CN107106606A - 神经微生理系统和使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开大体上涉及一种细胞培养系统，特别是涉及一种用于神经元细胞的三维细胞培养系统，所述系统促进结构特征和功能特征这两者，所述特征模拟了体内外周纤维的那些特征，包括细胞髓鞘形成。使用双重水凝胶构建体和来自神经元细胞的外植体，本公开提供了用于容许细胞内和细胞外电生理学测量和记录的体外空间受控的三维模型的方法、器件、以及系统。所述三维水凝胶构建体允许所并入的细胞类型、几何制造以及电操作方面的灵活性，从而提供用于培养、干扰、以及测试具有生理相关结果的仿生神经生长的可行的系统。

Description

神经微生理系统和使用其的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年9月12日提交的美国临时申请号62/049,692和2015年3月25日提交的美国临时申请号62/138,258的优先权，这些美国临时申请中的每一件以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开大体上涉及一种细胞培养系统，特别是涉及一种用于神经元细胞的三维细胞培养系统，所述系统促进结构特征和功能特征这两者，所述特征模拟了体内神经纤维的那些特征，包括细胞髓鞘形成和复合动作电位的传播。
背景技术
为了桌面评估来复制生理机能的功能方面对于外周神经元组织来说特别具有挑战性，其中经过长距离的生物电传导是最相关的生理学结果之一。出于这个原因，外周神经的三维组织模型落后于上皮组织、代谢组织、以及肿瘤组织的模型，其中可溶性分析物用作适当的量度。电生理学技术的应用近来已经经由多电极阵列技术而可能用于筛查环境毒素以及用于疾病建模和治疗测试。这一应用对于外周神经系统(PNS)应用和中枢神经系统(CNS)应用这两者的研究来说是开创性的，但是培养物的解离性质不能复制群体水平环境和对于外周组织来说关键的量度。相反，研究外周神经病变和神经保护的临床方法包括神经传导测试，所述神经传导测试是经由使用皮肤活检的形态测定分析来测量复合动作电位(CAP)和神经纤维密度(NFD)而实现的。
发明内容
本公开解决了对制备和使用三维水凝胶系统的需求，所述系统允许对模拟临床神经传导的神经组织和NFD的体外生理学测量。
本公开涉及一种在包含固体基质的培养容器中产生一个或多个神经元细胞的三维培养物的方法，所述方法包括：(a)使一个或多个分离的施旺细胞(Schwann cell)和/或少突胶质细胞与所述固体基质接触，所述基质包含至少一个外表面、至少一个内表面以及至少一个内室，所述内室是由所述至少一个内表面所限定的并且可从所述固体基质外部的点经由至少一个开口进入；(b)将一个或多个分离的神经元细胞或包含神经元细胞的组织外植体接种到所述至少一个内室中；(c)将细胞培养基施用到所述培养容器中，其中细胞培养基的体积足以覆盖所述至少一个内室；其中所述内表面的至少一部分包含第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物。在一些实施方案中，在步骤(a)之前，将包含所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一细胞可穿透聚合物的溶液放入所述培养容器中并且诱导所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一细胞可穿透聚合物物理粘附或化学键合到所述内表面的至少一部分上。在一些实施方案中，所述固体基质包含具有预定形状的基底，所述预定形状限定了所述外表面和所述内表面的形状。
在一些实施方案中，所述基底包含二氧化硅、塑料、陶瓷、或金属中的一种或组合，并且其中所述基底呈圆柱体的形状或呈基本上类似于圆柱体的形状，以使得所述第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物包被所述基底的内表面并且限定圆柱形或基本上圆柱形的内室或隔室；并且其中所述开口被定位于所述圆柱体的一端处。在一些实施方案中，所述基底包含足以允许蛋白质、营养物质、以及氧气在所述细胞培养基存在下扩散穿过所述固体基质的尺寸和形状的一个或多个孔隙。
在一些实施方案中，诱导所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一可穿透聚合物交联到所述固体基质上的步骤包括使所述溶液暴露于紫外光或可见光。在一些实施方案中，所述第一细胞不可穿透聚合物是以所述溶液的体积计不超过约20重量％的浓度的聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，所述第一细胞可穿透聚合物具有以所述溶液的体积计约0.1重量％至约3.0重量％的浓度。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：使所述培养容器暴露于37℃和不超过约5.0％的水平的二氧化碳，持续足以允许轴突在所述内室中生长的一段时间。在一些实施方案中，所述固体基质的至少一部分是圆柱形的或基本上圆柱形的以使得所述固体基质的内表面的至少一部分限定圆柱形或基本上圆柱形的内室，向所述内室中接种所述一个或多个施旺细胞并且接种所述一个或多个神经元。
在一些实施方案中，步骤(c)包括接种选自以下各项中的一种或组合的组织外植体：分离的背根神经节、脊髓外植体、视网膜外植体、以及皮层外植体。在一些实施方案中，步骤(c)包括接种选自以下各项中的一种或组合的神经元细胞的悬浮液：运动神经元、皮层神经元、脊髓神经元、外周神经元。
在一些实施方案中，所述固体基质包含与所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一细胞可穿透聚合物的混合物交联的塑料基底；并且其中所述塑料基底包含具有不大于约1微米的直径的多个孔隙。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：形成固体基质并且将所述固体基质定位于培养容器中。在一些实施方案中，所述形成固体基质的步骤包括通过光刻使包含所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一细胞可穿透聚合物的溶液固化。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：在步骤(c)之后使所述神经元细胞生长神经突和/或轴突，持续约1天至约1年的一段时间。
在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：在步骤(a)之前从样品中分离一个或多个施旺细胞和/或一个或多个少突胶质细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(b)之前从一种或多种哺乳动物分离背根神经节(DRG)。
在一些实施方案中，所述培养容器不含海绵。
在一些实施方案中，所述固体基质包含不大于约15％的PEG和约0.05％至约1.00％的选自以下各项的自组装肽中的一种或组合：RAD 16-I、RAD 16-II、EAK 16-I、EAK16-II、以及dEAK 16。
在一些实施方案中，所述培养容器包含约1个至约1200个孔，可以向所述孔中相继或同时进行步骤(a)-步骤(c)。
在一些实施方案中，所述基质的至少一部分是以圆柱体或矩形棱柱体的形状形成的，所述圆柱体或矩形棱柱体包含由所述内表面限定并且可通过一个或多个开口进入的内室。
在一些实施方案中，所述固体基质聚合物不含PEG。
在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约5皮克/毫升至约20皮克/毫升的浓度的神经生长因子(NGF)和/或约0.001％重量/体积至约0.01％重量/体积的范围内的浓度的抗坏血酸。
在一些实施方案中，所述方法还包括将至少一个刺激电极定位在所述一个或多个神经元细胞或组织外植体的细胞体处或附近并且将至少一个记录电极定位在轴突的最远离所述细胞体的点处或附近，以使得当在所述刺激电极中引入电流时，所述记录电极能够接收对应于能够在所述记录电极处被测量的一个或多个电生理学量度的信号。在一些实施方案中，所述一个或多个电生理学量度是以下各项中的一个或组合：电传导速度、动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的包络。
本公开还涉及一种组合物，所述组合物包含：(i)培养容器；水凝胶基体，所述水凝胶基体至少包含第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物；以及一个或多个分离的施旺细胞和/或一个或多个少突胶质细胞；以及一个或多个组织外植体或其碎片；或(ii)培养容器；水凝胶基体，所述水凝胶基体至少包含第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物；以及一个或多个分离的施旺细胞和/或一个或多个少突胶质细胞；以及包含一个或多个神经元细胞的细胞悬浮液。
在一些实施方案中，所述组合物还包含固体基质，所述水凝胶基体交联到所述固体基质上，所述固体基质包含具有约1微米至约5微米的直径的孔隙的至少一个主要为塑料的表面。在一些实施方案中，所述组合物还包含固体基质，所述水凝胶基体交联到所述固体基质上，所述固体基质包含至少一个外表面和至少一个内表面以及至少一个内室，所述内室是由所述至少一个内表面所限定的并且可从所述固体基质外部的点经由至少一个开口进入的。在一些实施方案中，所述组合物还包含细胞培养基和/或脑脊髓液。
在一些实施方案中，所述组织外植体或其碎片是以下各项中的一种或组合：DRG外植体、视网膜组织外植体、皮层外植体、脊髓外植体、以及外周神经外植体。
在一些实施方案中，所述组合物还包含具有连续的外表面和内表面的固体基质，所述固体基质包含呈圆柱形或基本上圆柱形的形状的至少一部分以及至少一个中空内部，所述中空内部在它的边缘处由所述内表面的至少一部分限定，所述内表面包含具有约0.1微米至约1.0微米的直径的一个或多个孔隙，其中所述固体基质的中空内部是可从所述固体基质外部的点经由至少一个开口进入的；其中所述中空内部部分包含接近所述开口的第一部分和远离所述开口的至少第二部分；其中所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体被定位在所述中空内部的第一部分处或附近并且与所述水凝胶基体进行物理接触，并且其中所述至少一个中空内部的第二部分与所述第一部分处于流体连通以使得轴突能够从所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体生长到所述中空内部的第二内部部分中。
在一些实施方案中，所述组合物不含海绵。
在一些实施方案中，所述至少一种细胞不可穿透聚合物包含不大于约15％的PEG并且所述至少一种细胞可穿透聚合物包含约0.05％至约1.00％的选自以下各项的自组装肽中的一种或组合：RAD 16-I、RAD 16-II、EAK 16-I、EAK 16-II、以及dEAK 16。
在一些实施方案中，所述培养容器包含96个、192个、384个或更多个内室，其中一个或多个分离的施旺细胞和/或一个或多个少突胶质细胞足够接近所述一个或多个分离的组织外植体和/或所述一个或多个神经元细胞以使得所述施旺细胞或所述少突胶质细胞沉积髓磷脂以使轴突从所述组织外植体和/或神经元细胞生长。
在一些实施方案中，所述固体基质不含PEG。
在一些实施方案中，所述基质的至少一部分是以圆柱体或矩形棱柱体的形状形成的，所述圆柱体或矩形棱柱体包含由所述内表面限定的并且可通过一个或多个开口进入的空间。
在一些实施方案中，所述组合物还包含细胞培养基，所述细胞培养基包含约5皮克/毫升至约20皮克/毫升的浓度的神经生长因子(NGF)和/或约0.001％重量/体积至约0.01％重量/体积的范围内的浓度的抗坏血酸。
在一些实施方案中，所述一个或多个神经元细胞包含选自包括以下各项的组的至少一种细胞：胶质细胞、胚胎细胞、间充质干细胞、以及衍生自诱导多能干细胞的细胞。在一些实施方案中，所述组合物还包含一个或多个干细胞或多能细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个神经元细胞包含源自于所述哺乳动物的外周神经系统的原代哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，所述水凝胶基体包含至少1％的聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，所述神经元细胞和/或组织外植体在培养中不少于3天、30天、90天或365天。
在一些实施方案中，所述固体基质的至少一部分是圆柱形的或基本上圆柱形的以使得所述固体基质的内表面的至少一部分限定圆柱形或基本上圆柱形的中空内室，其中所述一个或多个施旺细胞和所述一个或多个神经元接触。
在一些实施方案中，所述一个或多个组织外植体包含一个或多个DRG，所述DRG具有约100微米至约500微米宽的和约0.11微米至约10000微米长的轴突生长。
在一些实施方案中，所述组合物还包含至少两个电极，所述电极与电化学电池和电压计可操作地连通，其中第一刺激电极被定位在所述组织外植体的细胞体处或附近并且第二记录电极被定位在轴突的远端处或附近以使得所述电极沿着所述组织外植体中的至少一个细胞的膜的距离形成电压差。
本公开还涉及一种评估来自一个或多个神经元细胞的响应的方法，所述方法包括：在培养容器中培养一个或多个神经元细胞；将一种或多种刺激引入所述一个或多个神经元细胞中；以及测量所述一个或多个神经元细胞对所述一种或多种刺激的一种或多种响应。在一些实施方案中，所述一个或多个神经元细胞包含感觉外周神经元。在一些实施方案中，所述一个或多个神经元细胞包含选自以下各项的细胞中的至少一种或组合：脊髓运动神经元、交感神经元、以及中枢神经系统(CNS)神经元。
在一些实施方案中，所述培养容器包含与具有预定形状的固体基质交联的水凝胶基体，并且其中所述水凝胶基体包含至少一种细胞不可穿透聚合物和至少一种细胞可穿透聚合物。在一些实施方案中，所述水凝胶基体包含选自以下各项的化合物中的一种或组合：Puramatrix、甲基丙烯酸酯化透明质酸、琼脂糖、甲基丙烯酸酯化肝素、以及甲基丙烯酸酯化葡聚糖。
在一些实施方案中，所述一种或多种刺激包括电流并且所述一种或多种响应包括电生理学量度。在一些实施方案中，通过光学记录技术来测量所述响应。
在一些实施方案中，所述一种或多种刺激包括以下各项中的一种或组合：一种或多种光遗传学执行子(actuator)、一种或多种笼锁神经递质、一种或多种红外激光、或一种或多种光门控离子通道。
在一些实施方案中，所述测量的步骤包括监测电压敏感性染料、钙染料的移动、或使用无标记光子成像。在一些实施方案中，所述一个或多个神经元细胞包含分离的原代神经节组织。
在一些实施方案中，所述固体基质的至少一部分是通过光刻而被微图案化的并且包含外表面、内表面、以及由所述至少一个内表面所限定的至少一个内室；其中所述方法还包括将所述一个或多个神经元细胞接种到所述微图案化的固体基质中以使得所述一个或多个神经元细胞的生长局限于由所述至少一个内室所限定的特定几何形状。在一些实施方案中，所述内室将细胞体与轴突突起分开在不同的位置。在一些实施方案中，所述内室的形状允许在所述室内不同的位置处探查待检测和使用的形态测定或电生理学量度中的任一个。通常，例如，所述固体基质的内室或内部隔室或所述水凝胶基体(如果不使用固体基质的话)允许所述基体或基质内的一个或多个位置使细胞体和轴突突起在不同的位置定位。
在一些实施方案中，所述一个或多个神经元细胞源自于原代人类组织或人类干细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个神经元细胞是原代哺乳动物神经元。在一些实施方案中，所述至少一个神经元细胞包含分离的DRG或其碎片；并且诱导来自所述一个或多个神经元细胞的刺激包括将刺激电极放置在所述DRG或其碎片的细胞体处或附近并且将记录电极放置在最远离所述细胞体的轴突突起处或附近。
在一些实施方案中，所述一种或多种刺激包括电刺激或化学刺激。在一些实施方案中，所述一种或多种刺激包括使所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体与至少一种药理活性化合物接触。
本公开还涉及一种评价试剂的毒性的方法，所述方法包括：(a)在本文所公开的组合物中的任一种中培养一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；(b)使至少一种试剂暴露于所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；(c)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；以及(d)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述试剂的毒性相关联，以使得如果所述形态测定变化指示细胞活力降低，那么将所述试剂表征为具有毒性，并且如果所述形态测定变化指示细胞活力不变或提高，那么将所述试剂表征为无毒的。
本公开还涉及一种评价第一试剂与第二试剂相比的相对毒性程度的方法，所述方法包括：(a)在本文所公开的组合物中的任一种中培养一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；(b)使第一试剂和第二试剂在依次或并行的时间段内(如果在同一组细胞上，那么依次；或如果在第二组细胞上，例如在多重化系统中，那么并行)暴露于所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；(c)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；以及(d)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述第一试剂的毒性相关联；以及(e)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述第二试剂的毒性相关联；以及(f)比较所述第一试剂和所述第二试剂的毒性；以及(g)将所述第一试剂或所述第二试剂表征为与所述第二试剂相比更具毒性或不太具毒性。在一些实施方案中，当将所述第一试剂或所述第二试剂表征为与所述第二试剂相比更具毒性或不太具毒性时，如果与所述第二化合物相比，所述由所述第一试剂诱导的形态测定变化更严重并且指示细胞活力降低到更大的程度，那么所述第一试剂比所述第二试剂更具毒性；并且，如果与所述第二化合物相比，所述由所述第一试剂诱导的形态测定变化不太严重和/或指示细胞活力提高，则所述第二试剂比所述第一试剂更具毒性。在其中观测和/或测量电生理学量度的实施方案中可以应用相同的表征。
在一些实施方案中，通过用一个或一系列剂量或量的试剂重复本文提供的步骤中的任何一个或多个来确定毒性程度。本领域技术人员不是比较或对比两种不同试剂之间相对的毒性，而是可以通过这种方式添加不同剂量的相同试剂以表征所述试剂在何时以及在什么剂量下可能对一个或多个神经元变得具有毒性。
本公开还涉及一种评价试剂的毒性的方法，所述方法包括：(a)在本文所公开的组合物中的任一种中培养一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；(b)使至少一种试剂暴露于所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；(c)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度；以及(d)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度与所述试剂的毒性相关联，以使得如果所述电生理学量度指示细胞活力降低，那么将所述试剂表征为具有毒性，并且如果所述电生理学量度指示细胞活力不变或提高，那么将所述试剂表征为无毒的；其中步骤(c)任选地包括和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；并且其中步骤(d)任选地包括使所述一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述试剂的毒性相关联，以使得如果所述形态测定变化指示细胞活力降低，那么将所述试剂表征为具有毒性，并且如果所述形态测定变化指示细胞活力不变或提高，那么将所述试剂表征为无毒的。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括小化合物。在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括至少一种环境污染物或工业污染物。在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的小化合物中的一种或组合：化学治疗剂、镇痛剂、心血管调节剂、胆固醇水平调节剂、神经保护剂、神经调节剂、免疫调节剂、抗炎剂、以及抗微生物药物，如细菌抗生素。在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括治疗有效量的抗体，如临床相关单克隆抗体，如泰斯布里(Tysabri)。
在一些实施方案中，所述一个或多个电生理学量度是以下各项中的一个或组合：电传导速度、动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的包络。在一些实施方案中，所述一个或多个电生理学量度包括跨组织外植体的复合动作电位。
本公开还涉及测量一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的量或程度的方法，所述方法包括：(a)将一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下培养在本文所公开的组合物中的任一种中；(b)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；以及(c)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述神经元细胞或组织外植体的髓鞘形成的定量变化或定性变化相关联。
本公开还涉及一种测量一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：(a)将一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下培养在本文所公开的组合物中的任一种中；(b)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度；以及(c)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度与所述神经元细胞或组织外植体的髓鞘形成的定量变化或定性变化相关联；其中步骤(b)任选地包括和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；并且其中步骤(c)任选地包括使所述一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述神经元细胞或组织外植体的髓鞘形成的定量变化或定性变化相关联。
本公开还涉及一种测量一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：(a)将一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下培养在本文所公开的组合物中的任一种中；以及(b)检测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突上髓鞘形成的量。
在一些实施方案中，所述检测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突上髓鞘形成的量的步骤包括使所述细胞暴露于结合髓磷脂的抗体。
在一些实施方案中，所述方法还包括(i)在步骤(a)和(b)之后使一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体暴露于至少一种试剂；(ii)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度、测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化、和/或检测来自所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的髓磷脂的定量；(iii)计算在存在和不存在所述试剂的情况下来自所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体的测量结果、观测结果和/或髓磷脂的定量的变化；以及(iv)使来自所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体的测量结果、观测结果和/或髓磷脂的定量的变化与所述试剂的存在或不存在相关联。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括至少一种环境污染物或工业污染物。在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的小化合物中的一种或组合：化学治疗剂、镇痛剂、心血管调节剂、胆固醇水平调节剂、神经保护剂、神经调节剂、免疫调节剂、抗炎剂、以及抗微生物药物。
在一些实施方案中，所述一个或多个电生理学量度是以下各项中的一个或组合：电传导速度、动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的包络。在一些实施方案中，其中所述一个或多个电生理学量度包括跨组织外植体的复合动作电位。
本公开还涉及一种测量一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：(a)将一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下培养在本文所公开的组合物中的任一种中；以及(b)在所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体中诱导复合动作电位；(c)测量所述复合动作电位；以及(d)基于所述复合动作电位对所述一个或多个神经元细胞的髓鞘形成的水平进行定量。在一些实施方案中，所述方法还包括使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体暴露于试剂。在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括至少一种环境污染物或工业污染物。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的小化合物中的一种或组合：化学治疗剂、镇痛剂、心血管调节剂、胆固醇水平调节剂、神经保护剂、神经调节剂、免疫调节剂、抗炎剂、以及抗微生物药物。
在一些实施方案中，所述方法还包括测量选自以下各项中的一个或组合的除复合动作电位以外的一个或多个电生理学量度：电传导速度、单个动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的包络。在一些实施方案中，所述方法还包括测量与所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体相关的一种或多种形态测定变化。
本公开还涉及一种在包含固体基质的三维培养容器中诱导一个或多个神经元细胞生长的方法，所述方法包括：(a)用所述固体基质接种一个或多个分离的施旺细胞；(b)将于悬浮液中的一个或多个分离的神经元细胞或于外植体中的分离的神经元细胞接种到至少一个内室中；(c)将细胞培养基以足以覆盖至少所述细胞的体积引入到所述培养容器中；其中所述固体基质包含第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括将至少一个电极定位在所述固体基质的任一端或两端处以使得所述电极可以用于刺激或记录动作电位(AP)和/或复合动作电位(cAP)，从而允许测量AP/cAP传播。
在一些实施方案中，所述组合物还包括放置至少一个电极，从而提供用于电刺激的装置，其中所述一个或多个电极被定位在所述DRG神经元的细胞体处或远离所述细胞体处以使得所述电极形成神经突/轴突的两个点之间的电压差以诱发传播的AP/cAP。
本公开还涉及一种评估培养容器中的神经元细胞的响应的方法，所述评估是在以下步骤之后进行的：将一种或多种刺激引入所述一个或多个神经元细胞；以及使用局部场电位(LFP)或其它单细胞记录方法测量所述一个或多个神经元细胞对所述一种或多种刺激的AP或cAP响应。
在一些实施方案中，所述固体基质包含外表面和内表面，所述固体基质包含呈圆柱形或基本上圆柱形的形状的至少一部分以及至少一个中空内部，所述中空内部在它的边缘处由所述内表面的至少一部分所限定；所述内表面包含具有约0.1微米至约1.0微米的直径的一个或多个孔隙，其中所述固体基质的中空内部是可从所述固体基质外部的点经由至少一个开口进入的；其中所述中空内部部分包含接近所述开口的第一部分和远离所述开口的至少第二部分；其中所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体被定位在所述中空内部的第一部分处或附近并且与所述第一细胞不可穿透聚合物或所述第一细胞可穿透聚合物中的至少一种进行物理接触，并且其中所述至少一个中空内部的第二部分与所述第一部分处于流体连通以使得轴突能够从所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体生长到所述中空内部的第二内部部分中。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述一个或多个神经元细胞与至少一种试剂接触。在一些实施方案中，所述至少一种试剂是一个或多个干细胞或修饰的T细胞。在一些实施方案中，所述修饰的T细胞表达对癌细胞具有特异性的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含以下各项中的一种或组合：层粘连蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、BSA、FBS、抗坏血酸、I型胶原、以及III型胶原。
