CN111849770A - 一种建立体外神经网络的方法、体外神经网络及其应用 - Google Patents

一种建立体外神经网络的方法、体外神经网络及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种建立体外神经网络的方法、体外神经网络及其应用。本申请建立体外神经网络的方法，包括采用透明导电材料为培养皿，并采用微阵列电极为底座，将培养皿嵌套安装于底座上；将不同类型的神经元细胞通过分区培养，在不同位置培养形成不同类型神经元；同时，在细胞开始成熟并生长神经纤维阶段，诱导神经纤维定向生长，连接形成所需体外神经网络或神经回路。本申请方法，能高效构建完整的神经元群落或神经合团，更好进行神经回路研究或药物筛选；本申请方法采用透明导电的培养皿配合微阵列电极底座，可同时进行电位记录和激光共聚焦显微镜观测，简化了实验成本、提高了药物筛选效率，真正实现了电生理功能检测和细胞学成像一体化研究。

Description

一种建立体外神经网络的方法、体外神经网络及其应用
技术领域
本申请涉及体外神经网络技术领域，特别是涉及一种建立体外神经网络的方法、体外神经网络及其应用。
背景技术
大脑的基本单位是神经元，而神经元之间的链接是决定大脑功能的重要结构。有研究显示，神经连接的特异性决定了脑功能在不同个体之间的差异(Crochet et al.,2018)。而神经环路是神经连接的主要表现，其失调在不同类型的神经精神类疾病中扮演着关键作用。神经连接在人格形成、行为学调控、学习记忆甚至深度学习模式建立中均起到了十分关键的作用。从治疗学角度出发，多种难治性神经精神类疾病，包括精神分裂、自闭症、老年性痴呆、帕金森病、抑郁症、双向情感障碍等均存在神经连接或者神经核团网络功能障碍(Raj and Powell,2018)。而目前这些严重的神经精神类疾病大部分没有有效的治疗药物，所以高通量的药物筛查是目前有效的研发药物开发手段。同时，多能诱导干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)技术为人类疾病的体外模型建立提供了基础，病人来源的iPSC建立并诱导的体外神经元能够提供可靠的疾病模型，尤其是针对多种复杂的神经精神类疾病(Chen et al.,2018)。而目前急需完成的，是如何高效的建立疾病模型下的神经网络并对其进行研究，从而实现药物开发与筛选。
目前对这些疾病中神经网络功能的研究主要通过在体光遗传学方法在动物模型上进行研究。然而，动物模型无法满足大规模药物筛查的需求，且光遗传手段十分依赖于实验室设备与操作人员技术。并且，现有的体外细胞模型均无法提供一整套从神经网络建立到电生理刺激记录到后续生化检测的全套培养体系与实验工具。
体外神经细胞培养是目前最流行的神经疾病体外模型建立的基本手段。主要包括：类神经元元系培养、原代神经元培养和多能诱导干细胞(iPSC)诱导形成神经元培养。其中，类神经元细胞系培养因其细胞系的高度异质性，无法完整的模拟真正神经元的功能特征，如突触连接，电信号传递等。而这些功能的异常是神经精神类疾病的主要特点，故类神经元细胞系培养并不能完整模拟神经元的细胞形态。原代神经元培养是从胎鼠体内得到脑组织并分离形成原代神经元。这些神经元是真正的神经细胞并能够模拟神经元的一切功能，但是因为在体外培养的条件下，神经元之间形成的神经连接无法像脑内形成的完整神经元群落或神经合团之间的神经投射，故该模型也无法模拟真正的神经回路。iPSC诱导形成的神经元具有人体原本基因印记，故可以较完整的模拟病人的病理状态，是很好的体外神经培养模型。同时，目前有研究可以通过微流控诱导方法形成体外神经回路(Sarkar etal.,2018)。但是，研究中使用的电生理记录方法为膜片钳手段，无法得到体外模拟的神经核团的场电位数据；并且，重复利用率低，且无法同时进行电位记录和激光共聚焦显微镜观测。同时，iPSC诱导神经元成本较高，并不能满足大量药物筛查的需要。
此外，光遗传与脑电记录两种方法均需要在动物脑部进行开颅手术并植入光导纤维或电极，所以成本较高，也无法满足高通量药物筛查的需要。虽然光遗传手段可以用于体外，然而前提必须是体外神经元能够形成成蔟神经环路；而如前面所说，目前的体外神经细胞培养难以做到成蔟神经环路。
发明内容
