CN108893445A - 一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法 - Google Patents

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Abstract

一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，通过视网膜神经节细胞的纯化方法提取视网膜神经节细胞，通过将磁性微球营养与磁性微球营养加入具有0.5mg/mL光引发剂的水凝胶A中，通过加载磁场控制磁性微球营养在水凝胶A中的空间位置，当位置抵达实验所需要的位置后，通过紫外光S5时间的照射，使得水凝胶A发生光交联，形成甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶的水凝胶B，进而进行视网膜神经节细胞与轴突的培养该引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法能够提高视网膜神经节细胞的粘附性、提高视网膜神经节细胞的生存率。

Description

一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，特别是涉及一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法。
背景技术
目前，众多实验研究中，常用的视网膜神经节细胞的培养方法之一，即大鼠原代视网膜神经节细胞悬液加入培养基中，将细胞接种在组织工程支架上，将其在37℃、5％CO2饱和湿度的条件下的进行二维培养，通过各种实验方法观察生长过程中细胞及轴突的形态结构及电生理情况。
部分研究将原代视网膜神经节细胞封装在水凝胶(如海藻酸钠、明胶和聚异丙基丙烯酰胺等)内，进行交联后对细胞进行三维培养，观察生长过程中细胞及轴突的形态结构及电生理情况，也有部分学者在装有视网膜神经节细胞的培养基或水凝胶内加入微球颗粒，微球可缓释细胞生长所需的营养成分，将其共培养，研究不同时间点细胞及轴突的形态结构的变化及细胞的电生理学情况。
但是现有的培养方法通常存在有缺点及其原因：
1、视网膜神经节细胞处于的二维生长环境，与其体内的三维生长环境具有较大的区别，研究过程中所得的结果与真实结果存在有偏差；
2、视网膜神经节细胞在被封装于水凝胶内时，在生长过程中，由于缺乏促进细胞及轴突生长的营养物质，导致其细胞及轴突的生长较为缓慢，不利于观察与研究；另一方面，水凝胶内由于环境以及水凝胶的环境所限，在视网膜神经节细胞在培养过程中细胞黏附低，且不利于视网膜神经节细胞的生长；
3、在培养过程中视网膜神经节细胞和轴突的生长以及延展方向没有规律，因此只能对培养后的细胞进行筛选，得到用于研究的目的细胞，极大增加了细胞培养的成本。
因此，针对现有技术不足，提供一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法以克服现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，该引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，一方面使用为视网膜神经节细胞提供一个类细胞外基质的生长环境；另一方面，实现磁性微球具有提高细胞的粘附性、提高细胞的生存率，并通过在磁场和生长因子的联合作用，对磁性微球进行空间定位后，促进视网膜神经节细胞的生长，引导视网膜神经节细胞及轴突的生长延展，加快轴突生长速度；另外，磁性微球表面提高了对生长因子的包封率，并且促进细胞的黏附及生长。
本发明的上述目的通过如下技术手段实现。
提供一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，具体步骤如下，
第A步，制备水凝胶A；
第B步，制备具有营养因子的磁性微球营养；
第C步，提取视网膜神经节细胞，将视网膜神经节细胞与磁性微球营养均匀混合于水凝胶A中，使得视网膜的密度达到V细胞，使得磁性微球营养的密度达到V磁球，加载磁场Φ，调节磁性微球营养空间位置；
第D步，使用紫外光进行照射S5时间，形成水凝胶B，使得视网膜神经节细胞在水凝胶B内培养S1时间。
优选的，步骤A中，水凝胶A的具体制备步骤为，
