 3D para los cribados. Los hidrogeles funcionan tan bien como los actuales estándares de oro, en particular para los cultivos de neuronas en 3D, aunque existen otras alternativas, tales como los geles de fibrina, los geles de colágeno y el matrigel. Sin embargo, estas matrices son de origen animal, lo que plantea serios problemas de riesgo de inmunogenicidad o de contaminación por virus, así como mayores costes, y suelen degradarse demasiado rápido en presencia de células, todo lo cual se supera con los presentes hidrogeles. No se han descrito otros hidrogeles totalmente sintéticos que proporcionen una excelente viabilidad y crecimiento de neuritas en 3D de las neuronas encapsuladas como es el caso aquí. Para la entrega in vivo de células y la formación de gel macroporoso, los procedimientos alternativos conocidos tienen serias limitaciones que sólo esta invención supera. Ninguna solución anterior permitía obtener hidrogeles macroporosos inyectables de fácil manipulación, formación directa de poros y compatibilidad celular. Además, el protocolo actual es especialmente sencillo de poner en marcha y más flexible en cuanto a la gama de tamaños de poro y rigidez fácilmente accesibles.
La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos y figuras, de los que pueden extraerse otras realizaciones y ventajas. Estos ejemplos pretenden ilustrar la invención, pero no limitar su alcance.
Ejemplos
Se proporciona un protocolo que demuestra un crecimiento de neuritas en 3D sin precedentes y estabilidad en presencia de DRGs encapsulados y neuronas centrales disociadas (corticales primarias de rata y derivadas de iPSC humanas) con base en la formación de una red macroporosa interconectada. La clave de este protocolo es el uso de polisacáridos (PS) de alto peso molecular no modificados para la exclusión del polietilenglicol (PEG) (hialuronano (HA) o el mannuronano (MA) no interactivo). La exclusión del PEG de la fase PS mejora la cinética del entrecruzamiento mediante la adición por Michael de tioles en las vinil sulfonas (VS), de modo que la gelificación se produce en cuestión de minutos en medios a pH fisiológico, en lugar de requerir un pH 8,0 que es perjudicial para las células sensibles, tales como las neuronas.
La separación de fases entre el PEG y los polisacáridos también da lugar a geles con mayor estabilidad y crecimiento de las neuritas en comparación con los equivalentes no microestructurados. Las señales de adhesión, tales como las proteínas o los péptidos de unión a las integrinas, son innecesarias en este sistema, lo que ejemplifica la abrumadora importancia de las propiedades físicas en la ingeniería de una ECM permisiva para las neuritas. En condiciones optimizadas, las neuronas corticales encapsuladas extendieron sus neuritas a un ritmo típico de 100 pm/neurona/día desde la primera semana y formaron sinapsis en la matriz sintética, lo que dio lugar a redes neuronales 3D con actividad eléctrica coordinada espontánea al cabo de dos semanas, permaneciendo estables durante al menos un mes en cultivo.
Microestructura de hidrogeles de PEG con PSs
Se sabe desde hace tiempo que el PEG forma sistemas acuosos bifásicos con el dextrano y algunas sales, debido a sus propiedades de organización del agua. Este efecto físico se ha utilizado ampliamente para las extracciones de proteínas, y ha demostrado ser útil para la formación de microesferas de gel, pero su potencial para el autoensamblaje in situ de andamios macroporosos aún no se ha demostrado. Esto se debe probablemente a que la separación de fases procede típicamente a través de la formación rápida de microesferas, con la subsiguiente fusión y decantación, lo que no proporciona redes percoladoras de poros y gel. Las redes interconectadas pudieron obtenerse mediante el foto-entrecruzamiento durante la noche bajo el volteo del dextrano de una mezcla de PEG-dextrano de alto porcentaje. A pesar de sus méritos, este procedimiento no permite la gelificación y la encapsulación celular in situ, y los andamios resultantes tienen poca transparencia. Los inventores descubrieron que la clave para generar hidrogeles macroporosos de forma compatible con la encapsulación e inyección de células era combinar bajos contenidos de polímeros y altas viscosidades. El bajo contenido de polímeros garantiza que las soluciones de PEG y de polisacáridos sean inicialmente miscibles. A continuación, la separación de fases, que en los sistemas acuosos depende en gran medida del peso molecular, se desencadena por la elongación de las cadenas de PEG que se produce en presencia del agente de entrecruzamiento (Fig. 7).
La Figural muestra dos implementaciones típicas de este procedimiento, que dan como resultado geles con microestructuras radicalmente diferentes: 1,5 % de PEG-VS de 4 brazos (p/v) (polietilenglicol en forma de estrella, con terminación de vinilsulfona) entrecruzado con péptidos escindibles por m Mp (que contienen dos cisteínas que proporcionan tioles para el entrecruzamiento por adición de Michael) con el 70 % (v/v) de una solución de 2 % de manuronano (MA) (p/v) o una solución de hialuronano (HA) al 0,5% (p/v) respectivamente (denotados PEG+MA y PEG+HA). La gelificación se realiza en medio de cultivo celular (Neurobasal+B27) complementado con tampón HEPES de pH 7,4. Los polisacáridos se eligieron por ser químicamente inertes, por estar disponibles en alto peso molecular para garantizar una alta viscosidad a baja concentración, y por no tener ningún (para MA) o poco (para HA) efecto biológico específico. Las concentraciones de las soluciones madre de HA/MA se ajustaron para obtener viscosidades complejas similares en un amplio intervalo de frecuencias (Fig. 2b), con viscosidades estáticas cercanas a 1 Pa (similares al glicerol a RT). La ventaja de partir de una solución homogénea es que la microestructura final no depende del protocolo exacto de mezcla o inyección, siempre y cuando la solución inicial esté bien mezclada: es la base para la formación de poros reproducibles, homogéneos e isótropos. Para cuantificar el tamaño de los poros, la conectividad y la isotropía, se utilizó un derivado de PEG-VS de 4 brazos con una etiqueta fluorescente y un microscopio confocal de barrido láser (CLSM). El gel de PEG formado en ausencia de polisacárido parecía perfectamente homogéneo (la distancia entre las cadenas de PEG se estima en 5 a 50 nm y el límite de difracción en las condiciones de imagen utilizadas es de 185 nm), mientras que los geles de PEG formados en presencia de HA o MA eran macroporosos (Fig. 1a,c). La inspección en 3D reveló que los poros estaban totalmente interconectados. Se calculó la función de autocorrelación (Fig. 1e), que resultó ser isotrópica. La cuantificación del tamaño de los poros se realizó ajustando los datos con el modelo de esfera penetrable (Fig. If), lo que arrojó unos tamaños de poro típicos de 0,82+/-0,1 |jm para PEG+HA y 2,39+/-0,16 jm para PEG+MA. Los valores de R2 fueron >0,8, lo que demuestra una buena concordancia con el modelo. La fracción de volumen de los poros, S2(0), resultó ser del 58+/-4 % para el PEG+MA y del 43+/-1,6 % para el PEG+HA (este último valor debe tomarse con precaución, ya que los poros creados en presencia del HA están cerca del límite de difracción, y por tanto aparecen borrosos; los poros en el PEG+MA, en cambio, están bien resueltos). Cabe destacar que las soluciones de HA y MA de la misma viscosidad dan lugar a estructuras porosas drásticamente diferentes: esto es de esperar ya que se sabe que la cinética de separación de fases depende no sólo de la viscosidad sino también de la tensión interfacial. El tamaño de los poros también puede ajustarse mediante la adición de cantidades variables de dextrano, que proporciona una exclusión más rápida del PEG sin cambiar notablemente la viscosidad, para obtener poros de tamaño ajustable (datos no mostrados).
Los bajos contenidos de polímeros también garantizan pequeñas diferencias de densidad e índice óptico entre ambas fases. Lo primero es interesante para evitar la sedimentación, que daría lugar a diferencias entre el tamaño de los poros en la parte superior e inferior de los geles. Esto último evita la difracción de la luz dentro de los geles, lo que da lugar a una perfecta transparencia del gel (Fig. 8), algo relativamente excepcional para los andamios macroporosos. Esto permite obtener imágenes ópticas a varios milímetros de profundidad y observar fácilmente las células en contraste de interferencia diferencial (DIC). Estos geles macroporosos percoladores son de gran interés para las aplicaciones de ingeniería de tejidos, ya que tienen pasajes libres que maximizan las propiedades de transporte y permiten la rápida extensión de las neuritas o la invasión de las células, dependiendo del tamaño de los poros. Estos grandes poros interconectados se encuentran normalmente en matrices fibrilares naturales como el colágeno y la fibrina, pero no en los clásicos hidrogeles químicamente entrecruzados, que suelen tener un tamaño de poro de 5-50 nm.