本公开还涉及一种检测和/或定量神经元细胞生长的方法，所述方法包括：(a)对一个或多个神经元细胞进行定量；(b)在本文所公开的组合物中的任一种中培养所述一个或多个神经元细胞；以及(c)在培养足以允许所述一个或多个细胞生长的一段时间之后计算所述组合物中神经元细胞的数目。在一些实施方案中，步骤(c)包括在培养一个或多个神经元细胞之后检测所述一个或多个神经元细胞的内部记录和/或外部记录并且使所述记录与对应于已知或对照数目的细胞的相同记录的测量结果相关联。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述一个或多个神经元细胞与一种或多种试剂接触。在一些实施方案中，所述方法还包括：(i)在使所述一个或多个神经元细胞与所述一种或多种试剂接触的步骤之前和之后测量细胞内记录和/或细胞外记录；以及(ii)使在使所述一个或多个神经元细胞与所述一种或多种试剂接触之前的记录和在使所述一个或多个神经元细胞与所述一种或多种试剂接触之后的记录的差异与细胞数的变化相关联。
本公开还涉及一种检测或定量一个或多个神经元细胞的轴突变性的方法，所述方法包括：(a)将一个或多个神经元细胞接种在本文所公开的组合物中的任一种中；(b)在足以使至少一个或多个轴突从所述一个或多个神经元细胞生长的时间段内和条件下培养所述一个或多个神经元细胞；(c)对从所述神经元细胞生长的轴突的数目或密度进行定量；(d)使所述一个或多个神经元细胞与一种或多种试剂接触；(e)在使所述一个或多个细胞与一种或多种试剂接触之后对从神经元细胞生长的轴突的数目和/或密度进行定量；以及(f)计算在存在或不存在所述试剂的情况下培养物中轴突的数目或密度的差异。
在一些实施方案中，所述从神经元细胞生长的一个或多个轴突和/或所述轴突的密度的步骤包括将所述一个或多个神经元细胞用染料、荧光团、或标记的抗体染色。
在一些实施方案中，步骤(c)、步骤(e)、和/或步骤(f)是经由显微镜术或数字成像进行的。
在一些实施方案中，步骤(c)和步骤(e)包括获取来自一个或多个轴突的接近一个或多个细胞体的部分的测量结果并且获取来自一个或多个轴突的远离一个或多个细胞体的部分的测量结果。
在一些实施方案中，在存在或不存在所述试剂的情况下培养物中轴突的数目或密度的差异是所述一个或多个神经元细胞的一个或多个轴突的接近细胞体的部分与所述一个或多个神经元细胞的轴突的远离所述细胞体的部分之间的差异。
在一些实施方案中，获取测量结果包括测量以下各项中的任一个或组合：形态测定量度或电生理学量度，并且其中所述计算培养物中轴突的数目或密度的差异的步骤包括使测量结果中的任一个或组合与轴突的数目或密度相关联。在一些实施方案中，获取测量结果包括测量电生理学量度中的任一个或组合并且其中所述计算培养物中轴突的数目或密度的差异的步骤包括使电生理学量度中的任一个或组合与轴突的数目或密度相关联。
在一些实施方案中，所述方法还包括(g)使试剂的神经变性作用与在步骤(c)和步骤(e)中所获取的电生理学量度相关联。
本公开还涉及测量细胞内记录或细胞外记录的方法，所述方法包括：(a)在本文所公开的组合物中的任一种中培养一个或多个神经元细胞；(b)跨越所述一个或多个神经元细胞施加电压电位；以及(c)从所述一个或多个神经元细胞测量一个或多个电生理学量度。在一些实施方案中，所述一个或多个电生理学量度选自以下各项中的一个或组合：电传导速度、细胞内动作电位、复合动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的包络。
本公开还涉及一种测量或定量试剂的任何神经保护作用的方法，所述方法包括：(a)在存在和不存在所述试剂的情况下将一个或多个神经元细胞或组织外植体培养在本文所公开的组合物中的任一种中；(b)在存在和不存在所述试剂的情况下跨越所述一个或多个神经元细胞或组织外植体施加电压电位；(c)在存在和不存在所述试剂的情况下从所述一个或多个神经元细胞或组织外植体测量一个或多个电生理学量度；以及(d)使通过所述一个或多个神经元细胞或组织外植体的一个或多个电生理学量度的差异与所述试剂的神经保护作用相关联，以使得与在不存在所述试剂的情况下所测量的电生理学量度相比，在所述试剂存在下所述电生理学量度的下降指示不佳的神经保护作用，并且与在不存在所述试剂的情况下所测量的电生理学量度相比，在所述试剂存在下所述电生理学量度没有变化或倾斜指示所述试剂赋予神经保护作用。
本公开涉及一种测量或定量试剂的任何作用的方法，所述方法包括：(a)在存在和不存在所述试剂的情况下将一个或多个神经元细胞或组织外植体培养在本文所公开的组合物中的任一种中；(b)在存在和不存在所述试剂的情况下跨越所述一个或多个神经元细胞或组织外植体施加电压电位；(c)在存在和不存在所述试剂的情况下从所述一个或多个神经元细胞或组织外植体测量一个或多个电生理学量度；以及(d)使通过所述一个或多个神经元细胞或组织外植体的一个或多个电生理学量度的差异与所述试剂的神经调节作用相关联，以使得与在不存在所述试剂的情况下所测量的电生理学量度相比，在所述试剂存在下所述电生理学量度变化指示神经调节作用，并且与在不存在所述试剂的情况下所测量的电生理学量度相比，在所述试剂存在下所述电生理学量度没有变化指示所述试剂不赋予神经调节作用。
本公开还涉及一种在体外检测或定量轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：(a)将一个或多个神经元细胞在足以使所述一个或多个神经元细胞生长一个或多个轴突的时间内和条件下培养在本文所公开的组合物中的任一种中；(b)跨越所述一个或多个神经元细胞施加电压电位；以及(c)测量通过所述一个或多个神经元细胞的场电位或复合动作电位；(d)计算通过所述一个或多个神经元细胞的传导速度；以及(e)使所述一个或多个值或传导速度与一个或多个轴突的髓鞘形成的量相关联。
在一些实施方案中，所述方法还包括使步骤(d)的传导速度与已知或预定数目的有髓鞘的健康的神经元细胞的传导速度值相关联。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述一个或多个神经元细胞暴露于试剂；其中步骤(a)-(e)是在所述试剂存在下进行的并且所述方法还包括评估由于所述试剂的存在所引起的髓鞘形成量的差异，其中将在所述试剂存在下所述细胞的传导速度与在不存在所述试剂的情况下所述细胞的传导速度相比较。
在一些实施方案中，所述方法还包括使用显微镜和/或数字照相机使所述一个或多个神经元细胞和/或组织外植体成像。
本公开还涉及一种培养干细胞或免疫细胞的方法，所述方法包括：(a)在本文所公开的组合物中的任一种中培养一个或多个神经元细胞和/或组织外植体；以及(b)使分离的干细胞或免疫细胞暴露于所述组合物。
本公开还涉及一种系统，所述系统包括：(i)包含水凝胶的细胞培养容器；(ii)于悬浮液中或作为组织外植体的组分的一个或多个神经元细胞；(iii)包括用于电流的发生器的放大器；(iv)电压计和/或电流计；(v)至少第一刺激电极和至少第一记录电极；其中所述放大器、电压计和/或电流计以及电极是经由电路彼此电连接的，其中电流从所述放大器馈送到所述至少一个刺激电极并且电流在所述记录电极处被接收并且馈送到所述电压计和/或电流计；其中所述刺激电极被定位在所述神经元细胞的一个或多个细胞体处或附近，并且所述记录电极被定位在远离所述细胞体预定距离处，以使得跨越所述细胞培养容器建立电场。
附图说明
图1A-1E描绘了用动态掩模投影光刻对PEG构建体进行的示例性微图案化。图1A描绘了数字微镜器件(DMD)动态掩模光刻方法的示例性示意图。图1B描绘了六孔细胞培养插入物内示例性PEG构建体的宏观视图。图1C描绘了细胞培养插入物内示例性PEG构建体的特写。图1D描绘了示例性DMD光掩模。图1E描绘了在附着的DRG周围交联的示例性PEG构建体。
图2描绘了在示例性PEG构建体内相对于所添加的PBS的体积Puramatrix的稳定性：在PEG中在胶凝后的48小时之时Fluosphere标记的Puramatrix的荧光显微照片的代表性图像(白色虚线轮廓指示PEG空隙)并且双重水凝胶构建体的示意图示出于Puramatrix稳定性相对于所添加的PBS的体积的条形图上方(三个实验中的每一个的n＝18，棒表示平均值的标准误差)。
图3A-3F描绘了在双重水凝胶构建体中示例性的DRG神经突生长和细胞迁移。图3A描绘了在培养5天之后活/死染色的构建体(活细胞和细胞结构、死细胞、明视野)；图3B和图3C描绘了在双重水凝胶构建体中培养7天的DRG外植体，所述DRG外植体是由β-III微管蛋白阳性神经突和DAPI染色的核指示的。图3D描绘了在5天之后通道内前端生长(β-III微管蛋白)的特写视图。图3E描绘了培养7天的DRG外植体，所述DRG外植体是针对MAP2阳性树突和β-III微管蛋白阳性神经突染色的。图3F描绘了在细胞培养插入物的表面处聚焦的构建体的分叉部分(β-III微管蛋白)。
图4A-4E描绘了β-III微管蛋白和DAPI(仅4A)染色的构建体的共聚焦显微照片。图4A描绘了在分叉点附近生长的三维表示，示出了正视图和侧视图这两者以显示厚度。内插图像切片以说明切片之间的距离。图4B描绘了在双重水凝胶构建体中神经突生长的合并z-栈投影。图4C描绘了在没有Puramatrix的PEG构建体中神经突生长的合并z-栈投影。图4D描绘了在没有Puramatrix的PEG构建体中神经突生长的深度编码的z-栈投影。图4E描绘了在双重水凝胶构建体中神经突生长的深度编码的z-栈投影。在图4B-4E中，使用标准偏差投影。
图5A-5D描绘了在体外7天之后在三维双重水凝胶构建体中DRG神经突生长和细胞迁移的荧光显微镜术：被局限在填充有Puramatrix的通道内的β-III微管蛋白阳性神经突、DAPI染色的核、以及S100阳性胶质细胞；支持细胞存在于通道的末端附近，距离神经节约1.875mm，如从含有神经节的圆形区域的末端和直通道的起点所测量(C-D)。
图6A-6C描绘了共聚焦图像的三维渲染。以3D示出了在通道的起点(图6A)、中间(图6B)、以及末端(图6C)处的β-III微管蛋白阳性神经突、DAPI染色的核、和S100阳性胶质细胞，其中z平面中的相应横截面示于下方。
图7A-7D描绘了神经培养物横截面的透射电子显微镜术。图7A描绘了在通道中距离神经节约1.875mm的高密度的平行的成束的无髓鞘神经突，其中图7B插图示出了放大视图。图7C描绘了以距离神经节约1mm的由施旺细胞(SC)封装的轴突(Ax)为中心的焦点。图7D描绘了在神经节中发现的施旺细胞核(SN)；所有测量均是从直通道的起点处含有神经节的圆形区域的末端进行的。
图8A描绘了溴酚蓝染色的构建体，其中已经放置了分别被放置在神经节和通道中的神经束内的记录电极(左侧)和刺激电极(右侧)以进行场记录。图8B描绘了群体响应的示例迹线，证实了在三维神经构建体中成功的场电位记录和复合动作电位(CAP)特征性的波形特性。图8C描绘了在三维神经培养物的神经节中从近端位置(1.5mm)和远端位置(2.25mm)诱发的场电位，n＝4；由虚线标记。平均迹线突出显示了在远端刺激时起始相延迟时间的延长。图8D描绘了远端刺激使得起始相延迟时间显著延长(p＝0.02)，其中平均延迟时间从0.82ms延长到2.88ms，并且平均响应振幅降低了29.46％。刺激距离是从直通道的起点到刺激点来测量的。起始相延迟时间被测量为在刺激伪迹返回到基线与响应的正峰之间的时间。图8E描绘了在三维神经构建体中使用0.5μM河豚毒素(TTX)阻断Na+通道活性。平均迹线显示了TTX消除了群体响应，n＝3。图8F描绘了响应振幅具有显著差异，p＝0.029，其中在TTX洗入之后平均振幅从448.75μV降低到0.04μV。振幅是从峰到峰测量的。
图9A描绘了在三维神经构建体中兴奋性谷氨酸阻断剂DNQX和APV无作用，n＝4。在药物洗入之前(t1-t5)和之后(t16-t20)响应的平均迹线显示药物的响应振幅(图9B)或持续时间(图9C)没有显著的变化。在DNQX和APV之后，响应振幅和持续时间没有统计学差异。振幅是峰到峰测量的并且持续时间是在半峰处测量的以使测量结果之间的变异减到最低限度。图9D描绘了在三维神经构建体中高频刺激期间响应的一致发放，n＝3。示例迹线显示在50Hz序列期间电诱发的群体峰电位的一致性，示出了开始和结束时放大的迹线以进行比较。在50Hz脉冲序列结束时响应的振幅(图9E)和持续时间(图9F)与开始时的那些没有显著差异。振幅是从峰到峰测量的并且持续时间是在半峰处测量的以使测量结果之间的变异减到最低限度。
图10A-10F描绘了在培养的神经元上进行的电生理学实验。图10A描绘了用于全细胞膜片钳的记录电极(左侧)和刺激电极(右侧)的放置。图10B描绘了三维神经构建体中初级感觉神经元的成功全细胞膜片钳。图10C描绘了三维神经培养物中成功的全细胞膜片钳记录，所述记录没有表现出突触活动的证据，n＝3。示例迹线显示从神经节中的细胞记录的电诱发的动作电位。图10D描绘了放大的迹线，它显示响应的快速的非分级的起始相。图10E描绘了在没有自发电流的情况下的电压钳迹线。图10F描绘了没有表现出电位的自发变化的电流钳迹线。
图11A-11B描绘了构建体中神经突生长的深度的分析。图11A描绘了在存在和不存在Puramatrix的情况下在构建体中β-III标记的神经突的平均高度(p<0.005)。图11B描绘了在整个Puramatrix深度上呈总神经突生长百分比形式的神经突生长。
图12A-12F描绘了在体外7天之后神经突生长的荧光显微镜术。图12A描绘了从顶部焦平面示出的Puramatrix中前端神经突生长的分支和随机取向。图12B描绘了从底部焦平面示出的Puramatrix中前端神经突生长的分支和随机取向。图12C描绘了在没有Puramatrix的通道中沿着插入膜表面的有限神经突生长。图12D描绘了沿着PEG边界的优先生长。图12E描绘了在FluoromyelinTM红色荧光髓磷脂染剂之前不存在髓磷脂。图12F描绘了在FluoromyelinTM红色荧光髓磷脂染剂之后不存在髓磷脂。
图13描绘了用于共培养SC和DRG的方法。步骤1是形成PEG模具；步骤2是插入DRG；步骤3是以特定的细胞计数将SC与凝胶溶液混合并且将凝胶溶液添加到空隙中；步骤4是使用负像掩模辐照并且形成凝胶。
图14描绘了在三维中四个培养模型中的每一个中神经元生长的量的定量。观测到在具有胶原的两种系统中有更多的神经元生长。在神经元生长方面没有检测到由于培养基方案的变化所造成的显著影响。
图15描绘了在25天之后髓磷脂蛋白质(MBP)的产生。将DRG/SC与神经元一起共培养，固定并且用抗MBP和β-III微管蛋白抗体针对致密髓磷脂和神经丝进行免疫标记；物镜20×；比例尺表示25μm。在所有实验组中，在25天之后SC完全包围轴突，从而形成MBP阳性轴突。
图16A-16B描绘了共聚焦图像的三维渲染。图16A描绘了MBP蛋白质的免疫组织化学。图16B描绘了MAG的免疫组织化学。这两者的培养物厚度是190μm，从而确认了体外系统的三维髓磷脂形成能力。
图17A-17C描绘了神经丝β-III和MBP的免疫组织化学。图17A可视地描绘了各种培养基中的免疫组织化学。这些图是用共聚焦显微镜术使用z-栈采集来采集的。随后获得最大投影。在25天之后可以观测到密集的成束生长。比例尺＝500μm。图17B描绘了髓鞘形成的体积的图表。在胶原存在下MBP阳性髓磷脂的量增加。具有更少的AA暴露的NCol-15具有最少量的髓磷脂。图17C描绘了MBP阳性髓磷脂的体积与神经丝的体积的比率的图表，描绘了更长时间暴露于AA的培养物形成更致密的髓磷脂。在所有实验组中，髓磷脂形成的百分比在对照组中显著降低，从而证实外源性SC在髓鞘形成过程中具有主要作用。
图18A-18C描绘了神经丝β-III和PO的免疫组织化学。图18A可视地描绘了各种培养基中的免疫组织化学。比例尺＝500填充。图18B描绘了髓鞘形成的体积的图表。在胶原存在下PO阳性髓磷脂的量增加。PO存在于PNS致密髓磷脂中并且因此PO阳性髓磷脂表示PNS致密髓磷脂。具有更高的AA暴露和胶原的并入的Col-25具有最大量的致密髓磷脂。减少的趋势证实了去除这两种因素，即胶原的存在和更长时间暴露于AA，将使得在25天之后三维培养物中髓磷脂的形成最少。图18C描绘了相对于神经丝，PO阳性髓磷脂的百分比的图表，显示尽管存在神经元产生的体积，但是所述系统仅引起髓磷脂形成。排除在存在或不存在胶原的情况下(Col或N-Col)显示的神经元生长的体积，暴露于AA在三维中的髓磷脂形成中起重要作用。然而，Col-15在统计学上等同于NCol-25，这证实在不存在胶原的情况下AA暴露25天之后构建体的效率类似于在胶原存在下AA暴露15天之后的效率。应当指出的是，如图18B中所示，所述量是显著不同的。
图19A-19C描绘了神经丝β-III和MAG的免疫组织化学。图19A可视地描绘了各种培养基中的免疫组织化学。MAG是存在于非致密髓磷脂中的主要蛋白质之一。比例尺＝500μm。图19B描绘了在所有四个实验组中致密髓磷脂的体积的图表。具有更高的AA暴露和胶原的并入的Col-25具有最大量的非致密髓磷脂。图19C描绘了MAG阳性髓磷脂与神经丝的体积的比率的图表，证实了具有最短的AA暴露时间并且不存在胶原的NCol-15在非致密髓磷脂形成方面具有最低的效率，不论系统中神经纤维的体积如何。
图20A-20F描绘了神经培养物横截面的透射电子显微镜照片，显示了在25天培养物中单个神经纤维周围的髓鞘：(图20A)NCol-25；(图20B)NCol-15；(图20D)Col-25；(图20E)Col-15。图20C描绘了通道中高密度的平行的成束的神经突。神经元是有髓鞘的或SC已经开始在神经纤维周围包覆，从而解释了在免疫组织化学染色中有大量髓磷脂蛋白质呈阳性。图20F描绘了厚髓鞘的放大。A＝轴突，M＝髓磷脂，S＝施旺细胞。
图21A-21B描绘了结构-功能相关性。图21A描绘了用β-III微管蛋白神经突、DAPI核、以及S100施旺细胞染色的接近背根神经节、处于中点、以及远离神经节的无髓鞘神经纤维束的共聚焦图像栈。图21B描绘了数据，所述数据显示所记录的在近端刺激的cAP比在远端刺激的那些显示更高的振幅和更短的潜伏期。
图22A-22C描绘了在高葡萄糖条件存在下在毒性应激下神经培养物的生理学评价。图22A描绘了在25mM和60mM葡萄糖存在下持续48小时的细胞培养物的电生理学迹线。图22B描绘了显示暴露于60mM葡萄糖条件使得复合动作电位振幅降低的图表。图22B描绘了显示暴露于60mM葡萄糖条件使得复合动作电位潜伏期延长的图表。
图23A-23C描绘了在0.1μM紫杉醇(Paclitaxel)存在下在毒性应激下神经培养物的生理学评价。图23A描绘了在施用紫杉醇之前和之后细胞培养物的电生理学迹线。图23B描绘了显示暴露于紫杉醇降低了复合动作电位振幅的图表。图23C描绘了显示暴露于紫杉醇延长了复合动作电位潜伏期的图表。
图24描绘了可以在背根神经节的神经节处、在背根神经节的近侧神经束处、在背根神经节的神经束的中点处、以及在背根神经节的远侧神经束处获取的形态学和生理学测量结果的列表。
图25描绘了所提出的在背根神经节、微管、离子通道、髓磷脂、线粒体、以及小神经纤维处由化学治疗诱导的外周神经毒性的靶标的列表。
图26描绘了实验设计，其中将在培养物生长和髓鞘形成之后获取基线生理学记录。实验将限于急性(48小时)施用每一种药物，继而通过生理学记录(Rec)和成像(CFM和TEM)立即或延迟(7天)评估。对照组将由媒介物施用组成而无药物。
图27A-27B描绘了视网膜(CNS)组织的培养物。将来自胚胎大鼠的视网膜外植体在三维微图案化的水凝胶内培养在补充有CNTF(图27A)或BDNF(图27B)的“神经基础Sato”培养基中。在培养一周之后将可观测的视网膜神经节细胞轴突延伸可视化，用β-III微管蛋白染色。
图28描绘了实验，所述实验显示DRG神经突优先朝向NGF生长，所述NGF与BSA相对，从水凝胶构建体中的贮器中扩散。
图29描绘了微生理培养系统和非侵入性电生理学分析，它们的特征在于选择性照射和同时激活单个皮层神经元以及表达GFP和ChR2的细胞中的单个树突。DLP显微镜术和光遗传学用于光学神经激活的这一应用与电压敏感性染料成像，如VF组合。
图30描绘了利用荧光显微镜术和电生理学的多孔形式。
具体实施方式
在整个本说明书和权利要求书中使用了与本公开的方法和其它方面有关的各种术语。除非另外指明，否则这些术语将被给予它们的本领域的普通含义。其它具体定义的术语应当以与本文所提供的定义一致的方式来解释。
除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书以及所附权利要求书中所用的单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述”包括复数指代对象。
如本文所用的术语“大于2”被定义为大于数字2的任何整数，例如3、4、或5。
如本文所用的术语“多个(种)”被定义为大于或多于1的任何量或数目。
术语“生物反应器”指的是其中培养细胞，任选地在悬浮液中培养细胞的封闭物或部分封闭物。在一些实施方案中，所述生物反应器指的是其中培养细胞的封闭物或部分封闭物，其中所述细胞可以处于液体悬浮液中，或可替代地可以与另一种非液体基质接触、在另一种非液体基质上或以内生长，所述基质包括但不限于固体生长支持材料。在一些实施方案中，所述固体生长支持材料或固体基质包含以下各项中的至少一种或组合：二氧化硅、塑料、金属、烃、或凝胶。本公开涉及一种系统，所述系统包括生物反应器，所述生物反应器包括一个或多个培养容器，可以在所述培养容器中在细胞生长培养基存在下培养神经元细胞。
如本文所用的术语“培养容器”被定义为适用于使细胞生长、培养、培育细胞、使细胞增殖、繁殖、或以其它方式类似地操作细胞的任何容器。培养容器在本文也可以被称为“培养插入物”。在一些实施方案中，所述培养容器是由生物相容性塑料和/或玻璃制成的。在一些实施方案中，所述塑料是塑料薄层，所述塑料薄层包含一个或多个孔隙，所述孔隙允许蛋白质、核酸、营养物质(如重金属和激素)、抗生素、以及其它细胞培养基组分扩散穿过所述孔隙。在一些实施方案中，所述孔隙具有不大于约0.1微米、0.5微米、1.0微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、15微米、20微米、25微米、30微米、40微米、50微米的宽度。在一些实施方案中，所述培养容器处于水凝胶基体中并且不含基底或任何其它结构。在一些实施方案中，所述培养容器被设计成含有水凝胶或水凝胶基体和各种培养基。在一些实施方案中，所述培养容器由水凝胶或水凝胶基体组成或基本上由水凝胶或水凝胶基体组成。在一些实施方案中，所述培养容器的唯一塑料部件是培养容器的构成培养容器的侧壁和/或底部的部件，所述侧壁和/或底部将细胞生长的孔或区域的体积与培养容器外部的点分开。在一些实施方案中，所述培养容器包含水凝胶和一个或多个分离的胶质细胞。在一些实施方案中，所述培养容器包含水凝胶和一个或多个分离的胶质细胞，向其中接种一个或多个神经元细胞。
术语“电刺激”指的是其中细胞正在暴露于交流电(AC)或直流电(DC)的电流的过程。可以将电流引入固体基质中或经由细胞培养基或细胞培养系统的其它合适的组分施加。在一些实施方案中，通过将一个或多个电极定位在器件或系统内的不同位置处以跨越细胞培养容器形成电压电位来向所述器件或系统提供电刺激。所述电极通过一个或多个电线与一个或多个放大器、电压计、电流计、和/或电化学系统(如电池或发电机)可操作地连接。这些器件和电线形成电路，通过该电路产生电流并且通过该电路跨越组织培养系统产生电位。
如本文所用的术语“水凝胶”被定义为聚合物链的任何水不溶性的交联的三维网络，所述网络在聚合物链之间具有填充有或能够填充以水的空隙。如本文所用的术语“水凝胶基体”被定义为任何三维水凝胶构建体、系统、器件、或类似的结构。水凝胶和水凝胶基体是本领域已知的并且各种类型已经描述于例如美国专利号5,700,289、和6,129,761；以及Curley和Moore,2011；Curley等,2011；Irons等,2008；以及Tibbitt和Anseth,2009中，这些文献中的每一篇以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体可以通过使液化的预凝胶溶液经受具有高于约300nm、400nm、450nm或500nm的波长的紫外光、可见光或日光而凝固。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体可以凝固成各种形状，例如被设计成模拟神经元神经束的分叉形状。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEG)。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含Puramatrix。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含甲基丙烯酸缩水甘油酯-葡聚糖(MeDex)。在一些实施方案中，将神经元细胞并入水凝胶或水凝胶基体中。在一些实施方案中，将来自神经系统的细胞并入水凝胶或水凝胶基体中。在一些实施方案中，所述来自神经系统的细胞是施旺细胞和/或少突胶质细胞。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含来自动物(如哺乳动物)的神经系统的组织外植体和补充细胞群体，所述补充细胞群体源自于神经系统，但是被分离和培养以使它的群体在培养物中富集。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含组织外植体，如视网膜组织外植体、DRG、或脊髓组织外植体以及分离和培养的施旺细胞、少突胶质细胞、和/或小胶质细胞的群体。在一些实施方案中，在细胞培养容器中同时使用两种或更多种水凝胶或水凝胶基体。在一些实施方案中，在同一个细胞培养容器中同时使用两种或更多种水凝胶或水凝胶基体，但是所述水凝胶由壁分开，从而形成组织培养容器，如孔中可独立定位的微环境。在多重化组织培养容器中，对于一些实施方案来说有可能在细胞培养容器内包括许多上述孔或可独立定位的位置以使得一个孔或位置中的水凝胶基体与细胞培养容器的另一个孔或位置中的水凝胶基体不同或相同。
在一些实施方案中，所述两种或更多种水凝胶可以包含不同量的PEG和/或Puramatrix。在一些实施方案中，所述两种或更多种水凝胶可以具有各种密度。在一些实施方案中，所述两种或更多种水凝胶可以具有能够允许细胞在所述水凝胶内生长的各种渗透性。在一些实施方案中，所述两种或更多种水凝胶可以具有各种柔性。
术语“细胞可穿透聚合物”指的是具有相同的或混合的单体亚单元的亲水性聚合物，所述聚合物的浓度和/或密度足以在以固态或半固态在固体基质上交联时形成空间，所述空间具有足够的生物相容性以使得细胞或细胞的一部分可以在培养物中生长。
术语“细胞不可穿透聚合物”指的是具有相同的或混合的单体亚单元的亲水性聚合物，所述聚合物的浓度和/或密度足以在以固态或半固态在固体基质上交联时不形成生物相容性空间或隔室。换句话说，细胞不可穿透聚合物是在以特定的浓度和/或密度交联之后不能支持细胞或细胞的一部分在培养物中生长的聚合物。
本领域普通技术人员可以了解的是，细胞不可穿透聚合物和细胞可穿透聚合物可以包含相同的或基本上相同的聚合物，但是在交联之后浓度或密度的差异形成具有有助于细胞或细胞的一部分在培养物中生长的一些部分的水凝胶基体。
在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体可以具有各种厚度。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约150μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约200μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约250μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约300μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约350μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约400μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约450μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约500μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约550μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约600μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约650μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约700μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约750μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约750μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约700μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约650μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约600μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约550μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约500μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约450μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约400μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约350μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约300μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约250μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约200μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约150μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约300μm至约600μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约400μm至约500μm。