A-1，制备明胶A溶液；
A-2，将体积份计，将10份的甲基丙烯酸酐加至H2份的明胶A溶液中,反应S2时间后形成H1体积的混合溶液；
A-3，将5H1体积、浓度M2的磷酸缓冲盐溶液A加入混合溶液中稀释终止反应；
A-4，透析S3时间，离心干燥，得到水凝胶A。
优选的，步骤B中，具有营养因子的磁性微球营养具体制备步骤为，
B-1，制备水相溶液；
B-2，制备浓度M8的SPN-80油相溶液；
B-3，制备内相溶液；
B-4，制备用于收集磁性微球的收集溶液；
B-5，将步骤B-2中制备浓度M8的SPN-80油相溶液作为外相溶液，将外相溶液与内相溶液分别注入到微流芯片的两个不同入口；在出口处用收集溶液收集尺寸C尺寸的磁性微球B；
B-6，清洗磁性微球B；
B-7，将清洗后的磁性微球B，置于丙酮C中，浸泡S4时间后，冷冻干燥，制备得到磁性微球C；
B-8，将磁性微球C分别浸泡于浓度为M5的脑源性神经营养因子溶液A与浓度为M6的睫状神经营养因子溶液A中，得到具有营养因子的磁性微球营养。
优选的，明胶A溶液的浓度为M7；
优选的，步骤A-1制备明胶A溶液的具体步骤为；
以质量份计，将5份的明胶加入50份的浓度M1的PBS溶液，加热至温度T1，然后保持在温度T1搅拌溶解，形成明胶A溶液。
优选的，步骤B-1中，制备水相溶液的具体过程为；
B-1.1，配置浓度为M4的壳聚糖溶液。
壳聚糖溶液的具体配置步骤为将壳聚糖粉末溶于浓度为M3的乙酸溶液中，配置成浓度为M4的壳聚糖溶液。
B-1.2，离心除去气泡和不溶性杂质，得到成浓度为M4的水相溶液。
优选的，步骤B-2中，制备水相溶液的具体过程为；以体积份计，将2份的SPN-80加入100份的环已烷中，配置成浓度为M8的SPN-80油相溶液。
优选的，步骤B-3中，制备内相溶液的具体过程为；
将磁性微球加入水相溶液中，并保持所述磁性微球在水相溶液中浓度为200mg/mL，然后进行超声分散得到内相溶液。
优选的，收集溶液为浓度M9的氢氧化钠-乙醇溶液；
优选的，步骤B-5中，使用推注泵A1对装有外相溶液的注射器以流速A1流速进行推注；
使用推注泵A2对装有内相溶液的注射器以流速A2流速进行推注；
优选的，A1流速/A2流速为A流速比；
优选的，步骤B-6中清洗磁性微球B的具体步骤为依次用水、乙醇A、丙酮B清洗。
优选的，在第C步中，水凝胶A还添加有光引发剂，光引发剂在水凝胶聚合物A溶液中的浓度为M10；光引发剂为Irgacure2959光引发剂，浓度M10为0.5mg/mL。
优选的，V细胞为5×104个/ml，V磁球为1×104个/ml。
优选的，M2为0.01mol/L；H2为50份。
优选的，在步骤A-4中离心干燥的具体操作为，将步骤A-3中得到的溶液保持在离心转速为800r/min，持续离心时间为5min后离心去沉淀，置于冻干机内，在-60℃的条件下进行冷冻干燥。
优选的，磷酸缓冲盐溶液A为PBS磷酸缓冲盐溶液。
优选的，微流控芯片为F-shaped微流控芯片，A流速比为50。
优选的，A1流速为100μL/min，A2流速为2μL/min。
优选的，M1为0.01mol/L；乙醇A为无水乙醇，丙酮B为纯度为100％的丙酮。
优选的，磁场Φ为300-500G，进一步的，磁场Φ为400G。
优选的，紫外光为355-375nm的紫外光，进一步的，紫外光为365nm的紫外光，进一步的，S5为2分钟。
优选的，时间S1为5-9天，优选的时间S1为6天。
优选的，时间S2为4-6小时，浓度M8为2v/v。
优选的C尺寸为90-110μm，进一步的，C尺寸为100μm。
优选的，S4为24h；磁性微球C为表面成微孔状的壳聚糖磁性微球；
优选的，浓度M5为20ng/mL；
优选的，脑源性神经营养因子溶液A为BDNF脑源性神经营养因子溶液；
优选的，睫状神经营养因子溶液A为CNTF睫状神经营养因子溶液。
优选的，浓度M6为20ng/mL，浓度M7为5g/mL。
优选的，温度T1为50-70℃，进一步的，温度T1为60℃。
优选的，浓度M4为5mg/mL；浓度M3为100％；磁性微球为Fe3O4磁性纳米颗粒，浓度M9为0.15-06moL/L。