Cinética de gelificación
Un aumento de la viscosidad da lugar a una difusión más lenta y, por tanto, a una cinética. Pero este efecto es más que contrarrestado por la concentración a través de la exclusión de volumen, y como resultado se formaron geles de PEG porosos con una cinética mejorada. Es particularmente interesante porque esto permitió la formación de geles con una cinética óptima a pH fisiológico, mientras que normalmente sólo se consiguen buenos tiempos de gelificación a pH 8,0 (Fig. 2a/c), que es estresante para las células en general y puede provocar el daño o la muerte de células sensibles tales como las neuronas. La alta viscosidad también impide la sedimentación de las células antes de que se produzca la gelificación.
Encapsulación de los ganglios de la raíz dorsal (DRG)
Los DRG son el modelo in vitro más común de regeneración de axones periféricos y, como explantes completos, son fáciles de cultivar debido a su resistencia al estrés químico y biológico. Normalmente se cultivan en 2D para probar la bioactividad de diversos sustratos y en 3D en fibrina o colágeno, aunque estos tienden a degradarse en pocos días debido a la alta concentración de proteasas alrededor del explante. Los investigadores descubrieron que los geles de PEG porosos no degradables eran permisivos con la invasión de los axones periféricos, y estables durante largos periodos de tiempo (Fig. 3). Para ello, se encapsularon explantes de DRG de embrión de pollo E9.5 en discos (4 mm x 1,5 mm) de gel de PEG formado por 0,8 % de 4 brazos de PEG-VS (p/v), entrecruzado con una cantidad estequiométrica de PEG ditiol en presencia de 0,525 % de HA (p/v) y 1,4 % de dextrano (p/v)). Las imágenes de todo el gel de los procedimientos de células vivas (teñidas con calceína Am) después de 30 días revelaron que todo el gel había sido invadido por una densa malla de axones, mostrando permisividad, así como estabilidad a largo plazo. La muerte celular era obvia en la superficie del explante, pero no en el interior, como se observa en el patrón de tinción de yoduro de propidio (PI, muerto) / Calceína AM (vivo). Esto sugiere que la capa celular externa ayuda a proteger las células internas del estrés asociado a la encapsulación.
Redes neuronales 3D de neuronas corticales de rata en PEG poroso
Se encapsularon neuronas corticales primarias de rata en geles macroporosos formados con cantidades crecientes de HA (Fig. 4). Se cuantificó la viabilidad de las neuronas, la tasa de crecimiento de las neuritas y la degradación del gel, ya que son los parámetros más críticos para optimizar la formación de redes neuronales en 3D. El producto comercial Q-gel se utilizó como control del gel de PEG clásico no poroso, ya que representa el estándar de oro actual y ha tenido éxito para la encapsulación de muchos tipos de células diferentes.
Para esta serie de experimentos, dado que se sabe que las neuronas crecen mejor en matrices de fibrina y colágeno muy blandas, los investigadores eligieron una concentración de 1,5 % de PEG (p/v), que tiene un módulo de almacenamiento de 70 Pa justo después de la gelificación. También utilizaron péptidos escindibles por MMP para el entrecruzamiento, ya que los experimentos piloto mostraron una viabilidad notablemente reducida cuando se utilizó un agente de entrecruzamiento no escindible (Fig. 13). Para intentar explicar esto, los investigadores encontraron que PEG-VS de 4 brazos marcados con TMR podían ser absorbidos por las neuronas durante el tiempo de formación del gel (Fig. 12), y por lo tanto hipotetizaron que las neuronas deberían ser capaces de metabolizar los fragmentos del gel para prevenir la toxicidad. Esta restricción no se aplica a las neuronas que se cultivan en forma de agrupaciones, ya que las neuronas externas proporcionan una protección contra la exposición al PEG, y las agrupaciones pueden cultivarse directamente en geles de PEG porosos no degradables (por ejemplo, la Fig. 3). Las cuantificaciones dos días después de la encapsulación (D2) mostraron que las neuronas conservaban una viabilidad muy alta (>95 %) en los geles porosos (Fig. 4d), lo que supone un punto de partida importante, lejos del alcance del que podría ser el gel sintético de soporte de neuronas más exitoso actualmente, Puramatrix. La viabilidad en el control Q-gel se redujo al 70 %, probablemente debido a la corta exposición a un pH más alto, así como al mayor contenido de PEG utilizado en el enfoque clásico. La extensión de las neuritas fue ~100 pm/neurona en promedio en D2, independientemente del porcentaje de HA (Fig. 4c), lo que demuestra que la baja rigidez elegida es adecuada para soportar la rápida extensión de las neuritas. La microestructuración tuvo una gran influencia en la estabilidad de los geles: el aumento de las cantidades de HA dio lugar a una menor degradación macroscópica (Fig. 4b). Los geles formados sin HA se degradaron por completo en dos días (por lo que esta condición no aparece en la Fig. 4), mientras que los geles formados con 0,525 % de HA (p/v) fueron totalmente estables después de más de un mes. Esto es lo que se espera, ya que los geles microestructurados tienen pilares más densos y robustos de gel de PEG concentrado, separados por canales débiles dejados por el HA no entrecruzado. Esto hace que estos geles microestructurados sean más resistentes a la degradación, a la vez que mantienen su potencial para favorecer el rápido crecimiento de las neuritas.
Los hidrogeles microestructurados con MA tenían una estructura de poros grandes y abiertos que daba lugar a una morfología celular deforme, ya que los cuerpos celulares adaptan su forma a los poros de tamaño multimétrico en los que se encuentran y las neuritas hacen giros bruscos para seguirlos (Figs. 11, 13). Por lo tanto, no se estudiaron más para esta aplicación. Los poros submicrométricos creados por la HA forman, en cambio, una red fina y densa en la que los cuerpos celulares y las neuritas aparecen lisos, como lo hacen in vivo. Aunque durante mucho tiempo se ha supuesto que la laminina o los péptidos de laminina son necesarios para el crecimiento de las neuritas en hidrogeles 3D, los investigadores demuestran aquí un excelente crecimiento de las neuritas en geles microestructurados de PEG+HA en ausencia de cualquier señal de adhesión. Esto es especialmente digno de mención dadas las propiedades furtivas, antiadhesivas y no interactivas del PEG. Varias líneas de datos sugieren que la extensión de las neuritas depende principalmente de las propiedades físicas.
Para comprobar si los geles tenían señales de adhesión intrínsecas por la presencia de HA, se digirió con 1 mg/ml de hialuronidasa (HAsa) inmediatamente después de la formación del gel. h A se degrada en cuestión de segundos en estas condiciones, como se observa en la reometría (Fig. 10), y la difusión de proteínas a través de los geles no es un problema (por ejemplo, la inmunotinción completa del gel se realiza fácilmente). Además, cuando se seleccionó el MA para la microestructuración por exclusión de fase, las neuronas siguieron creciendo a pesar de carecer de receptores para este polímero marino/bacteriano. Además, cuando los geles de PEG+HA y p Eg MA fueron funcionalizados covalentemente con IKVAV, incluso a altas concentraciones, el crecimiento de las neuritas fue cualitativamente similar a los controles sin IKVAV, mientras que en los controles de plástico de cultivo de tejidos 2D, los péptidos indujeron potentemente el crecimiento de las neuritas de forma dependiente de la concentración (Fig. 11). Esto demuestra que las señales específicas no son esenciales sobre un fondo físico ya óptimo. También es poco probable que las neuronas se adhieran de forma no específica a las proteínas atrapadas en el gel, ya que los investigadores trabajan en condiciones libres de suero y sin factores de crecimiento. El crecimiento inicial de las neuritas también se produce demasiado rápido para que la deposición de la matriz por parte de las células desempeñe un papel importante (normalmente, muchos ~10 pm neuritos son visibles una hora después de la encapsulación). Por último, los investigadores han descartado la adhesión no selectiva a los péptidos escindibles con MMP: los geles de PEG microestructurados y no degradados que se entrecurzan con PEG-ditiol están completamente libres de aminoácidos o cargas, y siguen siendo igual de permisivos para el crecimiento de las neuritas, aunque con una viabilidad reducida (Fig. 13). En general, los datos de los investigadores indican, por tanto, que las propiedades físicas, más que las señales de adhesión específicas tienen una importancia abrumadora para permitir la rápida extensión de las neuritas en 3D. Las variaciones en el contenido de macromeros de 1,2 a 1,9 % (p/v) (18-250 Pa) no afectaron significativamente al crecimiento de las neuritas durante dos o cinco días (Fig. 14). Los geles más blandos son más inestables, lo que puede provocar más daños y pérdida de neuritas. Los controles no porosos de 1,5 y 1,9 % (p/v), gelificados a pH 8,0 sin HA, se degradaron al cabo de unos días. Los geles Q eran perfectamente estables, pero no permitían el crecimiento de las neuritas en la misma medida que los PEG porosos. En las condiciones optimizadas, las neuronas primarias encapsuladas formaban redes extensas en pocos días, que aumentaban en densidad y se mantenían estables durante al menos un mes (Fig. 5a). Los principales marcadores de neuronas diferenciadas se expresaron de forma similar a lo que se conoce de los cultivos en 2D (Fig. 5b), y hubo un gran número de densidades presinápticas. Se observó la actividad de los picos sólidos después de 16 días de cultivo utilizando un reportero fluorescente de calcio intracelular. La actividad coordinada era clara (Fig. 5c), lo que demuestra la formación de redes 3D con conectividad sináptica funcional en la ECM sintética.