在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体可以具有各种厚度。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约10μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约150μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约200μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约250μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约300μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约350μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约400μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约450μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约500μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约550μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约600μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约650μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约700μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约750μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约800μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约850μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约900μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约950μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约1000μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约1500μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约2000μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约2500μm至约3000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约2500μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约2000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约1500μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约1000μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约950μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约900μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约850μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约800μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约750μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约700μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约650μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约600μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约550μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约500μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约450μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约400μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约350μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约300μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约250μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约200μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约100μm至约150μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约300μm至约600μm。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体的厚度是约400μm至约500μm。
在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含一种或多种合成聚合物。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含下列合成聚合物中的一种或多种：聚乙二醇(聚氧化乙烯)、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、聚丙烯酰胺、有机硅、以及其任何衍生物或组合。
在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含一种或多种合成多糖和/或天然多糖。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含下列多糖中的一种或多种：透明质酸、硫酸肝素、肝素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、藻酸盐、以及其任何衍生物或组合。
在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含一种或多种蛋白质和/或糖蛋白。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含下列蛋白质中的一种或多种：胶原、明胶、弹性蛋白、肌联蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、角蛋白、丝素蛋白、以及其任何衍生物或组合。
在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含一种或多种合成多肽和/或天然多肽。在一些实施方案中，所述水凝胶或水凝胶基体包含下列多肽中的一种或多种：聚赖氨酸、聚谷氨酸或聚甘氨酸。
在一些实施方案中，所述水凝胶包含选自以下文献中所公开的那些的聚合物中的一种或组合：Khoshakhlagh等,“作为用于神经突生长的可选择性调节的支架的透明质酸和Puramatrix的光反应性互穿网络(Photoreactive interpenetrating network ofhyaluronic acid and Puramatrix as a selectively tunable scaffold for neuritegrowth)”,Acta Biomaterialia,2015年1月21日。
适用于细胞生长的任何水凝胶可以通过将本文所公开的聚合物中的任一种或组合以足以形成以下两种不同密度的交联聚合物的浓度以及条件和足够的时间段放置而形成：一种是细胞可穿透的并且一种是细胞不可穿透的。所述聚合物可以是合成聚合物、多糖、天然蛋白质或糖蛋白和/或多肽，如选自以下的那些。
合成聚合物
如聚乙二醇(聚氧化乙烯)、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯、聚丙烯酰胺、有机硅、它们的组合、以及它们的衍生物。
多糖(无论是合成的还是源自于天然来源)
如透明质酸、硫酸乙酰肝素、肝素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、藻酸盐、它们的组合、以及它们的衍生物。
天然蛋白质或糖蛋白
如胶原、明胶、弹性蛋白、肌联蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、角蛋白、丝素蛋白、它们的组合、以及它们的衍生物。
多肽(无论是合成的还是天然来源)
如聚赖氨酸、以及已经列出的所有RAD和EAK肽。
术语“分离的神经元”指的是如下的神经元细胞，所述神经元细胞已经从最初长出它们的生物体或培养物中被取出或解离。在一些实施方案中，分离的神经元是于悬浮液中的神经元。在一些实施方案中，分离的神经元是更大的细胞混合物的组分，所述混合物包括组织样品或含有非神经元细胞的悬浮液。在一些实施方案中，在将神经元细胞从作为它们的来源的动物中取出时，如在组织外植体的情况下，所述神经元细胞已经变成分离的。在一些实施方案中，分离的神经元是从动物切下的DRG中的那些神经元。在一些实施方案中，所述分离的神经元包含来自选自以下各项的一种物种或物种的组合的至少一个或多个细胞：绵羊细胞、山羊细胞、马细胞、牛细胞、人类细胞、猴细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、狗细胞、猫细胞、猪细胞、或其它非人类哺乳动物。在一些实施方案中，所述分离的神经元是人类细胞。在一些实施方案中，所述分离的神经元是被预条件化以具有类似于或基本上类似于人类神经元细胞的分化表型的干细胞。在一些实施方案中，所述分离的神经元是人类细胞。在一些实施方案中，所述分离的神经元是被预条件化以具有类似于或基本上类似于非人类神经元细胞的分化表型的干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞选自：间充质干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、从哺乳动物的脐带中分离的干细胞、或内胚层干细胞。
术语“神经变性疾病”在整个本说明书中用于描述由对中枢神经系统和/或外周神经系统造成损伤所引起的疾病。可以作为可以使用所公开的模型、系统或器件研究的疾病的实例的示例性神经变性疾病包括例如帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、肌萎缩性侧索硬化(卢伽雷氏病(Lou Gehrig's disease))、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、溶酶体贮积病(“白质病”或胶质/脱髓鞘疾病，如例如由Folkerth,J.Neuropath.Exp.Neuro.,58,1999年9月9日所述)、泰萨二氏病(Tay Sachsdisease)(β氨基己糖苷酶缺乏症)、其它遗传性疾病、多发性硬化、由缺血、事故、环境损伤等所引起的脑损伤或创伤、脊髓损伤、共济失调以及酒精中毒。此外，本发明可以用于测试药剂对培养物中的神经元细胞的功效、毒性、或神经变性作用以研究用于神经变性疾病的治疗。术语神经变性疾病还包括神经发育病症，包括例如自闭症和相关的神经系统疾病，如精神分裂症等。
如本文所用的术语“神经元细胞”被定义为包含树突、轴突、以及细胞体中的至少一种或组合的细胞、或可替代地，从神经系统组织中分离的任何细胞或细胞群。在一些实施方案中，神经元细胞是包含轴突或能够形成轴突的任何细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是施旺细胞、胶质细胞、神经胶质、皮层神经元、从神经元组织中分离或获得的或已经分化成具有神经元表型或与神经元细胞的表型基本上类似的表型的细胞的胚胎细胞、已经分化成神经元表型的诱导多能干细胞(iPS)、或源自于神经元组织或分化成神经元表型的间充质干细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是来自成年、青少年、幼年或胎儿受试者的背根神经节(DRG)组织、视网膜组织、脊髓组织、或脑组织的神经元。在一些实施方案中，神经元细胞是从受试者的神经元组织中分离的任何一个或多个细胞。在一些实施方案中，所述神经元细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人类哺乳动物细胞或衍生自从非人类哺乳动物分离的细胞。如果从作为所述细胞的来源的原始动物分离或解离，那么神经元细胞可以包含来自多于一种物种的分离的神经元。
在一些实施方案中，神经元细胞是下列神经元中的一种或多种：交感神经元、脊髓运动神经元、中枢神经系统神经元、运动神经元、感觉神经元、胆碱能神经元、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、中间神经元、肾上腺素能神经元、以及三叉神经节神经元。在一些实施方案中，神经元细胞是下列胶质细胞中的一种或多种：星形细胞、少突胶质细胞、施旺细胞、小胶质细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞、卫星细胞、肠神经胶质细胞、以及垂体细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是下列免疫细胞中的一种或多种：巨噬细胞、T细胞、B细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、肥大细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、以及嗜碱性粒细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是下列干细胞中的一种或多种：造血干细胞、神经干细胞、脂肪衍生的干细胞、骨髓衍生的干细胞、诱导多能干细胞、星形细胞衍生的诱导多能干细胞、成纤维细胞衍生的诱导多能干细胞、肾上皮衍生的诱导多能干细胞、角质细胞衍生的诱导多能干细胞、外周血液衍生的诱导多能干细胞、肝细胞衍生的诱导多能干细胞、间充质衍生的诱导多能干细胞、神经干细胞衍生的诱导多能干细胞、脂肪干细胞衍生的诱导多能干细胞、前脂肪细胞衍生的诱导多能干细胞、软骨细胞衍生的诱导多能干细胞、以及骨骼肌衍生的诱导多能干细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是角质细胞。在一些实施方案中，神经元细胞是内皮细胞。
如本文所用的术语“神经元细胞培养基”或简称“培养基”被定义为适用于支持神经元细胞生长、培养、培育神经元细胞、使神经元细胞增殖、繁殖、或以其它方式操作神经元细胞的任何营养物质。在一些实施方案中，所述培养基包含补充有神经生长因子(NGF)的神经基础培养基。在一些实施方案中，所述培养基包含胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，所述培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.001％重量/体积至约0.01％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.001％重量/体积至约0.008％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.001％重量/体积至约0.006％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.001％重量/体积至约0.004％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.002％重量/体积至约0.01％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.003％重量/体积至约0.01％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.004％重量/体积至约0.01％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.006％重量/体积至约0.01％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.008％重量/体积至约0.01％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.002％重量/体积至约0.006％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.003％重量/体积至约0.005％重量/体积范围内的浓度的抗坏血酸。
在一些实施方案中，水凝胶、水凝胶基体、和/或神经元细胞培养基包含下列组分中的任何一种或多种：神经胚素(artemin)、抗坏血酸、ATP、β-内啡肽、BDNF、小牛血清、牛血清白蛋白、降钙素基因相关肽、辣椒素、角叉菜胶、CCL2、睫状神经营养因子、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、D-丝氨酸、胎牛血清、氟代柠檬酸盐、福尔马林、胶质细胞系衍生神经营养因子、胶质纤维酸性蛋白、谷氨酸盐、IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、胰岛素、层粘连蛋白、脂氧素、mac-1-皂草素、甲硫氨酸砜亚胺、米诺环素(minocycline)、神经调节蛋白-1、神经保护素、神经秩蛋白、NGF、一氧化氮、NT-3、NT-4、珀尔塞蛋白(persephin)、血小板裂解物、PMX53、聚-D-赖氨酸(PLL)、聚-L-赖氨酸(PLL)、丙戊茶碱、消退素、S100钙结合蛋白B、硒、物质P、TNF-α、I型-V型胶原、以及酵母聚糖。
如本文所述的术语“光遗传学”指的是涉及使用光来控制活组织中的细胞(通常是神经元)的生物技术，所述细胞已经被遗传修饰成表达光敏离子通道。它是一种用于神经科学中的神经调节方法，使用来自光学和遗传学的技术的组合来控制和监测活组织中，甚至是自由移动的动物体内单个神经元的活动并且精确测量那些操作的实时效果。用于光遗传学中的关键试剂是光敏蛋白。空间精确的神经元控制是使用光遗传学执行子，如通道视紫红质、盐细菌视紫红质(halorhodopsin)、以及古细菌视紫红质(archaerhodopsin)来实现的，而时间精确的记录可以在钙(水母发光蛋白、卡默莱昂(Cameleon)、GCaMP)、氯离子(克洛梅隆(Clomeleon))或膜电压(墨梅徳(Mermaid))的光遗传学感受子的帮助下来完成。在一些实施方案中，被光遗传学执行子和/或感受子修饰的神经细胞用于本文所描述的培养系统中。
术语“塑料”指的是包含烃的生物相容性聚合物。在一些实施方案中，塑料选自由以下各项组成的组：聚苯乙烯(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丁二烯(PVP)、聚乙烯醇缩丁醛(PVB)、聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯基甲基醚(PVME)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚(L-乳酸)、聚酯、聚己内酯(PCL)、聚氧化乙烯(PEO)、聚苯胺(PANI)、聚芴、聚吡咯(PPY)、聚乙烯二氧噻吩(PEDOT)、以及前述聚合物中的两种或任一种的混合物。
如本文所用的术语“接种”被定义为将一定量的细胞转移到新的培养容器中。所述量可以被限定并且可以使用细胞的体积或数量作为限定量的基础。细胞可以是悬浮液的一部分。
如本文所用的术语“固体基质”指的是作为不含或基本上不含细胞毒素的固体载体的任何物质。在一些实施方案中，所述固体基质包含二氧化硅、塑料、以及金属中的一种或组合。在一些实施方案中，所述固体基质包含具有足以允许蛋白质、营养物质、以及气体在细胞培养基存在下扩散或非主动转运穿过固体基质的尺寸和形状的孔隙。在一些实施方案中，孔径具有不超过约10微米、9微米、8微米、7微米、6微米、5微米、4微米、3微米、2微米、1微米的直径。本领域普通技术人员可以基于细胞培养基的内含物以及在特定微环境中在固体基质上生长的细胞的暴露来确定多大的孔径是必要的。举例来说，本领域的普通技术人员可以观测系统或器件中的任何培养细胞在使用包含各种直径的孔隙的固体基质的条件下是否是存活的。在一些实施方案中，所述固体基质包含具有预定形状的基底，所述预定形状限定了所述外表面和所述内表面的形状。在一些实施方案中，所述基底包含二氧化硅、塑料、陶瓷、或金属中的一种或组合，并且其中所述基底呈圆柱体的形状或呈基本上类似于圆柱体的形状，以使得所述第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物包被所述基底的内表面并且限定圆柱形或基本上圆柱形的内室；并且其中所述开口被定位在所述圆柱体的一端处。在一些实施方案中，所述基底包含足以允许蛋白质、营养物质、以及氧气在所述细胞培养基存在下扩散穿过所述固体基质的尺寸和形状的一个或多个孔隙。在一些实施方案中，所述固体基质包含具有不超过1微米直径的孔径的塑料基底并且包含至少一层水凝胶基体；其中所述水凝胶基体包含至少第一细胞不可穿透聚合物和至少第一细胞可穿透聚合物；所述基底包含预定形状，所述第一细胞不可穿透聚合物和至少第一细胞可穿透聚合物物理粘附或化学键合在所述预定形状周围；其中所述固体基质包含至少一个隔室，所述隔室至少部分地由所述固体基质的内表面的形状所限定并且可从所述固体基质外部的点通过开口进入，所述开口任选地被定位在所述固体基质的一端处。在实施方案中，在所述固体基质包含由至少一个内表面限定的中空内部部分的情况下，可以通过将细胞放置在开口处或附近以使得细胞可以在生长之前附着到所述固体基质的内表面的至少一部分上来接种悬浮液或组织外植体中的细胞。所述固体基质的至少一个隔室或中空内部允许将细胞容纳在由固体基质的内表面的形状限定的特定三维形状中并且促进细胞远离开口定向生长。在神经元细胞的情况下，至少一个隔室的容纳程度和形状有助于轴突从被定位在至少一个隔室内并且处于开口处或附近的细胞体生长。在一些实施方案中，所述固体基质呈管状或基本上呈管状以使得内部隔室的形状是圆柱形的或部分圆柱形的。在一些实施方案中，所述固体基质包含一个或多个分支管状内部隔室。在一些实施方案中，固体的中空内部部分的分叉或多重分叉形状被配置用于或允许轴突按多重分支模式生长。当(并且如果)将电极放置在轴突的远端处至附近以及神经元细胞体处或附近时，可以在器件或系统内测量电生理学量度，如细胞内动作电位。
本公开还涉及一种系统，所述系统包括：
(i)水凝胶基体；
(ii)于悬浮液中或作为组织外植体的组分的一个或多个神经元细胞；
(iii)电流发生器；
(iv)电压计和/或电流计；
(v)至少第一刺激电极和至少第一记录电极；
其中所述发生器、电压计和/或电流计以及电极是经由电路彼此电连接的，其中电流从所述发生器馈送到所述至少一个刺激电极并且电流在所述记录电极处被接收并且馈送到电压计和/或电流计；其中所述刺激电极被定位在所述神经元细胞的一个或多个细胞体处或附近，并且所述记录电极被定位在远离所述细胞体预定距离处，以使得跨越所述细胞培养容器建立电位。
在一些实施方案中，所述固体基质由水凝胶或水凝胶基体组成。在一些实施方案中，所述固体基质由水凝胶或水凝胶基体组成并且不含玻璃、金属或陶瓷。在一些实施方案中，所述固体基质被成型成被预定用于接种适用于轴突生长的特定尺寸的细胞的形式或模具。在一些实施方案中，所述固体基质或至少一个基底部分经过成型而具有至少一个分支内部管状结构，其中管的位置越远离其中进行组织外植体或神经元细胞的接种的位置，直径任选地逐渐变细。举例来说，本公开考虑了在所述固体基质的半圆柱形或圆柱形部分的一端处的中心点，所述中心点可在所述固体基质外部的点处通过外表面处的开口或洞进入。所述开口或洞可以用于将细胞(神经元细胞和/或胶质细胞)放置或接种在上述中心点处。在使细胞在培养物中在几天内生长时，细胞暴露于具有本文所公开的组分中的任一种的培养基，所述组分的浓度和暴露的时间段足以使得轴突从神经元细胞生长。如果要使细胞形成髓鞘或期望髓鞘形成以进行研究，那么可以在添加神经元细胞或外植体之前将胶质细胞通过相同的洞引入并且接种。在轴突在半圆柱形或管状结构中生长时，轴突突起生长可以越来越远离中心点发生。固体基质中越来越远离中心点(或接种点)的点处的进入点或开口可以用于定位或观测轴突状态的轴突生长。本公开考虑了固体基质的结构采取促进轴突生长的任何形式。在一些实施方案中，容纳轴突突起的内室或隔室包含半圆形或基本上圆柱形直径。在一些实施方案中，所述固体基质在远离中心点的点处在两个或更多个内部隔室中分支。在一些实施方案中，这一分支可以类似于钥匙孔形状或树，其中存在2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个或更多个管状或基本上圆柱形的内室彼此处于流体连通以使得轴突生长源自于一个或多个细胞体的接种点并且沿着内室纵向延伸并且延伸到任何一个或多个分支中。在一些实施方案中，可以将一个或多个电极放置在一个或多个开口处或附近以使得可以在沿着轴突长度的一个或多个位置上获取记录。这还可以用于探查沿着轴突长度的一个或多个位置。
如本文所用的术语“记录”被定义为测量一个或多个神经元细胞的响应。所述响应可以是电生理学响应，例如膜片钳电生理学记录或场电位记录。
本公开公开了获得模拟临床神经传导和NFD测试的体外神经组织的微尺度器官型模型的生理学测量结果的方法和器件。通过使用这些方法和器件所获得的结果更好地预测临床结果，从而使得更具成本效益的方法能够用于选择具有更高的后期成功可能性的有前途的先导化合物。本公开包括制造和利用三维微工程系统，所述系统使得能够生长特别密集的、高度平行的神经纤维束。由于神经束的局限性质，因此这一体外模型能够测量CAP和细胞内膜片钳记录这两者。此外，后续的共聚焦和透射电子显微镜术(TEM)分析允许定量结构分析，包括NFD。综上所述，所述体外模型系统具有新的评估组织形态测定和群体电生理学的能力，类似于临床组织病理学和神经传导测试。
本公开还提供了一种用于测量使用本文所述的体外模型形成的轴突的髓鞘形成的方法。类似于人类传入外周神经的结构，这些体外构建体中的背根神经节(DRG)神经元向外周伸出长的、平行的、成束的轴突。在天然组织中，不同直径和髓鞘形成程度的轴突以不同的速度将感觉信息传导回中枢神经系统。施旺细胞通过使轴突形成髓鞘并且为更快的传导提供隔离来支持感觉中继。类似地，由这一体外构建体诱导的三维生长包含在密集的平行取向上跨越长达3mm的距离的各种直径的轴突。在共聚焦和TEM成像中观测到施旺细胞的存在和包覆。
