JP2002318231A - シュワン細胞活性化剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents
シュワン細胞活性化剤及びそのスクリーニング方法Info
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- JP2002318231A JP2002318231A JP2001121861A JP2001121861A JP2002318231A JP 2002318231 A JP2002318231 A JP 2002318231A JP 2001121861 A JP2001121861 A JP 2001121861A JP 2001121861 A JP2001121861 A JP 2001121861A JP 2002318231 A JP2002318231 A JP 2002318231A
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】シュワン細胞活性化作用を有する物質のスクリ
ーニング方法を提供する。 【解決手段】被験物質を、分散させた哺乳動物の初代培
養シュワン細胞と共に培養し、培養上清中のＢＤＮＦ又
はＮＧＦ含量を指標にしてシュワン細胞活性化作用を有
する物質を選抜することを特徴とする、シュワン細胞活
性化剤のスクリーニング方法。
ーニング方法を提供する。 【解決手段】被験物質を、分散させた哺乳動物の初代培
養シュワン細胞と共に培養し、培養上清中のＢＤＮＦ又
はＮＧＦ含量を指標にしてシュワン細胞活性化作用を有
する物質を選抜することを特徴とする、シュワン細胞活
性化剤のスクリーニング方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はシュワン細胞活性化
作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。ま
た、本発明は、同スクリーニング方法で選抜された物質
を含有するシュワン細胞活性化剤に関する。
作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。ま
た、本発明は、同スクリーニング方法で選抜された物質
を含有するシュワン細胞活性化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで、末梢神経障害に対する根治的
な治療薬はなく、糖尿病性ニューロパチーや外傷性神経
障害の治療薬としては、メチルコバラミン(ビタミンB1
2) (Yamatsu, K. et al.: Nippon Yakurigaku Zasshi,
72, 259-68(1976))、アルドース還元酵素阻害剤である
エパーレススタット（Ohi, T. et al.: Experimental N
eurology, 151, 215-220(1998)）、血流改善剤であるプ
ロスタグランジンE1 (Yasuda, H. et al.: Metabolism,
41,778-782(1992)) などが用いられている。末梢神経
は、脊髄(中枢)に存在するニューロンが、軸索と呼ばれ
る神経突起を末梢標的器官に向かって伸展させ、そこで
シナプスを形成し、初めて神経機能を有するようにな
る。髄鞘（ミエリン鞘）は、軸索を包み込むようにして
覆っており、神経の刺激を電気信号として伝達するのに
重要な働きを持っている。シュワン細胞は末梢神経系に
存在するグリア細胞であり、神経軸索の周囲にミエリン
鞘を形成することで電気的絶縁を提供している。末梢神
経が障害を受けると、障害部位から遠位部ににおいて軸
索の変性と髄鞘の崩壊が生じる。これらの変性組織の除
去がマクロファージにより行われた後、脱分化したシュ
ワン細胞の増殖が生じる。これと同調してシュワン細胞
は細胞外マトリックス（Ｎ−ＣＡＭ，Ｌ１）や種々の神
経栄養因子（ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＧＤＮＦ）を産生し、
軸索の突起伸展を促進する。その後、軸索とシュワン細
胞が互いに協調しあいながら遠位標的部位に到達する。
軸索の突起伸展とシュワン細胞が同調してミエリン鞘の
形成が生じる。これらの一連の過程を経て末梢神経の再
生が終了する（Ide, C. et al.: Neurosci. Res., 25,
101-121 (1996)）。一方、強い障害時には、一過性にシ
ュワン細胞の増殖(障害後１ヶ月程度)が生じるが、それ
以降、シュワン細胞の増殖能が低下することにより軸索
の突起伸展能の消失と軸索変性が生じる。しかし、その
ような休眠状態に陥ったシュワン細胞に増殖因子(Glial
growth factorなど)を作用させることにより、増殖能
は回復し、さらに接着分子の発現も上昇することが報告
されている（Wigley, H. et al.: GLIA, 24, 290-303(1
998)）。糖尿病性ニューロパチーにおいては、神経再生
開始の遅延（Biaby, M. A. etal.: Exp. Neurol., 69,