Traslado a neuronas derivadas de hiPSC
Los cultivos primarios de neuronas de rata han sido durante mucho tiempo un modelo de referencia para los estudios de biología celular, pero las neuronas derivadas de hiPSC están emergiendo como un modelo más relevante de las condiciones neurológicas humanas. Proporcionan una fuente reproducible de células definidas en las que se pueden estudiar mutaciones particulares o efectos de fármacos, y se cree que tienen potencial terapéutico. Normalmente se cultivan en medios definidos sin suero en 2D, pero para los cultivos en 3D se suele utilizar matrigel. Aquí, los investigadores establecen un sistema de cultivo 3d definido y eficaz para las neuronas derivadas de hiPSC que no depende de materiales inmunogénicos que impedirían la traslación a aplicaciones clínicas. Las neuronas derivadas de hiPSC se encapsularon en geles de p Eg microestructurados con 0,525 % de HA (p/v) con una alta viabilidad (hasta el 85 %) y extendieron las neuritas a la misma alta tasa que las neuronas primarias (Fig. 6). Eran muy sensibles a la rigidez y a la densidad celular, y degradaban los geles notablemente más rápido. Como resultado, los geles fueron estables durante los cinco días necesarios para formar redes conectadas, pero desafortunadamente no durante las 2­ 3 semanas necesarias para obtener una actividad en picos. El mejor compromiso, que dio un gel estable durante más de una semana con una rápida extensión de las neuritas y una alta viabilidad, fue el de un 2 % de PEG (p/v) y 5 M de células/ml en estas condiciones de microestructuración. Las células parecían completamente diferenciadas, siendo positivas a los marcadores neuronales neurofilamento, plIl-tubulina y MAP2, y negativas al marcador astrocítico GFAP.
DISCUSIÓN
Se han desarrollado muchos procedimientos para crear andamios con porosidad macroscópica o jerárquica, típicamente por lixiviación de sales, liofilización o electrohilado. Sin embargo, estos procedimientos no permiten la encapsulación de células ni la formación in situ. Aquí, los investigadores presentan un procedimiento único que permite la encapsulación directa de las células en estructuras porosas que se crean mediante la separación de fases entre PEG y los polisacáridos de alta viscosidad a medida que PEG se somete a la polimerización de crecimiento por pasos. Los cultivos definidos en 3D que permiten el rápido crecimiento de las neuritas y la formación de sinapsis son de interés primordial para los estudios que dependen de las interacciones entre las neuronas y la matriz, tal como la guía axonal, la maquinaria de los conos de crecimiento, el ensamblaje de las sinapsis y la regeneración. La posibilidad de estudiar la bioactividad de las señales extracelulares en un fondo blanco es una herramienta importante, especialmente combinada con las neuronas derivadas de hiPSC, ya que éstas están disponibles comercialmente a partir de una variedad de líneas celulares específicas de pacientes y transgénicas que proporcionan importantes modelos reproducibles de enfermedades neurológicas. Debido a su perfecta transparencia, los geles microestructurados descritos son especialmente adecuados para los estudios de imagen.
Los modelos 3D eléctricamente activos también representan una mejora sustancial respecto a los modelos 2D. Las redes neuronales in vitro son una herramienta importante para el estudio de la electrofisiología, la neuromodulación, la neurotoxicología o para el cribado de fármacos. Sus contrapartes en 3D tienen una conectividad dramáticamente diferente, lo que produce datos, que son más relevantes para la situación in vivo. La conectividad de la red se estudió recientemente en superficies apiladas en 2D, sin embargo, el sistema descrito por los investigadores va un paso más allá, al situar las neuronas en un entorno totalmente tridimensional.
Los hidrogeles macroporosos descritos en este estudio proporcionaron una excelente imitación de las propiedades biofísicas de la matriz extracelular neural, permitiendo por primera vez la formación de redes estables y funcionales en un gel sintético de PEG. Para las aplicaciones in vivo, es interesante que los componentes y la química de entrecruzamiento utilizados aquí sean todos biocompatibles. En particular, p Eg , HA y alginato ya se utilizan en las clínicas. Debido a la sencilla sintonización del sistema hacia el intervalo de los micrómetros, también se puede prever la encapsulación de otros tipos de células para controlar su migración, ensamblaje e interacciones en el espacio 3D. La meso/macroporosidad de estos hidrogeles proporciona una superficie muy elevada, un mejor transporte de masas y debería permitir el desarrollo de análogos tisulares más organizados en comparación con los sistemas homogéneos.
PROCEDIMIENTOS
A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos eran de Sigma-Aldrich, los reactivos de cultivo celular de Invitrogen, los experimentos se realizaron por triplicado, y las imágenes se modificaron mínimamente (brillo/contraste para todas las imágenes, y gamma para las imágenes de las neuronas solamente, ajustadas para que tanto las neuritas como los cuerpos celulares fueran claramente distinguibles).
PEG-vinilsulfona de 4 brazos(PEG-VS de 4 brazos)
Se disolvió 1 g (50 pmol) de 20 kDa de PEG-tiol de 4 brazos (Laysan Bio) en 4 ml de tampón de trietanolamina (TEOA), 300 mM, pH 8,0, y se añadió inmediatamente, gota a gota y con agitación vigorosa, a 1.004 pl (10 mmol) de divinil sulfona en 4 ml del mismo tampón. La reacción se completó esencialmente en unos minutos, y se dejó proceder durante 2h. El producto se dializó con agua mQ (al menos 6 cambios de agua durante al menos 6 horas cada uno) y se liofilizó. Se encontró que los tioles estaban completamente sustituidos dentro del límite de detección de NMR de protones (en cloroformo deuterado en un instrumento Bruker de 400 Mhz). El producto se resuspendió al 4 % (p/v) en agua mQ, se filtró estérilmente, se alicuotó en 200 pl (8 mg), se liofilizó y se almacenó a -20 °C hasta su uso.
Manipulación de péptidos escindibles por la metaloproteinasa de la matriz (MMP)
Péptido escindible por MMP (Nagase, H., Biopolymers 40, 339-416, 1996 Lutolf, B. M. P., Adv. Mater. 15, 888-892, 2003) con la secuencia Ac-g Cr D-GPQGIWGQ-Dr CG-NH2 (1746 Da) procedía de Anawa (Suiza) con una pureza > 95%. El péptido purificado por HPLC se presenta como una sal ácida de TFA que debe ser neutralizada. Para ello, ~100 mg de polvo de péptido se dispersaron en una pequeña cantidad de agua (~1 ml), complementada con una cantidad mínima de rojo de fenol como indicador de pH, y neutralizada (la solución amarilla se vuelve naranja) con 300 mM de NaOH acuoso. La forma protonada del péptido es poco soluble, pero la pasta inicial se vuelve clara durante el procesamiento. Es importante evitar añadir un exceso de NaOH ya que los tioles se oxidan rápidamente a pH>7,0 (el indicador se vuelve naranja rojizo). A continuación, el péptido neutralizado se diluyó en agua mQ al 1 % (p/v), se filtró estérilmente, se alicuotó en 400 pl (4 mg), se liofilizó, se selló y se almacenó a -20 °C hasta su uso. Se comprobó que era estable durante al menos 6 meses en esta forma. El polvo de péptidos suele contener una cantidad significativa de contraiones y unos pocos péptidos oxidados, por lo que para cada lote se determinó la concentración exacta de tioles libres en una alícuota resuspendida con el ensayo de Ellman (Ellman, G. L., Arch. Biochem. Biophys. 70-77, 1959) utilizando una curva de calibración de beta-mercaptoetanol. La pequeña cantidad de rojo de fenol utilizada para equilibrar el pH se controló para que tuviera una absorbencia insignificante en el contexto de este ensayo.
Tampones
El tampón HEPES (200 mM de HEPES y 100 mM de NaOH en agua mQ, ajustado a pH7,4) se preparó con especial cuidado, ya que se utilizó para la formación del gel por adición de Michael, que es muy sensible al pH (Lutolf, M.P., Biomacromolecules 4, 713-722, 2003). Se comprobó que las mediciones de absorbencia del indicador de pH rojo fenol a 558/433 nm proporcionaban los valores de pH más fiables, para garantizar la reproducibilidad de los experimentos sin depender de las soluciones y electrodos de calibración, más propensos a la deriva. La relación de absorbencia a 558 / 433 nm se ajustó a 2, lo que corresponde a un pH de 7,40 a 24 °C y una fuerza iónica de 300 mM (Yao, W., Environ. Sci. Technol. 35, 1197-201, 2001) (asumiendo que los zwitteriones llevan dos cargas. Si por el contrario se tratan como una molécula sin carga, esto corresponde a una fuerza iónica de 100 mM y un pH de 7,5). TEOA pH 8,0 se preparó de forma similar, mientras que PBS pH6.0 se preparó bajando el pH de PBS pH 7,4 (Gibco) con HCI 300 mM.