尽管神经元形态是表型成熟度的一个有用的指标，但是健康神经元的更明确的标志是它们传导动作电位的能力。单独的细胞凋亡不是神经元健康的全面量度，这是因为许多病理变化可能在细胞死亡表现之前出现。对动作电位生成的电生理学研究可以确定所观测的结构是否支持预测的功能，并且测量临床相关终点的能力产生更具预测性的结果。类似地，由成像收集的信息可以确定髓鞘形成程度的定量量度，同时CAP测量结果表明髓磷脂的整体健康情况并且使得进一步深入了解所关注的各种试剂或化合物的毒性和神经保护机制。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括小化合物。在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括至少一种环境污染物或工业污染物。在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的小化合物中的一种或组合：化学治疗剂、镇痛剂、心血管调节剂、胆固醇、神经保护剂、神经调节剂、免疫调节剂、抗炎剂、以及抗微生物药物。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的化学治疗剂中的一种或组合：放线菌素(Actinomycin)、阿利维甲酸(Alitretinoin)、全反式视黄酸、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、蓓萨罗丁(Bexarotene)、博来霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、卡培他滨(Capecitabine)、卡铂(Carboplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂(Cisplatin)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、达卡巴嗪(Dacarbazine，DTIC)、柔红霉素(Daunorubicin)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、多西菌定(Doxifluridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、埃博霉素(Epothilone)、埃罗替尼(Erlotinib)、依托泊苷(Etoposide)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲、伊达比星(Idarubicin)、伊马替尼(Imatinib)、伊立替康(Irinotecan)、氮芥(Mechlorethamine)、美法仑(Melphalan)、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、亚硝基脲、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇、培美曲塞(Pemetrexed)、罗米地辛(Romidepsin)、塔非布苷(Tafluposide)、替莫唑胺(Temozolomide)(口服达卡巴嗪)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Tioguanine)(以前称为硫鸟嘌呤(Thioguanine))、拓扑替康(Topotecan)、维甲酸(Tretinoin)、戊柔比星(Valrubicin)、威罗菲尼(Vemurafenib)、长春花碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、维莫德吉(Vismodegib)、以及伏立诺他(Vorinostat)。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的镇痛剂中的一种或组合：扑热息痛(Paracetoamol)、非类固醇抗炎药(NSAID)、COX-2抑制剂、阿片样物质、氟吡汀(flupirtine)、三环抗抑郁药、卡马西平(carbamaxepine)、加巴喷丁(gabapentin)以及普瑞巴林(pregabalin)。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的心血管调节剂中的一种或组合：内匹司他(nepicastat)、胆固醇、烟酸、黄芩(scutellaria)、普尼拉明(prenylamine)、脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone)、莫那匹尔(monatepil)、艾氯胺酮(esketamine)、尼古地平(niguldipine)、阿塞那平(asenapine)、阿托莫西汀(atomoxetine)、氟桂利嗪(flunarizine)、米那普仑(milnacipran)、美西律(mexiletine)、安非他明(amphetamine)、硫喷妥钠(sodium thiopental)、类黄酮(flavonoid)、溴苄胺(bretylium)、奥沙西泮(oxazepam)、以及和厚朴酚(honokiol)。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的神经保护剂和/或神经调节剂中的一种或组合：色胺、甘丙肽受体2、苯丙氨酸、苯乙胺、N-甲基苯乙胺、腺苷、京都啡肽(kyptorphin)、物质P、3-甲氧酪胺、儿茶酚胺、多巴胺、GABA、钙、乙酰胆碱、肾上腺素、去甲肾上腺素、以及血清素。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的免疫调节剂中的一种或组合：克诺立珠单抗(clenolizimab)、恩曲单抗(enoticumab)、利格珠单抗(ligelizumab)、西姆土珠单抗(simtuzumab)、瓦替利珠单抗(vatelizumab)、帕沙珠单抗(parsatuzumab)、英加妥珠单抗(Imgatuzumab)、曲加立珠单抗(tregalizaumb)、帕特立珠单抗(pateclizumab)、那穆鲁单抗(namulumab)、帕科珠单抗(perakizumab)、法拉莫单抗(faralimomab)、帕图单抗(patritumab)、阿堤努单抗(atinumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、弗妥昔单抗(futuximab)以及杜利妥单抗(duligotumab)。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的抗炎剂中的一种或组合：布洛芬(ibuprofen)、阿司匹林(aspirin)、酮洛芬(ketoprofen)、舒林酸(sulindac)、萘普生(naproxen)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、双氯芬酸(diclofenac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮咯酸(ketorolac)、吡罗昔康(piroxicam)、吲哚美辛(indomethacin)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奥沙普秦(oxaprozin)、酮洛芬、法莫替丁(famotidine)、甲氯芬那酸(meclofenamate)、托美丁(tolmetin)、以及双水杨酯(salsalate)。
在一些实施方案中，所述至少一种试剂包括选自以下各项的抗微生物剂中的一种或组合：抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生物剂、热、辐射、以及臭氧。
本公开另外公开了一种在三维培养平台中测量仿生神经组织的细胞内记录和细胞外记录这两者的方法。先前，电生理学实验是在解离的表面接种的培养物或器官型切片制备物中进行的，具有每一种方法固有的限制。在解离的细胞培养物中进行研究通常受限于单细胞记录，这是因为缺乏有组织的多细胞神经突构造，如将在器官型制备物中所见到的那样。器官型制备物具有完整的神经回路并且允许细胞内研究和细胞外研究这两者。然而，急性脑切片呈现一系列复杂的同时存在的变量而没有控制单个因素的手段并且因此在本质上在通量可能性方面受限。
体外三维培养物中的细胞内记录先前已经被证实。然而，神经元生长在空间上不局限于支持细胞外群体研究的解剖相关结构。需要更仿生的三维神经培养物以允许研究群体水平电生理学行为。本公开支持了全细胞膜片钳技术和由呈三维几何形状的受限的神经突生长产生的细胞外场记录中的同步群体水平事件。在本公开之前，这些终点的测量直接类似于临床神经传导测试，尚有待被证实以用于纯细胞体外研究。
使用本文所公开的方法和器件，使用场记录来测量由所有募集的纤维中的信号传导所引起的电位的组合细胞外变化。由电刺激所引出的群体响应是CAP。电诱发的群体峰电位在性质上是分级的，包括慢纤维和快纤维中动作电位的组合效应。峰电位是单个连贯事件，具有快速的起始相和短的持续时间，这是CAP或仅包含在不存在突触输入的情况下具有快速的信号传导的动作电位的响应的特征。本公开所公开的三维神经构建体还支持沿着神经突束或通道从更远的距离刺激的CAP，这证实了神经培养物能够快速地传送来自远距离刺激的信号的能力，这非常像传入外周神经。本公开的三维神经培养物支持了可用于测量传导特性的近端和远端刺激技术。
本公开可以与诱导神经纤维束中典型的许多纤维类型募集的一种或多种生长因子一起使用。具体来说，神经生长因子(NGF)优先地募集小直径纤维，所述小直径纤维常常与疼痛信号传导相关，如本文所提供的数据中所证实。已经证实的是，脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子3(NT-3)优先地支持更大直径的本体感受纤维的生长。生长影响因素，如生物活性分子和药理学试剂可以与电生理学研究结合以允许系统地操作用于机制研究的条件。
使用本公开形成的三维神经培养物可以用作平台来研究髓磷脂损害性疾病和外周神经病变潜在的机制，这是通过研究已知的髓鞘形成障碍药剂、神经病变诱发性培养条件、以及毒性神经病变诱发性化合物对所述神经培养物的作用来实现的。本公开容许使用传导速度作为在毒性条件和治疗条件下髓磷脂和神经纤维完整性的功能量度，从而有助于对药物安全性和功效进行研究。将遗传突变和药物并入到使用本文所公开的技术产生的神经培养物中可以使得能够以受控方式再现疾病现象，从而使得更好地理解神经变性和可能的治疗疗法。
本公开提供了涉及产生、维持、以及生理学探查被设计成模拟天然神经组织解剖结构的微工程配置的神经细胞的器件、方法、以及系统。在一些实施方案中，所述器件和系统包括一个或多个培养或分离的施旺细胞和/或一个或多个培养或分离的少突胶质细胞，所述细胞在细胞培养容器中与一个或多个神经元细胞接触，所述细胞培养容器包含固体基质，所述基质包含至少一个外表面、至少一个内表面以及至少一个内室；所述内室的形状至少部分地由所述至少一个内表面所限定并且可从所述固体基质外部的点经由所述外表面中的至少一个开口进入；其中所述一个或多个神经元细胞的细胞体被定位在所述内室的一端处并且轴突能够在所述内室内沿着所述内室的至少一个长度生长，以使得轴突尖端的位置从细胞体向远侧延伸。在一些实施方案中，所述固体基质的内表面呈圆柱体的形状或是基本上圆柱形的，以使得来自神经元细胞的细胞体被定位在圆柱形或基本上圆柱形内表面的一端处的开口附近，并且神经元细胞的轴突包含从细胞体边缘处的点沿着所述内表面的长度向远离细胞体的点延伸的一段长度的细胞物质。在一些实施方案中，所述固体基质的内表面呈圆柱体的形状或是基本上圆柱形的，以使得来自神经元细胞的细胞体被定位在圆柱形或基本上圆柱形内表面的一端处的开口附近，并且神经元细胞的轴突包含从细胞体边缘处的点沿着所述内表面的长度向远离细胞体的点延伸的一段长度的细胞物质。在一些实施方案中，所述固体基质的内表面呈圆柱体的形状或是基本上圆柱形的，以使得来自神经元细胞的细胞体被定位在圆柱形或基本上圆柱形内表面的一端处的开口附近，并且神经元细胞的轴突包含从细胞体边缘处的点沿着所述内表面的长度向远离细胞体的点延伸的一段长度的细胞物质；其中如果所述细胞培养容器包含多个神经元细胞，那么多个轴突从多个细胞体延伸以使得多个轴突限定能够从细胞体沿着所述内表面的长度向远侧生长的一束轴突。在一些实施方案中，所述神经元细胞在可穿透聚合物上和可穿透聚合物内生长。在一些实施方案中，一个或多个电极被定位在至少一个轴突的尖端处或附近，并且一个或多个电极被定位在细胞体处或附近以使得跨越一个或多个神经元细胞的长度建立电压电位。
本公开的另一个目的在于提供一种神经功能的中至高通量测定以用于筛查化学和生物试剂的药理学和/或毒理学特性。在一些实施方案中，所述试剂是细胞，如本文所公开的任何类型的细胞、或抗体，如用于治疗临床疾病的抗体。在一些实施方案中，所述试剂是用于治疗人类疾病的任何药物或药剂以使得可以在作为所提出的哺乳动物治疗的新药剂与人类疾病的现有治疗之间比较毒性、作用或神经调节作用。在一些实施方案中，用于治疗人类疾病的新药剂是用于神经变性疾病的治疗并且与用于神经变性疾病的现有治疗相比较。在作为非限制性实例的多发性硬化的情况下，可以将新药剂(修饰的细胞、抗体、或小化合物)的作用与用于多发性硬化的现有治疗的相同作用相比较和对比，所述现有治疗诸如柯珮松(Copaxone)、利比(Rebif)、其它干扰素治疗、泰斯布里(Tysabri)、反丁烯二酸二甲酯、芬戈莫德(fingolimod)、特立氟胺(teriflunomide)、米托蒽醌(mitoxantrone)、泼尼松(prednisone)、替扎尼定(tizanidine)、巴氯芬(baclofen)。
本公开的另一个目的在于将诸如二维和三维微工程神经束的技术的独特集合与神经细胞群体的电生理刺激和记录结合使用。
本公开的另一个目的在于提供一种体外评价神经生理机能的新型方法，所述方法使用复合动作电位(CAP)作为临床上类似的量度以获得比由当前方法所提供的那些更灵敏和更能预测人类生理机能的结果。
本公开的另一个目的在于提供微工程神经组织，所述组织模拟天然的解剖和生理特征并且易于使用高通量电生理刺激和记录方法来评价。
本公开的另一个目的在于提供复制、操作、修改、以及评价髓磷脂损害性疾病和外周神经病变潜在的机制的方法。
本公开的另一个目的在于允许人类神经细胞中神经调节的中至高通量测定用于筛查化学和生物试剂的药理学和/或毒理学活性。
本公开的另一个目的在于将诸如二维和三维微工程神经束的技术的独特集合与人类神经细胞群体的光学和电化学刺激和记录结合使用。
本公开的另一个目的在于定量仿生的工程丘脑皮层回路中诱发的突触后电位。我们观测到神经束中逆行性生成的群体峰电位，这表明它们能够执行群体水平生理机能，如传导复合动作电位和突触后电位。
本公开的另一个目的在于利用光遗传学方法、照射的硬件和软件控制、以及荧光成像来允许非侵入性刺激和记录神经回路中对诱发电位的多单位生理响应。
本公开的另一个目的在于使用微工程回路来测试选择性5-HT再摄取抑制剂(SSRI)和第二代抗精神病药以观察它们是否改变它们的发育成熟。
在一个实施方案中，利用使用数字微镜器件(DMD)进行的投影光刻来将聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和Puramatrix水凝胶的组合微图案化，如图1中所示。这种方法使得能够将一种或多种水凝胶直接快速微图案化到常规的细胞培养材料上。由于光掩模从不与凝胶材料接触，因此多种水凝胶可以连续地快速固化，从而使得能够在没有自动化的情况下在1小时内制备许多凝胶构建体。这种方法使得能够使用聚乙二醇(PEG)(一种机械上稳固的细胞生长限制性凝胶)将神经突生长约束在仿生的生长促进凝胶内。在一些实施方案中，这种生长促进凝胶可以是Puramatrix、琼脂糖、或甲基丙烯酸酯化的葡聚糖。在使胚胎背根神经节(DRG)外植体在这一受约束的三维环境中生长时，轴突以高密度和束化从神经节长出，如图5和图6中所示。大部分轴突表现为小直径、无髓鞘的纤维，所述纤维在2周至4周内生长到接近1em的长度。具有从神经节延伸出的密集的、高度平行的、三维的神经纤维束的这一培养模型的结构大致类似于外周神经构造。它的形态可以使用神经形态测定来评估，从而允许进行对于传统的细胞测定来说不可用的临床类似的评估。
在一个优选的实施方案中，所述培养模型提供了记录由复合动作电位(CAP)产生的电诱发群体场电位的能力。示例迹线显示特征性均匀的、快速的、短潜伏期、群体峰电位响应，它们在高频(100Hz)刺激下保持一致，如在图8B中所看到的那样。CAP可逆地由河豚毒素(TTX)消除，如图8E和图8F中所示，这证实药物可以被施用并且被证实具有作用。存在与远端神经束刺激相关的起始相延迟时间的可测量的延长，如在图8C和图8D中所看到的那样。所述响应对神经递质阻断剂不敏感，这表明诱发的响应主要是CAP而不是突触电位，如图10中所示。胚胎DRG培养物已经被有效地用作外周神经生物学的模型达数十年。虽然作为模型系统是非常有用的，但是已知常规的DRG培养物在用传统的细胞活力测定评估时对临床毒性的预测性不佳。虽然有可能在DRG培养物中进行单细胞膜片钳记录，但是没有记录CAP的报告，这是因为缺乏组织构造。在一个优选的实施方案中，本公开提供了类似于临床组织病理学和神经传导测试，评估组织形态测定和群体电生理学的能力。
在一些实施方案中，本公开使用人类神经细胞使神经组织在三维环境中生长，其中神经元细胞体被管束在一起并且位于与轴突纤维束不同的位置处，从而模拟天然的神经构造并且允许测量形态测定和电生理学数据，包括CAP。在一些实施方案中，本公开使用源自于原代人类组织的神经元细胞和胶质细胞。在其它实施方案中，神经元细胞和胶质细胞可以衍生自人类干细胞，包括诱导多能干细胞。
在另一个实施方案中，本公开使用传导速度作为在毒性条件和治疗条件下神经组织状况的功能量度。有关髓鞘形成程度、髓磷脂健康情况、轴突转运、mRNA转录以及神经元损伤的信息可以通过电生理学分析来确定。结合神经密度、髓鞘形成百分比以及神经纤维类型的形态测定分析，可以确定所关注的化合物的作用机制。在一些实施方案中，本文所公开的器件、方法、以及系统可以包括遗传突变和药物而以受控方式复制疾病现象，从而使得更好地理解神经变性和可能的治疗疗法。
下列实施例意图是如何作出和使用本申请中所公开的实施方案的非限制性实施例。在实施例或说明书的主体中公开的任何出版物以引用的方式整体并入本文。
实施例
实施例1：水凝胶构建体中神经组织的生长和生理学评估(非假想)
A.材料和方法
动态掩模投影光刻：经由投影光刻形成水凝胶微图案。具有USB计算机接口(ALP3Basic)的DMD开发套件(DiscoveryTM 3000，德克萨斯州达拉斯的德克萨斯仪器公司(Texas Instruments,Dallas,TX))通过将数字黑白图像转换成DMD阵列上的微镜图案而用作动态掩模，其中单个镜面可以分别通过将反射角从+12°旋转到-12°而被“打开”或“关闭”。用可调整的准直适配器(EXPO公司)使来自OmniCure 1000(加拿大魁北克的EXFO公司(EXFO,Quebec,Canada))Hg蒸气光源的在320nm-500nm处过滤的紫外(UV)光准直并且投影到DMD阵列上。反射光通过具有数值孔径0.13的4×Plan Fluor物镜(纽约州梅尔维尔的尼康仪器公司(Nikon Instruments,Melville,NY))投影并且直接聚焦到可光致交联的水凝胶溶液上，如图1A所示。调整UV光源的光圈以维持如使用辐射计(EXPO公司)所测量的5.0瓦特/平方厘米的辐照输出。使水凝胶溶液固化约55秒，从而经由自由基链反应诱导交联。不同于先前的报道，这种方法用单次辐照在整个本体中引发交联，从而不需要逐层的方法。
双重水凝胶构建体的形成：如先前对于动态掩模投影光刻所述进行水凝胶聚合。通过将具有平均分子量(MW)1000Da的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEG)(宾夕法尼亚州沃灵顿的Polysciences公司(Polysciences,Warrington,PA))在含有作为光引发剂的0.5％(w/v)Irgacure 2959(1-2959)(瑞士巴塞尔的汽巴特种化学品公司(Ciba SpecialtyChemicals,Basel,Switzerland))的PBS或生长培养基中稀释到10％(w/v)来制备可光致交联的溶液。PEG的浓度和分子量是基于先前公开的数据来选择的以使细胞粘附减到最低限度并且使水凝胶对聚合表面的粘附性达到最大。使微图案化的PEG构建体直接交联到以下三种类型的渗透性细胞培养插入物之一上：具有24mm直径膜和0.411m孔隙的聚酯、聚碳酸酯、以及胶原包被的PTFE渗透性支持物(纽约州科宁的康宁公司(Corning,Corning,NY))。用(德克萨斯州休斯敦的SO PUS Products公司(SO PUSProducts,Houston,TX))处理培养插入物的内壁而不是膜本身以减少PEG溶液的弯液面效应。将每一个支持物放置在被定位在光刻投影透镜正下方的倒置显微镜的台上。在交联之后，冲洗支持物，从而去除过量的未交联的PEG溶液，并且微图案化的PEG保持附着于表面。如果不立即使用的话，那么在缓冲盐水溶液(4℃)中维持PEG凝胶的水化。
在使用之前将自组装肽凝胶Puramatrix(马萨诸塞州贝德福德的碧迪生物科技公司(BD Biosciences,Bedford,MA))在去离子H2O中稀释到0.15％(w/v)并且在用于神经突生长实验时，在预胶凝的情况下补充以1μg/mL的可溶性层粘连蛋白(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))。这一第二凝胶也已经被琼脂糖以及透明质酸、肝素和葡聚糖的甲基丙烯酸酯化型式所替代。Puramatrix的浓度和层粘连蛋白的添加这两者是根据制造商关于神经应用的说明书。使用移液管，将这一溶液小心地添加到微图案化的PEG水凝胶内的空隙中。与水化PEG凝胶的盐溶液接触诱导Puramatrix的自组装，它保持局限于PEG几何形状内。通过在37℃和5％CO2下孵育来维持Puramatrix的胶凝。
组织收集和培养：遵守NIH实验室动物护理和使用指南(NIH出版号85-23Rev.1985)。将胚胎第15天(E-15)幼仔从定时怀孕的Long Evans大鼠(马萨诸塞州威尔明顿的查尔斯河公司(Charles River,Wilmington,MA))取出并且放置在汉克氏平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution)中。将脊柱从胚胎中分离，从所述脊柱收集背根神经节(DRG)并且将所述背根神经节放置在补充有神经生长因子(NGF)、10％胎牛血清(FBS)、以及青霉素/链霉素(P/S)(英杰公司)的神经基础培养基中以促进贴壁。在贴壁后，将DRG放置在胶原包被的细胞培养插入物上并且在37℃和5％CO2下维持在孵育箱中，其中用B-27和L-谷氨酰胺代替FBS用于生长培养基。
经由通过胰蛋白酶消化和研磨以解离DRG来获得原代DRG神经元，随后使用氟脱氧尿苷和尿苷取出支持细胞(3天处理)。然后根据制造商的方案将细胞以3×105个细胞/毫升的浓度悬浮在Puramatrix中。将足以获得约480μm厚的水凝胶的体积的细胞悬浮液添加到24孔细胞培养插入物或24孔组织培养板(康宁公司)中，并且在添加生长培养基时引发自组装(n＝4)。将构建体孵育约48小时，之后测试细胞活力。
双重水凝胶中的神经突生长：将胶原包被的PTFE细胞培养插入物在贴壁培养基中浸泡过夜以将膜水化。然后将四个DRG放置在插入物的表面上并且使其贴壁，持续约2小时，之后将培养基更换为500μL于如先前所述的不含FBS的生长培养基中的10％PEG。可以调整这一体积以改变PEG构建体的厚度。将DMD用可见光源照射以有助于投影掩模与每一个贴壁的DRG对准。然后将可见光源替换成紫外光源并且PEG水凝胶在组织外植体周围交联。将含有DRG的PEG构建体用PBS洗涤三次以去除任何未交联的PEG溶液。在适用时，将修饰的Puramatrix添加到PEG内部的空隙中，并且为了诱导Puramatrix自组装，将1.5mL生长培养基引入到插入物的下方。除了不添加Puramatrix之外，如上文所述制备被称为不含Puramatrix的构建体，从而将DRG限制于胶原包被的PTFE膜的二维环境。将构建体在孵育箱中在37℃和5％CO2下维持7天，并且在第二天和第五天之后更换培养基。
制备构建体并且针对形态、活力、神经突生长、以及容纳程度将其可视化。如果没有神经突被可视化为在PEG空隙上或外部生长，那么认为所述样品具有被容纳的生长。这是在添加Puramatrix和没有添加Puramatrix的相同PEG构建体中进行的，并且针对上文所述的五个不同的PEG高度尝试了每一种条件的十二次试验。在不完全的PEG聚合或缺乏DRG贴壁的情况下，试验被否决。
标本制备和可视化：用测定(英杰公司)，按照制造商的说明书评价活标本的活力。对于在Puramatrix中的细胞悬浮液，在每一个水凝胶标本的三个不同区域中在整个凝胶深度上在多个焦平面处捕捉宽场荧光图像。然后通过对钙黄绿素AM(活标记)和乙锭同二聚体-1(死标记)进行计数(从而提供每种条件总共12个样品)针对细胞培养插入物和组织培养板这两者中的细胞活力来分析标准偏差投影。将用免疫组织化学评价的标本在4％多聚甲醛中固定约2小时。按照制造商的说明书，将细胞核用DAPI核酸染剂(分子探针公司(Molecular Probes))染色。使用针对神经元特异性βIII微管蛋白的小鼠单克隆[2G10]一抗和山羊抗小鼠lgG-H+L(CY2)二抗将神经突染色，并且使用针对MAP2的兔多克隆一抗和驴抗兔IgG Dylight 594二抗(马萨诸塞州剑桥的艾博抗公司(AbCam,Cambridge,MA))进行树突染色。将每一个步骤在含0.1％皂苷和2.0％BSA的PBS中进行过夜，继而在含0.1％皂苷的PBS中洗涤三次。用装备有荧光立方体的Nikon AZl 00立体变焦显微镜(纽约州梅尔维尔的尼康公司)采集明视野和常规的荧光图像，而使用Zeiss LSM 510Meta显微镜(德国上科亨的蔡司公司(Zeiss,Oberkocken,Germany))采集共聚焦图像。由共聚焦图像计算β-III标记的结构的平均深度以测量含有荧光的第一个焦平面与最后一个焦平面之间的距离(n＝7)。用Image J(马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(National Institutes ofHealth,Bethesda,MD))进行图像处理，并且使用V3D软件(弗吉尼亚州阿什本的霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute,Ashburn,VA))将共聚焦图像栈以3D可视化。
由手动阈值处理的共聚焦切片的像素计数来定量在凝胶深度上神经突生长的比例。将共聚焦切片以总深度的10％增量合并，并且将合并的切片的测量荧光与对于每一个z-栈所测量的总数相比较以得出在整个构建体深度上神经突生长的比例(n＝3)。使用VolumeJ插件来创建神经突生长的深度编码的z-栈投影。使用含有Puramatrix的构建体和不含Puramatrix的构建体这两者的3.0μm厚的切片(1024×1024×63)，经由可见的神经突生长的最大深度(186μm)采集共聚焦z-栈。使用具有光谱深度编码LUT的Z Code Stack功能来添加颜色，并且使用标准偏差z投影将栈合并。最后，将z-栈去斑以去除背景噪音。通过将标本冷冻在液氮浆中并且用Hitachi S4800场发射SEM(德国克雷费尔德的日立公司(Hitachi,Krefeld,Germany))和Gatan Alto 2500低温系统(宾夕法尼亚州沃伦代尔的Gatan公司(Gatan,Warrendale,PA))在3kV和-130℃下成像来进行低温扫描电子显微镜术(Cryo-SEM)。
背根神经节外植体的并入：所有动物处理和组织收集程序是在遵守由NIH(NIH出版号85-23Rev.1985)和杜兰大学(Tulane University)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)所制定的指南下进行的。如上文所述将神经外植体并入双重水凝胶构建体中。简单地说，将6孔胶原包被的PTFE细胞培养插入物在贴壁培养基中浸泡过夜，所述培养基由补充有青霉素/链霉素、神经生长因子(NGF)、10％胎牛血清(FBS)、以及L-谷氨酰胺(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司-英杰公司)的神经基础培养基组成。将从Long-Evans大鼠胚胎第15天幼仔(马萨诸塞州威尔明顿的查尔斯河公司)分离的四个背根神经节(DRG)放置在水化的细胞培养插入物上并且在贴壁培养基中在37℃和5％CO2下孵育约2小时以贴壁。然后将贴壁培养基用500μl于PBS中10％的PEG/0.5％的Irgacure 2959替换以进行构建体聚合。
使用可见光和倒置显微镜将用于PEG构建体的投影光掩模图案在贴壁的DRG周围对准。使用UV光将相同的光掩模投影55秒，如上文所述，并且将DRG有效地局限于聚合的PEG构建体内。将组织培养物在生物安全柜外部所耗费的时间保持在最低限度以有助于防止污染，并且将未交联的水凝胶溶液用含有1％青霉素/链霉素(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司-英杰公司)的PBS冲洗3次以去除未聚合的PEG溶液并且提高培养无菌度。将过量的PBS从PEG内部的图案化空隙中去除并且将Puramatrix小心地吸移到其余空间中。立即将各自具有活DRG外植体的含有双重水凝胶构建体的插入物放置在1.5ml生长培养基(补充有NGF、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、以及B27的神经基础培养基；加利福尼亚州卡尔斯巴德的Gibco公司-英杰公司)中以引发Puramatrix的自组装并且维持在37℃和5％CO2下，约每48小时更换一次培养基。在7天之后开始实验以容许神经突生长和神经元成熟。
免疫细胞化学：在37℃将用免疫组织化学评价的标本在4％多聚甲醛(宾夕法尼亚州哈特菲尔德的电子显微镜科技公司(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA))中固定约2小时。根据制造商的说明书(俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,OR))将细胞核用DAPI核酸染剂染色。将神经突使用小鼠单克隆[2G 10]神经元特异性β-III微管蛋白一抗(1:200)标记，继而用Cy3.5缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)二抗(1:100；马萨诸塞州剑桥的Abeam公司(Abeam,Cambridge,MA))荧光标记。将胶质细胞使用兔多克隆S 1 00特异性一抗(1:500，马萨诸塞州剑桥的Abeam公司)和Cy2缀合的山羊抗兔免疫球蛋白G(H+L)二抗(1:100，宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Westgrove,PA))染色。抗体标记步骤是在含有0.1％皂苷和2％牛血清白蛋白(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))的PBS中在4℃进行过夜，继而在室温在含有0.1％皂苷的PBS中进行三次10分钟洗涤。
对于针对髓磷脂染色的构建体，将神经突使用小鼠单克隆[2G 10]神经元特异性β-III微管蛋白一抗(1:200)标记，继而使用Cy2缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)二抗(1:500；马萨诸塞州剑桥的Abeam公司)荧光标记。根据制造商推荐的制备方法，使用FluoromyelinTM红色荧光髓磷脂染剂(俄勒冈州尤金的分子探针公司)将髓磷脂染色40分钟。