74-83(1980)）、再生速度の低下（Love, A. et al.: Eu
r. J. Pharmacol., 314, 33-40(1995)）、髄鞘の小径化
（Terada, M. et al.:Metabolism, 45, 1189-1193(199
6)）、ＮＧＦ量の低下（Hellweg, R. et al.: J. Neuro
sci. Res., 26, 258-270(1990)）が報告されており、神
経再生初期及び成熟過程（ミエリン鞘形成）の何れもが
障害されていると考えられる。
な治療薬はなく、糖尿病性ニューロパチーや外傷性神経
障害の治療薬としては、メチルコバラミン(ビタミンB1
2) (Yamatsu, K. et al.: Nippon Yakurigaku Zasshi,
72, 259-68(1976))、アルドース還元酵素阻害剤である
エパーレススタット（Ohi, T. et al.: Experimental N
eurology, 151, 215-220(1998)）、血流改善剤であるプ
ロスタグランジンE1 (Yasuda, H. et al.: Metabolism,
41,778-782(1992)) などが用いられている。末梢神経
は、脊髄(中枢)に存在するニューロンが、軸索と呼ばれ
る神経突起を末梢標的器官に向かって伸展させ、そこで
シナプスを形成し、初めて神経機能を有するようにな
る。髄鞘（ミエリン鞘）は、軸索を包み込むようにして
覆っており、神経の刺激を電気信号として伝達するのに
重要な働きを持っている。シュワン細胞は末梢神経系に
存在するグリア細胞であり、神経軸索の周囲にミエリン
鞘を形成することで電気的絶縁を提供している。末梢神
経が障害を受けると、障害部位から遠位部ににおいて軸
索の変性と髄鞘の崩壊が生じる。これらの変性組織の除
去がマクロファージにより行われた後、脱分化したシュ
ワン細胞の増殖が生じる。これと同調してシュワン細胞
は細胞外マトリックス（Ｎ−ＣＡＭ，Ｌ１）や種々の神
経栄養因子（ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＧＤＮＦ）を産生し、
軸索の突起伸展を促進する。その後、軸索とシュワン細
胞が互いに協調しあいながら遠位標的部位に到達する。
軸索の突起伸展とシュワン細胞が同調してミエリン鞘の
形成が生じる。これらの一連の過程を経て末梢神経の再
生が終了する（Ide, C. et al.: Neurosci. Res., 25,
101-121 (1996)）。一方、強い障害時には、一過性にシ
ュワン細胞の増殖(障害後１ヶ月程度)が生じるが、それ
以降、シュワン細胞の増殖能が低下することにより軸索
の突起伸展能の消失と軸索変性が生じる。しかし、その
ような休眠状態に陥ったシュワン細胞に増殖因子(Glial
growth factorなど)を作用させることにより、増殖能
は回復し、さらに接着分子の発現も上昇することが報告
されている（Wigley, H. et al.: GLIA, 24, 290-303(1
998)）。糖尿病性ニューロパチーにおいては、神経再生
開始の遅延（Biaby, M. A. etal.: Exp. Neurol., 69,
74-83(1980)）、再生速度の低下（Love, A. et al.: Eu
r. J. Pharmacol., 314, 33-40(1995)）、髄鞘の小径化
（Terada, M. et al.:Metabolism, 45, 1189-1193(199
6)）、ＮＧＦ量の低下（Hellweg, R. et al.: J. Neuro
sci. Res., 26, 258-270(1990)）が報告されており、神
経再生初期及び成熟過程（ミエリン鞘形成）の何れもが
障害されていると考えられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】糖尿病性ニューロパチ
ーや外傷性神経障害などの末梢神経障害の治療剤として
有用な医薬が望まれていた。本発明はそのような医薬を
提供し、また、そのような医薬活性物質のクリーニング
方法を提供せんとするものである。
ーや外傷性神経障害などの末梢神経障害の治療剤として
有用な医薬が望まれていた。本発明はそのような医薬を
提供し、また、そのような医薬活性物質のクリーニング
方法を提供せんとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】末梢グリア細胞として知
られているシュワン細胞は末梢神経組織にのみ存在し、
神経の機能発現に重要な役割を果たしている。シュワン
細胞の末梢神経に対する役割として、神経栄養因子産
生による神経細胞生存維持、機能亢進、突起伸展促進、
細胞外マトリックス産生による神経細胞突起伸展促
進、ミエリン鞘形成による神経成熟、等が考えられて
いる。末梢神経障害時には軸索の変性・脱落及び脱髄が
観察されるが、変性・脱落はシュワン細胞からの神経栄
養因子産生促進により防ぐことができ、また、脱髄はシ
ュワン細胞の分化促進（神経成熟促進）により回避でき