Mannuronano (MA)
MA bacteriana de alta viscosidad (véase figura S1) (Ertesvag, H., Methods Biotechnol. 10, 71-78, 1999) fue un amable regalo del profesor Skják-Brak (Norwegian University of Science and Technology, Biopolymer Laborator). A diferencia del HA, el alginato no está presente en los mamíferos y, por tanto, no se espera que sea reconocido específicamente por ningún receptor neuronal. Además, esta forma de alginato es puramente viscosa, ya que carece de guluronatos (que permiten el entrecruzamiento del calcio en los alginatos de tipo salvaje).
Formación de gel
Los soportes se prepararon de antemano. Se calentó una capa de 1 mm de PDMS (Sylgard 184, 10 % (p/p) de agente de entrecruzamiento) en una placa de Petri durante 2 horas a 50 °C. Se obtuvieron moldes en forma de anillo con sucesivos punzones concéntricos a 4 y 6 mm (punzones dérmicos de Kai Medical). Se prepararon placas de 24 pocillos con un cubreobjetos estéril por pocillo, sobre el que se colocó un molde de PDMS. El PDMS se adhiere al vidrio y los geles pueden hacerse directamente en este soporte, lo que permite una fácil transferencia, obtención de imágenes o inmunotinción, todo ello sin perturbar mecánicamente las neuronas. Los intentos de mantener los geles en flotación libre, como es habitual en otros tipos de células, dieron resultados mucho más pobres: las neuritas suelen romperse mecánicamente durante los cambios de medio o las transferencias de gel. Los moldes de PDMS se pueden reciclar después de lavarlos con detergente y esterilizarlos con rayos UV. Debe evitarse el etanol, ya que puede cargarse en el PDMS y liberarse en el cultivo. Justo antes de la fabricación del gel, se resuspendieron alícuotas de 20 % de PEG-VS de 4 brazos (p/v) en HEPES pH 7,4 (dando 40 mM de vinil sulfonas). Los péptidos escindibles por MMP se resuspendieron al 8% (p/v) en PBS pH 6.0 (dando típicamente 50 mM de tioles de acuerdo con la prueba de Ellman). El pH ligeramente ácido de la solución de péptidos es importante para evitar la oxidación de los tioles, que se vuelve significativa en cuestión de horas a pH 7,4 Las alícuotas del medio completo filtrado estéril suplementado con 0,75 % de hialuronano (p/v) (HA, Sigma 53747) se mantuvieron a 4 °C. Se necesita una pipeta de desplazamiento positivo, como la Gilson Microman M50E, para pipetear con precisión las soluciones que contienen más del 0,5 % de HA (p/v), debido a su alta viscosidad. Para preparar 100 j l de un gel típico que contenga 2 % de PEG (p/v), 0,525 % de HA (p/v) y 1e7 células/ml, se combinaron las soluciones madre como se indica a continuación: 10 j l de solución madre de 4arm-PEG-VS, 12 j l de tampón HEPES pH 7,4, 70 j l de suspensión celular a 1,43e7 células/ml en medio suplementado con HA y, por último, 8 jl de solución madre de péptido escindible con MMP en forma de gota en el lateral del tubo. Después de una rápida agitación en vórtex y una mezcla enérgica con una pipeta de desplazamiento positivo durante ~ l0 segundos, el precursor líquido pudo distribuirse con 15 jl/molde de PDMS. La gelificación se produce en 3-4 minutos a esta concentración, pero puede tardar hasta 15 minutos en el caso de geles más blandos, por lo que se dejó que cada gelificación procediera durante 1hora en la incubadora de cultivo celular (37 °C, 5 % CO2) antes de añadir 1 ml de medio de crecimiento. La mezcla de gelificación tiene un pH y una presión osmótica fisiológicos, así como una gran proporción de medio completo: como resultado, las células están mínimamente estresadas, y la extensión de las neuritas ya es visible en el contraste de fases cuando se detiene la gelificación a 1h. El pH se mantiene estable gracias a ~20% (v/v) de solución HEPES pH 7,4 fuertemente tamponada . Otras condiciones se obtienen cambiando los volúmenes de las soluciones madre de PEG-VS de 4 brazos y de péptidos MMP añadidos en la mezcla correspondientemente, sustituyendo el tampón por TEOA pH 8,0, cambiando las concentraciones de HA y de células en el stock, cambiando el medio por el adaptado a cada tipo celular, o sustituyendo e1HA por otro suplemento de alta viscosidad, según se indique para cada experimento. Se formaron geles no degradables sustituyendo los péptidos escindibles por MMP por PEG-ditiol (Laysan Bio, 3,4 kDa) en el mismo tampón y molaridad de tiol. Se añadieron péptidos de laminina a1 (2110 - 2127) con la secuencia CSRARKQAASIKVAVSADR-NH2 (designados simplemente como IKVAV, ANAWA) en los casos indicados. Para ello, se añadió primero el péptido IKVAV a la solución PEG-VS de 4 brazos a partir de una reserva de 4 mg/ml y se dejó conjugar durante 30 minutos, antes de realizar el resto del protocolo (en este caso, la cantidad de tampón HEPES añadida se redujo en consecuencia para mantener el mismo volumen total). Se utilizó una prueba f Ra P con un péptido IKVAV marcado con cumarina para verificar que el péptido se ancla con éxito en el gel. La bioactividad del IKVa V se ensayó en 2D de acuerdo conlos protocolos publicados (Tashiro, K., J. Biol. Chem. 264, 16174-82, 1989).
Las mediciones de cizallamiento dinámico se realizaron en un reómetro Anton Paar MCR 301. El precursor líquido del gel se preparó como se ha descrito anteriormente, con un medio de crecimiento completo, pero sin células, y se insertó entre una placa metálica de suelo y una geometría de placa paralela de 20 mm de diámetro. El aumento de los módulos de almacenamiento G' y de pérdida G'' se controló con una oscilación de 1 Hz a una deformación del 5 %, con una separación de 0,25 mm, a una temperatura controlada por peltier de 37 °C y con una atmósfera saturada de agua. Esta tensión se eligió para que quedara bien situada dentro de la región viscoelástica lineal de los geles (que se extiende al menos del 1 al 400 % de tensión a 1 Hz). La rigidez se definió como el módulo de almacenamiento a los 60 minutos (punto en el que todas las muestras alcanzaron una meseta y en el que se detuvo la gelificación mediante la adición de medio de cultivo celular), y el tiempo de gelificación se definió como el tiempo en el que se alcanza la mitad de la rigidez de la meseta en la escala logarítmica, como se indica en la figura 1 complementaria en una curva experimental típica. Se midieron las viscosidades complejas del 0,5% (p/v) de HA y del 2 % (p/v) de MA en el medio de crecimiento a una tensión del 2 %, con una separación de 0,2 mm, a 37 °C y con una atmósfera saturada de agua, entre 0,01 y 10 Hz. PEG-vinilsulfona de 4 brazos marcada con tetrametil rodamina (PEG-VS de 4 brazos marcado con TMR). Se disolvieron 100 mg (5 jm ol) de 20 kDa de PEG-tiol de 4 brazos en 2 ml de agua mQ. A continuación, se añadieron 0,12 mg (0,25 jm ol) de tetrametil rodamina-5-maleimida (Sigma 94506) en 2 ml de PBS de pH 7,4 con agitación. La conjugación se produce en cuestión de segundos, pero se dejó que se produjera durante 10 minutos más. La mezcla resultante se añadió gota a gota en 220 j l (2,2 mmol) de divinil sulfona en 4 ml de tampón TEOA 300 mM pH8,0, se dejó reaccionar durante 30 minutos, se dializó y se liofilizó. Toda la manipulación se realizó en la oscuridad.
Este protocolo sustituye 1/80 de los extremos PEG de 4 brazos en el caso de límite superior del 100 % de eficiencia de conjugación, lo que asegura un impacto insignificante en la formación del gel.
Imágenes y cuantificación de la porosidad
Los geles se hicieron como se ha descrito anteriormente con 1,9 % de PEG (p/v), sin células, y utilizando PEG-VS de 4 brazos marcado con TMR. Para producir diferentes tamaños de poro, el medio (70 % de la mezcla) se complementó con 0 o 0,5 % de HA (p/v) o 2 % de MA. La microestructura de cada gel se visualizó después de 3 días de incubación en PBS pH 7,4 en un microscopio confocal Leica SP8 con un objetivo 63x/1,4 Oil y excitación a 520 nm, como un apilamiento cúbico de 25 jm con un tamaño de píxel de 50x50x200 nm3. Para la detección se utilizaron los Leica HyD, que tienen la ventaja de trabajar en el recuento de fotones con muy poco ruido y, por tanto, de proporcionar un nivel de negro "verdadero". La vista 3D de la conectividad de los poros se obtuvo con la corrección de la decoloración, el suavizado gaussiano de 2 px, el umbral, la triangulación de la superficie con las funciones de isosuperficie y reducción de parches de Matlab, y el renderizado de Blender. Para la cuantificación del tamaño de los poros, cada una de las tres pilas por condición se filtró con corrección de blanqueo (Fiji, proporción simple, nivel de fondo 0) y suavizado gaussiano de 1 px. A continuación, las pilas se umbralizan y se invierten para obtener imágenes binarias con los poros marcados con 1 y el PEG fluorescente con 0, y las funciones de correlación de segundo orden S2(x,y) se calcularon con un script personalizado de Matlab. Dado que se observó isotropía, los datos se redujeron a
S2(x,y) = S2( r = tJx2 + y 2)),
utilizar intervalos de 50 nm para r. Por último, los datos resultantes se ajustaron mediante el modelo de esfera penetrable (Berryman, J. G., J. Appl. Física. 57, 2374-2384, 1985).