荧光显微镜术和图像处理：使用Nikon AZ100立体变焦显微镜，使用1×和2×物镜(纽约州梅尔维尔的尼康公司)采集明视野和常规的荧光图像，而使用Leica TCS SP2激光扫描显微镜和20×物镜(伊利诺伊州布法罗格罗夫的徕卡微系统公司(LeicaMicrosystems,Buffalo Grove,IL))拍摄共聚焦图像。经由在各自512×512的20个切片上成像的具有55μm-65μm范围的厚度的可见神经突生长的最大深度采集共聚焦z-栈。使用ImageJ(马萨诸塞州贝塞斯达的国立卫生研究院)进行图像处理。对于共聚焦z-栈中的颜色编码深度，使用用于lmageJ的MacBiophotonics插件包应用具有Rainbow LUI的Z CodeStack功能。获取z-栈的投影作为最大强度投影。V3D-Viewer软件(弗吉尼亚州阿什本的霍华德休斯医学研究所的珍利亚农场研究园区(Janelia Farm Research Campus,HowardHughes Medical Institute,Ashburn,VA))允许共聚焦z-栈图像的三维渲染和可视化。
透射电子显微镜术：使用透射电子显微镜术定性地评估神经培养物的形态、空间分布、以及纳米级特征。在体外7天之后，将构建体在37℃在4％多聚甲醛中固定约2小时，用PBS洗涤三次，持续10分钟，并且切片以暴露所关注的区域。在有限光环境中进行使用1％OsO4约1小时和使用2％乙酸双氧铀约30分钟的后固定，在之间进行三次10分钟PBS洗涤。将样品用乙醇(50％、70％、95％、以及2×100％，各自约30分钟)脱水，并且在1:1的环氧丙烷-spurr树脂中包埋约45分钟并且在100％spur树脂中包埋过夜(低粘度包埋试剂盒，宾夕法尼亚州哈特菲尔德的电子显微镜科技公司)。在70℃经过24小时进行标本的聚合。
使用Reichert Ultracut S超薄切片机(伊利诺伊州布法罗格罗夫的徕卡微系统公司)和超级45°钻石刀(宾夕法尼亚州华盛顿堡的Diatome公司(Diatome,FortWashington,PA))以从80nm到100nm变动的厚度将包埋的样品修剪和切片。将切片放置在具有200目的Formvar涂有碳的铜网上并且用2％乙酸双氧铀和0.1％柠檬酸铅(各自约20分钟)染色。将样品安装在单倾转台上并且用FEI Tecnai G2 F30 Twin透射电子显微镜(俄勒冈州希尔斯伯勒的FEI公司(FEI,Hillsboro,OR))使用200kV的加速器电压来检查。使用4000×4000像素分辨率以3,000×-20,000×放大倍率拍摄图像。用于样品制备的所有材料和试剂均是从电子显微镜科技公司(宾夕法尼亚州的哈特菲尔德)获得的。
场电位记录：在体外7天之后，将含有活DRG外植体的双重水凝胶构建体转移到保持在室温并且灌注有碳酸氢盐缓冲的人工脑脊髓液(ACSF)的界面室中，所述脑脊髓液由124mM的NaCl、5mM的KCl、26mM的NaHCO3、1.23mM的NaH2PO4、4mM的MgSO4、2mM的CaCl2、以及10mM的葡萄糖制成。将ACSF始终用95％O2、5％CO2鼓泡以维持一致的氧合和pH值。将构建体用1％溴酚蓝(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)染色以对比并且使用SMZ 745立体显微镜(纽约州梅尔维尔的尼康公司)可视化。使用P-97Flaming/Brown微量移液管拉制器(加利福尼亚州诺瓦托的萨特仪器公司(Sutter Instrument Co.,Novato,CA))将薄壁硼硅酸盐玻璃移液管(OD＝1.5，ID＝1.6；康涅狄格州哈姆登的华纳仪器公司(WarnerInstruments,Hamden,CT))拉制到约3MQ至约7MQ的电阻并且用ACSF回填。
如图8A中所示，将记录电极在每一个神经节附近放置在细胞体附近，并且在沿着神经突束远离神经节不同距离处用同心双极电极(CBARB75，缅因州鲍登的FHC公司(CBARB75,FHC,Bowdoin,ME))刺激构建体。将Axopatch-1C放大器(加利福尼亚州桑尼维尔的分子器件公司(Molecular Devices,Sunnyvale,CA))联合孤立脉冲刺激器(型号2100；华盛顿州塞基姆的A-M系统公司(A-M Systems,Sequim,WA))、PowerLab 26T数字化仪(科罗拉多州科罗拉多斯普林斯的AD仪器公司(AD Instruments,Colorado Springs,CO))、以及LabChart软件(科罗拉多州科罗拉多斯普林斯的AD仪器公司)用于记录、刺激以及数据采集。将记录以5kHz过滤，显示于Tektronix示波器上，并且使用Igor Pro(俄勒冈州波特兰的WaveMetrics公司(WaveMetrics,Portland,OR))中的定制书写例程进行离线分析。在适当时计算标准偏差。使用双尾配对t检验计算统计值，其中p值<0.05被认为具有显著性。所有值以作为平均值的标准误差(SEM)的误差报告。
使用20μM的DNQX(6,7-二硝基喹喔啉-2,3-二酮)和50μM的APV((2R)-氨基-5-膦酰基戊酸酯)鉴定和阻断突触活动。使用0.5μM河豚毒素(TTX)作为Na+通道活性的完全阻断。用于实验溶液中的所有药物和盐分别是从托克斯公司(Tocris)(明尼苏达州的明尼阿波利斯(Minneapolis,MN))和西格玛-奥德里奇公司(密苏里州的圣路易斯)获得的。
全细胞膜片钳记录：在体外7天之后，将构建体在室温转移到浸没型记录室中并且使其平衡20分钟。将碳酸氢盐缓冲的ACSF溶液(含有124mM的NaCl、5mM的KCl、26mM的NaHCO3、1.23mM的NaH2PO4、1.5mM的MgCl2、2mM的CaCl2、以及10mM的葡萄糖)始终用95％O2、5％CO2鼓泡以维持一致的氧合和pH值。对于电压钳记录，将硼硅酸盐玻璃移液管填充以铯取代的细胞内溶液，该溶液含有120mM的CsMeSO3、1mM的NaCl、0.1mM的CaCl2、2mM的ATP、0.3mM的GTP、10mM的HEPES、以及10mM的EGTA。对于电流钳记录，将移液管填充以葡萄糖酸钾基内部溶液，该溶液含有120mM的葡萄糖酸钾、10mM的KCl、10mM的Hepes、10mM的D-山梨糖醇、1mM的MgCl2×6H2O、1mM的NaCl、1mM的CaCl2、10mM的EGTA、2mM的ATP。移液管电阻在约4MQ至约7MQ的范围。串联进入电阻在约7MQ至约15MQ的范围，并且监测其一致性。对于诱发动作电位记录，将同心双极刺激电极(CBARC75，缅因州鲍登的FHC公司)放置在DRG的传入纤维中，并且在获得全细胞膜片之后，使用必要的最小刺激，通常<0.01mA来诱发动作电位。记录电极和刺激电极的放置示于以下图10A中。
用BX61WI Olympus立式显微镜(宾夕法尼亚州中心谷的奥林帕斯公司(Olympus,Center Valley,PA))通过活微分干涉相衬(DIC)成像将DRG可视化。用PC-505B膜片钳放大器(康涅狄格州哈恩登的华纳仪器公司(Warner Instruments,Harnden,CT))进行全细胞记录。将信号用PowerLab 26T数字化仪数字化并且用Lab Chart采集软件(科罗拉多州科罗拉多斯普林斯的AD仪器公司)收集。将信号放大，以20kHz采样，滤波到2kHz，并且使用IgorPro(俄勒冈州波特兰的WaveMetrics公司)中的定制书写例程进行分析。
大鼠神经节外植体和电生理学评估：在用上文所述的动态掩模投影光刻方法微图案化的双重水凝胶构建体中培养大鼠E-15背根神经节外植体。将神经构建体孵育1周或2周，并且神经突生长局限于填充有Puramatrix的狭窄管道，其被测量为具有约200μm的直径、约400μm的厚度、以及高达约2mm的长度。将构建体放置在灌注有碳酸氢盐缓冲的ACSF溶液的界面室上，并且用细胞外场电位电极评估电生理学。将记录电极在每一个神经节附近放置在细胞体附近，并且在沿着神经突束远离神经节不同距离处用双极电极刺激构建体。
B.结果
双重水凝胶中的神经突生长：通过将DRG外植体在具有递增厚度的构建体中培养来研究约束神经突生长所需的PEG厚度。在此测量容纳程度，这是因为它对于这一系统能够可靠地用作体外模型的能力是至关重要的。使用233μm厚的PEG经常出现部分聚合，从而产生不可用的构建体。此外，在整个聚合过程中，一些DRG从膜的表面脱离，从而导致低于预期的用于分析的试验数。对于含有Puramatrix的构建体，观察到神经突的容纳程度随着凝胶厚度增加而有不同的增加，如表1中所示。在233μm的厚度，没有构建体限制神经突的生长。368μm、433μm、481μm、以及543μm的后续高度的容纳率是：10％、22.2％、63.6％、以及87.5％。总体上，在缺乏Puramatrix的构建体中观察到更高的容纳百分比。在这两组中神经突似乎能够在某些厚度的倾斜PEG壁上生长，但是在不含Puramatrix的构建体中，除了534μm以外，在类似的高度存在更有效的容纳，并且与在含有Puramatrix的PEG中相比，更低的高度有更有效的容纳，如表1中所列。
表1：随水凝胶厚度而变化的神经突生长容纳程度
为了平衡空隙尺寸分辨率和图案保真度与神经突容纳程度，在具有481μm的平均PEG厚度的构建体(500μL溶液)中进行后续的神经突生长实验。在5天之后监测构建体的细胞活力证实有大量的活细胞，有非常小部分的死细胞位于DRG自身中，如图3A所示。在7天时固定和染色之后，神经突和迁移细胞受PEG水凝胶的几何形状约束，如通过用β-III微管蛋白和DAPI进行双重标记所表明，见于图(B)中。神经突生长始终是稳健的，并且所有标记的结构都集中在双重水凝胶的Puramatrix部分内部，如图1A-1E和图5A-5D所示。此外，MAP2抗体标记表明构建体中神经突生长的大部分似乎是树突状的，如在图3E中所看到的那样。生长似乎首先沿着两种凝胶之间的边界发生，如图3A中所示。然而，在沿着通道延伸的神经突之后，观察到生长充满PEG之间的内部空间中，也如图3A中所示。在Puramatrix的三维本体中前端神经突生长的图像显示了沿随机方向生长的倾向，如图3D所示。
与之形成鲜明对照的是，沿着细胞培养插入物的表面生长的神经突自身倾斜地取向，显然紧密地跟随插入物膜的纤维，如图3F中所示。观测到生长在分叉点处散开而没有明显的在方向上的偏好。观测到大量的分支和束化，这在生长的前沿处是特别明显的，如在图3D中所看到的那样。在约7天内，在整个通道的长度上观察到生长。与在没有Puramatrix的构建体中所看到的明显无效的有限生长相比，在填充有Puramatrix的构建体中观测到显著更多的生长，如图4B和4C所示。共聚焦成像确认了神经突生长在三个维度中发生，如图7A-7D中所示。在含有Puramatrix的构建体中β-III标记的结构的平均厚度是159.8μm±23.9μm的厚度，而在不含Puramatrix的构建体中的平均厚度是85.4μm±38.6μm，该差异被发现具有统计显著性并且由图11A所示，p<0.005。
图4D显示了缺乏Puramatrix的构建体中生长的实例，其中生长似乎是拥挤的并且神经突生长到54.0μm的最大高度。在没有Puramatrix的构建体中神经突的生长被可视化为沿着胶原包被的PTFE的膜生长，而没有生长发生在PEG本身中。或者，图4E显示了在双重水凝胶构建体中神经突的生长，其中观测到显著更少的神经突拥挤，并且单个神经突在多个焦平面中通过Puramatrix生长，从而达到120.0μm的最大高度。图11B还显示神经突生长没有被局限于Puramatrix的膜或顶部表面，这是因为在切片的底部和顶部10％中分别仅观察到总生长的7.3％±2.9％和4.9％±1.3％。不同于神经突，DAPI染色表明迁移细胞没有受到影响而迁移到Puramatrix中，从而保持局限于支持表面附近，如图4A所示，尽管先前的研究表明胶质细胞迁移和神经突生长常常在一起发生。
三维神经培养物的空间和形态特征：本公开公开了一种体外三维神经培养物，所述培养物近似于天然传入外周神经组织的细胞尺度和宏观尺度构造。所述三维神经构建体由在细胞培养插入物的表面上培养的DRG组织外植体组成，所述外植体由容许在填充有Puramatrix的图案化空隙内生长的PEG构建体所容纳。引导神经突沿着x轴从神经节生长的狭窄管道被测量为具有约490μm的直径、高达约400μm的厚度、以及约3mm的长度。在体外7天之后含有DRG神经元、神经胶质、以及神经突生长的三维双重水凝胶构建体示于图12A-12D中。
神经突和支持胶质细胞有效地由PEG水凝胶的几何形状所约束。用抗β-III微管蛋白、抗S100、以及DAPI进行的同时标记确认了在体外7天之后的生长始终是稳健的并且所有标记的结构均处于构建体的Puramatrix部分内，如图5A和5B中所示。包括胶质细胞在内的支持细胞的存在和迁移跨越通道长度的高达四分之三，如从直通道的起点所测量，距离神经节接近1.875mm，如图5C和5D中所示。
在整个Puramatrix深度上前端神经突生长随机地发生在通道内，在多个焦平面处存在大量的分支和束化，如图6A-6C中所示。相反，缺乏Puramatrix的通道中的生长似乎是有限的并且沿着膜表面处插入物的纤维排列。图像中的抗体标记表明沿着通道边缘的更密集的神经突生长，如图12D所示。与表明髓磷脂在体外14天之后开始形成的文献相一致，在体外7天时在用FluoromyelinTM红色荧光髓磷脂染剂(俄勒冈州尤金的分子探针公司)染色之后，三维神经培养物没有显示髓磷脂的存在，如图12E和F所示。共聚焦成像确认了β-III微管蛋白阳性神经突在通道的起点、中间、以及末端处在三个维度上存在，如先前所证实的那样。DAPI染色的核和S100阳性胶质细胞在整个z-栈中存在，如图6A-6C所示。
使用在包埋生物样品上进行透射电子显微镜术(TEM)的样品制备方案的技术，对神经构建体尝试了后固定程序的几次重复，之后获得具有可辨别的结构的TEM图像。对染色方案的另外的改动可以提供具有更高分辨率的结构以用于更清晰的可视化。来自TEM的横截面图像支持了由荧光显微镜术所显示的证据。在神经节内和神经束中所采集的切片显示高密度的平行的、高度束化的无髓鞘的神经突，如在图7A和7B中所看到的那样；施旺细胞的存在，如在图7D中所看到的那样；以及施旺细胞开始封装神经突，如在图7C中所看到的那样。
三维构建体中神经元的电生理学特性：为了测试三维神经培养物的功能特性并且确定它是否用作传入外周神经组织的生理活性和相关模型，在体外7天之后进行细胞内和细胞外电生理学实验。使用改编自急性啮齿类动物脑切片中的传统场电位记录的技术，在允许使用定制的装备以进行细胞外记录的界面室上研究这些构建体。对于每一个实验，将记录电极放置在构建体的神经节或细胞体区域中并且将刺激电极在通道中沿着神经突束插入，如图8A中所示。在刺激后，复合动作电位(CAP)以逆行方式传播到细胞体区域中并且被记录为每一个构建体的神经节中的所得细胞外电位变化(n＝19)。所述三维神经构建体支持了持续超过一小时的场记录并且在刺激时始终显示一致的群体峰电位。群体响应或CAP的示例迹线示于图8B中。类似于从完整神经记录的复合动作电位，响应一致地表现出到起始相短的潜伏期，继而是具有分级性质的单个连贯事件，代表了募集的轴突和相应细胞上每一个动作电位的总和效应。所述响应的一致的短包络和起始相延迟时间也是CAP的特征并且表明了单纯由动作电位驱动的快速事件。如同神经刺激一样，在更高的刺激强度下更多的纤维被募集，从而产生更强的响应直到最大激发发生为止。
在记录电极与刺激电极之间的距离增大时，响应的起始相延迟时间也延长，如图8C和8D中所示，这确认了几何限制的神经培养物能够沿着它的神经样神经束以不同距离传导信号的能力。平均来说，在近端或在如从直通道的起点所测量的距离神经节区域1.5mm内刺激时，响应显示0.82ms的起始相延迟时间。然而，当将刺激电极移动到距离神经节2.25mm时，远端刺激产生具有2.88ms的平均值的起始相延迟时间，与在近端刺激中所观测到的那些相比，这具有统计显著性，p<0.05[p＝0.02，图8D]。如在荧光显微镜术中所看到以及图6A-6C和图12A和12B中所示的那样，体外生长7天没有使得神经突完全充满通道；在远端刺激中表现出振幅有29.46％的降低。此外，通过抑制Na+通道活性，在刺激时不能再产生动作电位。在引入0.5μM TTX的2分钟内，来自构建体的响应可以被完全消除，这确认了响应的来源和生物性质。在TTX洗入之前的响应和之后的响应具有统计显著性，p＝0.029，n＝3，如图8E和F中所示。
为了研究所述响应是否是突触性质，分别以20μM和50μM引入谷氨酸受体抑制剂DNQX和APV以阻断兴奋性突触传递。实验持续了35分钟，每一分钟获取记录一次，并且时间点被称为t1-t35以供简单参考。药物洗入在进入实验5分钟时(t6)进行，并且在20分钟后或在进入实验25分钟时(在t26时)洗脱。将在药物洗入之前(t1-t5)的响应与在进入药物洗入阶段10分钟(t16-t20)记录的响应相比较，从而允许药物有充足的时间灌注和起作用。在药物洗入之前和之后在响应振幅或持续时间方面没有观测到统计显著性差异，如图9A-9C中所示，这表明没有响应的突触组分被阻断。
还诱导了高频脉冲序列以评估响应的特征。当将20个脉冲以50Hz施加到培养物时，群体峰电位维持一致的起始相延迟时间、包络、以及振幅，这表明能够反复发放而没有由突触输入所引起的压抑或促进的强响应。在高频刺激之前和之后响应振幅和半峰持续时间没有统计显著性，如图9D-9F所示。
还使用细胞内记录，从而使得全细胞膜片钳能够进入三维神经构建体内部，持续超过1小时。来自急性啮齿类动物脑切片中的全细胞膜片钳位的修改的技术允许电压钳和电流钳记录。Puramatrix凝胶比天然脑组织更具粘性并且密集的DRG外植体含有结缔组织。如同场记录一样，这些特征使得电极的移动、更换、以及持续使用变得困难。与脑切片神经纤维网中通常由具有不同衍射指数的特征包围的更稀疏分布的细胞相比，DRG内的细胞是分布密集的，具有更小的对比度，并且更难以可视化。经由在多个焦平面中的反复可视化、通过凝胶时的正压、以及倾斜的电极接近角，成功的全细胞膜片钳记录是可能的，如图10A-10F中所示。
将双极刺激电极放置在通道内的神经突束中并且在构建体的细胞体区域中从细胞获取记录，如图10A和10B中所示。细胞支持从通道中的神经突延伸结构驱动的电诱发动作电位，如图10C所示。作为缺乏突触输入的响应的特征，细胞内响应具有快速的上升时间，平均为2ms的基线到峰时间，具有明显的非分级的起始相，如图10D中所示。在响应的起始相之前没有导致阈值的电位上升，如在图10D中所看到的那样，在响应之后也不存在任何更小的分级事件，如在图10C中所看到的那样，从而没有获得突触输入的证据。此外，如果突触活动促成响应的起始相，那么引发动作电位的阈值将更难以在超极化下达到。然而，在从静息膜电位(RMP)超极化到-100mV(平均来说是RMP的1/1.95)时细胞仍能够支持动作电位，并且显示的响应与在RMP时没有不同。此外，在电压钳或电流钳下的基线记录中没有观测到由突触激活所引起的自发活动，如图10E和10F中所示。
实施例2：在水凝胶构建体中在施旺细胞存在下神经组织的生长以及髓鞘形成和脱髓鞘的评估(非假想)
外周神经系统(PNS)中成功的轴突再生取决于适当地使神经元生长靶向所选择的位置以及形成用于信号传播的功能性突触。PNS原生的施旺细胞(SC)在这一过程中起主要作用。SC将发育中的轴突包裹在髓磷脂中并且产生细胞外基质(ECM)组分、细胞粘附分子、以及神经营养因子。这些事件依赖于来自局部微环境的复杂的信号网络，包括SC到神经元、SC到SC、以及SC到ECM的通信。含有SC/神经元共培养物的实验提供了对这些过程的深入了解，从而产生了用于神经系统疾病的新临床方法。
先前已经将原代神经元和SC共培养在二维系统和三维系统中以研究涉及SC/神经元结合的机制。已经证实的是，SC在将发育中的轴突朝向它们所期望的目标定向方面起重要的作用，从而在这些模型中产生功能性重新神经支配，不论维数如何。然而，涉及SC/神经元结合的许多特性，如形态和基因表达受到系统构造的显著影响。三维系统提供了神经元微环境的结构和功能的更准确的表示以及对细胞-细胞和细胞-ECM机制的更好的了解。已经证实的是，与三维模型相比，静息电位、动作电位传播以及电压门控通道的功能在二维模型中是显著不同的。尽管利用三维仿生神经系统微环境的重要性已经被证实，但是很少有研究探究了在共培养物中的SC/神经元相互作用以及它们对髓磷脂形成的影响。
在此，使用与简单显微镜物镜相结合的数字微镜器件(DMD)，利用上文所述的简易和快速的技术以将所期望的三维水凝胶光图案化。DMD能够进行结构和分子三维微图案化。这一体外模型提供了模拟ECM的支持和三维构造的环境，具有能够将固定的或可溶性的化学生物分子、机械线索、以及药物独立地引入以评价每一种对神经元行为的作用的能力。这一系统提供了平台以在一个标本中三维共培养不同的细胞类型以在更仿生的环境中对它们进行研究。使用这种方法将官能化的葡聚糖光微图案化并且将DRG和SC在更接近它们的天然环境的条件下封装在三维共培养系统中并且研究引起髓磷脂形成的因素。
A.材料和方法
双重水凝胶系统的制造：使用数字投影光刻制造双重水凝胶培养系统，如上文所述。所述工艺的示意图见于图13中。简单地说，利用光刻装置照射具有0.4μm孔径的渗透性细胞培养插入物中所容纳的可光致固化的水凝胶溶液，所述光刻装置包括准直UV光源(具有320nm-500nm滤光器的OmniCure 1000，加拿大魁北克的EXFO公司)和可见光源(具有375nm-650nm滤光器的SOLA光引擎，美国俄勒冈州的Lumencor公司(Lumencor,OR,USA))、作为动态光掩模的数字微镜器件(DMD)(DiscoveryTM 3000，德克萨斯州达拉斯的德克萨斯仪器公司)以及2×Plan Fluor物镜(日本东京的尼康仪器公司)。所述插入物是胶原包被的PTFE渗透性支持物或TranswellTM透明聚酯膜插入物(美国纽约州科宁的康宁公司)以研究胶原化的基质对SC/神经元结合的影响。双重水凝胶系统由两个隔室组成：容纳神经元的细胞容许性部分和用作水凝胶模具的细胞限制性部分。为了制备细胞限制性部分，将10％(w/v)PEG-二丙烯酸酯(Mn 1000；宾夕法尼亚州沃灵顿的Polysciences公司)和0.5％(w/v)Irgacure 2959于PBS中的溶液用如通过辐射计(306UV功率计，加利福尼亚州圣荷西的Optical Associates公司(Optical Associates,San Jose,CA))所测量的85mW/cm2的UV光照射38秒以产生PEG微型模具，如图13中所示。在添加凝胶溶液之前将细胞培养插入物用经过过滤的原始玻璃处理(Original Glass Treatment)(德克萨斯州休斯敦的RainX公司(RainX,Houston,TX))处理以避免弯液面行为。将0.5ml的溶液添加到每一个6孔板插入物中。添加0.5ml的溶液产生480μm的凝胶厚度。将水凝胶构建体在含有1％抗生素-抗霉菌添加剂的DPBS中洗涤以抑制污染。
葡聚糖合成和凝胶组合物的表征：基于公开的方案将葡聚糖(MW＝70kDa)由甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)接枝。最初，称取1g葡聚糖并且在氮气下添加到9ml二甲亚砜(DMSO)中。将0.2g的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶解在1ml DMSO中。随后，在氮气下将DMAP溶液逐滴添加到葡聚糖溶液中，继而添加232μL的GMA。将最终溶液在室温搅拌48小时。为了在48小时之后淬灭反应，将280μL的37％盐酸(HCl)添加到溶液中，并且将所得产物相对于去离子水透析约三天并且冻干约两天。所得产物是甲基丙烯酸缩水甘油酯-葡聚糖(MeDex)，并且使用1H NMR确认甲基丙烯酸酯基向葡聚糖中的添加[(D2O)δ6.1-5.7(m,2H,CH2),δ5.2(m,1H,CH),δ4.9(m,1H,CH),δ1.9(s,3H,CH3)]，其中取代度是42％。制备50％(w/v)的MeDex、MeDex的0.1％(w/w)的Arg、MeDex的0.001％(w/w)的RF、最终溶液的0.2％(v/v)的TEMED的凝胶组合物。
双重水凝胶系统中的原代组织培养：作为共培养的第一个步骤，进行原代组织培养。在组织培养之前制备PEG构建体并且将其浸泡在贴壁培养基中并且孵育(37℃、5％CO2)过夜。贴壁培养基包含补充有B27(2％v/v)、L-谷氨酰胺(0.25％v/v)、神经生长因子(NGF)(0.02μg/ml)、胎牛血清(FBS)(10％v/v)以及青霉素/链霉素(1％v/v)的神经基础培养基(所有均来自加利福尼亚州的生命科技公司(Life Technologies,CA))。然后遵照机构动物护理和使用委员会的指南，将构建体与Long Evans大鼠胚胎背根神经节(DRG)组织一起培养。从胚胎第15天大鼠胚胎中分离DRG并且在培养之前进行修剪。将单个DRG外植体放置在每一个构建体中。然后将DRG在新鲜的贴壁培养基中孵育过夜以使组织贴壁到插入物。
施旺细胞培养：购买从新生大鼠坐骨神经中分离的SC细胞系(加利福尼亚州的ScienCell研究实验室公司(ScienCell Research Laboratories,CA))。将具有>5×105个细胞/毫升的冷冻保存的小瓶在37℃水浴中解冻。然后将小瓶的内容物轻轻地重悬并且分配到平衡的聚L-赖氨酸包被的培养容器中以促进细胞附着，接种密度是2:10,000个细胞/平方厘米。之后使培养物不受干扰至少16小时。为了去除残余的DMSO和未附着的细胞，最初在24小时之后更换培养基并且之后每隔一天更换一次培养基。培养基由含有FBS(5％v/v)、青霉素/链霉素(1％v/v)以及SC培养基补充剂(1％v/v)的SC培养基(所有均来自加利福尼亚州的ScienCell研究实验室公司)构成。每当培养物达到90％汇合度时，将它进行传代，并且在第三次传代之后不被使用。
在双重水凝胶系统中SC的封装和结合：将SC分散于如上文所述的SC培养基中的50％MeDex溶液中以达到20×106个细胞/毫升的细胞计数。为了实现均匀分布的单细胞溶液，将凝胶混合物上下剧烈吹吸。轻轻地将贴壁培养基从通道中吸出以避免干扰贴壁的DRG并且将2μL的MeDex单细胞溶液添加到每一个PEG微型模具中。将负像光掩模装载到DMD上，并且在使用可见光源(具有375nm-650nm滤光器的SOLA光引擎，美国俄勒冈州的Lumencor公司)照射30秒之后，用如通过辐射计(306UV功率计，加利福尼亚州圣荷西的OpticalAssociates公司)所测量的85mW/cm2的可见光使通道中的凝胶溶液交联。使用上文所述的洗涤缓冲液将构建体轻轻地洗涤三次。
用于在三维水凝胶系统中进行DRG/SC共培养的培养基方案：为了了解在三维共培养物中各种培养基方案对DRG和SC的行为的影响，应用两种不同的培养系统。所述培养系统描述于表2中。培养系统1具有两个阶段，其中将培养基1(10天)和培养基2(15天)按照这个顺序施用。这一培养基方案先前已经被用于促进生长和神经突延伸以及促进DRG本体的内源性SC并入髓鞘形成过程中。培养系统2仅施用培养基2，所述培养基2专门用于诱导髓磷脂。对于每一个实验组中的每一个标本，每隔一天更换一次培养基。
表2：培养基系统
免疫组织化学：为了评价神经突生长和髓磷脂形成，利用免疫组织化学技术。最初，将组织在37℃用4％多聚甲醛(PFA)固定2小时，继而在进行每一个染色程序之前进行三个洗涤步骤。除非另外说明，否则所有试剂均是由马萨诸塞州剑桥的艾博抗公司提供的。
将神经突用小鼠单克隆[2G10]神经元特异性β-III微管蛋白一抗和Cy3.5缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)二抗(马萨诸塞州剑桥的艾博抗公司)标记。标记步骤是在4℃在于PBS中2％的牛血清白蛋白(BSA)和0.1％的皂苷中过夜完成的，并且在每一个步骤之后用PBS进行三个洗涤步骤。
为了评估髓磷脂形成，将构建体针对三种髓磷脂蛋白质进行标记：髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白零(Protein Zero，PO)以及髓磷脂相关糖蛋白(MAG)。利用一抗鸡多克隆抗髓磷脂碱性蛋白、小鼠单克隆抗髓磷脂相关糖蛋白以及兔多克隆抗髓磷脂蛋白零抗体。将染剂在2％BSA/PBS溶液中以1:500的浓度稀释。将构建体在室温在5％山羊血清中浸泡30分钟以避免任何非特异性蛋白结合。将构建体在4℃在一抗溶液中储存过夜并且用PBS洗涤三次。在三次洗涤循环之后，将水凝胶系统在二抗溶液中在4℃孵育。如下制备二抗溶液：1:500抗体于2％BSA溶液中的溶液，分别是山羊抗鸡IgY H+L、山羊抗小鼠IgG H+L以及山羊抗兔IgG H+L。
图像处理、神经突生长、以及髓磷脂形成：利用共聚焦显微镜(日本东京的尼康AI公司)测量三维水凝胶中生长的体积。由于在模型中缠结和密集的神经突生长，因此在单个神经元沿着长度延伸时，难以对单个神经元的数目进行计数。因此，为了测量在三个维度中系统的生长，最佳的是获取双重水凝胶培养系统中细胞物质的体积。将每一个样品在三个维度中成像，其中光学切片不大于11μm的深度，每个样品有平均20个切片，分辨率是1024×1024像素并且使用10×物镜。均匀地跨越所有图像应用包括阈值处理和转换成二进制表示的预处理步骤。使用ImageJ和Matlab(马萨诸塞州纳蒂克的Mathworks公司(Mathworks,Natick,MA))中的定制算法进行数据分析。使用在整个凝胶深度上阈值切片的像素计数来定量神经突生长。在25天之后，髓磷脂是密集的和缠结的，并且利用相同的图像处理程序来评价在整个深度上髓磷脂的体积。这一过程允许在考虑培养物的三维性质的情况下测量在整个深度上的体积。由于构建体的尺寸太大而无法一次性成像，因此对于上述两个成像过程，采用大图像z-栈(1×5)。对于论证照片，将样品在三个维度中成像，其中光学切片在深度上不大于11μm，每个样品有平均20个切片，分辨率是1024×1024像素，并且使用20×物镜。使用最大投影采集来形成总生长的二维图像。对于生长的体积，利用相同的程序并且使用三维体积采集来确认生长和髓鞘形成发生在整个深度上。