本发明的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，通过视网膜神经节细胞的纯化方法提取视网膜神经节细胞，通过将磁性微球营养与磁性微球营养加入具有0.5mg/mL光引发剂的水凝胶A中，通过加载磁场控制磁性微球营养在水凝胶A中的空间位置，当位置抵达实验所需要的位置后，通过紫外光S5时间的照射，使得水凝胶A发生光交联，形成甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶的水凝胶B，进而进行视网膜神经节细胞与轴突的培养；当视网膜神经节细胞在水凝胶B中培养时，因为磁性微球营养在脑源性神经营养因子溶液A与睫状神经营养因子溶液A中浸泡，且磁性微球营养表面包裹的壳聚糖形成的微孔结构，所以磁性微球营养能够对神经营养因子进行大量的吸收与包附，使得磁性微球营养在后续的细胞培养中，逐渐在水凝胶B中释放神经营养因子，进而促进视网膜神经节细胞、轴突的生长与延展；磁性微球营养在微流芯片的作用下，具有磁性，当加载磁场后，能够控制磁性微球营养的运动，进而控制磁性微球营养在水凝胶A中的空间位置，当使用紫外光进行照射后，水凝胶A发生光交联形成甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶的水凝胶B。该引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法能够提高视网膜神经节细胞的粘附性、提高视网膜神经节细胞的生存率，通过在磁场的作用，对磁性微球进行空间位置引导，进而对视网膜神经节细胞的生长位置进行引导，并通过在磁场和生长因子的联合作用，使得视网膜神经节细胞、轴突的生长中的各项状态得到有效提高。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是本发明的结构示意图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1。
一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，如图1所示，具体步骤如下：
第A步，制备水凝胶A；
步骤A中，水凝胶A的具体制备步骤为，
A-1，制备浓度为M7的明胶A溶液；
以质量份计，将5份的明胶加入50份的浓度M1的PBS溶液，加热至温度T1，然后然后保持在温度T1搅拌溶解，形成明胶A溶液。
A-2，以体积份计，将10份的甲基丙烯酸酐加至H2份的明胶A溶液中，反应时间S2后形成H1体积的混合溶液。
A-3，将5H1体积、浓度M2的磷酸缓冲盐溶液A加入混合溶液中稀释终止反应。
A-4，透析S3时间，离心干燥，得到水凝胶A。
第B步，制备具有营养因子的磁性微球营养；具有营养因子的磁性微球营养具体制备步骤为，
B-1，制备水相溶液。
步骤B-1中，制备水相溶液的具体过程为：
B-1.1，配置浓度为M4的壳聚糖溶液。
壳聚糖溶液的具体配置步骤为将壳聚糖粉末溶于浓度为M3的乙酸溶液中，配置成浓度为M4的壳聚糖溶液。
B-1.2，离心除去气泡和不溶性杂质，得到成浓度为M4的水相溶液。
B-2，制备浓度M8的SPN-80油相溶液；步骤B-2中，制备水相溶液的具体过程为：以体积份计，将2份的SPN-80加入100份的环已烷中，配置成浓度为M8的SPN-80油相溶液。
B-3，制备内相溶液；制备内相溶液的具体过程为，将磁性微球加入水相溶液中，并保持所述磁性微球在水相溶液中浓度为200mg/mL，然后进行超声分散得到内相溶液。
磁性微球为Fe3O4磁性纳米颗粒。
B-4，制备用于收集磁性微球的收集溶液；收集溶液为浓度M9的氢氧化钠-乙醇溶液。
B-5，将步骤B-2中制备浓度M8的SPN-80油相溶液作为外相溶液。
将外相溶液与内相溶液分别注入到微流芯片的两个不同入口；在出口处用收集溶液收集尺寸C尺寸的磁性微球B；
在步骤B-5中，使用推注泵A1对装有外相溶液的注射器以流速A1流速进行推注；
使用推注泵A2对装有内相溶液的注射器以流速A2流速进行推注；具体的，A1流速/A2流速为A流速比＝50。
B-6，清洗磁性微球B；具体步骤B-6中清洗磁性微球B的具体步骤为依次用水、乙醇A、丙酮B清洗。
B-7，将清洗后的磁性微球B，置于丙酮C中，浸泡时间为S4后，冷冻干燥，制备得到磁性微球C；磁性微球C为表面成微孔状的壳聚糖磁性微球。
B-8，将磁性微球C分别浸泡于浓度为M5的脑源性神经营养因子溶液A与浓度为M6的睫状神经营养因子溶液A中，得到具有营养因子的磁性微球营养。
第C步，在水凝胶A中添加光引发剂，