Neuronas corticales disociadas de rata E17
Las cortezas de embriones de rata Wistar E17 fueron disecadas y disociadas como se ha descrito previamente (Buerli, T., Nat. Protoc. 2, 3090-101, 2007). Brevemente, las corticales picadas se incubaron durante 15 minutos a 37 °C en PBS complementado con 1 mg/ml de BSA, 10 mM de glucosa, 0,5 pg/ml de DNAse (Sigma, D-5025) y 0,5 mg/ml de papaína (Sigma, P-4762), y se lavaron con medio de bloqueo consistente en DMEM 10 % de FBS. A continuación, se resuspendieron en 2 ml de medio de bloqueo y se disociaron por trituración utilizando una pipeta Pasteur pulida al fuego. Las células disociadas se resuspendieron en un medio de crecimiento libre de suero, consistente en Neurobasal B27 (Gibco 21103-049 y 17504-044) complementado con 1x Glutamax y Penicilina/Estreptomicina, y se sembraron durante la noche en frascos recubiertos de PLL (50 ug/ml de PLL en tampón de borato, pH 8,4, incubado a 37 °C durante 1 hora). Al día siguiente, las neuronas sembradas se lavaron primero con TrypLE express durante 5 minutos, para desprender las células no viables débilmente adheridas y los restos celulares. Las células sanas restantes se desprendieron con tripsina/EDTA (Gibco 12605-010 y 25200-072). Tras añadir dos volúmenes de medio de bloqueo, las células se centrifugaron y se resuspendieron en medio de crecimiento sin suero. Todo el cultivo celular posterior en 2D o 3D se realizó en el medio de crecimiento libre de suero, cambiando la mitad una vez a la semana.
Aislamiento y cultivo de los ganglios de la raíz dorsal (DRG)
Los DRG se aislaron a partir de embriones de pollo E10 inmediatamente antes de la encapsulación. Se cultivaron en un medio de crecimiento libre de suero suplementado con 1 mg/ml de albúmina y 50 ng/ml de NGF. La encapsulación se realizó en 0,8 % de PEG-VS de 4 brazos (p/v), entrecruzado con una cantidad estequiométrica de PEG-ditiol en presencia de 0,525 % de HA (p/v) y 1,4 % de dextrano (p/v)) como se describe en la sección de formación del gel.
Neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas (hiPSC)
Las células progenitoras neurales derivadas de hiPSC (Axol ax0016) se propagaron y diferenciaron de acuerdo con el protocolo del proveedor en línea. Las neuronas corticales cerebrales humanas derivadas fueron entonces encapsuladas en geles con el mismo protocolo que las neuronas primarias, en presencia de 0,525 % de HA (p/v) para la microestructuración y sustituyendo el medio de crecimiento por el medio de mantenimiento Axol (también libre de suero).
Imágenes en picos con sensor de calcio
El medio de los geles para la obtención de imágenes de calcio se eliminó y se sustituyó por medio completo fresco complementado con 6 pM de Oregon Green BAPTA-1 (Life technologies) a partir de una solución de 1 mM en DMSO seco. Después de 1 hora de incubación, los geles se lavaron en su medio original durante 1 hora, y se visualizó en un microscopio confocal Leica SP8 utilizando un objeto de agua de 20x/0,95 con un escáner resonante de 8 Khz e irradiación a 488 nm. La tasa de formación de imágenes resultante fue de 7,44 Hz.
Ensayos de viabilidad
Los ensayos de viabilidad se realizaron complementando el medio de los geles con calceína AM (citoplasma verde, células vivas, 2 pM a partir de una solución madre de 4 mM en DMSO) y una tinción nuclear entre Hoechst (núcleos azules, todas las células, 10 pg/ml a partir de una solución de 10 mg/ml en agua mQ), homodímero de etidio-1 (núcleos rojos, células muertas, 2pM a partir de una solución madre de 2 mM en DMSO/agua 1:4), y yoduro de propidio (núcleos rojos, células muertas, 6,6 pg/ml a partir de una solución de 0,33 mg/ml en agua mQ). Los geles se incubaron en el medio suplementado durante 1h, luego se lavaron durante 1 hora en medio fresco y se visualizó en un microscopio multifotónico Leica SP8 con un objeto de agua de 20x/0,95 sobre 200 pM de profundidad para las células disociadas, o con un objeto de aire de 10x/0,3 como un solo corte para los explantes de DRG. Las células vivas y muertas se contaron manualmente.
Degradación del gel
La estabilidad del gel se cuantificó después de dos días (las condiciones que se disolverían en un mes de cultivo ya estaban visiblemente degradadas en este punto) en capas de gel de 4 mm de diámetro, tomando un barrido de mosaico que cubriera todo el gel en un microscopio Zeiss Observer 2 en campo brillante con un objetivo de aire 5x. El mosaico se ensambló con Microsoft Image Composite Editor. Las zonas degradadas eran claramente visibles, ya que están libres de cuerpos celulares en suspensión y se perfilan con aglomerados celulares oscuros que se agrupan en los lados y el fondo de las partes degradadas. Se segmentaron manualmente con Fiji, y el porcentaje de degradación se presenta como el área degradada sobre el área total del gel (promedio y desviación estándar de 6 muestras).
Agrupación inducida por PEG y captación de PEG
Se observó la agrupación de células inmediatamente después de la mezcla cuando se realizó la encapsulación de neuronas con 10 % de PEG (p/v) de alto peso molecular (Sigma, 200kDa) como componente viscoso. La formación de imágenes con PlasDIC en un objetivo 20x Air. Para estudiar la captación de PEG en las mejores condiciones de visibilidad, las neuronas se cultivaron en 2D durante 6 días en plástico de cultivo tisular recubierto con PLL, para asegurar la recuperación completa de la disociación del tejido. A continuación, el medio se complementó con un 1 % de TMR (p/v) marcado con PEG-VS de 4 brazos, para imitar la exposición al PEG durante la encapsulación. El cultivo se lavó cuidadosamente 5 veces durante 10 minutos con nuevo medio de crecimiento, y se visualizó inmediatamente en PlasDIC y fluorescencia en un objetivo Air 20x para ver la asociación del PEG con las células. La misma observación se realizó después de 12 días adicionales en cultivo, para observar la retención de PEG. El canal de fluorescencia fue corregido por falta de homogeneidad de la luz y el ruido con una substracción de fondo y un filtrado mediano de 3 px.
Cuantificación del crecimiento de las neuritas
La longitud de las neuritas se cuantificó con un trazado manual en D2, ya que proporciona la máxima precisión y fiabilidad, pero con un trazado automatizado en D5 porque la longitud en este punto temporal se vuelve casi intratable para el trazado manual. Cada imagen del trazado automatizado se comprobó visualmente para ver si el rastreo era adecuado. El trazado manual se realizó con un trazador de neuritas simple (Longair, M. H., Bioinformatics 27, 2453­ 2454, 2011) y el trazado automatizado con NeuriteQuant (Dehmelt, L., Bm C Neurosci. 12, 100, 2011). El trazado se realizó en pilas de imágenes 3D de dos fotones de 200 pm de profundidad y 620 pm de anchura. La tinción fluorescente fue de pIII-tubulina por defecto (tinción de todas las neuritas en las muestras fijadas) y de calceína AM (tinción de todos los procedimientos en las muestras vivas) para las series que contenían geles parcialmente degradados, que son demasiado débiles para soportar la inmunotinción (curva de respuesta de HA en la Fig. 4 y Fig. 6). Se contaron los núcleos teñidos con DAPI y se utilizaron para la normalización del número de células.