透射电子显微镜术：利用TEM来研究水凝胶培养物中神经元突起、SC的纳米级结构以及它们的空间串扰、分布、以及形态。除非另有说明，否则用于这一程序的所有试剂均是由宾夕法尼亚州哈特菲尔德的电子显微镜科技公司提供的。将水凝胶构建体在37℃在4％PFA溶液中浸泡约两小时之后固定。然后将样品用PBS以15分钟的时间间隔洗涤三次。后固定步骤包括用于100mM磷酸乙酯中的1％四氧化锇(OsO4)染色约2小时，继而用PBS进行四个洗涤步骤。然后在室温在暗处将组织用2％乙酸双氧铀水溶液染色约30分钟。在所述程序之后进行脱水步骤，包括将样品在50％和70％乙醇中浸渍，各自持续10分钟，然后在95％乙醇中浸渍过夜。然后将样品在用分子筛(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)过滤的100％乙醇中浸泡两个30分钟的时间间隔。切割构建体以仅维持所关注的区域，继而进行树脂包埋。使用1:1环氧丙烷-spurr树脂进行浸片步骤，持续45分钟。然后将样品在70℃在100％spur树脂中包埋约48小时以允许树脂聚合完成。
使用Reichert Ultracut S超薄切片机(伊利诺伊州布法罗格罗夫的徕卡微系统公司)和超级45°钻石刀(宾夕法尼亚州华盛顿堡的Diatome公司)以从80nm到100nm变动的厚度将包埋的样品修剪和切片。将切片装载在铜网(Formvar涂有碳，200目)上，并且使所述载网在2％乙酸双氧铀的液滴上漂浮约20分钟并且通过以1分钟的时间间隔在去离子水液滴上漂浮三次来冲洗。在将所述载网安装在单倾转台上之后，使用FEI Tecnai G2 F30Twin透射电子显微镜(俄勒冈州希尔斯伯勒的FEI公司)以100kV-200kV的加速器电压将它们成像。在3,000×-20,000×放大倍率下以4000×4000像素分辨率拍摄图像。
B.结果
三维双重水凝胶系统和DRG/SC共培养：本公开提供了一种三维模型来研究双重水凝胶平台用于共培养应用的用途；以及一种使用DMD作为动态光刻工具的三维水凝胶系统。利用这一模型，研究机械刺激和化学线索(包括排斥的和有吸引力的生物分子)对体外神经元生长的影响。这一模型模拟了ECM的三维结构并且更准确地体现了神经元微环境。评价了这一系统在单一培养物中处理两种细胞类型以及研究细胞行为的能力。将SC和神经元共培养以在更接近它们的天然环境的条件下研究髓鞘形成过程。这一模型允许髓磷脂形成作为在三个维度中SC-神经元共培养的结果。用于双重水凝胶系统的方法描绘于图13中。
胶原对三维共培养物中神经突生长的影响：展示了在具有或没有胶原包被层的渗透性插入物中形成的水凝胶内三维培养物的形成。这两种培养物中的生长均是稳健的、束化的、以及对齐的。这一特征将这种系统与先前开发的体外模型区分开来，这是因为生长在通道内被定向。尽管生长在25天之后是高度密集的，但是它主要被容纳在三维水凝胶系统的细胞容许性部分中。β-III微管蛋白阳性神经元丝描绘于图17A、图18A、以及图19A中。与在不存在胶原的情况下的培养物相比，在胶原存在下培养物中神经元生长的体积显著更高(n＝15个-18个构建体)。在两种培养基方案之间，生长的量基本上没有不同。
双重水凝胶系统中三维共培养模型中髓磷脂的发育：目前公开的共培养系统促进三个维度中髓磷脂的形成。利用免疫组织化学和TEM以证实髓磷脂的形成。将培养物用三种抗体染色：MBP、MAG以及PO。所述构建体呈MAG、MBlP以及PO阳性，这确认了致密和非致密髓磷脂的形成。图17B和图18B这两者示出了针对β-III微管蛋白染色的神经丝和合并图像，所述图像确认了MBP和PO段沿着轴突延伸结构的形成；图17B示出了MBP阳性成熟髓鞘；并且图18B示出了PO阳性成熟髓鞘。
如上文所述，经由z-栈采集拍摄所有图像。共聚焦成像确认了神经突生长在三个维度上发生在整个通道中。这些构建体的生长和髓鞘形成的深度是88μm±15μm。TEM图像确认了髓磷脂形成，如在图20A-20F中所看到的那样。在神经束中采集的切片示出了高密度的平行的高度束化的和有髓鞘的神经突、施旺细胞的存在、以及施旺细胞对神经突的封装。在TEM图像中一致地鉴定出髓磷脂段，从而确认了致密髓磷脂形成。这些发现证实了这一三维体外模型使得SC能够在神经突周围形成成熟的髓磷脂层。
抗坏血酸(AA)对髓磷脂在三个维度中的形成的作用：将两种培养基方案用于培养。对于NCol-25和Col-25，25天的含有AA的培养基使得髓磷脂的量显著增加。髓磷脂的量证实了培养物形成髓鞘的能力，不论神经元生长的量如何。测量髓磷脂与神经元生长的比率，证实了在更长时间暴露于AA的情况下，构建体中髓磷脂的百分比增加。这经由针对MBP、MAG、以及PO的三种免疫组织化学抗体染剂所确认，从而证实了这对于致密髓磷脂和非致密髓磷脂这两者来说都是准确的。
胶原对髓磷脂发育的影响：在所述系统中评价胶原I和胶原III对致密和非致密髓磷脂发育的影响。髓磷脂蛋白质遵循类似的趋势，如图17A-17C、图18A-18C以及图19A-19C中所示。胶原的添加增加了系统中髓磷脂形成的量。Col-15和NCol-25的髓磷脂与神经突生长的比率是相似的。这证实了与NCol-25相比Col-15中髓磷脂量的增加是因为神经元生长的量增加。这两种系统在使髓磷脂发育方面的效率取决于AA暴露。图16A和16B示出了胶原显著增加了神经元生长。NCol-15显示在不存在胶原的情况下以及在更短时间暴露于AA的情况下，形成最少的髓磷脂。
C.讨论
髓鞘是围绕轴突并且降低神经系统电容的具有多层螺旋结构的特化细胞膜。有良好髓鞘的神经由髓鞘完全包围，除了被称为郎飞氏结(nodes of Ranvier)的暴露于细胞外环境的小的周期性间隙之外。髓磷脂以两种形式存在：致密和非致密。致密髓磷脂超微结构由螺旋状细胞鞘组成，所述细胞鞘缺乏细胞质以及细胞外间隙，但是含有两个质膜。非致密髓磷脂是髓磷脂的通道样段并且是非凝聚的并且由施-兰切迹(Schmidt-Lantermanincisure)、髓磷脂层中的周期性中断以及结侧区构成。
致密髓磷脂和非致密髓磷脂各自含有各种蛋白质，如髓磷脂碱性蛋白(MBP)，所述髓磷脂碱性蛋白是CNS和PNS致密髓磷脂的必要组分。MBP位于髓鞘的细胞质表面上并且带有大量电荷。PNS中的另一种至关重要的髓磷脂蛋白质是PO，它是一种跨膜糖蛋白，影响细胞粘附，维持PNS致密髓磷脂的主要密集线，并且在将致密髓磷脂之间的间距保持一致中起重要作用。非致密髓磷脂的主要组分之一是髓磷脂相关糖蛋白(MAG)，它不存在于髓磷脂的外层上，但是存在于内层中。它与轴突接触，从而使它连接到致密髓磷脂。这三种蛋白质对于髓磷脂形成和维持来说是必要的并且已经广泛地用于检测培养物中的髓磷脂。
源自于原代组织来源或细胞系的SC和神经元的共培养系统可以准确地描绘天然PNS的事件和复杂髓磷脂构造。PC 12细胞系和SC先前已经被使用以建立运动神经元/SC共培养模型来研究运动神经元疾病。感觉神经元和SC的体外模型先前被用于了解髓鞘形成背后的机制。许多先前的研究使用DRG，这是因为它们被深入研究并且被认为是使用神经元/SC共培养物的发育来评价PNS中的髓鞘形成过程的强有力的体外模型。
这些先前的体外共培养模型主要是在二维细胞培养物和三维组织切片中进行的。很少有研究在三维培养物中探究神经元/SC共培养物的结合以及它们对髓磷脂形成的影响。
为了设计三维仿生聚合物模型以研究神经元/SC共培养物中的髓鞘形成，利用光微图案化配置。光图案化已经被用于研究神经系统，这是因为它允许适当地三维地体现仿生神经元微环境。这一研究中所用的动态掩模投影光刻装置提供了一种容易的制造技术来产生微图案化的水凝胶。这些水凝胶是在渗透性细胞培养插入物上形成的，所述插入物提供了用于神经再生实验的基底。
为了产生这些构建体，利用DMD器件形成动态光掩模。将这一掩模与被照射的PEG溶液一起使用以形成模具，DRG最初附着到所述模具中，之后添加可光致固化的单细胞MeDex溶液。利用负像动态光掩模在三个维度中封装SC并且将它们与DRG结合。利用具有短(30秒)暴露时间长度的可见光对于水凝胶形成和细胞封装来说是最实用的以降低细胞毒性，并且将这些程序用于这一设计。这一模型提供了一种长期(25天)体外平台，该平台确保了在三维环境中神经元的存活、它们的伸长、以及它们的髓鞘形成。
这些模型使用了两种不同的细胞培养基，如表2中所述。培养基1由已经被良好表征并且已知支持DRG和SC生长的因子构成。这种培养基含有BSA，它已经被证实支持SC的迁移。然而，这一系统不是专门用于促进髓磷脂形成。培养基2含有FBS连同抗坏血酸，它已经被证实促进二维培养物中的髓鞘形成。先前在神经元存在下对SC的研究证实它们能够在体外形成具有基底层和胶原纤维的完整ECM。SC/DRG共培养已经证实抗坏血酸可以促进SC产生髓磷脂，这是通过使它们能够形成基底层而实现的。培养基2还含有ITS(胰岛素、转铁蛋白以及硒)，它已经被证实促进大鼠细胞系中的髓鞘形成。
在每一个实验组中使用了层粘连蛋白，这是因为它已经在神经元/SC共培养物中被证实是为髓鞘形成所必需的。在体内，已经证实不存在层粘连蛋白会导致小鼠和人类的外周神经病变。缺乏层粘连蛋白的突变小鼠将有神经内膜基底层的破坏，这随后降低了神经传导速度。
目前公开的系统还经由使用胶原包被的基质研究了在这一三维模型中胶原的存在对神经元生长的作用。利用I型胶原和III型胶原进行这些研究。III型胶原结合并且激活施旺细胞上的粘附g-蛋白偶联受体Gpr56，这可以引起Gpr125的激活以引发髓鞘形成。I型胶原和III型胶原是神经外膜的关键组分，所述神经外膜是支持和围绕外周神经和髓磷脂的密集组织的最外层。
为了研究神经元细胞在三维模型中形成髓磷脂的能力，评价了两种不同的培养基的影响和胶原的影响。所述四种培养系统是通过胶原的存在和共培养物所暴露的培养基方案来区分的。利用两种培养基方案。一种方案包括培养基1，持续10天，然后是培养基2，持续15天(培养系统1)；在第二种方案中，仅使细胞暴露于培养基2，持续25天(培养系统2)。表3描述了组。为了确定髓鞘形成是否受外源性SC的影响，在没有将封装的SC添加到双重水凝胶系统中的情况下进行上述实验，而保持所有其它变量恒定。
表3：培养组
培养物名称 I型胶原和III型胶原 培养基方案
NCol-15 否 培养基1(10天)；培养基2(15天)
NCol-25 否 培养基2(25天)
Col-15 是 培养基1(10天)；培养基2(15天)
Col-25 是 培养基2(25天)
使用免疫组织化学和共聚焦成像确认髓磷脂的形成并且通过TEM进一步验证。20×放大倍率的二维图像显示MBP/β-III微管蛋白阳性培养物中包裹在神经元突出物周围的髓磷脂段的形成，如图15中所示。由于致密髓磷脂和非致密髓磷脂的形成而针对MBP和MAG这两者染色的髓磷脂的三维发育描绘于图16A和16B中。TEM图像还确认了在所有实验组中成熟髓磷脂层的出现和丰度，如图20A-20D中所示。髓磷脂层的放大图像描绘于图20F中。图20E示出了在培养25天之后，SC已经在许多神经突周围形成髓鞘，并且一些SC已经开始将细胞质层裹在神经纤维周围。这一图像证实髓磷脂的量是显著的并且所述培养物可以被用于长期研究，包括持久的三维药物评价。图20A-20F还示出了培养物中高密度的对齐的、高度束化的神经元。
所进行的第一组分析定量了在三个维度中四种培养系统中的每一种中神经元生长的量，如图14所述。公认的是，胶原和它们的受体促进神经突生长。在此所呈现的数据证实了在其中存在胶原的两种系统中有显著更多的神经元生长。然而，没有由于所利用的培养基方案而对生长造成显著影响，这证实它对在所含系统中在25天之后神经突延伸的量几乎没有影响。
通过两种不同的方法测量髓磷脂的量。第一种方法是将髓鞘形成视为独立变量并且仔细检查髓鞘形成的总量，不论系统中神经元发育的量如何。第二种方法是计算髓磷脂与神经突延伸的比率并且将髓磷脂发育的量归一化。这提供了对髓鞘形成效率的了解并且描述了周围包裹有髓鞘的神经元突出物的百分比。利用MBP、MAG以及PO的染剂以研究由四个实验组产生的髓磷脂的量。
图17C描述了培养系统中形成的髓磷脂的百分比。利用MBP抗体获得这些数据。虽然所有四个样品在培养25天之后均呈MBP阳性，但是在各组之间存在显著性差异。MBP是存在于致密髓磷脂中的蛋白质，并且它在培养物中的表达验证了成熟髓鞘的致密膜段的形成。当AA暴露增加时，在这些系统中发生增加的髓鞘形成。这些结果是在比典型的二维培养物或组织切片更准确模拟神经系统的环境的三维体外模型中实现的。数据表明当暴露于髓鞘形成培养基25天时，在这些系统中髓磷脂与神经元生长的比率显著增加。当在胶原存在下将培养持续相同的暴露时间长度时，培养基方案引起髓鞘形成增加。
基于这些数据，以下两种因素在这些培养物中起作用：胶原的存在和更长时间的AA暴露。缺乏这两种因素的构建体(NCol-15)有最少的髓鞘形成。培养物的髓磷脂相对于神经元生长的百分比证实相同的AA暴露具有相似的作用，不论已经产生的神经元的数目如何。然而，图17B示出了当这两种因素均存在于实验中(Col-25)时，观测到协同响应，从而使得髓磷脂量值显著增加。包括z-栈平面的最大投影以支持这些数据。
为了确认外源性SC显著改变髓鞘形成，利用了没有另外的SC的对照组。图17C中的数据显示每一个实验组相比于它的相应对照组具有髓鞘形成的显著增加，这证实外源性SC对系统有很大的影响。所述结果显示胶原显著地增加了对照组中的髓鞘形成，但是AA暴露持续时间有较小的影响。
使用PO蛋白质抗体在三维培养物中测量髓鞘形成。PNS髓磷脂中总蛋白的70％由PO组成，并且这种蛋白质的缺乏将验证非致密髓磷脂的缺乏。评价了PO表达与β-III微管蛋白阳性神经丝的比率。图18C中所示的结果证实NCol-15存在所有培养物中最少量的PO。在25天内在存在AA的培养物中PO表达的百分比是显著更高的，这与来自MBP染色的结果相一致，所述结果显示Col-25组中有最高的MBP表达。这是有趣的，这是因为PO和MBP都是PNS中致密髓磷脂的特征蛋白，但是具有不同的职能。PO保持髓磷脂膜的ECM和细胞质间隔这两者的有组织的重现，而MBP在细胞质融合中起作用。该值与NCol-25组是等同的，这表明培养基2在25天之后的培养物的效率是相同的，不论胶原是否存在于培养物中。
图18B示出了在用PO标记的培养物中髓磷脂的量。Col-25显示最大量的致密髓磷脂PO发育，不论神经元生长的量如何。所述结果显示培养物中含有胶原的样品产生更多的神经元，从而产生更高量的髓磷脂。在两个含有胶原的样品之间，暴露于AA增加了PO出现的量。这甚至在通过计算髓磷脂与神经丝体积的比率来将含有胶原的样品中髓磷脂的体积值归一化之后仍被维持，如图18C中所示。图像证实在不含胶原的构建体(NCol-15和NCol-25)中，PO的量显著减少。神经元生长的体积也减少，并且因此，致密髓磷脂形成的百分比与Col-15没有显示出任何显著的差异。在这些长期的三维构建体中，在使培养物暴露于AA 25天之后表达PO的致密髓磷脂的百分比与在15天内在AA存在下含有胶原的培养物中表达PO的致密髓磷脂的百分比基本上没有差异。AA是为二维培养物的含血清培养基中的髓鞘形成所必需的。AA暴露的持续时间在髓磷脂形成的效率方面起重要作用。胶原I和III支持神经元生长并且可以有助于引发髓鞘形成过程。系统中胶原的存在增加了神经元三维延伸，并且因此，增加了三维环境中髓磷脂形成的量。
用于髓磷脂的一个不同量度是MAG，它是非致密髓磷脂中富含的蛋白质。通过MAG免疫染色来评价大鼠DRG/SC共培养物在三维构建体中形成髓磷脂的能力。所有构建体均呈MAG阳性并且与PO和MBP遵循相同的模式。类似于PO和MBP，通过MAG的共聚焦显微镜术分析证实了高水平的髓磷脂合成。MAG指示了施-兰切迹和结侧区，它们是非致密髓磷脂的特征。不论神经元生长的体积如何，在Col-25组中在胶原存在下在更长时间的AA暴露下非致密髓磷脂的量是更高的。AA帮助系统形成基底层并且促进髓磷脂形成。MAG标记的结构的百分比在具有相同的AA暴露的培养物之间(Col-25和N-Col 25)基本上没有差异。然而，当不向系统中添加胶原时，生长量显著降低。
本公开公开了一种允许结合SC和神经元的新型三维体外共培养模型。利用提供三维环境的简单的高通量光刻方法在受控的微环境中复制神经元现象而以高分辨的时空精度引入机械线索和化学线索。在此，数据证实这一共培养环境提供了对齐的高度束化的神经元生长，具有沿着它们很好地包裹的髓鞘。经由免疫组织化学和TEM确认了髓鞘形成。使用了两种培养系统，并且研究了胶原对神经元生长和髓鞘形成的影响。这一平台提供了对于药物发现和评价有用的器件、方法以及系统。
实施例3：模型的校准和可行性(非假想和假想)
药物开发管线受到不可接受的损耗率的困扰，这在很大程度上归因于在开发的临床前阶段中没有鉴定的毒性。特别是化学治疗剂，它们虽然对一系列广泛的癌症具有临床有效性，但是通常与剂量限制性全身毒性相关。在很多情况下，外周神经系统首先受到这些不良作用的影响，并且这样的毒性往往只能首先在动物研究中被鉴定出或被忽略直到临床试验为止。化学治疗诱发的外周神经病变(CIPN)是癌症治疗的一种常见的副作用，从而导致许多患者改变剂量方案并且一些由于严重的神经毒性损伤而完全停止治疗。在细胞模型中针对外周神经毒性筛选药物候选者的能力将通过在进行高成本的和耗时的动物研究之前帮助公司鉴定出有前途的先导化合物来加速药物发现过程。
“类器官芯片”技术作为先进的细胞模型显示出巨大的前景，所述细胞模型可以提供可用于后期药物开发的中等通量和高内涵数据，前提条件是它们提供了预测人类生理或病理的信息。许多合同研究组织已经取得了为各种器官系统提供这样的测定的商业成功。然而，外周神经芯片测定的开发是滞后的。常用的外周神经培养制备物对临床毒性没有预测性，这在某种程度上是因为它们通常利用细胞凋亡或神经突伸长作为可测量的终点，而成体外周神经元已完全生长并且已知会抵抗细胞凋亡。组织活检的神经传导测试和组织形态测定是神经病变的最具临床相关性的量度。然而，目前没有提供这些量度的培养模型。
我们已经开发了一种创新性的感觉神经芯片模型，这是通过将背根神经节培养在微图案化的水凝胶构建体中以在类似于外周神经解剖结构的三维排列上约束轴突生长而实现的。此外，在这些模型系统中可以可再现地记录由复合动作电位(cAP)产生的电诱发群体场电位。这些早期结果证实了使用适合于类似于临床测试的形态学和生理学测量的微工程神经组织的可行性。我们假设化学治疗诱导的神经毒性将以模拟临床神经病理学的方式表现在这些测量中。这一提案的目标在于证实使用复合动作电位波形作为体外外周神经毒性的量度的可行性。为此，我们将施用具有已知的外周神经毒性的化学治疗药物，测量cAP的变化，并且与形态变化以及所记录的临床病理生理学相比较。以下具体目标将允许我们实现这一目标：
目标1：通过定量关键的形态学量度并且与复合动作电位(cAP)量度相关联来校准神经芯片模型。
·使用共聚焦和透射电子显微镜术定量在体外四周内细胞体的尺寸和密度、以及神经突密度、直径、以及在沿着神经束的三个长度上有髓鞘的神经突％。
·确定四周内诱发群体动作电位响应的一致性。
·使cAP波形与形态测定参数相关联以确定基线结构-功能关系。
目标2：证实使用cAP波形测量通过急性施用已知会引起临床神经病变的四种化学治疗剂所诱导的毒性的可行性。
·在实验性研究中确定适合于神经芯片模型的奥沙利铂、紫杉醇、长春新碱、以及硼替佐米的剂量和孵育时间。
·在以实验性研究中所确定的终点施用药物之后测量cAP传导速度、振幅、潜伏期、以及积分。
·定量形态测定变化并且确定与cAP波形的变化的相关性。
普遍认识到的是，当前从发现进展到临床使用的实验药物的损耗率是高到不可接受的，从而驱使单个药物上市的成本高达26亿美元(DiMasi等,2014)。据估计在药物开发期间没有被发现的剂量限制性毒性是上市后药物撤回的第二大原因，并且这些后期失败一般与缺乏对于药物候选者毒性的可靠筛查方法相关(Kola和Landis 2004；Li 2004；Schuster等,2005)。尽管如此，FDA针对体外-体内相关性(IVIVC)的最新指南强调了药物溶解与生物利用率之间的关系(Emami 2006)；没有IVIVC指南被限定用于使临床毒性与体外毒性测试相关联。显然，基于细胞的毒性筛查测定将帮助公司鉴定出具有更低毒性的先导化合物，但是可靠地预测临床毒理学的体外测定少得可怜并且迫切需要这样的测定(Astashkina和Grainger 2014)。
化学治疗剂是一类特殊的药物，这是因为它们本身具有细胞毒性。毒性副作用因此是不可避免的，并且临床上可耐受的全身毒性的水平限制了药物的剂量。神经系统是特别易受不良作用影响的，与化学治疗相关的神经毒性的发生率仅次于血液毒性(Malik和Stillman 2008；Windebank和Grisold 2008)。外周神经是特别敏感的，这很可能是因为处于保护性血脑屏障外部并且具有从它们的细胞体到达很远处的非常长的轴突。据估计，化学治疗诱发的外周神经病变(CIPN)在接受治疗的患者的30％-40％中发生，并且感觉神经一致地比运动神经受到更严重的影响(Windebank和Grisold 2008)。症状从四肢的慢性疼痛到麻刺感、缺乏感觉或关节位置感、以及运动障碍不等。国家癌症研究所(NationalCancer Institute)将CIPN鉴定为最具剂量限制性副作用之一以及患者选择降低剂量或完全停止治疗的最常见原因(Moya del Pino 2010)。在一些情况下，在停止治疗之后症状消退，但是最经常，CIPN仅是部分可逆的，一些症状永久保留。不同于能够容易治疗的血液毒性，目前没有针对CIPN的护理标准临床治疗(Windebank和Grisold 2008)。
已知会造成最大的外周神经毒性风险的化学治疗剂的类别是铂衍生物；微管蛋白结合化合物，包括长春花生物碱、紫杉烷、以及埃博霉素；蛋白酶体抑制剂硼替佐米；以及沙利度胺(thalidomide)。这些药物也是六种最常见的恶性肿瘤的护理标准(Argyriou等,2012；Cavaletti和Marmiroli 2010；Wang等,2012)。导致所报告的症状范围的确切神经毒性分子机制是不同的并且在一些情况下，仍然不清楚。一般来说，铂化合物结合DNA并且引起细胞凋亡，而抗微管蛋白剂破坏微管蛋白动力学，包括轴突转运(Malik和Stillman2008)；硼替佐米被认为破坏神经节中的mRNA转录和加工，并且沙利度胺的机制是未知的，尽管它可能涉及与血管系统和/或炎性细胞的相互作用(Argyriou等,2012)。CIPN的具体表现和严重程度可以通过神经传导测试和/或皮肤或神经活检来最客观地和可靠地诊断(Dyck和Thomas 2005)。这些测量结果目前仅可从动物和人类中的安全测试中获得。因此，大多数的药物公司根本就不会专门针对外周神经毒性进行筛查直到先导化合物鉴定之后为止，尽管它是开发后期中最有可能的失败原因之一。
三维“类器官芯片”模型的使用作为开发适用于药物开发和毒性筛查的预测性基于细胞的测定的最佳希望正在被接受(Ghaemmaghami等,2012；Kimlin等,2013)。然而，关键的是，这样的模型系统超越了常规细胞活力测定的三维型式而成为真正再现可以被评价以鉴定毒性途径的器官生理学的功能方面的模型(Astashkina和Grainger 2014)。这样的生理学评估对于外周神经组织来说是特别有挑战性的，其中经过长距离的生物电传导按理说可以是最相关的生理学终点。出于这个原因，外周神经的三维组织模型落后于上皮组织、代谢组织、以及肿瘤组织的模型，其中可溶性分析物用作适当的量度。利用临床相关毒性量度的神经芯片模型通过使得能够选择具有更低的由于外周神经毒性导致后期失败的可能性的有前途的先导化合物而对于临床前药物开发来说将是非常有价值的。此外，由这样的模型所提供的高内涵信息通过提供对可能的毒性机制的深入了解，从而指导重新配制而将对于调查毒理学是有价值的。通过证实我们的模型系统的可行性，我们期望用预测性筛查外周神经毒性的首先进入市场的技术使我们自己强有力地定位为商业领跑者。
我们已经开发了一种简单但是独特的数字投影光刻方法以用于将一种或多种水凝胶直接快速微图案化到常规的细胞培养材料上(Curley等,2011；Curley和Moore 2011)。我们的简单和快速的方法使用两种凝胶：作为限制性模具的聚乙二醇(PEG)、以及作为容许性基体的交联甲基丙烯酸酯化的肝素(Me-Hep，我们先前使用Puramatrix)。这些双重凝胶有效地将来自胚胎背根神经节(DRG)外植体的神经突生长约束在特定的三维几何形状内，从而产生具有高密度和束化作用的轴突生长。当在髓磷脂诱导培养基中培养时，我们观测到极大程度的呈髓磷脂碱性蛋白(MBP)阳性的髓磷脂染色，这表明了致密髓磷脂，它的特征性螺旋结构在TEM图像上是明显的。具有从神经节延伸的密集的、高度平行的、有髓鞘的三维神经纤维束的这一培养模型的独特结构对应于外周神经构造；它可以使用神经形态测定来评估，从而允许进行对于传统细胞测定来说不可用的临床类似评估。我们的神经芯片培养模型的最独特之处在于能够记录由复合动作电位(cAP)产生的电诱发群体场电位的能力。迹线显示了特征性均匀的、短潜伏期的群体响应，所述响应在高频(100Hz)刺激下保持一致，显示出与远端神经束刺激相关的可测量的潜伏期延长(图21A和21B)，可以由河豚毒素(TTX)可逆地消除，并且所述响应对神经递质阻断剂不敏感，这表明了cAP而不是突触电位(Huval等,2015)。初步的证据表明与中等葡萄糖水平(20mM)相比，高水平的葡萄糖(60mM)使得cAP振幅显著降低，以及潜伏期延长(图22A-22C)。初步的证据还表明急性(48小时)施用0.1μM的紫杉醇(PTX)使得cAP振幅显著降低以及潜伏期延长(图23A-23C)。与在我们的模型中显著的可测量的cAP变化相比，这个浓度先前在常规的DRG培养物中已经引起50％细胞死亡，这表明了一种潜在更具信息性的毒性量度。胚胎DRG培养物已经被有效地用作外周神经生物学的模型达数十年(Melli和Hoke 2009)。虽然作为模型系统是有用的，但是已知常规的DRG培养物在用传统的细胞死亡测定评估时对临床毒性的预测性不佳。虽然可以从DRG获得单细胞记录，但是我们意识到没有记录cAP的报告，这是因为缺乏组织构造。使我们的模型系统具有创新性的是能够类似于临床组织病理学和神经传导测试评估组织形态测定和群体电生理学的独特能力。
该项目的目的是证实某些外周神经毒性化学治疗剂将在可以使用类似于临床量度的形态学和生理学量度加以定量的微工程神经组织中诱导毒性。我们将通过首先校准所述模型系统以确定基线变异性并且对结构-功能关系进行表征来接近这一目的。我们然后将对由已知会引起临床神经病变的特定化学治疗剂的急性施用所诱导的变化进行定量以证实使用复合动作电位(cAP)波形作为神经毒性的临床前测定的技术优点。
目标1基本原理和理由：传统的神经元细胞活力测定尚未被证实可用作神经毒性的临床前筛查。这并不奇怪，这是因为公知的是，胚胎背根神经节(DRG)神经元比成熟神经细胞更加容易受到细胞凋亡的影响(Kole等,2013)。DRG神经突生长的测定作为毒性的早期高通量筛查可以是更相关的(Melli和Hoke 2009)。然而，可用于辨别潜在的神经病变表现以及告知先导化合物选择的高内涵测定仍然是令人困惑的。与二维培养物相比，三维培养的神经元细胞已经被证实表现出更仿生的形态学和电生理学行为(Desai等,2006；Irons等,2008；Lai等,2012；Paivalainen等,2008)。因此，在三维培养物中的功能测量可以是用于这样的高内涵分析的最有前途的候选者，只要它们与临床相关器官生理学相当即可。神经传导测试已经被证实能够甚至在症状完全表现之前预测临床神经病理学的类型和严重程度(Velasco等,2014)。我们提出了一种在体外环境中类似的电生理学量度；为了解释结果，我们首先需要建立基线测量并且确定结构-功能相关性。
目标1研究设计：将使用在我们发表的论文之上的改进方案来制备有髓鞘的以及无髓鞘的神经组织构建体(Curley和Moore 2011；Huval等,2015)。将由填充有补充有胶原和层粘连蛋白的Me-Hep凝胶的PEG凝胶微型模来制造双重水凝胶构建体。神经突生长构建体将被制造成约400μm宽和高达5mm长。将从胚胎第15天(E15)大鼠胚胎中解剖的脊髓胸段中获取背根神经节(DRG)并且将其并入双重水凝胶构建体的球状区域内。将有髓鞘的组织构建体在含有ITS补充剂和0.2％BSA的基础伊格氏培养基中培养10天以促进施旺细胞迁移和神经突生长，继而在另外补充有15％FBS和50μg/ml抗坏血酸的相同的培养基中再培养长达四周以诱导髓鞘形成(Eshed等,2005)。将通过在相同的但是缺乏抗坏血酸的培养基方案(诱导生长，继而诱导髓磷脂)中培养来形成无髓鞘的构建体。在含有抗坏血酸的髓磷脂诱导培养基中培养至少两周是为致密髓磷脂的显著形成所需的。为了评估成熟的各个阶段的组织形态，将各自约12个有髓鞘和无髓鞘的组织构建体在髓鞘形成诱导培养基中一周、两周、三周、以及四周(或17天、24天、31天、以及38天的体外总天数(DIV))时在4％多聚甲醛中固定并且针对核(赫斯特(Hoechst))、神经突(βIII-微管蛋白)、施旺细胞(S-100)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、以及细胞凋亡(膜联蛋白-V和TUNEL)染色。将样品用共聚焦显微镜术在DRG内、接近神经节、纤维束中点附近、以及远离神经节的纤维束中的区域处成像；精确的距离将与每一组中平均最大神经突范围成比例。在共聚焦成像之后，将样品在2％四氧化锇中后固定，脱水，并且包埋于环氧树脂中。将约10个超薄横截面从每一个样品中在每一个限定的区域(即神经节、近端、中点、远端)处切割并且用柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色以进行TEM成像。
将如先前所述进行生理学分析(Huval等,2015)。将有髓鞘的构建体和无髓鞘的构建体这两者从培养物中取出并且放置在灌注有人工脑脊髓液(aCSF)的场记录装备上。如图24中所描绘，将场电位电极放置在DRG外植体的细胞体区域中并且将双极刺激电极在接近神经节、靠近中点、以及远离神经节的距离处以约300μm的深度插入到通道中；距离将通过形态测定来告知。对于每一个刺激位置处的每一个标本，将增加刺激强度直到记录到特征性快速的(<5ms)、短潜伏期的、负偏转电位为止。将在17DIV、24DIV、31DIV、以及38DIV时，从约5个-10个标本获取来自每一个刺激位置的DRG峰电位记录。将这些相同的标本在电生理学记录之后立即固定并且处理以进行共聚焦和TEM分析。
将如图24中所汇总来评估形态分析。将在神经节中测量细胞体的密度和直径分布。在神经纤维束中，测量结果将包括轴突的密度和直径分布、具有髓磷脂的轴突％、以及髓鞘的厚度分布。这一分析将提供形态变异性的重要的定量量度和与生理学的相关性。生理学量度也汇总于图24中。将在沿着神经束的长度的三个点处记录cAP，并且测量结果将包括cAP振幅(和峰数)、包络(宽度)、积分(曲线下面积)、以及传导速度(从潜伏期)的分布。将所记录的构建体的形态测定参数与更大的形态测定数据池比较以确保它们在预期的变异范围内。我们将进行统计互相关以确定哪些形态学量度与哪些生理学量度具有最好的相关性(Manoli等,2014)。此外，这些实验将提供用于统计功效分析的变异性的量度以确定用于目标2的适当的样本量，并且它们将用于限定排除标准，例如具有与平均值相差多于/少于2倍标准偏差的神经突生长的样品将被排除。
