CN103007351B - 纤维环与髓核一体化复合双相支架及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纤维环与髓核一体化复合双相支架及其构建方法,属于生物组织工程技术。本发明用猪松质骨制备出外层为脱细胞脱钙骨基质明胶环，用猪尾椎间盘髓核组织制备中央为脱细胞髓核基质，冷冻冻干后依次经紫外线照射交联和化学试剂EDAC及NHS交联，将两种材料复合而成。这样设计的本发明，生物相容性好，避免发生免疫排斥反应；组成结构及力学性能与人椎间盘细胞外基质相似；且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单，可用于构建组织工程椎间盘修复椎间盘退变，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织工程技术，具体是一种纤维环与髓核一体化复合双相支架及其构建方法。
背景技术
生物组织工程方法主要包括支架材料、种子细胞和信号因子三要素，其中，支架材料是组织工程构建的关键环节。理想的组织工程椎间盘支架材料除了具备良好的生物相容性，良好的孔隙结构，以及适当的降解性能等共性以外，还应该在成分、形状、结构、力学性能上与人椎间盘细胞外基质相似。
椎间盘结构复杂并有很高程度的异质性，含有髓核与纤维环两个发育上和形态上不同的区域，由不同的细胞和细胞外基质组成。目前对于组织工程椎间盘支架材料的研究多停留在分别构建组织工程纤维环支架(AF)和组织工程髓核支架(NP)上，早期用于椎间盘组织工程的支架材料有藻酸盐、琼脂糖、透明质酸、以及聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA)等，后来则倾向于应用类似椎间盘细胞外基质的含有胶原和蛋白聚糖成分的材料，如I型胶原/透明质酸复合支架、Ⅱ型胶原/透明质酸凝胶复合支架、Ⅱ型胶原/透明质酸/6-硫酸软骨素、脱细胞小肠粘膜下层(SIS)等,尚缺乏对一体化AF-NP支架材料的研究。
美国Mizuno课题小组创新性用聚乙醇酸-聚乳酸材料(PGA/PLLA)制成椭圆形的纤维环外形支架，并种植羊纤维环细胞，其中心部注入以藻酸盐凝胶复合的髓核细胞，从而制成一椎间盘样组织工程化复合物并植入裸鼠背部皮下培养。结果表明培养组织的大体形态与正常椎间盘相似；组织学结果表明培养组织外周的类纤维环组织多含有I型胶原而中央的类髓核组织中多含有II型胶原，这和正常椎间盘组织中的分布特点类似；生化成分检测结果表明DNA、GAG以及胶原的含量在16周超过正常组织的50％；生物力学检测结果表明生成的椎间盘样组织弹性模量增加了4倍，仍低于正常的椎间盘组织；该研究培养的椎间盘组织，无论形态大小还是力学性能，距离能够真正临床应用的椎间盘组织相差甚远(Mercuri JJ,Gill SS,Simionescu DT.Novel tissue-derived biomimetic scaffold forregenerating the human nucleus pulposus.J Biomed Mater Res A,2011,96(2):422-435.)，但以上研究表明构建工程化纤维环与髓核复合组织是构建一体化椎间盘的可行方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中仅有单一组织工程纤维环支架或组织工程髓核支架的不足，提供一种同时适合纤维环细胞和髓核细胞生长要求的生物组织工程纤维环与髓核一体化复合双相支架及其制备方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种纤维环与髓核一体化复合双相支架的构建方法，其是以下步骤构建的：
a、制备脱细胞脱钙骨基质明胶环
取猪股骨头的松质骨，修整成纤维环形状后，依次在室温条件下进行脱细胞脱钙处理：
(1)、用体积比为1:1的氯仿甲醇混合液与松质骨按1g/30ml的比例浸泡24h；
(2)、用0.6mol/L的HCl浸泡48h；
(3)、2mmol/L CaCl2浸泡1h；
(4)、0.5mmol/L EDTA浸泡1h；
(5)、8mmol/L的LiCl浸泡1h；
(6)、5％Triton X-100浸泡24h；
(7)、去离子水反复冲洗，即得；
b、制备脱细胞髓核基质微丝悬液
(1)、将猪尾椎间盘髓核组织放入含0.6％TritonX-100和1.0％脱氧胆酸的Tris－HCL缓冲液中，超声频率42kHz±6％，处理10分钟，过滤去除骨屑杂质；
(2)、放入含0.6％TritonX-100和1.0％脱氧胆酸的Tris－HCL缓冲液中，室温持续震荡72h，150r/min，每隔24h换液一次、超声10分钟，去离子水冲洗干净；