Inmunocitoquímica e formación de imágenes
Los anticuerpos primarios fueron: pIII-tubulina (Sigma T5076, 1:500), Neurofilamento (Sigma N4142, 1:150), Sinaptotagmina (DSHB mAB 30, desarrollado por el Dr. Reichardt de Uc Sf , 8 pg/ml), MAP-2 (Sigma M3696, 1:200), GFAP (R&D Systems AF2594, 10 pg/ml). Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 y 594 (Invitrogen A11005, A11008, A10680, A11015) a 1:200. Los investigadores adaptaron los protocolos estándar de inmunocitoquímica para teñir y obtener imágenes directamente de los geles completos. Las muestras se fijaron y permeabilizaron durante 1 hora a 4 °C en 10 % de formalina con 0,1 % de Tritón X-100, se bloquearon durante la noche con 5% de BSA en PBS y se lavaron con PBS (dos veces durante 1 hora, una vez durante la noche). A continuación, se incubaron con el anticuerpo primario (durante la noche a RT con agitación suave, dilución con 3 % de BSA en PBS), se lavaron con PBS, se incubaron durante una noche con el anticuerpo secundario, se lavaron con PBS, se tiñeron con 0,3 pM de DAPI en PBS durante 1 hora y, finalmente, se lavaron con PBS. Las imágenes de las muestras inmunotinadas se realizaron en un microscopio multifotónico Leica SP8 con un objeto de agua de 20x/0,95, sobre 620 pm de ancho y 200 pm de profundidad, utilizando un paso de 1 pm, una tasa de barrido de 600 Hz, 1.024x1.024 px, y excitación simultánea a 710 nm y 1.100 nm utilizando los láseres fs MaiTai Deepsee e Insight Deepsee respectivamente (Spectra Physics). Los dos o tres colores se recogieron simultáneamente. A las pilas resultantes se les aplicó una proyección de intensidad máxima (MIP), se compensó la falta de homogeneidad de la luz dividiéndola por una imagen de referencia de fluoresceína, y se ajustó su visualización en color (brillo/contraste/gama).
Análisis estadístico
Para cuantificar las diferencias dentro de las series se utilizó el ANOVA de una vía y la prueba post hoc de Tukey, considerándose significativa una p<0,01.
Descripción de las Figuras
Figura 1. Los polisacáridos de alta viscosidad forman sistemas de dos fases con PEG que dan lugar a geles porosos. (a) Formación de imágenes con CLSM del gelificado de control sin polisacárido. La estructura es perfectamente homogénea y libre de poros a una resolución de 185 nm. (b) El 1,5 % de PEG formado en presencia de HA de alta viscosidad de 0,35% (p/v) tiene estructuras porosas de 0,5 a 1,5 |jm. (c) El 1,5% de PEG formado en presencia de 1,4% de MA (p/v) de alta viscosidad tiene estructuras porosas de varios micrómetros. (d) El examen en 3D de la red porosa muestra que los poros están totalmente interconectados. (e) Función de autocorrelación de los poros. La simetría circular de la función de correlación muestra que la red porosa es isotrópica. (f) Por lo tanto, la función de autocorrelación puede analizarse únicamente en función del radio. Se muestran los datos experimentales (puntos) para ambos tipos de geles porosos y su ajuste con el modelo de esfera penetrable (líneas). El mejor ajuste se obtiene para un diámetro de poro de 0,82 /- 0,1 jm para HA y 2,39 /- 0,16 jm para MA. Barras de error: desviación estándar (n=3). (a-c) son cortes individuales de microscopía confocal. (d) es una representación de un cubo de 25 jm en el gel. Barras de escala: 5 jm .
Figura 2. La exclusión de volumen mejora la cinética de la gelificación del PEG con la adición de Michael. (a) Monitorización reológica de la gelificación. La complementación con HA permite la formación de geles a pH fisiológico con casi la misma cinética que la obtenida a pH 8,0 con geles de PEG puro. (b) Viscosidad compleja de las soluciones madre de HA y MA en medio de crecimiento completo a 37 °C. (c) Tiempo de gelificación. Un mayor contenido de PEG o un mayor pH dan lugar a una gelificación más rápida, al igual que la sustitución del medio de gelificación por la solución madre de HA viscosa. El Q-gel se da como referencia de un gel de PEG disponible en el mercado. (d) Rigidez tras 60 minutos de formación del gel (meseta inicial). Las concentraciones de PEG entre el 1,2 y el 1,9 % (p/v) abarcan un intervalo de rigidez relevante para el sistema nervioso en desarrollo, y se supone que ofrecen las mejores condiciones para el crecimiento axonal. La rigidez del Q-gel también se muestra después de 10 minutos de gelificación, ya que es el tiempo en el que el fabricante recomienda añadir el medio. Barras de error: desviación estándar (n=3).
Figura 3. Ganglios de la raíz dorsal (DRG) en geles de PEG macroporosos no degradables. (a) La formación de imágenes del gel completo después de 30 días de cultivo muestran la invasión completa de los axones del DRG (agrupación en el centro, imagen de fluorescencia de 1,5 mm de proyección de intensidad máxima (MIP)). (b) Acercamiento del centro mostrando una alta densidad de neuritas (vista superior, 1,5 mm MIP). (c) Vista lateral del anterior mostrando que las neuritas se distribuyen por toda la profundidad del gel (1,5 mm MIP). La posición del DRG está resaltada, ya que sólo es visible su superficie inferior, el resto y las neuritas en un cono posterior son menos accesibles a la luz y aparecen oscuras. (d) Formación de imágenes viva/muerta de una sección transversal del DRG. Se ve una corona de células muertas, pero las células interiores están vivas. Barras de escala: 1 mm (a) 250 jm (b) 250 jm (c) 125 jm (d).
Figura 4. La microestructuración con HA mejora la estabilidad de los geles blandos y permite un rápido crecimiento de las neuritas, la formación de geles a pH 7,4 y una alta viabilidad. El hialuronano puede eliminarse después de la gelificación sin matar a las neuronas, degradar el gel o impedir el crecimiento de las neuritas. (a) Degradación macroscópica del gel vista en campo claro en D2, con las partes degradadas resaltadas en blanco y el soporte de PDMS en verde, y acercamiento de la morfología de las neuronas vista por microscopía de fluorescencia (proyecciones de pilas de 200 jm ). Los geles de 1,5 % de PEG formados sin HA no se muestran porque no fueron estables durante 2 días y, por lo tanto, no pudieron cuantificarse. La tinción es calceína/DAPI (1 a 3) y pIN-tubulina/ DAPI (4 y 5). Ambos procedimientos tiñen todas las neuritas/cuerpos celulares, pero los geles parcialmente degradados no resistieron la inmunotinción, por lo que la morfología celular se visualizó directamente en muestras vivas teñidas con calceína. (b) Degradación macroscópica en D2 como porcentaje del área del gel. (c) Longitud total de la neurita dividida por el número de cuerpos celulares en un volumen de muestra en D2. (d) Viabilidad en D2. Barras de error: desviación estándar (n=6 para la degradación, n=3 para la viabilidad y la longitud de las neuritas). *: Diferente de todas las demás condiciones (p<0,01). Otros son comparables (p>0,01). Barras de escala: 1 mm (primera línea) y 25 jm (segunda línea).
Figura 5. Las neuronas corticales primarias del embrión de rata E17 encapsuladas en geles porosos de PEG forman redes neuronales 3D eléctricamente activas y estables a largo plazo. (a) Las MIP de 200 jm con profundidad codificada por colores muestran que las neuronas encapsuladas están distribuidas homogéneamente y extienden neuritas en 3D a través de la matriz. Las neuritas largas ya son visibles dos días después de la encapsulación, y el crecimiento continúa a un ritmo creciente para formar una red densa para D5. Para D26, todo el gel está lleno de una densa red de neuritas. (b) Marcadores inmunocitoquímicos (MIP de 200 jm de adquisiciones de apilamiento de microscopía de barrido láser de dos fotones): la pIII-tubulina es un marcador neuronal que tiñe todas las neuritas de las neuronas embrionarias, la sinaptotagmina es un marcador de terminales presinápticas, y el MAP2 un marcador de neuronas diferenciadas que se sabe que tiñe sólo los cuerpos celulares y las neuritas proximales en este momento. (c) Se observa la actividad de los picos en los geles con el reportero fluorescente de calcio intracelular Oregon Green BAPTA-1. Se observa una actividad espontánea independiente (por ejemplo, los cuerpos celulares 1 a 3), así como una actividad sincronizada (cuerpos celulares 5 a 11 a los 10 segundos), lo que demuestra que se ha establecido una red funcional conectada sinápticamente a los 16 días en la ECM sintética. Barras de escala: 100 jm con 200 jm de profundidad codificada por colores (a) y 50 jm (b,c).
Figura 6. Traslado del procedimiento a neuronas humanas derivadas de iPSC. (a) Efecto de la densidad y la rigidez celular en geles de PEG estructurados con 0,525 % de HA sobre la morfología celular, tal como se observa en la microscopía de fluorescencia excitada por dos fotones (Calceína/Hoechst) en D2 (200 jm de MIP). (b-c) La viabilidad y el crecimiento de las neuritas se ven afectados cuando la rigidez es alta o la densidad celular es baja. (d) Descripción cualitativa de los geles en D5: los geles más blandos y las densidades celulares más elevadas dan lugar a una degradación más rápida, dando lugar a geles inestables en la combinación más extrema. (e) Inmunocitoquímica. Prácticamente todas las células vivas son positivas para los marcadores neuronales neurofilamento, pIII-tubulina y MAP2, y negativas para el marcador astrocítico GFAP. Barras de error: desviación estándar (n=3). *Estadísticamente diferente de todas las demás condiciones (p<0,01). p>0,01 en caso contrario. Barras de escala: 40 pm.