目标1预期结果：我们假设所记录的cAP波形将反映形态学观测结果。举例来说，我们的初步数据表明在培养两周之后，水凝胶通道内接近神经节处的神经突生长比远离神经节处的神经突生长要密集得多(图21A和21B)。因此，当近端刺激时，与远端刺激相比，所记录的cAP显示更大的振幅和积分。当远端刺激时，cAP的潜伏期果然是更长的，这反映了传导时间。在主要含有小直径、无髓鞘的轴突的构建体中，所计算的传导速度是约0.5m/s，这不出意料是缓慢的。
在所提出的实验中，我们预期看到cAP传导速度与髓鞘形成％和/或轴突直径具有相关性，而cAP振幅应当与刺激位置处轴突的密度具有相关性。我们还将通过观测峰数、包络、以及积分，并且用形态学量度进行相关性分析来寻找进一步的相关性。
目标1潜在问题和替代策略：初步的发现强有力证实了为了这一目标所提出的工作的技术可行性。最可能的预期缺陷是当我们测量更多的培养物时，我们可能发现形态学和/或生理学变异性可能过高以致许多强相关性不能被鉴定。如果发生这种情况，我们将根据需要增加样本量和/或将我们的努力集中在代表最强相关性的那些量度上。我们还可以尝试改进培养条件以降低变异性，如通过使用确定成分培养基、或使用从多个动物汇集的解离细胞。
目标2基本原理和理由：具有最严重的所记录的神经毒性的最常施用的化学治疗剂是铂衍生物；微管蛋白结合化合物，包括长春花生物碱、紫杉烷以及埃博霉素；蛋白酶体抑制剂硼替佐米；以及沙利度胺(Argyriou等,2012；Cavaletti和Marmiroli 2010)。所有这些试剂似乎对感觉神经元比对运动神经元或交感神经元更具毒性，但是它们各自靶向神经的不同部分，如图25中所汇总，从而产生临床上可测量的组织学变化和生理学变化的不同集合。毒性的高内涵功能测定应当能够检测与这些化合物相关的体内作用的范围。为了使可管理的范围成为可能，我们将实验限于奥沙利铂、长春新碱、紫杉醇、以及硼替佐米。这一清单确保了适当多样的响应范围，这是因为它包括每一个家族的一种化合物，不包括埃博霉素，这是因为它们以类似于紫杉烷的方式结合微管蛋白，并且不包括沙利度胺，这是因为它可能涉及与其它细胞类型和细胞因子的相互作用(Argyriou等,2012)。我们将实验进一步限于被确认在体外具有神经毒性的神经毒性剂量的急性施用。长期和低剂量施用将被保留用于未来的详细研究。
我们建议通过定量对这四种化学治疗剂的形态学和生理学响应来证实使用cAP作为毒性的量度的可行性。所提出的实验被设计成建立具有直接类似于神经传导测试以及临床组织学的评估的模型。分子机制研究超出了这一提案的范围，但是重要的是注意到微图案化培养物的准三维性质适合于常规的细胞和分子测定。
目标2研究设计：我们将首先进行小的实验性研究以确保使用有效剂量。我们将从被证实在急性施用(48小时)之后在体外诱导统计显著性神经元细胞死亡的剂量开始并且验证在这些浓度下形态变化和生理变化在我们的模型中是可测量的。整体实验设计汇总于图26中。根据髓鞘形成诱导方案，将DRG外植体(n＝20)培养在微图案化的凝胶(如目标1中所述)中。在由目标1确定为产生完全有髓鞘的构建体的时间点，将针对足够的神经突生长(细胞示踪剂绿色(Cell Tracker Green))和髓鞘形成(FluoroMyelin红色)检查标本；此时没有足够的神经突生长和/或髓鞘形成的标本将被排除在实验以外。将获取健康组织构建体的电生理学记录，并且在第二天，将神经毒性浓度的四种药物急性施用48小时，如表4中所汇总。对照组将接受不含药物的媒介物。将在48小时施用期结束时对一半(n＝10)的外植体进行电生理学，并且在施用期后7天时对另一半进行电生理学。将所有标本在最终的记录之后立即固定，染色，并且评估，如图24中所汇总。此外，将对细胞体和轴突损伤，如染色质凝聚、起泡、以及轴突断裂进行定性观测。
表1：用于初始实验性研究的药物剂量。
将使用这一实验性研究的结果来评估剂量施用的适当性，并且将根据全面研究的需要调整剂量(下文)。还将使用实验性研究的结果来确定最强相关的形态学量度和生理学量度，并且进行统计功效分析以估计在这些量度中检测约10％差异所需的样本量。在更大的研究中，我们假设在急性药物施用之后体外的形态变化和生理变化将与如文献中所报道的体内神经病变非常相似。这个实验的目的在于将在我们的神经芯片模型中所述药物中的每一种的可定量的神经毒性标志编目。全面实验设计将反映实验性研究，如图26中所描绘，但是所有四种药物(奥沙利铂、长春新碱、紫杉醇、硼替佐米)的样本量和剂量将反映由实验性研究所确定的任何变化。
目标2预期结果：我们假设每一种药物的急性施用将诱导可以通过测量cAP相对于基线的变化来检测的毒性。我们预期这些变化中的大部分将与如通过我们的形态测定分析所定量的任何形态损伤具有相关性。举例来说，参考图25，使用微管蛋白结合药物长春新碱和紫杉醇，我们预期看到轴突萎缩，如通过轴突直径和密度减小所测量，我们预期这将伴随cAP振幅的降低。我们还可能看到髓磷脂厚度和有髓鞘的轴突％的降低，这可能伴有cAP传导速度的降低。使用奥沙利铂，我们预期将看到更高水平的细胞凋亡，但是看到较少的轴突萎缩和髓磷脂损伤。因此，虽然cAP振幅可能由于奥沙利铂对Na+通道的作用而仍降低，但是在没有髓磷脂毒性的情况下，我们预期不会看到传导速度降低很多。我们进一步预期生理变化和形态变化将与如通过神经传导测试和组织形态测定所测量的记录的临床病理学相似。
目标2潜在问题和替代策略：虽然已经在体外观测到待测试的四种化合物的神经毒性，但是生物效应可能以不可预测的方式受三维制备物的影响。有可能，预期种类的形态和生理病理学将不在实验性研究中表现，要不就是细胞死亡将盖过功能量度。如果是这样的话，我们可以增加/降低剂量和/或转变成长期施用(7天)。另一个似乎合理的情况是神经病变将是明显的，但是定量量度如此可变以致于使得10％的可检测的差异是不切实际的。如果是这样的话，我们将设计更大的研究以在切实可行的情况下检测20％-30％的可检测的差异。
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实施例4：视网膜外植体模型(非假想)
在本公开中呈现了背根神经节模型的工作和实验数据。对于中枢神经系统模型，还已经研究了视网膜外植体的生长。图27A-27B描绘了视网膜(CNS)组织的培养物。将来自胚胎大鼠的视网膜外植体在三维微图案化的水凝胶内培养在补充有睫状神经营养因子CNTF(图23A)或脑源性神经营养因子BDNF(图23B)的“神经基础Sato”培养基中。在培养一周之后将可观测的视网膜神经节细胞轴突延伸可视化，用β-III微管蛋白染色。
实施例5：丘脑皮层模型(假想)
本发明的一个实施方案在仿生工程丘脑皮层回路中定量了诱发的突触后电位。使用DLP光刻将约500μm厚的10％聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG)凝胶的微型模固化。所述模具含有由约200μm宽和约1mm长的管道隔开的具有约500μm直径的两个贮器。使用常规程序将丘脑和皮层神经元从E18大鼠胚胎中分离，用胰蛋白酶/木瓜蛋白酶解离，研磨，并且沉淀。通过将沉淀物在10％蔗糖溶液中重悬并且与等体积的0.3％Puramatrix和10％蔗糖组合来形成于Puramatrix凝胶中的浓缩细胞悬浮液(约5E6个细胞/毫升)。经由微量移液管将对应的丘脑和皮层细胞悬浮液放置在每一个模具内的单个贮器中，并且将不含细胞的Puramatrix放置在之间的空间中。将微图案化的共培养构建体培养长达两周并且使回路自发地形成。以约3天的时间间隔，将构建体固定并且针对细胞核(DAPI)、神经突(β3-微管蛋白)、树突(MAP2)以及突触(突触素)染色以确定为产生回路所必需的时程。随后，将亲脂性示踪染料Di-I和Di-O的糊状物放置在突触形成发生之前固定的构建体的任一端处，以确定来自任一细胞群体的神经突生长的出现率和组织。用共聚焦分析来定量这些形态学参数并且将其用于最后确定微工程回路的设计。这产生高的和可再现均匀密度的以突触连接到突触后皮层神经元的限定群体上的丘脑轴突，同时使皮层丘脑重新神经支配减到最低限度(<10％的突触)。
随后，确定回路的电生理学特征。使用单个双极刺激电极来激活这些TC回路中的逆行性传播动作电位(AP)和顺行性诱发兴奋性突触电位(EPSP)。通过场电位和全细胞电压钳记录来测量响应。记录逆行性动作电位以确认在这些轴突中有效电流的诱导和传播。与来自我们的DRG构建体的结果相一致，我们预期能够在丘脑神经元池中使用场电位电极记录逆行性AP。这被观察为短的和一致的潜伏期、TTX敏感性、负偏转、短持续时间的场电位。使用全细胞电压记录来基于这些逆行性AP的动力学、从基线的直接起始相、以及对超极化的不敏感性来验证它们。然后在双极刺激丘脑轴突后确认皮层神经元群体中的谷氨酸能EPSP和兴奋性突触后电流(EPSC)。使用以下各项来确认EPSC：1)在皮层神经元池中所记录的场电位响应的动力学分析；2)使用电压钳位策略以分离AMPAR介导的电流(在超极化保持电位)和AMPAR+NMDAR介导的电流(在正保持电位)的全细胞电流记录；以及3)标准谷氨酸能突触药理学，包括选择性阻断AMPAR介导的电流的DNQX(20μM)和拮抗NMDAR介导的电流的d-APV(50μM)。响应于丘脑轴突刺激的由AMPAR和NMDAR介导的突触后电流然后出现。在体外在这两周内AMPAR介导的电流与NMDAR介导的电流的相对比率将增加，从而模拟了体内情形。
在一些实施方案中，皮层神经元对丘脑细胞的营养作用不足以形成所期望的单向回路。在这些实施方案中，皮层丘脑重新神经支配一致地高于10％，或树突棘连接在两个细胞群体之间。如果在不期望的程度上观测到这些情况，那么将引入每一种细胞类型的时间错开以使得在添加皮层靶神经元之前引入丘脑神经元并且给予时间产生轴突并且使轴突朝向皮层神经元贮器延伸。可替代地或结合地，使用水凝胶的微图案化能力在培养期间引入人工营养信号传导。我们已经证实DRG神经突优先地朝向与BSA相对的从水凝胶构建体中的贮器扩散的NGF生长，如图28中所示。TC轴突的潜在化学引诱剂分子包括轴突导向因子-1(netrin-1)和神经营养因子3。以类似的方式，使用信号素3A(semaphorin 3A)，这是因为它已经被证实通过吸引树突和排斥轴突来将皮层神经元极化。如果这些方法无效，那么使用PEG水凝胶的可光降解型式，我们已能合成所述型式。这种凝胶允许将PEG屏障放置在皮层池与丘脑池之间，可以在期望时用UV光使其降解以允许突触形成。
实施例6：微生理培养系统与非侵入性电生理学分析的组合(假想)
本发明的一个实施方案是利用微生理培养系统与非侵入性电生理学分析的独特组合。这具有潜在范式改变能力以在体外在仿生配置中进行群体水平的功能测定。我们已经在荧光显微镜记录装备上手动配置了DLP器件并且已经显示选择性照射和同时激活单个皮层神经元以及表达GFP和ChR2的细胞中的单个树突。我们还已经开发了定制软件，所述定制软件通过使得能够直接在如由用户所看到的显微镜照相机的实时馈送上指定所关注的区域来对照射进行灵活的用户控制。DLP显微镜术和光遗传学用于光学神经激活的这一强效和通用的应用与新形式的电压敏感性染料成像，如VF组合。光遗传学和VF成像与DLP显微镜术的这一独特的和适时的组合代表了用于非侵入性刺激我们的微工程回路的强效的、完全光学的方法；图29。
在一个实施方案中，分别在传统的平面的解离的丘脑神经元和皮层神经元培养物中制定DLP光学刺激和记录方案。使用上文所述的方法产生皮层和丘脑培养物。我们将使用基于ChR2质粒和慢病毒的DNA构建体，我们已经从光遗传学公司(Optogenetics,Inc.)获得了所述构建体，并且其中包括红色荧光蛋白(mCherry)作为转染/感染报告基因。将神经元接种并且用ChR2感染，然后用VF染料(2μM)染色。然后在转染/感染的细胞上建立全细胞膜片记录，然后DLP以约475nm(蓝绿色)照射。将以电流钳模式记录分级电位和动作电位，同时改变照射强度和放大倍率(4×-40×)。或者，将电压钳位到可变电位，同时以约535nm(黄绿色；VF对激发波长相对不敏感)监测VF荧光，再次同时也改变激发强度和放大倍率。重复这些测试以确定照射和电压灵敏度的范围和极限。此外，在这个实施例中，确定用于光学刺激和记录的同时照射(或接近同时)的时间要求。对于诱发和记录突触电位，产生低密度的皮层培养物。需要这一操作(约10-100k个细胞/毫升)来使连接性达到最大并且在这些皮层培养物中的单个视野中获得连接的神经元。在建立全细胞膜片之后，然后用DLP照射转染/感染的相邻细胞并且将以电流钳模式记录突触后电位。使用这些实验来确定检测ChR2/光诱发突触后电位所需的精确的光学设置、照射、以及光学取样的时间。
随后在三维细胞群体中制定光学刺激和记录方案。刺激和记录是在相对低的放大倍率(10×)下进行的以使得丘脑池和皮层池在视野内同时可见。根据上述方法将TC回路微工程化。然而，通过将颗粒添加到于Puramatrix溶液中的细胞悬浮液中来使丘脑细胞感染ChR2病毒，之后注入到PEG微型模中，然后将凝胶洗涤几次以去除颗粒，之后添加皮层神经元。将刺激场电极放置在丘脑神经元池中，并且将记录电极放置在皮层神经元池中，并且确认诱发EPSP的能力。在之后立即使用DLP照射ChR2以刺激丘脑神经元，同时记录皮层池中的响应。研究在不同的放大倍率(4×-40×)下对不同的突触前ChR2照射强度的EPSP响应。在一些实施方案中，使用在具有VF染色的皮层神经元的TC回路中的场记录来确认EPSP，并且之后立即在用场电极刺激丘脑神经元时通过VF荧光来测量皮层池中的电诱发突触后响应。EPSP的荧光测量的特征在于动力学分析和谷氨酸能突触药理学。最终，在用场刺激和记录确认之后不久，用ChR2刺激丘脑神经元，同时用VF测量皮层EPSP。
根据被确定用于回路制备的技术，在水凝胶中病毒ChR2的感染可能会造成问题，这是因为感染效率会降低或凝胶中残留的病毒会引起皮层神经元的不期望的感染。病毒感染是优选的，这是因为它预期产生最高的效率，但是在其它实施方案中，也可以使用化学转染和电穿孔方法。必要时，可以将丘脑细胞常规地接种以进行感染，充分洗涤，然后解离并且悬浮在Puramatrix中。如果不可能平衡为将整个TC回路可视化所需的低放大倍率与为以高速分辨VF荧光所需的SNR，那么使用替代设备配置，包括具有低放大倍率和高数值孔径的专门的物镜以及具有更高的速度和灵敏度的照相机(CCD或PMT)。或者，在其它实施方案中，使用独立于显微镜光路的用于ChR2刺激的光的光纤应用。
实施例7：培养系统的高通量形式(假想)
本发明的一个实施方案将是用于如图30中所描绘的多孔形式。在一个实施方案中，将配置荧光显微镜和电生理学装备。配置落射荧光显微镜和记录平台，包括具有数字干涉相衬(“DIC”)和荧光光学器件的固定台立式显微镜以及分别用于放置刺激电极和记录电极的粗微型操纵器和细微型操纵器。将场电位和全细胞放大器补充以数字刺激能力以允许进行基于电极的微电极分析，从而用于所需要的对光学激活和记录的确认。此外，显微镜装备有DLP自适应照射器(安道尔科技有限公司(Andor Technology,plc.))、快速固态多谱光源(如SPECTRA X light engineTM，Lumencor公司)、以及用于同步DLP、光源以及照相机的接口。对系统的控制将经由与定制的LabView界面通信的用于照射和成像的市售软件和用于数据采集和分析的IgorPro的组合来实现。
可以如上文所述来制备微工程DRG构建体，并且将其在标准六孔组织培养板形式中培养和记录。这些当前构建体的尺寸非常适合于快速筛选。在一个实施方案中，优选的是，通过使培养的组织的密度达到最大来使信号一致性稳定。通过产生简单的单突触回路，有可能增加靶细胞池来抵消这个问题。在照射方面，对于刺激和记录，DLP系统的强度是它的适应性。软件将创建在视野内对照射和记录进行空间模式化的能力。
在一个实施方案中，以24孔板形式制备构建体。在其它实施方案中，使用96孔板。在每一个阶段，研究响应振幅和响应的一致性以及在控制条件下孔之间的个体变异性。在分析速度与需要被记录的构建体数之间确定平衡以使变异性减到最低限度而足以观察到突触传递的生物相关变化。为此，在测试孔中进行受控的改动以研究确定的传递变化。举例来说，通过在这些构建体中添加20μM的DNQX+50μM的APV对传递进行100％抑制将提供阴性对照。还进行更精细尺度的操作，例如添加环噻嗪(cyclothiazide)以去除基础水平的AMPAR脱敏可以用于将这些突触处的传递增强约10％-20％。对于每个操作，使用基于电极的电生理学来确认传递的抑制或增强的平均程度。确定我们需要光学测量的构建体数以对于每一种条件可靠地记录这一传递变化％。在功能评估之后，将TC回路固定并且选择随机样品进行形态学评估。将构建体的细胞核、神经突、树突以及突触染色。使用共聚焦显微镜术定量这些形态学参数的相对密度，并且研究形态变异性与功能变异性之间的相关性，这有助于改进制备程序。这一测定的主要优势在于通过去除对放置微电极以记录生物相关突触电位的需要所带来的在记录方面的进步。
在一些实施方案中，在制备被证明是限制因素的情况下，使用喷墨式细胞沉积的细胞印刷，这或许与投影光刻组合。如果流体处理被证明是瓶颈，那么使用机器人移液系统或其它自动化流体处理机。
实施例8：治疗剂对神经传递的作用(假想)
在一个实施方案中，本发明用于测试治疗剂对神经传递的作用。在一个实施方案中，对于慢性暴露和急性暴露这两者，制备TC构建体。对于慢性实验，使构建体生长直到皮层神经元的TC轴突神经支配的初始点为止，此时将实验培养物用外源性5-HT来源单独或结合来自我们的组的药物之一来处理(图16)。在实施例1和实施例2中确定了与皮层神经元的神经支配相关的时间点。作为对照，还包括没有被提供外源性5-HT供应的培养物。使用缺乏5-HT的培养物与仅5-HT培养物之间的比较来证实在这些突触处突触传递的发展中对这种血清素能信号传导的需要。任何所观测到的5-HT的作用是通过用5-HT受体拮抗剂的共同施用来逆转这些变化而确认的。将培养的构建体在相同条件下同时产生和维持，以使实验变异性减到最低限度。
通过比较5-HT培养物与缺乏5-HT(仅培养基)培养物来研究5-HT对正常突触功能的发展的作用。实验药物的长期处理的持续时间是基于5-HT介导的突触响应变化的时程和强度来确定的。在记录阶段，使用VSD染色的皮层神经元和通道视紫红质介导的对丘脑轴突的刺激来测量以下突触响应参数：1)自发兴奋性突触后电位在它们的事件频率和振幅方面的水平；2)通道视紫红质诱发的突触后电位的振幅和动力学以及刺激响应关系；以及3)兴奋性突触电位的药理学。使用这些药理学测量来验证这些突触处AMPAR/NMDAR介导的突触电流的适当进展，这在发展过程中增加。记录每种条件的多个构建体以允许统计测量。5-HT增强了突触特性的发展，包括自发活动和AMPAR/NMDAR电流比的增加。使用已知会增强自发活动的处理作为阳性对照来确认我们使用我们的光学方法记录这些变化的能力。举例来说，已知会按比例放大培养的皮层神经元中自发突触响应的振幅和频率这两者的3天TTX处理。
本发明测试了5-HT是否将为这些突触处突触传递的正常发展所需。然而，如果没有慢性阻断SERT的作用，那么这将表明急性神经传递与这些突触输入的发展空间模式化之间的有趣脱离。根据先前的研究，最初将以1.3μg/mL和5μg/mL测试氟西汀的浓度。对于每一种条件，使用在先前实施例中开发的光学激活和记录技术来收集数据，按照先前的文献施用药物，并且测量相同的三个参数。
通过在初始神经支配(7-14DIV)之后施用药物以及通过记录每种实验条件的多个构建体来使由于轴突导向(以及因此丘脑神经元的皮层神经支配的强度)的变化所引起的响应参数的潜在变化减到最低限度。通过将培养物针对轴突蛋白标志物τ免疫染色并且定量地测量每一种处理条件下皮层神经元中染色的强度来研究轴突生长。事后实验中的突触染色允许我们将突触数与这些操作相比较并且允许我们根据增加的突触数以及增加的单个突触强度来解释电压敏感性染料记录。通过研究突触前标志物(Vglut 1/2混合抗体)和PSD-95染剂的共定位以鉴定突触后结构来确定突触。此外，在初始研究中在适当时通过电学记录和免疫组织化学来确认数据。
如果血清素快速地改变这些突触处的突触功能，那么响应于SSRI或5-HT拮抗剂的施用，应当观测到基线谷氨酸能传递的双向相反变化。有趣的是，有证据说明SSRI对突触传递有快速的作用而与它们对血清素再摄取的作用无关。这些作用预期会在快得多的时间尺度期间发生。举例来说，氟西汀可以抑制T型、N型以及L型Ca2+电流、Na+电流、以及K+电流。出于这个原因，研究所有这些药物对兴奋性突触传递的急性作用。在这些急性实验中，进行基线记录10分钟，然后添加药物，持续10分钟，继而是10分钟洗脱期。诱发刺激并且自始至终以0.1Hz记录。对于这些急性记录，测量突触后响应的振幅和动力学来确定这些药物对突触传递的潜在作用。
在这一测定中纯光学刺激和记录的使用允许快速筛查这些药物的急性暴露和慢性暴露这两者的作用并且允许测试这些药物对兴奋性突触功能的绝对敏感性和剂量依赖性作用这两者。通过自动化例程分析编译的数据并且结果为了解血清素调节在发展TC突触时对谷氨酸能突触功能的急性作用和慢性作用这两者提供了基础。在一些实施方案中，通过在我们的突触测定中测量这些药物的调节潜能并且与体内副作用的出现率相比较，这一测定用于针对调节血清素能功能的能力来筛选新型分子和肽，同时使诸如改变谷氨酸能突触功能的‘脱靶’效应减到最低限度。
除了大容量、高通量筛选之外，在一些实施方案中，这种系统还可以通过快速地研究小分子和已知药剂对所观测的效应的作用来用于机制工作。举例来说，可以通过共同施用阻断特异性细胞途径或受体亚型的化合物来确定在SSRI调节突触功能中对不同的下游信号传导途径的需要。除了电压记录之外，还可以应用突触前或突触后神经元的钙负载来观察末端钙变化并且将其与递质释放中的功能变化相比较。此外，在一些实施方案中，可以容易地应用替代刺激范式的应用以通过测量成对脉冲比并且施加强直刺激以诱发增强来测试诸如突触前释放概率的参数的变化以及筛选可塑性的调节剂。在一些实施方案中，使用自动化培养基系统，如自动化移液机和/或细胞孵育箱的内置流体室允许去除药物施用和培养基去除的手动操作。

Claims (113)

1.一种在包含固体基质的培养容器中产生一个或多个神经元细胞的三维培养物的方法，所述方法包括：
(a)使一个或多个分离的施旺细胞和/或少突胶质细胞与所述固体基质接触，所述基质包含至少一个外表面、至少一个内表面以及至少一个内室，所述内室是由所述至少一个内表面所限定的并且可从所述固体基质外部的点经由至少一个开口进入；
(b)将一个或多个分离的神经元细胞或包含神经元细胞的组织外植体接种到所述至少一个内室中；
(c)将细胞培养基施用到所述培养容器中，其中细胞培养基的体积足以覆盖所述至少一个内室；
其中所述内表面的至少一部分包含第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，将包含所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一细胞可穿透聚合物的溶液放入所述培养容器中并且诱导所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一细胞可穿透聚合物物理粘附或化学键合到所述内表面的至少一部分上。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述固体基质包含具有预定形状的基底，所述预定形状限定了所述外表面和所述内表面的形状。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述基底包含二氧化硅、塑料、陶瓷、或金属中的一种或组合，并且其中所述基底呈圆柱体的形状或呈基本上类似于圆柱体的形状，以使得所述第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物包被所述基底的内表面并且限定圆柱形或基本上圆柱形的内室或隔室；并且其中所述开口被定位在所述圆柱体的一端处。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述基底包含足以允许蛋白质、营养物质、以及氧气在所述细胞培养基存在下扩散穿过所述固体基质的尺寸和形状的一个或多个孔隙。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述诱导所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一可穿透聚合物交联到所述固体基质上的步骤包括使所述溶液暴露于紫外光或可见光。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一细胞不可穿透聚合物是以所述溶液的体积计不超过约20重量％的浓度的聚乙二醇(PEG)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一细胞可穿透聚合物具有以所述溶液的体积计约0.1重量％至约3.0重量％的浓度。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：使所述培养容器暴露于37℃和不超过约5.0％的水平的二氧化碳，持续足以允许轴突在所述内室中生长的一段时间。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述固体基质的至少一部分是圆柱形的或基本上圆柱形的以使得所述固体基质的内表面的至少一部分限定圆柱形或基本上圆柱形的内室，向所述内室中接种所述一个或多个施旺细胞并且接种所述一个或多个神经元。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括接种选自以下各项中的一种或组合的组织外植体：分离的背根神经节、脊髓外植体、视网膜外植体、以及皮层外植体。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，步骤(c)包括接种选自以下各项中的一种或组合的神经元细胞的悬浮液：运动神经元、皮层神经元、脊髓神经元、外周神经元。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述固体基质包含与所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一细胞可穿透聚合物的混合物交联的塑料基底；并且其中所述塑料基底包含具有不大于约1微米的直径的多个孔隙。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：形成固体基质并且将所述固体基质定位于培养容器中。
15.如权利要求14中任一项所述的方法，其中所述形成固体基质的步骤包括通过光刻使包含所述第一细胞不可穿透聚合物和所述第一细胞可穿透聚合物的溶液固化。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：在步骤(c)之后使所述神经元细胞生长神经突和/或轴突，持续约1天至约1年的一段时间。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：在步骤(a)之前从样品中分离一个或多个施旺细胞和/或一个或多个少突胶质细胞。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(b)之前从一种或多种哺乳动物分离背根神经节(DRG)。
19.如权利要求1至18所述的方法，其中所述培养容器不含海绵。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述固体基质包含不大于约15％的PEG和约0.05％至约1.00％的选自以下各项的自组装肽中的一种或组合：RAD 16-I、RAD16-II、EAK 16-I、EAK 16-II、以及dEAK 16。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述培养容器包含约1个至约1200个孔，可以向所述孔中相继或同时进行步骤(a)-步骤(c)。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述固体基质聚合物不含PEG。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述基质的至少一部分是以圆柱体或矩形棱柱体的形状形成的，所述圆柱体或矩形棱柱体包含由所述内表面限定并且可通过一个或多个开口进入的内室。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基包含约5皮克/毫升至约20皮克/毫升的浓度的神经生长因子(NGF)和/或约0.001％重量/体积至约0.01％重量/体积的范围内的浓度的抗坏血酸。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，所述方法还包括将至少一个刺激电极定位在所述一个或多个神经元细胞或组织外植体的细胞体处或附近并且将至少一个记录电极定位在轴突的最远离所述细胞体的点处或附近，以使得当在所述刺激电极中引入电流时，所述记录电极能够接收对应于能够在所述记录电极处被测量的一个或多个电生理学量度的信号。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述一个或多个电生理学量度是以下各项中的一个或组合：电传导速度、动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的包络。
27.一种组合物，所述组合物包含：(i)
培养容器；
水凝胶基体，所述水凝胶基体至少包含第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物；以及
一个或多个分离的施旺细胞和/或一个或多个少突胶质细胞；以及
一个或多个组织外植体或其碎片；或
(ii)
培养容器；
水凝胶基体，所述水凝胶基体至少包含第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物；以及
一个或多个分离的施旺细胞和/或一个或多个少突胶质细胞；以及
包含一个或多个神经元细胞的细胞悬浮液。
28.如权利要求27所述的组合物，所述组合物还包含固体基质，所述水凝胶基体交联到所述固体基质上，所述固体基质包含具有约1微米至约5微米的直径的孔隙的至少一个主要为塑料的表面。
29.如权利要求27所述的组合物，所述组合物还包含固体基质，所述水凝胶基体交联到所述固体基质上，所述固体基质包含至少一个外表面和至少一个内表面以及至少一个内室，所述内室是由所述至少一个内表面所限定的并且可从所述固体基质外部的点经由至少一个开口进入的。