(3)、将髓核组织用含720mU/mL DNaseⅠ和720mU/mL RNase A的PBS消化液37℃消化48小时，去离子水冲洗干净；
(4)、粉碎、梯度离心，取直径为100nm～5μm左右的髓核基质微丝，蒸馏水反复冲洗，与双蒸水按重量百分比配成0.5％～5％的白色乳悬液；
c.支架构建和交联
将脱细胞髓核基质微丝悬液注入到脱细胞脱钙骨基质明胶环中央，渗透深度0.5～2mm，-20℃～-80℃,1～48小时冷冻冻干后构成脱细胞髓核基质,先行紫外线照射交联，紫外线波长258nm，距离光源5～10cm，交联时间12～48h；然后化学试剂交联，浓度为0.001～1M的碳化二亚胺与浓度为0.001～1M的N-羟基琥珀酰亚胺混合的水溶液中交联1h～48h，再次冻干，消毒即得。
化学试剂交联是由浓度为0.01～0.3M的碳化二亚胺与浓度为0.005～0.2M的N-羟基琥珀酰亚胺混合的水溶液。
这样设计的本发明主要优点如下：
①所采用的材料猪股骨头松质骨及猪尾椎间盘髓核均属于天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，且材料来源广泛，可供批量生产。
②通过脱细胞系列处理去处抗原成分，避免发生免疫排斥反应、传播疾病。
③通过调节髓核细胞外基质微丝悬液的浓度及冷冻冻干时冷冻温度、降温速率等因素，控制多孔支架的微结构，制备出具有适宜孔径和孔隙率的三维多孔支架。
④通过控制交联时间或交联剂浓度，调节多孔支架的生物力学特性和降解速率,使组成结构及力学性能与椎间盘细胞外基质相似。
⑤可塑性好，制备工艺简单，可利用CAD设计和制造技术制备与退变椎间盘的形状、大小相同的双相支架材料，可用于构建组织工程椎间盘修复椎间盘退变，具有良好的临床应用前景,个体化应用于病人。
附图说明
图1是本发明的立体结构示意图；
图2是本发明的平面结构示意图；
图3是本发明纤维环相支架HE染色无细胞及细胞碎片残留图；
图4是本发明髓核相支架HE染色无细胞及细胞碎片残留图；
图5是光镜下纤维环相支架呈三维多孔网状结构图；
图6是扫描电镜下纤维环相支架呈三维多孔网状结构图；
图7是光镜下脱细胞髓核基质微丝相互连接成网结构图；
图8是扫描电镜下脱细胞髓核基质微丝相互连接成网结构图；
图9是光镜下一体化支架结合部连接紧密30倍图；
图10是扫描电镜一体化支架结合部连接紧密100倍图；
图11是MTT检测不同浓度浸提液培养下脂肪干细胞的增殖图；
图12是Live/Dead染色脂肪干细胞在纤维环相支架上分布图；
图13是Live/Dead染色脂肪干细胞在髓核相支架上分布图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
1、制备脱细胞脱钙骨基质明胶环
以新鲜猪股骨头松质骨为原料，修整制成外径10mm、内径5mm、厚3mm的中空骨环，在室温条件下进行脱细胞脱钙处理，流程如下：①用体积比为1:1的氯仿甲醇混合液1500ml加入松质骨50g，浸泡24h；②0.6mol/L的HCl浸泡48h；③2mmol/L CaCl2处理1h；④0.5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)进行浸泡处理1h；⑤8mmol/L的氯化锂(LiCl)处理1h；⑥用5％Triton-100浸泡处理24h；⑦去离子水反复冲洗，备用。
2、制备脱细胞髓核基质微丝悬液
收集猪尾巴中的髓核组织，参考Mercuri的方法对髓核组织进行脱细胞处理(参见Mercuri JJ,Gill SS,Simionescu DT.Novel tissue-derived biomimeticscaffold for regenerating the human nucleus pulposus.J Biomed Mater Res A,2011,96(2):422-35.)。操作方法如下：①将新鲜猪尾椎间盘髓核组织放入含0.6％TritonX-100去垢剂和1.0％脱氧胆酸的Tris－HCL缓冲液中，超声10分钟(42kHz±6％)，过滤去除骨屑等杂质；②将髓核组织放入含0.6％TritonX-100和1.0％脱氧胆酸的Tris－HCL缓冲液中，室温持续震荡72h(150r/min)，每隔24h换液一次、超声10分钟(42kHz±6％)去除细胞成分，去离子水冲洗干净；③将髓核组织用含720mU/mL DNaseⅠ和720mU/mL RNase A的PBS消化液37℃消化48小时，去离子水冲洗干净；④粉碎、梯度离心，取直径为100nm～5μm左右的髓核基质微丝，蒸馏水反复冲洗，按重量比配成3％的白色乳悬液，即得。
本发明采用性质比较温和的去垢剂Triton X－100对天然骨进行脱细胞处理,去除了天然骨的细胞成分但没有改变骨组织的天然结构。
3、纤维环与髓核一体化复合双相支架的构建和交联