Figura 7. Control de la separación de fases durante la gelificación. La muestra es 1,5 % de PEG marcado con TMR (p/v) gelificado a temperatura ambiente (más lento que los 37 °C utilizados en el resto del trabajo) en presencia de 2 % de MA (p/v) utilizando PEG-ditiol como agente de entrecruzamiento, visualizado con CLSm . Se indica el tiempo de postmezcla. Barra de escala: 5 pm.
Figura 8. La transparencia del gel como se ve en el contraste de interferencia diferencial (DIC). (a) Los geles apenas se distinguen del agua inmediatamente después de su formación (b) Los geles siguen siendo perfectamente transparentes, salvo por algunos restos celulares dispersos, dos semanas y media después de la encapsulación de las neuronas. Barras de escala: 50 pm.
Figura 9. Perfil típico de gelificación junto con las definiciones de rigidez y tiempo de gelificación utilizadas en este trabajo. La rigidez inicial se toma como la rigidez a los 60 minutos, momento en el que la rigidez se aproxima a una meseta y se añade medio para detener la gelificación y proceder al cultivo celular. El tiempo de gelificación se toma como el tiempo en el que el módulo de almacenamiento ha alcanzado la mitad del máximo en una escala logarítmica - se prefirió esta definición en lugar del tiempo de cruce entre el módulo de almacenamiento y el módulo de pérdida debido a las viscosidades muy diferentes (por lo tanto, los módulos de pérdida) de las muestras a comparar. La curva es de1,9 % de PEG gelificado en presencia de 0,525 % de HA (p/v).
Figura 10. Monitorización de la degradación del hialuronano. El hialuronano se degrada rápidamente en un medio suplementado con 1 mg/ml de HAse, lo que permite eliminarlo de los geles porosos de PEG. Barras de error: desviación estándar (n=3).
Figura 11. Los péptidos de adhesión no son necesarios cuando se utilizan condiciones mecánicas optimizadas en el cultivo 3D. (a) Los péptidos de IKVAV promueven la adhesión celular y la extensión de las neuritas en el plástico de cultivo de tejidos (TCP) de forma dependiente de la dosis. (b) El crecimiento de las neuritas en los geles porosos de PEG es similar en ausencia y en presencia del péptido IKVAV incluso en alta concentración (se muestra 100 pM), independientemente del polisacárido utilizado para crear los poros. Nótese la morfología deforme que adoptan las neuronas en los grandes poros creados por MA. Barras de escala: 40 pm.
Figura 12. Interacciones de los componentes de PEG con las neuronas (a) PEG de muy alto peso molecular no podía utilizarse como suplemento viscoso, ya que inducía inmediatamente el agrupamiento de las neuronas en suspensión. (b) PEG estrella funcionalizado de alto peso molecular utilizado para la formación de geles es captado por las neuronas, como se observa utilizando una variante marcada con TMR. Barras de escala: 50 pm.
Figura 13. Crecimiento de neuritas a partir de neuronas corticales primarias encapsuladas en un gel poroso de PEG no degradable. El crecimiento de las neuritas se produce incluso en ausencia del péptido escindible por MMP, aunque la viabilidad se vea reducida. Esto también sirve como control de que los péptidos escindibles por MMP no se utilizaron para la adhesión en el resto del trabajo, ya que estos geles sólo se entrecruzan con PEG-ditiol en presencia de MA. 200 pm MIP, barra de escala: 50 pm.
Figura 14. Cuantificación del crecimiento de las neuritas a partir de imágenes de dos fotones de pIII-tubulina. (a) Crecimiento de las neuritas dos y cinco días después de la encapsulación. No se observa una fuerte dependencia de la rigidez a lo largo de más de un orden de magnitud (20 a 250 Pa) en presencia de la microestructuración de HA, sólo los geles más blandos presentan una reducción del crecimiento de las neuritas debido a la degradación parcial. Los geles fabricados sin microestructuración, sustituyendo el efecto acelerador de la exclusión de volumen por los polisacáridos por un pH más elevado, se degradan en los primeros días (cruces grises cuando se degradan). El Q-gel se utiliza como referencia, tanto en forma de geles de flotación libre (protocolo clásico) como de geles con soporte (moldes idénticos a los de nuestro protocolo). Barras de error: SEM (n=3). La Fig. 15 muestra que la mayor estabilidad de los geles macroporosos se debe a la estabilidad a un menor contenido de polímero entrecruzado y no a una mayor resistencia a la degradación enzimática. a) Los geles macroporosos son degradados por la proteasa a una tasa similar a la de los geles no macroporosos (1.5 % de PEG-vinilsulfona de 4 brazos de 20 kg/mol (p/v) entrecruzado con péptidos sensibles a MMP ERCG-GPQGIWGQ-GCRE mediante la adición de Michael de tioles a vinilsulfonas, en presencia de 1,6 kg/mol de hialuronano al 0,525% (p/v) para el gel macroporoso. La solución de digestión es papaína a 0,5 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La reacción se monitoriza con un analizador de textura utilizado para la indentación, y los módulos de indentación se normalizan con respecto al módulo de indentación inicial para cada medición). Barras de error: error estándar de n=3. b) Los geles macroporosos permanecen estables con un contenido de polímero entrecruzado inferior al de los geles normales (PEG-vinilsulfona de 4 brazos de 20 kg/mol en el peso sobre volumen indicado en la leyenda, entrecruzado con PEG-ditiol de 3,8 kg/mol. Los geles macroporosos se formaron en presencia de un 0,5% adicional de hialuronano (p/v) y un 1% de dextrano (p/v). La masa seca del gel se mide después de lavar las sales y el polímero no unido con hialuronidasa 1mg/ml en PBS seguido de agua ultrapura durante 1 día cada uno y liofilizado). Barras de error: error estándar de la media con n=11 a 16.
La Fig. 16 muestra que la concentración de equilibrio de las macromoléculas en los geles de PEG es inferior a la de la solución sobrenadante, pero los geles macroporosos permiten que las macromoléculas alcancen su concentración total en los poros, lo que hace que finalmente estén disponibles para las células encapsuladas en profundidad en los geles. A) Un gel de PEG formado a partir de 1,5 % de PEG-VS de 4 brazos (p/v) de 20 kg/mol con agente de entrecruzamiento PEG-ditiol de 3,8 kg/mol se sumerge en una solución de neutravidina marcada con fluorescencia y la concentración de neutravidina en el gel de PEG comparada con la del sobrenadante y los poros se mide a partir de las respectivas intensidades de fluorescencia. La relación de concentración se indica bajo una imagen de fluorescencia que muestra el gel en la parte inferior y el sobrenadante en la parte superior. B) Lo mismo para un quitosano succinilado marcado con fluorescencia. C) Lo mismo para un Dextrano marcado con fluorescencia de 500 kg/mol.
La Fig. 17 muestra que se pueden formar geles de PEG macroporosos con tamaño de poro sintonizable utilizando un suplemento de hialuronano para aumentar la viscosidad y diversas cantidades de dextrano para aumentar la repulsión del PEG de la fase polisacárida. La formación de geles de PEG macroporosos con un tamaño de poro que va de menos de un micrómetro a más de 50 micrómetros se demuestra en la figura (1,5 % de PEG-vinilsulfona de 4 brazos (p/v) de 20 kg/mol entrecruzado con PEG-ditiol de 3,8 kg/mol en presencia de los polisacáridos indicados sobre las micrografías de fluorescencia. Una etiqueta fluorescente está unida al polímero PEG para su visualización).
La Fig. 18 muestra geles de PEG macroporosos formados con otras químicas de entrecruzamiento distintas a la adición Michael de tioles sobre sulfonas de vinilo. Aunque el tamaño de los poros resultante de una determinada concentración de polisacáridos sea diferente, el principio del procedimiento sigue funcionando igual. El PEG entrecruzado con transglutaminasa se ilustra aquí con un gel de PEG formado a partir de un precursor de PEG de 4 brazos de 20 kg/mol funcionalizado al final con péptidos que son sustratos para el factor XIII de coagulación sanguínea activado por la transglutaminasa (FKGG-ERCG y NQEQVSPL-ERCG). El PEG-diacrilato lineal de peso molecular 10 kg/mol se disolvió al 10% (p/v) en un tampón acuoso (glucosa 100 mmol/l, TRIS 50 mmol/l, calcio 50 mmol/l). Se disolvió dextrano de peso molecular 450-550 kg/mol al 5 % (p/v) en el mismo tampón. El iniciador radical fotoactivable Irgacure 2959 se disolvió al 0,2% (p/v) en el mismo tampón. A continuación, las soluciones se combinaron con 40 pl de solución de PEG, 40 pl de solución de dextrano y 10 pl de solución Irgacure 2959. La mezcla fue una solución clara y homogénea, que se colocó entre dos cubreobjetos con una separación de 1 mm y se expuso a la radiación UV a 365 nm con una intensidad de luz de aproximadamente 10 mW/cmA2 durante 10 minutos para el entrecruzamiento. Para evaluar la formación de poros, el hidrogel resultante se incubó durante 20 minutos en una solución saturada de 4-metil 7-tiocumarina, que reacciona con los pocos grupos de acrilato no reaccionados, marcando así el PEG con fluorescencia azul. El gel de PEG poroso fluorescente fue fotografiado con fluorescencia excitada por dos fotones con excitación a 710 nm y recogida de luz entre 400 y 500 nm, mostrando una estructura porosa homogénea estructurada en 3D.