30.如权利要求27至29中任一项所述的组合物，所述组合物还包含细胞培养基和/或脑脊髓液。
31.如权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中所述组织外植体或其碎片是以下各项中的一种或组合：DRG外植体、视网膜组织外植体、皮层外植体、脊髓外植体、以及外周神经外植体。
32.如权利要求27至31中任一项所述的组合物，所述组合物还包含具有连续的外表面和内表面的固体基质，所述固体基质包含呈圆柱形或基本上圆柱形的形状的至少一部分以及至少一个中空内部，所述中空内部在它的边缘处由所述内表面的至少一部分限定，所述内表面包含具有约0.1微米至约1.0微米的直径的一个或多个孔隙，其中所述固体基质的中空内部是可从所述固体基质外部的点经由至少一个开口进入的；其中所述中空内部部分包含接近所述开口的第一部分和远离所述开口的至少第二部分；其中所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体被定位在所述中空内部的第一部分处或附近并且与所述水凝胶基体进行物理接触，并且其中所述至少一个中空内部的第二部分与所述第一部分处于流体连通以使得轴突能够从所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体生长到所述中空内部的第二内部部分中。
33.如权利要求27至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物不含海绵。
34.如权利要求27至33中任一项所述的组合物，其中所述至少一种细胞不可穿透聚合物包含不大于约15％的PEG并且所述至少一种细胞可穿透聚合物包含约0.05％至约1.00％的选自以下各项的自组装肽中的一种或组合：RAD 16-I、RAD 16-II、EAK 16-I、EAK 16-II、以及dEAK 16。
35.如权利要求27至34中任一项所述的组合物，其中所述培养容器包含96个、192个、384个或更多个内室，其中一个或多个分离的施旺细胞和/或一个或多个少突胶质细胞足够接近所述一个或多个分离的组织外植体和/或所述一个或多个神经元细胞以使得所述施旺细胞或所述少突胶质细胞沉积髓磷脂以使轴突从所述组织外植体和/或神经元细胞生长。
36.如权利要求27至35中任一项所述的组合物，其中所述固体基质不含PEG。
37.如权利要求27至36中任一项所述的组合物，其中所述基质的至少一部分是以圆柱体或矩形棱柱体的形状形成的，所述圆柱体或矩形棱柱体包含由所述内表面限定的并且可通过一个或多个开口进入的空间。
38.如权利要求27至37中任一项所述的组合物，所述组合物还包含细胞培养基，所述细胞培养基包含约5皮克/毫升至约20皮克/毫升的浓度的神经生长因子(NGF)和/或约0.001％重量/体积至约0.01％重量/体积的范围内的浓度的抗坏血酸。
39.如权利要求27至38中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个神经元细胞包含选自包括以下各项的组的至少一种细胞：胶质细胞、胚胎细胞、间充质干细胞、以及衍生自诱导多能干细胞的细胞。
40.如权利要求27至39中任一项所述的组合物，所述组合物还包含一个或多个干细胞或多能细胞。
41.如权利要求27至40中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个神经元细胞包含源自于所述哺乳动物的外周神经系统的原代哺乳动物细胞。
42.如权利要求27至41中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶基体包含至少1％的聚乙二醇(PEG)。
43.如权利要求27至42中任一项所述的组合物，其中所述神经元细胞和/或组织外植体在培养中不少于3天、30天、90天或365天。
44.如权利要求27至43中任一项所述的组合物，其中所述固体基质的至少一部分是圆柱形的或基本上圆柱形的以使得所述固体基质的内表面的至少一部分限定圆柱形或基本上圆柱形的中空内室，其中所述一个或多个施旺细胞和所述一个或多个神经元接触。
45.如权利要求27至44中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个组织外植体包含一个或多个DRG，所述DRG具有约100微米至约500微米宽的和约0.11微米至约10000微米长的轴突生长。
46.如权利要求27至45中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少两个电极，所述电极与电化学电池和电压计可操作地连通，其中第一刺激电极被定位在所述组织外植体的细胞体处或附近并且第二记录电极被定位在轴突的远端处或附近以使得所述电极沿着所述组织外植体中的至少一个细胞的膜的距离形成电压差。
47.一种评估来自一个或多个神经元细胞的响应的方法，所述方法包括：
在培养容器中培养一个或多个神经元细胞；
将一种或多种刺激引入所述一个或多个神经元细胞中；以及
测量所述一个或多个神经元细胞对所述一种或多种刺激的一种或多种响应。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述一个或多个神经元细胞包含感觉外周神经元。
49.如权利要求47至48中任一项所述的方法，其中所述一个或多个神经元细胞包含选自以下各项的细胞中的至少一种或组合：脊髓运动神经元、交感神经元、以及中枢神经系统(CNS)神经元。
50.如权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述培养容器包含与具有预定形状的固体基质交联的水凝胶基体，并且其中所述水凝胶基体包含至少一种细胞不可穿透聚合物和至少一种细胞可穿透聚合物。
51.如权利要求47至50中任一项所述的方法，其中所述水凝胶基体包含选自以下各项的化合物中的一种或组合：Puramatrix、甲基丙烯酸酯化透明质酸、琼脂糖、甲基丙烯酸酯化肝素、以及甲基丙烯酸酯化葡聚糖。
52.如权利要求47至51中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激包括电流并且所述一种或多种响应包括电生理学量度。
53.如权利要求47至52中任一项所述的方法，其中通过光学记录技术来测量所述响应。
54.如权利要求47至53中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激包括以下各项中的一种或组合：一种或多种光遗传学执行子、一种或多种笼锁神经递质、一种或多种红外激光、或一种或多种光门控离子通道。
55.如权利要求47至54中任一项所述的方法，其中所述测量的步骤包括监测电压敏感性染料、钙染料的移动、或使用无标记光子成像。
56.如权利要求47至55中任一项所述的方法，其中所述一个或多个神经元细胞包含分离的原代神经节组织。
57.如权利要求47至56中任一项所述的方法，其中所述固体基质的至少一部分是通过光刻而被微图案化的并且包含外表面、内表面、以及由所述至少一个内表面所限定的至少一个内室；其中所述方法还包括将所述一个或多个神经元细胞接种到所述微图案化的固体基质中以使得所述一个或多个神经元细胞的生长局限于由所述至少一个内室所限定的特定几何形状。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述内室将细胞体与轴突突起分开在不同的位置。
59.如权利要求47至58中任一项所述的方法，其中所述一个或多个神经元细胞源自于原代人类组织或人类干细胞。
60.如权利要求47至59中任一项所述的方法，其中所述一个或多个神经元细胞是原代哺乳动物神经元。
61.如权利要求47至60中任一项所述的方法，其中所述至少一个神经元细胞包含分离的DRG或其碎片；并且诱导来自所述一个或多个神经元细胞的刺激包括将刺激电极放置在所述DRG或其碎片的细胞体处或附近并且将记录电极放置在最远离所述细胞体的轴突突起处或附近。
62.如权利要求47至61中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激包括电刺激或化学刺激。
63.如权利要求47至62中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激包括使所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体与至少一种药理活性化合物接触。
64.一种评价试剂的毒性的方法，所述方法包括：
(a)在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中培养一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；
(b)使至少一种试剂暴露于所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；
(c)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；以及
(d)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述试剂的毒性相关联，以使得如果所述形态测定变化指示细胞活力降低，那么将所述试剂表征为具有毒性，并且如果所述形态测定变化指示细胞活力不变或提高，那么将所述试剂表征为无毒的。
65.一种评价试剂的毒性的方法，所述方法包括：
(a)在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中培养一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；
(b)使至少一种试剂暴露于所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体；
(c)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度；以及
(d)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度与所述试剂的毒性相关联，以使得如果所述电生理学量度指示细胞活力降低，那么将所述试剂表征为具有毒性，并且如果所述电生理学量度指示细胞活力不变或提高，那么将所述试剂表征为无毒的；
其中步骤(c)任选地包括和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；并且
其中步骤(d)任选地包括使所述一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述试剂的毒性相关联，以使得如果所述形态测定变化指示细胞活力降低，那么将所述试剂表征为具有毒性，并且如果所述形态测定变化指示细胞活力不变或提高，那么将所述试剂表征为无毒的。
66.如权利要求64至65中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂包括小化合物。
67.如权利要求64至66中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂包括至少一种环境污染物或工业污染物。
68.如权利要求64至66中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂包括选自以下各项的小化合物中的一种或组合：化学治疗剂、镇痛剂、心血管调节剂、胆固醇水平调节剂、神经保护剂、神经调节剂、免疫调节剂、抗炎剂、以及抗微生物药物。
69.如权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述一个或多个电生理学量度是以下各项中的一个或组合：电传导速度、动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的包络。
70.如权利要求65至69中任一项所述的方法，其中所述一个或多个电生理学量度包括跨组织外植体的复合动作电位。
71.一种测量一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：
(a)将一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下培养在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中；
(b)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；以及
(c)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述神经元细胞或组织外植体的髓鞘形成的定量变化或定性变化相关联。
72.一种测量一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：
(a)将一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下培养在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中；
(b)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度；以及
(c)使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度与所述神经元细胞或组织外植体的髓鞘形成的定量变化或定性变化相关联；
其中步骤(b)任选地包括和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化；并且
其中步骤(c)任选地包括使所述一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的一种或多种形态测定变化与所述神经元细胞或组织外植体的髓鞘形成的定量变化或定性变化相关联。
73.一种测量一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：
(a)将一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下培养在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中；以及
(b)检测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突上髓鞘形成的量。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述检测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突上髓鞘形成的量的步骤包括使所述细胞暴露于结合髓磷脂的抗体。
75.如权利要求71至74中任一项所述的方法，所述方法还包括：(i)在步骤(a)和(b)之后使一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体暴露于至少一种试剂；(ii)测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个电生理学量度、测量和/或观测所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一种或多种形态测定变化、和/或检测来自所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的髓磷脂的定量；(iii)计算在存在和不存在所述试剂的情况下来自所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体的测量结果、观测结果和/或髓磷脂的定量的变化；以及(iv)使来自所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体的所述测量结果、观测结果和/或髓磷脂的定量的变化与所述试剂的存在或不存在相关联。
76.如权利要求75中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂包括至少一种环境污染物或工业污染物。
77.如权利要求75至76中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂包括选自以下各项的小化合物中的一种或组合：化学治疗剂、镇痛剂、心血管调节剂、胆固醇水平调节剂、神经保护剂、神经调节剂、免疫调节剂、抗炎剂、以及抗微生物药物。
78.如权利要求72中任一项所述的方法，其中所述一个或多个电生理学量度是以下各项中的一个或组合：电传导速度、动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞的膜的电脉冲的包络。
79.如权利要求72或78中任一项所述的方法，其中所述一个或多个电生理学量度包括跨组织外植体的复合动作电位。
80.一种测量一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体的一个或多个轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：
(a)将一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体在足以使至少一个轴突生长的时间内和条件下培养在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中；以及
(b)在所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体中诱导复合动作电位；
(c)测量所述复合动作电位；以及
(d)基于所述复合动作电位对所述一个或多个神经元细胞的髓鞘形成的水平进行定量。
81.如权利要求80所述的方法，所述方法还包括使所述一个或多个神经元细胞和/或一个或多个组织外植体暴露于试剂。
82.如权利要求81中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂包括至少一种环境污染物或工业污染物。
83.如权利要求81或82中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂包括选自以下各项的小化合物中的一种或组合：化学治疗剂、镇痛剂、心血管调节剂、胆固醇水平调节剂、神经保护剂、神经调节剂、免疫调节剂、抗炎剂、以及抗微生物药物。
84.如权利要求80至83中任一项所述的方法，所述方法还包括测量选自以下各项中的一个或组合的除复合动作电位以外的一个或多个电生理学量度：电传导速度、单个动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的包络。
85.如权利要求80至84中任一项所述的方法，所述方法还包括测量与所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体相关的一种或多种形态测定变化。
86.一种在包含固体基质的三维培养容器中诱导一个或多个神经元细胞生长的方法，所述方法包括：
(a)用所述固体基质接种一个或多个分离的施旺细胞；
(b)将于悬浮液中的一个或多个分离的神经元细胞或于外植体中的分离的神经元细胞接种到至少一个内室中；
(c)将细胞培养基以足以覆盖至少所述细胞的体积引入到所述培养容器中；
其中所述固体基质包含第一细胞不可穿透聚合物和第一细胞可穿透聚合物。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述固体基质包含外表面和内表面，所述固体基质包含呈圆柱形或基本上圆柱形的形状的至少一部分以及至少一个中空内部，所述中空内部在它的边缘处由所述内表面的至少一部分所限定；所述内表面包含具有约0.1微米至约1.0微米的直径的一个或多个孔隙，其中所述固体基质的中空内部是可从所述固体基质外部的点经由至少一个开口进入的；
其中所述中空内部部分包含接近所述开口的第一部分和远离所述开口的至少第二部分；其中所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体被定位在所述中空内部的第一部分处或附近并且与所述第一细胞不可穿透聚合物或所述第一细胞可穿透聚合物中的至少一种进行物理接触，并且
其中所述至少一个中空内部的第二部分与所述第一部分处于流体连通以使得轴突能够从所述一个或多个神经元细胞和/或所述一个或多个组织外植体生长到所述中空内部的第二内部部分中。
88.如权利要求86至87中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述一个或多个神经元细胞与至少一种试剂接触。
89.如权利要求86至88中任一项所述的方法，其中所述至少一种试剂是一个或多个干细胞或修饰的T细胞。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述修饰的T细胞表达对癌细胞具有特异性的嵌合抗原受体。
91.如权利要求86至90中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基包含以下各项中的一种或组合：层粘连蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、BSA、FBS、抗坏血酸、I型胶原、以及III型胶原。
92.一种检测和/或定量神经元细胞生长的方法，所述方法包括：
(a)对一个或多个神经元细胞进行定量；
(b)在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中培养所述一个或多个神经元细胞；以及
(c)在培养足以允许所述一个或多个细胞生长的一段时间之后计算所述组合物中神经元细胞的数目。
93.如权利要求92所述的方法，其中步骤(c)包括在培养一个或多个神经元细胞之后检测所述一个或多个神经元细胞的内部记录和/或外部记录并且使所述记录与对应于已知或对照数目的细胞的相同记录的测量结果相关联。
94.如权利要求92至93中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述一个或多个神经元细胞与一种或多种试剂接触。
95.如权利要求92至94所述的方法，所述方法还包括：(i)在所述使所述一个或多个神经元细胞与所述一种或多种试剂接触的步骤之前和之后测量细胞内记录和/或细胞外记录；以及(ii)使所述在使所述一个或多个神经元细胞与所述一种或多种试剂接触之前的记录和所述在使所述一个或多个神经元细胞与所述一种或多种试剂接触之后的记录的差异与细胞数的变化相关联。
96.一种检测或定量一个或多个神经元细胞的轴突变性的方法，所述方法包括：
(a)将一个或多个神经元细胞接种到如权利要求27至46中任一项所述的组合物中；
(b)在足以使至少一个或多个轴突从所述一个或多个神经元细胞生长的时间段内和条件下培养所述一个或多个神经元细胞；
(c)对从所述神经元细胞生长的轴突的数目或密度进行定量；
(d)使所述一个或多个神经元细胞与一种或多种试剂接触；
(e)在使所述一个或多个细胞与一种或多种试剂接触之后对所述从神经元细胞生长的轴突的数目和/或密度进行定量；以及
(f)计算在存在或不存在所述试剂的情况下培养物中轴突的数目或密度的差异。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述从神经元细胞生长的所述一个或多个轴突和/或所述轴突的密度的步骤包括将所述一个或多个神经元细胞用染料、荧光团、或标记的抗体染色。
98.如权利要求96至97中任一项所述的方法，其中步骤(c)、步骤(e)、和/或步骤(f)是经由显微镜术或数字成像进行的。
99.如权利要求96至98中任一项所述的方法，其中步骤(c)和步骤(e)包括获取来自一个或多个轴突的接近一个或多个细胞体的部分的测量结果并且获取来自一个或多个轴突的远离一个或多个细胞体的部分的测量结果。
100.如权利要求96至99中任一项所述的方法，其中所述在存在或不存在所述试剂的情况下培养物中轴突的数目或密度的差异是所述一个或多个神经元细胞的一个或多个轴突的接近细胞体的部分与所述一个或多个神经元细胞的轴突的远离所述细胞体的部分之间的差异。
101.如权利要求99所述的方法，其中获取测量结果包括测量以下各项中的任一个或组合：形态测定量度或电生理学量度，并且其中所述计算培养物中所述轴突的数目或密度的差异的步骤包括使测量结果中的任一个或组合与所述轴突的数目或密度相关联。
102.如权利要求99所述的方法，其中获取测量结果包括测量电生理学量度中的任一个或组合并且其中所述计算培养物中所述轴突的数目或密度的差异的步骤包括使电生理学量度中的任一个或组合与所述轴突的数目或密度相关联。
103.如权利要求96至101中任一项所述的方法，所述方法还包括(g)使试剂的神经变性作用与在步骤(c)和步骤(e)中所获取的电生理学量度相关联。
104.一种测量细胞内记录或细胞外记录的方法，所述方法包括：
(a)在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中培养一个或多个神经元细胞；
(b)跨越所述一个或多个神经元细胞施加电压电位；以及
(c)从所述一个或多个神经元细胞测量一个或多个电生理学量度。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述一个或多个电生理学量度选自以下各项中的一个或组合：电传导速度、细胞内动作电位、复合动作电位、与沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲通过相关的波的振幅、沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的宽度、所述沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的潜伏期、以及所述沿着一个或多个神经元细胞和/或组织外植体的膜的电脉冲的包络。
106.一种测量或定量试剂的任何神经保护作用的方法，所述方法包括：
(a)在存在和不存在所述试剂的情况下将一个或多个神经元细胞或组织外植体培养在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中；
(b)在存在和不存在所述试剂的情况下跨越所述一个或多个神经元细胞或组织外植体施加电压电位；
(c)在存在和不存在所述试剂的情况下从所述一个或多个神经元细胞或组织外植体测量一个或多个电生理学量度；以及
(d)使通过所述一个或多个神经元细胞或组织外植体的一个或多个电生理学量度的差异与所述试剂的神经保护作用相关联，以使得与所述在不存在所述试剂的情况下所测量的电生理学量度相比，在所述试剂存在下所述电生理学量度的下降指示不佳的神经保护作用，并且与所述在不存在所述试剂的情况下所测量的电生理学量度相比，在所述试剂存在下所述电生理学量度没有变化或倾斜指示所述试剂赋予神经保护作用。
107.一种测量或定量试剂的任何神经调节作用的方法，所述方法包括：
(a)在存在和不存在所述试剂的情况下将一个或多个神经元细胞或组织外植体培养在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中；
(b)在存在和不存在所述试剂的情况下跨越所述一个或多个神经元细胞或组织外植体施加电压电位；
(c)在存在和不存在所述试剂的情况下从所述一个或多个神经元细胞或组织外植体测量一个或多个电生理学量度；以及
(d)使通过所述一个或多个神经元细胞或组织外植体的一个或多个电生理学量度的差异与所述试剂的神经调节作用相关联，以使得与所述在不存在所述试剂的情况下所测量的电生理学量度相比，在所述试剂存在下所述电生理学量度变化指示神经调节作用，并且与所述在不存在所述试剂的情况下所测量的电生理学量度相比，在所述试剂存在下所述电生理学量度没有变化指示所述试剂不赋予神经调节作用。
108.一种在体外检测或定量轴突的髓鞘形成或脱髓鞘的方法，所述方法包括：
(a)将一个或多个神经元细胞在足以使所述一个或多个神经元细胞生长一个或多个轴突的时间内和条件下培养在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中；
(b)跨越所述一个或多个神经元细胞施加电压电位；以及
(c)测量通过所述一个或多个神经元细胞的场电位或复合动作电位；
(d)计算通过所述一个或多个神经元细胞的传导速度；以及
(e)使所述一个或多个值或传导速度与所述一个或多个轴突的髓鞘形成的量相关联。
109.如权利要求108所述的方法，所述方法还包括使步骤(d)的传导速度与已知或预定数目的有髓鞘的健康的神经元细胞的传导速度值相关联。
110.如权利要求108至109中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述一个或多个神经元细胞暴露于试剂；其中步骤(a)-(e)是在所述试剂存在下进行的并且所述方法还包括评估由于所述试剂的存在所引起的髓鞘形成量的差异，其中将在所述试剂存在下所述细胞的传导速度与在不存在所述试剂的情况下所述细胞的传导速度相比较。
111.如权利要求47至110中任一项所述的方法，所述方法还包括使用显微镜和/或数字照相机使所述一个或多个神经元细胞和/或组织外植体成像。
112.一种培养干细胞或免疫细胞的方法，所述方法包括：
(a)在如权利要求27至46中任一项所述的组合物中培养一个或多个神经元细胞和/或组织外植体；以及
(b)使分离的干细胞或免疫细胞暴露于所述组合物。
113.一种系统，所述系统包括：
(i)包含水凝胶的细胞培养容器；
(ii)于悬浮液中或作为组织外植体的组分的一个或多个神经元细胞；
(iii)包括用于电流的发生器的放大器；
(iv)电压计和/或电流计；
(v)至少第一刺激电极和至少第一记录电极；
其中所述放大器、电压计和/或电流计以及电极是经由电路彼此电连接的，其中电流从所述放大器馈送到所述至少一个刺激电极并且电流在所述记录电极处被接收并且馈送到所述电压计和/或电流计；其中所述刺激电极被定位在所述神经元细胞的一个或多个细胞体处或附近，并且所述记录电极被定位在远离所述细胞体预定距离处，以使得跨越所述细胞培养容器建立电场。
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