以质量份计，1质量份的光引发剂，混合于1质量份的水凝胶A。
光引发剂在水凝胶聚合物A溶液中的浓度为M10。
通过提取提纯后的视网膜神经节细胞，使得视网膜的密度达到V细胞，使得磁性微球营养的密度达到V磁球，加载磁场Φ，调节磁性微球营养空间位置。
视网膜神经节细胞的提纯作为本领域内的公知常识，具体操作步骤就不再仔细赘述。
第D步，使用紫外光进行照射S5时间，形成水凝胶B，使得视网膜神经节细胞在水凝胶B内培养S1时间。
通过紫外光的照射的水凝胶B通过甲基丙烯酸酐化明胶发生光交联，最终形成甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶的水凝胶B，提高了视网膜神经节细胞在培养过程中细胞黏附性。
使用微流控芯片技术制备的磁性微球营养，通过加载磁场可对微球在水凝胶的空间位置进行调控，能够引导视网膜神经节细胞和轴突的生长和延展。并且结合磁性微球营养中脑源性神经营养因子溶液A与睫状神经营养因子溶液A的缓释作用，进一步的促进了细胞的生长速度、提高了细胞的生存率。
内相溶液中，因为磁性微球表面包裹的壳聚糖形成的微孔结构，加大神经营养因子的包封率，并且促进引导视网膜神经节细胞的黏附以及促进了轴突生长延展。
磁性微球营养因为在脑源性神经营养因子溶液A与睫状神经营养因子溶液A中浸泡，所以具有了缓释脑源性神经营养因子溶液A与睫状神经营养因子溶液A的作用，使得在引导视网膜神经节细胞的培养过程中能够促进细胞与轴突的生长。
本发明的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，通过视网膜神经节细胞的纯化方法提取视网膜神经节细胞，通过将磁性微球营养与磁性微球营养加入具有0.5mg/mL光引发剂的水凝胶A中，通过加载磁场控制磁性微球营养在水凝胶A中的空间位置，当位置抵达实验所需要的位置后，通过紫外光S5时间的照射，使得水凝胶A发生光交联，形成甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶的水凝胶B，进而进行视网膜神经节细胞与轴突的培养；当视网膜神经节细胞在水凝胶B中培养时，因为磁性微球营养在脑源性神经营养因子溶液A与睫状神经营养因子溶液A中浸泡，且磁性微球营养表面包裹的壳聚糖形成的微孔结构，所以磁性微球营养能够对神经营养因子进行大量的吸收与包附，使得磁性微球营养在后续的细胞培养中，逐渐在水凝胶B中释放神经营养因子，进而促进视网膜神经节细胞、轴突的生长与延展；磁性微球营养在微流芯片的作用下，具有磁性，当加载磁场后，能够控制磁性微球营养的运动，进而控制磁性微球营养在水凝胶A中的空间位置，当使用紫外光进行照射后，水凝胶A发生光交联形成甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶的水凝胶B。该引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法能够提高视网膜神经节细胞的粘附性、提高视网膜神经节细胞的生存率，
通过在磁场的作用，对磁性微球进行空间位置引导，进而对视网膜神经节细胞的生长位置进行引导，并通过在磁场和生长因子的联合作用，使得视网膜神经节细胞、轴突的生长中的各项状态得到有效提高。
实施例2。
一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其它结构与实施例1相同，不同之处在于，
V细胞为5×104个/ml，V磁球为1×104个/ml。
通过将V细胞保持在5×104个/ml，V磁球保持在1×104个/ml，能够提高视网膜细胞吸附在磁性微球营养的吸附率，进而促进细胞的生长。
实施例3。
一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其它结构与实施例1-2相同，不同之处在于，该引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法中，，脑源性神经营养因子溶液A为BDNF脑源性神经营养因子溶液，睫状神经营养因子溶液A为CNTF睫状神经营养因子溶液。
通过设置BDNF脑源性神经营养因子溶液、CNTF睫状神经营养因子溶液为视网膜细胞的培养提供了营养，促进视网膜细胞的生长。
实施例4。