本申请的目的是提供一种改进的建立体外神经网络的方法、体外神经网络及其应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种建立体外神经网络的方法，包括采用透明导电材料作为培养皿，并采用微阵列电极作为底座，将培养皿嵌套安装于底座上；将不同类型的神经元细胞通过分区培养，在不同位置培养形成不同类型的神经元；同时，在细胞开始成熟并生长神经纤维阶段，诱导神经纤维定向生长，连接形成所需的体外神经网络或神经回路；其中，具有微阵列电极的底座用于进行电生理记录，透明的培养皿方便后续观察和检测。
需要说明的是，本申请的体外神经网络建立方法，通过分区培养可以有效的模拟脑内的完整神经元群落或神经合团；采用透明导电的培养皿配合微阵列电极底座，可以同时进行电位记录和激光共聚焦显微镜观测，可以对体外神经元的功能与形态进行实时监测。本申请的方法简化了神经核团连接实验成本、实现了对体外神经元功能的随时监测、提高了药物筛选效率；并且，基于本申请的方法，可以用于其它类型细胞连接的研究。采用本申请的方法，可以实现体外神经核团连接建立、电生理功能检测、细胞学成像等一体化研究。
优选的，透明导电材料为ITO导电玻璃。
需要说明的是，ITO导电玻璃只是本申请的一种实现方式中经过证实可以采用的透明导电材料，不排除还可以采用其它类似性能的透明导电材料。
优选的，诱导神经纤维定向生长，具体包括，采用梯度神经营养因子或微流控技术，在输入侧诱导神经轴突生长，在输出侧诱导树突生长，最终形成连接。其中，梯度神经营养因子是指梯度浓度的神经营养因子。
优选的，本申请的体外神经网络建立方法中，采用的神经营养因子包括脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)和/或胶质细胞源性神经营养因子(glia-derived neurotrophic factor,GDNF)。
优选的，采用梯度神经营养因子诱导神经纤维定向生长，具体包括，在输出侧的培养孔中加入浓度为10ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF以及浓度为2ng/mL的胶质神经营养因子GDNF，在输入侧的培养孔中加入浓度为2ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF以及浓度为10ng/mL的胶质神经营养因子GDNF。
优选的，在进行梯度神经营养因子诱导神经纤维定向生长之前，还包括预先在输出侧的培养孔中加入2ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF和2ng/mL的胶质神经营养因子GDNF，同时，在输入侧的培养孔中也加入2ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF和2ng/mL的胶质神经营养因子GDNF，进行预先诱导，培养5-10天后，再进行梯度神经营养因子诱导，并加大培养基的量为预先诱导的至少两倍。例如，本申请的一种实现方式中，预先诱导采用约500μL的培养基，梯度神经营养因子诱导采用的培养基为1mL，是之前的两倍。
需要说明的是，本申请的诱导培养和预先诱导培养中，各神经营养因子的具体浓度只是本申请的一种实现方式中具体采用的浓度，可以在以上具体浓度的基础上，根据实际培养需求进行调整。原则上，预先诱导在输入侧和输出侧都采用较低浓度的BDNF和GDNF；然后，在梯度诱导中，输出侧采用较高浓度的BDNF和较低浓度的GDNF，输入侧则相反，采用较低浓度的BDNF和较高浓度的GDNF。
优选的，后续观察和检测包括细胞成像观察、免疫荧光成像检测或蛋白质组学研究。
优选的，神经元细胞为海马体神经元细胞。可以理解，海马体神经元细胞只是本申请实施例中构建的一种体外神经网络，在相同的构思下，还可以适用于其它神经元细胞的体外神经网络构建。
本申请的另一面公开了本申请的方法建立的体外神经网络。
本申请的再一面公开了本申请的方法建立的体外海马体CA3-CA1神经网络。
可以理解，与现有方法建立的体外神经网络相比，本申请方法建立的体外神经网络或体外海马体CA3-CA1神经网络，能够更有效的模拟脑内的完整神经元群落或神经合团，从而更有效的进行神经回路的相关研究或药物筛选；并且，本申请方法建立的体外神经网络，可以同时进行电位记录和激光共聚焦显微镜观测，真正实现了体外神经核团连接建立、电生理功能检测、细胞学成像等一体化研究。