将脱细胞髓核基质微丝悬液充分混匀后注入到脱细胞脱钙骨基质明胶环中央(见图1)，控制脱细胞髓核基质微丝悬液渗入深度保持在0.5～2mm，－20℃冷冻，使其完全凝固，构成脱细胞髓核基质，然后将样品放入冷冻冻干机内，冷冻干燥24小时以上；再用258nm紫外线，距离光源5cm照射24h,然后浸入浓度为14mM的碳化二亚胺(EDAC)及浓度为5.5mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液交联24h,PBS冲洗3遍后将支架冷冻冻干，消毒，得双相支架(见图2)。
4、双相支架的组织学及电镜观察
图3是本发明纤维环相支架HE染色放大100倍无细胞及细胞碎片残留图，图4是本发明髓核相支架HE染色放大200倍无细胞及细胞碎片残留图，
HE染色可见支架均质红染，外层的脱细胞脱钙骨基质明胶和中央的脱细胞髓核基质均无细胞残留。
图5是光镜下纤维环相支架呈三维多孔网状结构30倍放大图，图6是扫描电镜下纤维环相支架呈三维多孔网状结构80倍放大图，光镜及扫描电镜可见脱细胞脱钙骨基质明胶呈三维立体多孔网状结构，孔隙相互贯通。
图7是光镜下脱细胞髓核基质微丝相互连接成网结构40被放大图，图8是扫描电镜下脱细胞髓核基质微丝相互连接成网结构100倍图，脱细胞髓核基质微丝连接成网状结构。
图9是光镜下一体化支架结合部连接紧密30倍图，图10是扫描电镜一体化支架结合部连接紧密100倍图，结合部连接紧密。
5、支架的生物相容性
通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测支架浸提液对细胞的毒性：将脂肪干细胞(ADSCs)分别用25％、50％、100％浓度的浸提液以及含10％胎牛血清FBS的培养(FBS)基培养，于第1、2、3、4、5、6天通过MTT检测脂肪干细胞的生长情况。每个时间点四组均无统计学差异，表明支架无毒性，图11是MTT检测不同浓度浸提液培养下脂肪干细胞的增殖图。
Live/Dead检测细胞在支架上的生长情况：将ADSCs接种到消毒后的一体化支架上，培养3天后加入Live/Dead染液，荧光显微镜下观察细胞在支架上黏附与生长情况(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)。可见细胞均匀的分布在纤维环相支架和髓核相支架上，生长状况良好，无死细胞。图12是Live/Dead染色脂肪干细胞在纤维环相支架上分布100倍图，图13是Live/Dead染色脂肪干细胞在髓核相支架上分布100倍图。
Claims (2)
1.一种纤维环与髓核一体化复合双相支架的构建方法，其是以下步骤构建的：
a、制备脱细胞脱钙骨基质明胶环
取猪股骨头的松质骨，修整成纤维环形状后，依次在室温条件下进行脱细胞脱钙处理：
（1）、用体积比为1:1的氯仿甲醇混合液与松质骨按1g/30ml的比例浸泡24h；
（2）、用0.6mol/L的HCl浸泡48h；
（3）、2 mmol/L CaCl2浸泡1h；
（4）、0.5 mmol/L EDTA浸泡1h；
（5）、8 mmol/L的LiCl浸泡1h；
（6）、5% Triton X-100浸泡24h；
（7）、去离子水反复冲洗，即得；
b、制备脱细胞髓核基质微丝悬液
（1）、将猪尾椎间盘髓核组织放入含0.6%TritonX-100和1.0%脱氧胆酸的Tris－HCL缓冲液中，超声频率42 kHz±6%，处理10分钟，过滤去除骨屑杂质；
（2）、放入含0.6%TritonX-100和1.0%脱氧胆酸的Tris－HCL缓冲液中，室温持续震荡72h，150r/min，每隔24h换液一次、超声10分钟，去离子水冲洗干净；
（3）、将髓核组织用含720mU/mL DNaseⅠ和720mU/mL RNase A的PBS消化液37℃消化48小时，去离子水冲洗干净；
（4）、粉碎、梯度离心，取直径为100nm～5μm左右的髓核基质微丝，蒸馏水反复冲洗，与双蒸水按重量百分比配成0.5％～5％的白色乳悬液；
c.支架构建和交联
将脱细胞髓核基质微丝悬液注入到脱细胞脱钙骨基质明胶环中央，渗透深度0.5～2mm，-20℃～-80℃,1～48小时冷冻冻干后构成脱细胞髓核基质,先行紫外线照射交联，紫外线波长258nm，距离光源5～10cm，交联时间12～48h；然后化学试剂交联，浓度为0.001～1M的碳化二亚胺与浓度为0.001～1M的N-羟基琥珀酰亚胺混合的水溶液中交联1h～48h，再次冻干，消毒即得。
2.按照权利要求1所述纤维环与髓核一体化复合双相支架的构建方法，其特征在于：化学试剂交联是由浓度为0.01～0.3M的碳化二亚胺与浓度为0.005～0.2M的N-羟基琥珀酰亚胺混合的水溶液。
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