一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其它结构与实施例1-3相同，不同之处在于，该引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法中，时间S1为5-9天，磁场Φ为300-500G，紫外光为355-375nm的紫外光，进一步的，S5为2分钟。
时间S2为4-6小时，C尺寸为90-110μm。
具体的，S4为24h；具体的，浓度M5为20ng/mL。
具体的，浓度M8为2v/v。
具体的，浓度M9为0.15-06moL/L。
光引发剂为Irgacure2959光引发剂，浓度M10为0.5mg/mL，光引发剂在水凝胶A中的浓度为0.5mg/mL。
具体的，M2为0.01mol/L；H2为50份。
具体的，在步骤A-4中离心干燥的具体操作为，将步骤A-3中得到的溶液保持在离心转速为800r/min，持续离心时间为5min后离心去沉淀，置于冻干机内，在-60℃的条件下进行冷冻干燥。
具体的，磷酸缓冲盐溶液A为PBS磷酸缓冲盐溶液。
具体的，微流控芯片为F-shaped微流控芯片，A1流速为100μL/min，A2流速为2μL/min。
具体的，M1为0.01mol/L；乙醇A为无水乙醇，丙酮B为纯度为100％的丙酮。
通过选用磁场Φ为300-500G的磁场能够准确快速的引导磁性微球营养抵达相应的位置，通过选用355-375nm的紫外光照射2分钟，引发甲基丙烯酸酐化明胶发生光交联，形成甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶，并且不会对细胞的生长造成影响。
通过透析时间选为5-9天，使得能够最大限度的过滤杂质，得到最大限度的甲基丙烯酸酐化明胶溶液。
实施例5。
一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其它结构与实施例1相同，不同之处在于，该引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，磁场Φ为400G，C尺寸为100μm，浓度M6为20ng/mL，浓度M7为5g/mL，光引发剂为Irgacure2959光引发剂；紫外光为365nm的紫外光。
通过选用400G磁场、紫外光为365nm以及Irgacure2959光引发剂，能够使得细胞在培育的过程中，最大限度的附着在C尺寸为100μm的磁性微球营养，以及保证细胞在培育时间的生长速度以及细胞的存活率。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
具体步骤如下，
第A步，制备水凝胶聚合物A；
第B步，制备具有营养因子的磁性微球营养；
第C步，提取视网膜神经节细胞，将视网膜神经节细胞与磁性微球营养均匀混合于水凝胶聚合物A水溶液中，使得视网膜的密度达到V细胞，使得磁性微球营养的密度达到V磁球，加载磁场Φ，调节磁性微球营养空间位置；
第D步，使用紫外光进行照射S5时间，形成水凝胶B，使得视网膜神经节细胞在水凝胶B内培养S1时间。
2.根据权利要求1所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述步骤A中，水凝胶聚合物A的具体制备步骤为，
A-1，制备明胶A溶液；
A-2，以体积份计，将10份的甲基丙烯酸酐加至H2份的明胶A溶液中,反应S2时间后形成H1体积的混合溶液；
A-3，将5H1体积、浓度M2的磷酸缓冲盐溶液A加入混合溶液中稀释终止反应；
A-4，透析S3时间，离心干燥，得到水凝胶聚合物A。
3.根据权利要求2所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述步骤B中，具有营养因子的磁性微球营养具体制备步骤为，
B-1，制备水相溶液；
B-2，制备浓度M8的SPAN-80油相溶液；
B-3，制备内相溶液；
B-4，制备用于收集磁性微球的收集溶液；
B-5，将步骤B-2中制备浓度M8的SPAN-80油相溶液作为外相溶液，将外相溶液与内相溶液分别注入到微流控芯片的两个不同入口；在出口处用所述收集溶液收集尺寸C尺寸的磁性微球B；
B-6，清洗磁性微球B；
B-7，将清洗后的磁性微球B，置于丙酮C中，浸泡S4时间后，冷冻干燥，制备得到磁性微球C；