本申请的再一面公开了本申请的体外神经网络建立方法、本申请的体外神经网络或本申请的体外海马体CA3-CA1神经网络在细胞体外研究或药物筛选中的应用。
需要说明的是，本申请的体外神经网络建立方法、体外神经网络不仅可以用于神经细胞研究，基于相同的发明构思还可以用于其它细胞及相关群体的研究，以及各种药物筛选，包括但不仅限于神经精神类药物。
本申请的有益效果在于：
本申请建立体外神经网络的方法，能够高效的构建完整的神经元群落或神经合团，从而更好的进行神经回路研究或药物筛选；并且，本申请方法采用透明导电的培养皿配合微阵列电极底座，可以同时进行电位记录和激光共聚焦显微镜观测。本申请的方法简化了神经核团连接实验成本、实现了对体外神经元功能的随时监测、提高了药物筛选效率，真正实现了电生理功能检测和细胞学成像的一体化研究。
附图说明
图1是本申请实施例中构建的体外神经核团检测系统平面观示意图；
图2是本申请实施例中构建的体外神经核团检测系统侧面观示意图；
图3是本申请实施例中培养皿底座排布的微阵列电极结构示意图；
图4是本申请实施例中构建的体外神经网络的激光共聚焦显微镜观察结果图；
图5是本申请实施例中高频刺激的刺激侧和记录侧的结构示意图；
图6是本申请实施例中对构建的体外神经网络进行高频刺激记录的fEPSP斜率；
图7是本申请实施例中多肽beta淀粉样蛋白处理构建的体外神经网络细胞后的细胞活力测试结果；
图8是本申请实施例中多肽beta淀粉样蛋白处理和脑保护药物吡拉西坦处理构建的体外神经网络细胞后的激光共聚焦显微镜观察结果；
图9是本申请实施例中多肽beta淀粉样蛋白处理和脑保护药物吡拉西坦处理构建的体外神经网络细胞后的细胞活力测试结果；
图10是本申请实施例中多肽beta淀粉样蛋白处理和脑保护药物吡拉西坦处理构建的体外神经网络细胞后进行高频刺激记录的fEPSP斜率。
具体实施方式
目前，市场尚无体外诱导的神经环路。体外神经元场电位刺激与记录系统在国际市场仍十分有限，在国内市场尚无。并且，目前市场上的体外刺激记录系统无法完整模拟脑内生理状态。
因此，通过建立体外神经核团网络，并设计神经网络培养体系，集神经网络建立、神经电生理刺激与记录，并支持后续生化或形态学检测为一体的体外神经网络平台，对于大规模药物筛选是十分必要的。通过诱导不同类型的神经网络连接，科学家以及药物研发机构能够有效的筛选出对于各类神经精神类疾病的治疗药物并准确阐述病理机理以及药物作用原理。
基于以上研究和认识，本申请将基于传统细胞培养板，发展的体外特异性神经环路培养系统；通过对传统培养盘以及对培养基进行改进，通过分区域培养，在不同位置以培养不同类型神经元；同时，在细胞开始成熟并生长神经纤维阶段，利用不同梯度差异的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)或微流控技术，在输入侧诱导神经轴突(Axon)生长，同时输出侧诱导树突(dendrite)生长。具体的，本申请体外神经网络的建立方法，包括采用透明导电材料作为培养皿，并采用微阵列电极作为底座，将培养皿嵌套安装于底座上；将不同类型的神经元细胞通过分区培养，在不同位置培养形成不同类型的神经元；同时，在细胞开始成熟并生长神经纤维阶段，诱导神经纤维定向生长，连接形成所需的体外神经网络或神经回路；其中，具有微阵列电极的底座用于进行电生理记录，透明的培养皿方便后续观察和检测。
本申请的一种实现方式中，具体采用梯度脑源性神经营养因子或微流控技术，在输入侧诱导神经轴突生长，在输出侧诱导树突生长，最终形成连接，体外神经核团检测系统平面观示意图如图1所示，体外神经核团检测系统侧面观示意图如图2所示。图2中，A为输出侧的培养，C为输入侧的培养，E为中间区域引入的坡度分隔，B和D为具有坡度的梯度脑源性神经营养因子；图2中，中间图为前体细胞帖壁并开始形成连接之前的培养，此时培养基液面相对较低，以便于分区域培养，最下面的示意图为前体细胞帖壁并开始形成连接时，加入培养基没过中间区分隔，诱导两部分区域形成连接。
以大脑海马区为例，海马是具有极高神经可塑性的结构。其关键神经环路包括CA3-CA1以及DG-内嗅皮层，目前研究此类神经环路电生理活性的方法有微阵列电击脑片记录法以及绑定电击颅内记录等方法，然而在体记录并不能满足高通量药物筛选的要求。除此之外，脑内大量的神经环路，例如海马-杏仁核、纹状体-黑质、海马-神经基底节、中脑-皮层等，与各类神经系统疾病密切相关，例如如抑郁症、焦虑症、帕金森病、阿尔兹海默病等。此外，对于特定神经群落的研究，体外细胞培养实验更具有优势。以在体以及人体实验为依据，建立体外神经环路模型并进行药物筛选，是神经精神疾病药物开发的新策略。