En presencia del factor XIII activado y del calcio, el precursor de PEG de 4 brazos se entrecruza en un gel. La polimerización por radicales libres de PEG-diacrilato se ilustra aquí con 10 kg/mol de PEG-diacrilato (funcionalizado en el extremo) y utilizando 0,025 % de Irgacure 2959 (p/v) como iniciador de radicales activado tras la irradiación UV a 365 nm. El hialuronano (HA) y el dextrano se utilizan para la creación de macroporos. Las imágenes se adquieren con un microscopio equipado con filtros de contraste de interferencia diferencial (DIC). Barras de escala: 10 micrómetros.
La Fig. 19 muestra un hidrogel macroporoso de polioxazolina formado por adición de Michael, marcado con fluorescencia y visualizado con microscopía confocal de barrido láser con excitación de dos fotones.
Se utilizó como material de partida un copolímero de 150 unidades de longitud de 93 % de 2-etil 2-oxazolina y 7 % de 2-carboxietil 2-oxazolina. Se trata de una poli 2-etil 2-oxazolina lineal que contiene ácidos carboxílicos útiles para introducir fracciones que se pueden entrecruzar. Se obtuvo un derivado con contenido de tiol mediante la activación estándar con EDC de los carboxilatos para reaccionar con un exceso de dos veces de 3,3'-ditiobis(dihidrazida propanoica) (DTPHY) en tampón MES 300 mM pH 4,5, seguido de una reducción con un exceso de 10 veces de tricarboxietil fosfina (TCEP), seguido de diálisis y liofilización. Se obtuvo un derivado de vinilsulfona por reacción del derivado tiol con un exceso de 50 veces de divinilsulfona en tampón trietanolamina, pH 8,0, bajo atmósfera de nitrógeno durante 1 hora, seguido de diálisis y liofilización.
Los derivados de tio y vinilsulfona de poli(2-etil-oxazolina) se resuspendieron al 10 % (p/v) en agua mQ y en tampón trietanolamina 300mM, pH 8,0, respectivamente. Se disolvió hialuronano de peso molecular 1.000 a 2.000 kg/mol a 7,5 mg/ml en el mismo tampón. Las soluciones se combinaron, con 20 pl de cada derivado de polioxazolina para 40 pl de solución de hialuronano. Para la visualización de las estructuras porosas, una pequeña cantidad de cumarina fluorescente conjugada con tiol pudo ser preaccionada en la polioxazolina funcionalizada con vinilsulfona. Después de mezclar bien, se dejó que la gelificación por adición de Michael se produjera durante 1 hora a temperatura ambiente, y el hidrogel de polioxazolina macroporoso marcado con fluorescencia se visualizó en un microscopio confocal de fluorescencia de barrido.
La Fig. 20 muestra que la actividad de los picos de calcio medida en las neuronas corticales de rata encapsuladas en geles de PEG se debe a la excitación glutamatérgica de las neuronas y a los potenciales de acción que se disparan, ya que son inhibidos por los inhibidores de la transmisión glutamatérgica d,l-3[(±)-2-carboxipiperazin-4-il]-propil-1-ácido fosfónico (CPP) y 6-Ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX) y por el inhibidor del canal de sodio activado por voltaje tetrodotoxina (TTX). Los picos de calcio, según el indicador fluorescente Oregon Green BAPTA-1, se cuentan en el campo de visión de un vídeo de fluorescencia de 90 segundos adquirido con un objetivo 5x en un microscopio de campo amplio.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para proporcionar un hidrogel macroporoso, que comprende los pasos de
a) proporcionar una solución acuosa que comprenda un primer y un segundo soluto, en el que
i) el primer soluto es un polímero que se puede entrecruzar seleccionado entre un derivado que se puede entrecruzar de un polietilenglicol (PEG) y un derivado que se puede entrecruzar de una polioxazolina (POx); y
ii) el segundo soluto es un agente kosmotrópico polisacárido seleccionado del grupo que comprende hialuronano, mannuronano, carragenano, heparina, sulfato de condroitína, dextrano, hidroxipropil dextrano, pectina, alginato, goma gellan, celulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, almidón y hidroxipropilalmidón, en el que la concentración de dicho agente kosmotrópico polisacárido en dicha solución acuosa es de 0,1 a 50 % (p/v); y
b) añadir a dicha mezcla un reactivo de entrecruzamiento capaz de entrecruzar dicho polímero que se puede entrecruzar, iniciando así simultáneamente la gelificación de dicho polímero que se puede entrecruzar y la separación de fases.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polímero que se puede entrecruzar se selecciona entre
a) el grupo que comprende un polietilenglicol lineal o en forma de estrella, un copolímero dibloque de polietilenglicol y un copolímero tribloque de polietilenglicol, o
b) el grupo que comprende una polimetiloxazolina, una polietiloxazolina, una polipropiloxazolina y una polibutiloxazolina; o
c) el grupo que comprende una polioxazolina lineal o en forma de estrella y un copolímero de oxazolina, o d) el grupo que comprende poli 2-metil oxazolina parcialmente hidrolizada o poli 2-etil oxazolina e) un copolímero dibloque de polietilenglicol que consiste en bloques de dos monómeros, siendo uno de los cuales polietilenglicol y siendo el otro seleccionado del grupo que comprende polietileno (PE), polilactida (PLA), polilactida-co-glicolida (PLGA), poli-£-caprolactona (PCL) y poliestireno
f) un copolímero tribloque de polietilenglicol formado por bloques de dos monómeros, siendo uno de ellos polietilenglicol y siendo el otro seleccionado entre polipropilenglicol (PPG) y polilactida-co-glicolida (PLGA).
3. El procedimiento de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polímero que se puede entrecruzar comprende una fracción reactiva seleccionada del grupo que comprende acrilato, metacrilato, acrilamida, éster de vinilo, maleimida, sulfona de vinilo, alquino, azida, aldehído y fracciones de tiol.
4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polímero que se puede entrecruzar está modificado con vinilsulfona y dicho reactivo de entrecruzamiento se selecciona del grupo que comprende
a) una molécula enlazadora corta que comprende dos moléculas de tiol (-SH); y
b) un polietilenglicol en forma de estrella que comprenda elementos de tiol primario (-CH2SH) o un polietilenglicol lineal que comprenda elementos de tiol primario (-CH2SH); y
c) un péptido que contiene de dos a cien aminoácidos, en el que dos de dichos aminoácidos son cisteínas; y d) proteínas que contienen dos cisteínas.
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el peso molecular de dicho polímero que se puede entrecruzar es de 1.000 a 1.000.000 g/mol.
6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de dicho polímero que se puede entrecruzar en dicha solución acuosa es de 0,5 a 10 % (p/v).
7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha solución acuosa comprende del 0,5 a 3 % (p/v) de dicho derivado que se puede entrecruzar de un polietilenglicol o del 4 al 10 % (p/v) de dicho derivado que se puede entrecruzar de una polioxazolina.
8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho agente kosmotrópico polisacárido es un polisacárido seleccionado del grupo que comprende pectina, alginato, goma gellan, celulosa, hialuronano, mannuronano y dextrano, y en el que dicho polisacárido se caracteriza por tener un peso molecular en el intervalo de 1.000 g/mol a 10.000.000 g/mol, particularmente de 10.000 g/mol a 2.000.000 g/mol, más particularmente de 100.000 g/mol a 1.000.000 g/mol, incluso más particularmente de manera aproximada 150.000 g/mol.
9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de dicho agente kosmotrópico polisacárido en dicha solución acuosa es del 0,1 a 5 % (p/v).
10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha solución acuosa comprende de 0,1 a 1 % de hialuronano, o de 0,5 a 5 % de mannuronano, o de 0,1 a 20 % de dextrano, o una mezcla de los mismos.
11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polímero que se puede entrecruzar es 20 kDa de PEG-tiol de 4 brazos de modificado con fracciones de vinilsulfona, dicho polisacárido es mannuronano, y dicho reactivo de entrecruzamiento es un péptido escindible por matriz de metaloproteinasa.
12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha solución acuosa se caracteriza por un pH de 7,0-8,0 y la adición de dicho agente de entrecruzamiento se produce entre 20 °C y 40 °C.
13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se añade una célula a dicha solución acuosa antes del entrecruzamiento.
14. Un hidrogel macroporoso obtenido u obtenible por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
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