B-8，将磁性微球C分别浸泡于浓度为M5的脑源性神经营养因子溶液A与浓度为M6的睫状神经营养因子溶液A中，得到具有营养因子的磁性微球营养。
4.根据权利要求3所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述明胶A溶液的浓度为M7；
所述步骤A-1制备明胶A溶液的具体步骤为；
以质量份计，将5份的明胶加入50份浓度M1的PBS溶液，加热至温度T1，然后保持在温度T1搅拌溶解，形成明胶A溶液。
5.根据权利要求4所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述步骤B-1中，制备水相溶液的具体过程为；
B-1.1，配置浓度为M4的壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液的具体配置步骤为：
将壳聚糖粉末溶于浓度为M3的乙酸溶液中，配置成浓度为M4的壳聚糖溶液；
B-1.2，离心除去气泡和不溶性杂质，得到成浓度为M4的水相溶液。
6.根据权利要求5所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述步骤B-2中，制备油相溶液的具体过程为；以体积份计，将2份的SPAN-80加入100份的环已烷中，配置成浓度为M8的SPAN-80油相溶液。
7.根据权利要求6所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述步骤B-3中，制备内相溶液的具体过程为；
将磁性微球加入水相溶液中，并保持所述磁性微球在水相溶液中浓度为200mg/mL，然后进行超声分散得到内相溶液。
8.根据权利要求7所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述收集溶液为浓度M9的氢氧化钠-乙醇溶液。
9.根据权利要求8所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述步骤B-5中，使用推注泵A1对装有外相溶液的注射器以流速A1流速进行推注；
使用推注泵A2对装有内相溶液的注射器以流速A2流速进行推注；
所述A1流速/所述A2流速为A流速比；
所述步骤B-6中清洗磁性微球B的具体步骤为依次用水、乙醇A、纯度为100％的丙酮B清洗。
10.根据权利要求9所述的引导视网膜神经节细胞及其轴突生长延展的方法，其特征在于：
所述第C步中，水凝胶聚合物A溶液中还添加有光引发剂；所述光引发剂为Irgacure2959光引发剂；所述光引发剂在所述水凝胶聚合物A溶液中的浓度为M10；所述浓度M10为0.5mg/mL；
V细胞：5×104个/ml，V磁球:1×104个/ml；所述M2为0.01mol/L；所述H2为50份；
所述A-4步骤中离心干燥的具体操作为，将步骤A-3中得到的溶液保持在离心转速为800r/min，持续离心时间为5min后离心去沉淀，置于冻干机内，在-60℃的条件下进行冷冻干燥；
所述磷酸缓冲盐溶液A为PBS磷酸缓冲盐溶液；
所述微流控芯片为F-shaped微流控芯片；
所述A1流速为100μL/min，A2流速为2μL/min；所述M1为0.01mol/L；所述A流速比为50；
所述乙醇A为无水乙醇，所述丙酮B为纯度为100％的丙酮；
所述磁场Φ为300-500G，所述磁场Φ为400G；
所述紫外光为355-375nm的紫外光，所述紫外光为365nm的紫外光；
所述S5为2分钟；
所述时间S1为5-9天，所述S1为6天；
所述时间S2为4-6小时；
所述浓度M8为2％v/v；
所述C尺寸为90-110μm，所述C尺寸为100μm；
所述S4为24h；所述磁性微球C为表面成微孔状的壳聚糖磁性微球；
所述浓度M5为20ng/mL；
所述脑源性神经营养因子溶液A为BDNF脑源性神经营养因子溶液；所述睫状神经营养因子溶液A为CNTF睫状神经营养因子溶液；
所述浓度M6为20ng/mL；所述浓度M7为0.1g/mL；
所述温度T1为50-70℃，所述温度T1为60℃；
所述浓度M4为5mg/mL；所述浓度M3为100％；
所述磁性微球为Fe3O4磁性纳米颗粒；
所述浓度M9为0.15-0.6moL/L。
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