与现有的体外神经网络建立方法相比，本申请的方法具有以下优点：
1.简化了神经核团连接实验成本
目前对神经网络的研究方法主要是在体电生理研究，例如多通道脑电记录或在体神经可塑性记录。若要进一步研究在体脑内神经元形态以及突触数目变化，则需要提前用病毒转染荧光蛋白，或使用带有特定细胞荧光的转基因动物。这种方法通常需要较高的成本与时间，同时在特定情况下还需要开颅定位注射病毒。而离体电生理记录完成后，仅需要普通质粒转染方法，如钙转或脂质体转染，即可实现对神经元的形态标记。本申请采用离体手段建立了体外神经连接，并且配套有场电位记录系统对不同的连接单元进行刺激以及记录，使得研究的时间与经费成本大大降低。加之某些特殊的神经精神类疾病引起发病机制的复杂性并无业界广泛认可的动物模型，而病人iPSC诱导产生的神经元则成为了最有效和最直接的研究方法。结合这种干细胞诱导手段，本申请可以通过一体化检测体外神经连接的电生理功能、细胞形态、特异性的神经细胞类型的分布与生物化学或分子生物学指标，从而提高研究效率，为临床诊断与治疗提供更快捷的指导。
本申请的方法将神经电生理记录、神经网络连接、神经成像结合形成整套检测平台。方便科研及企业研发单位针对不同类型神经系统疾病进行药物研发。采用透明导电材料，既可以满足神经电生理记录，又能够在记录结束后对神经元进行后续检测，例如如成像、蛋白检测、组学研究等，尤其是免疫荧光等成像检测。在电生理和形态学两方面同时进行研究。
2.实现了对体外神经元功能的随时监测
体外神经元功能与形态的研究方法包括电生理与细胞成像。而在神经干细胞研究中，监测神经活动是证明干细胞发育必不可少的过程。通过该方法，可以随时将神经元培养皿嵌套在记录盒中进行电活动监测以准确记录神经干细胞成熟时间点。
3.提高了药物筛选效率
多数神经精神类药物依赖对脑内神经递质的调节，而多数神经精神类疾病与神经网络或神经连接异常有关。目前神经网络或神经连接的检测手段更多依赖于在体检测方法；本申请通过构建体外的神经连接，结合一体化的电生理与神经生物学检测手段，将大大提高神经精神类药物筛选效率，从而为药物开发提供更高效的研究手段。
多数神经疾病病因是由于异常核团连接引起，通过本申请的方法能够同时筛选大量药物对核团连接的功能恢复作用。同时，后续成像检测可以进一步帮助了解药物的细胞学机制。本申请的方法和构建的体外神经网络能够大大加快神经疾病药物的筛选效率。例如，通过建立原代动物神经体外核团或人iPSC诱导的神经核团为模型，可以大大提高药物筛选效率。同时，通过建立病人iPSC分化的体外神经核团，筛选最适合神经功能恢复药物，可以更有助于达到精准治疗的目的。
4.同样的模式能够适用于其他类型细胞连接的研究
除了中枢神经相关合团形成神经连接外，外周神经损伤如失神经肌萎缩，外周神经再生等基础研究与药物开发也同样需要构建满足大量药物筛查的体外模型。与体外神经网络模型建立的原理一致，本申请同样可以通过不同条件和细胞类型构建体外外周神经与肌肉细胞连接模型，并且满足外周神经功能的基础研究与外周神经损伤的药物筛选的要求。例如，通过本申请的方法和构建的体外神经网络，可以进一步建立神经肌肉连接、神经内分泌腺体连接等多种体系。研究运动神经元系统、神经内分泌系统等功能。同样可以提高相关领域药物研发与科研效率。
下面通过具体实施例结合附图对本申请进行详细说明。以下实施例仅用于对本申请进行说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
一、材料与设备
1.材料
1.1研究对象
神经细胞：本例采用大鼠元代海马神经元诱导体外神经网络。
1.2主要试剂
干细胞维持培养基，神经细胞基础培养液Neurobasal；及其添加成分B27，GlutaMax，MEM-NEAA均购自ThermoFisher公司。脑源性神经营养因子BDNF，胶质神经营养因子GDNF，购自Novoprotein公司。Accutase消化液购自ThermoFisher公司。多聚赖氨酸PDL购自ThermoFisher公司。Piracetam吡拉西坦购自Sigma公司。
2.主要器材
透明导电材料的培养皿具体为ITO导电玻璃，底座上具有排布8×8，64通道的微阵列电极，如图3所示，电生理记录仪采用购自以色列AMPI公司，激光共聚焦显微镜型号为尼康C2。
二、体外神经网络建立
本例采用透明导电材料作为培养皿，即ITO导电玻璃培养皿，并采用微阵列电极作为底座，将培养皿嵌套安装于底座上；将不同类型的神经元细胞通过分区培养，在不同位置培养形成不同类型的神经元；同时，在细胞开始成熟并生长神经纤维阶段，诱导神经纤维定向生长，连接形成所需的体外神经网络或神经回路；其中，具有微阵列电极的底座用于进行电生理记录，透明的培养皿方便后续观察和检测。本例具体的，培养皿为“2.主要器材”的培养皿，采用大鼠元代海马神经元诱导建立体外神经网络，具体培养方法如下：
每孔培养体系中加入1mL的5％PDL，并在37℃铺板1小时。在细胞铺板前吸去PDL。其中，PDL采用PBS稀释。
17.5天孕期大鼠处死后，取其胚胎并分离胎鼠脑组织并在解剖镜下分离海马并用组织剪剪碎。组织碎块随即通过Accutase消化液37℃下孵育15min。其后吸去消化液并加入Neurobasal培养基，将组织吹打至单细胞状态并自然沉积30分钟。取上清液细胞计数并种板，每孔10万细胞种入培养孔中。
如图2所示，预先在输出侧A的培养孔中加入含有2ng/mL BDNF和2ng/mL GDNF的Neurobasal培养基，同时在输入侧C的培养孔中加入含有2ng/mL BDNF和2ng/mL GDNF的Neurobasal培养基，进行预先诱导；预先诱导时加入少量培养基，约500μL。预先诱导5-10天后，进行梯度神经营养因子诱导，本例具体预先诱导培养10天。然后，在A区培养孔中加入浓度为10ng/mL的BDNF及浓度为2ng/mL的GDNF；在C区培养孔中加入浓度为2ng/mL的BDNF及浓度为10ng/mL的GDNF；并加大培养基量至约1mL，直至培养基在上层通道融合，诱导神经纤维形成连接。
三、形态观察及电生理功能展示
采用激光共聚焦显微镜观察所构建的体外神经网络，并采用电生理记录仪记载体外神经网络的电生理功能。具体的，本例对构建的体外神经网络的刺激侧施加20Hz的高频刺激，如图5所示，记录另一端，即记录侧，的神经长时程增强(long-term potentiation,LTP)的建立情况，以此评价神经连接及神经可塑性的形成；本例分别测试并记录了高频刺激0min、第30min、第60min的fEPSP。
四、测试结果
激光共聚焦显微镜观察结果如图4所示，可以观察到两端神经连接成功形成。
通过对刺激侧施加高频刺激(20Hz)以记录另一端神经长时程增强(long-termpotentiation,LTP)建立情况，以评价神经连接及神经可塑性的形成。结果如图6图所示，本例将高频刺激0min时，记录侧fEPSP斜率标化为100％，稳定三十分钟后进行高频刺激并在第30min与第60min记录fEPSP，发现相对于基础情况，fEPSP在强直刺激后提升至2倍，并于60min后维持在1.5倍水平。证明LTP在两端成功建立并能够实现两侧神经的突触可塑性。
实施例二
采用实施例一构建的体外神经网络进行药物筛选试验，本例具体采用阿尔兹海默式症病理多肽beta淀粉样蛋白(Amyloid beta缩写Abeta)对细胞进行处理，并分析了脑保护药物吡拉西坦(Piracetam)对神经保护效应的细胞活性，细胞形态及电生理功能评价。具体如下：
本例分别采用0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、60μM的Abeta处理细胞，模拟体外阿尔兹海默式症模型；分别检测不同处理后的细胞活力。结果如图7图所示，结果显示，Abeta能够对元代海马神经元细胞活力造成浓度依赖性降低，即随着Abeta浓度的增加，细胞活力呈下降趋势。其中，30μM的Abeta处理后的细胞活力与实际的阿尔兹海默式症最接近；因此，本例采用30μM的Abeta模拟体外阿尔兹海默式症模型，进行后续试验和研究。
本例采用30μM的Abeta模拟体外阿尔兹海默式症模型，分别观察并测试了添加或不添加10μg/mL吡拉西坦处理的情况，结果如图8和图9所示。其中，图8为激光共聚焦显微镜观察结果，“Abeta”表示没有进行吡拉西坦处理的观察结果，“Abeta+Piracetam”表示吡拉西坦处理的观察结果。图8的结果显示，吡拉西坦处理显著增加了培养条件下元代神经元的数目及神经纤维数量。
图9为细胞活力测试结果，“Abeta”表示没有进行吡拉西坦处理的测试结果，“Abeta+Piracetam”表示吡拉西坦处理的测试结果。图9的结果显示，吡拉西坦处理后元代神经元细胞活性显著增加。
与此同时，本例还分别测试并记录了添加或不添加10μg/mL吡拉西坦处理模型在高频刺激0min、第30min、第60min的fEPSP；同样的，将0min时的fEPSP斜率标化为100％。结果如图10所示，其中，“Abeta”表示没有进行吡拉西坦处理的测试结果，“Abeta+Piracetam”表示吡拉西坦处理的测试结果，“**”表示差异显著。图10的结果显示，电生理实验证明吡拉西坦同时提高了神经元的长时程增强可塑性，在刺激后30min和60min时，兴奋性突触后电位斜率比没有添加吡拉西坦的Abeta处理显著增加。以上试验和结果显示，实施例一构建的体外神经网络能够进行药物筛选试验，以及细胞的体外研究。
以上内容是结合具体实施方式对本申请所作的详细说明，不能认定本申请的实现方式只局限于这些说明。对于本申请技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请基本发明构思的前提下，还可以进行若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种建立体外神经网络的方法，其特征在于：包括采用透明导电材料作为培养皿，并采用微阵列电极作为底座，将所述培养皿嵌套安装于底座上；将不同类型的神经元细胞通过分区培养，在不同位置培养形成不同类型的神经元；同时，在细胞开始成熟并生长神经纤维阶段，诱导神经纤维定向生长，连接形成所需的体外神经网络或神经回路；其中，具有微阵列电极的底座用于进行电生理记录，透明的培养皿方便后续观察和检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述透明导电材料为ITO导电玻璃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述诱导神经纤维定向生长，具体包括，采用梯度神经营养因子或微流控技术，在输入侧诱导神经轴突生长，在输出侧诱导树突生长，最终形成连接。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述神经营养因子包括脑源性神经营养因子BDNF和/或胶质神经营养因子GDNF。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：采用梯度神经营养因子诱导神经纤维定向生长，具体包括，在输出侧的培养孔中加入浓度为10ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF以及浓度为2ng/mL的胶质神经营养因子GDNF，在输入侧的培养孔中加入浓度为2ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF以及浓度为10ng/mL的胶质神经营养因子GDNF；
优选的，在进行梯度神经营养因子诱导神经纤维定向生长之前，还包括预先在输出侧的培养孔中加入2ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF和2ng/mL的胶质神经营养因子GDNF，同时，在输入侧的培养孔中也加入2ng/mL的脑源性神经营养因子BDNF和2ng/mL的胶质神经营养因子GDNF，进行预先诱导，培养5-10天后，再进行梯度神经营养因子诱导，并加大培养基的量为预先诱导的至少两倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述后续观察和检测包括细胞成像观察、免疫荧光成像检测或蛋白质组学研究。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述神经元细胞为海马体神经元细胞。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法建立的体外神经网络。
9.根据权利要求1-7任一项所述的方法建立的体外海马体CA3-CA1神经网络。
10.根据权利要求1-7任一项所述的方法、权利要求8所述的体外神经网络或权利要求9所述的体外海马体CA3-CA1神经网络在细胞体外研究或药物筛选中的应用。
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