ると考えられる。即ち、シュワン細胞を活性化すること
により、神経栄養因子産生（局所的な直接作用による神
経細胞の賦活化）や突起伸展のみならず、神経の成熟過
程までの再生促進全体を通じての作用を期待することが
できる。本発明者らは、シュワン細胞を活性化する薬剤
は神経軸索の脱落変性を抑制すると同時に神経再生を促
進することを見い出し、さらに研究を重ねて、本発明を
完成した。
られているシュワン細胞は末梢神経組織にのみ存在し、
神経の機能発現に重要な役割を果たしている。シュワン
細胞の末梢神経に対する役割として、神経栄養因子産
生による神経細胞生存維持、機能亢進、突起伸展促進、
細胞外マトリックス産生による神経細胞突起伸展促
進、ミエリン鞘形成による神経成熟、等が考えられて
いる。末梢神経障害時には軸索の変性・脱落及び脱髄が
観察されるが、変性・脱落はシュワン細胞からの神経栄
養因子産生促進により防ぐことができ、また、脱髄はシ
ュワン細胞の分化促進（神経成熟促進）により回避でき
ると考えられる。即ち、シュワン細胞を活性化すること
により、神経栄養因子産生（局所的な直接作用による神
経細胞の賦活化）や突起伸展のみならず、神経の成熟過
程までの再生促進全体を通じての作用を期待することが
できる。本発明者らは、シュワン細胞を活性化する薬剤
は神経軸索の脱落変性を抑制すると同時に神経再生を促
進することを見い出し、さらに研究を重ねて、本発明を
完成した。
【０００５】すなわち、本発明は以下の［１］〜［８］
記載のとおり、シュワン細胞（Schwann cell）活性化作
用を有する物質を選抜するスクリーニング方法、並び
に、同スクリーニング方法で選抜された物質を含有する
シュワン細胞活性化剤あるいは医薬に関する。 ［１］被験物質を、分散させた哺乳動物の初代培養シュ
ワン細胞と共に培養し、培養上清中のＢＤＮＦ又はＮＧ
Ｆ含量を指標にしてシュワン細胞活性化作用を有する物
質を選抜することを特徴とする、シュワン細胞活性化剤
のスクリーニング方法。 ［２］請求項１記載の方法で選抜した被験物質を、更に
ＧａｌＣ発現誘導能または／及びミエリン鞘形成促進作
用を指標にしてシュワン細胞活性化作用を有する物質を
選抜することを特徴とする、シュワン細胞活性化剤のス
クリーニング方法。 ［３］上記［１］もしくは［２］記載の方法により選抜
されたシュワン細胞活性化作用を有する物質を含有する
シュワン細胞活性化剤。 ［４］培養上清中のＢＤＮＦ又はＮＧＦ含量が、未添加
の場合と比較して２倍以上となる作用を有することで特
徴づけられる、上記［３］記載のシュワン細胞活性化
剤。 ［５］シュワン細胞活性化作用を有する物質が、分子量
１０００以下の低分子化合物である上記［３］記載のシ
ュワン細胞活性化剤。 ［６］末梢神経障害治療剤である上記［３］記載のシュ
ワン細胞活性化剤。 ［７］末梢神経障害が糖尿病性ニューロパチーまたは外
傷性神経障害である上記［６］記載のシュワン細胞活性
化剤。 ［８］シュワン細胞活性化作用を有する物質が式
記載のとおり、シュワン細胞（Schwann cell）活性化作
用を有する物質を選抜するスクリーニング方法、並び
に、同スクリーニング方法で選抜された物質を含有する
シュワン細胞活性化剤あるいは医薬に関する。 ［１］被験物質を、分散させた哺乳動物の初代培養シュ
ワン細胞と共に培養し、培養上清中のＢＤＮＦ又はＮＧ
Ｆ含量を指標にしてシュワン細胞活性化作用を有する物
質を選抜することを特徴とする、シュワン細胞活性化剤
のスクリーニング方法。 ［２］請求項１記載の方法で選抜した被験物質を、更に
ＧａｌＣ発現誘導能または／及びミエリン鞘形成促進作
用を指標にしてシュワン細胞活性化作用を有する物質を
選抜することを特徴とする、シュワン細胞活性化剤のス
クリーニング方法。 ［３］上記［１］もしくは［２］記載の方法により選抜
されたシュワン細胞活性化作用を有する物質を含有する
シュワン細胞活性化剤。 ［４］培養上清中のＢＤＮＦ又はＮＧＦ含量が、未添加
の場合と比較して２倍以上となる作用を有することで特
徴づけられる、上記［３］記載のシュワン細胞活性化
剤。 ［５］シュワン細胞活性化作用を有する物質が、分子量
１０００以下の低分子化合物である上記［３］記載のシ
ュワン細胞活性化剤。 ［６］末梢神経障害治療剤である上記［３］記載のシュ
ワン細胞活性化剤。 ［７］末梢神経障害が糖尿病性ニューロパチーまたは外
傷性神経障害である上記［６］記載のシュワン細胞活性
化剤。 ［８］シュワン細胞活性化作用を有する物質が式
【化２】 （式中、Ｒ１はアシルアミノ基または環状イミド基を表
す。Ｒ２及びＲ３は、互いに独立して、水素原子または
ハロゲン原子を表す。Ｒ４はアシルアミノ基または環状
イミド基を表す。Ｒ５は水素原子または低級アルキル基
を表す。）で表される化合物またはその塩である上記
［３］、［６］または［７］記載のシュワン細胞活性化
剤。
す。Ｒ２及びＲ３は、互いに独立して、水素原子または
ハロゲン原子を表す。Ｒ４はアシルアミノ基または環状
イミド基を表す。Ｒ５は水素原子または低級アルキル基
を表す。）で表される化合物またはその塩である上記
［３］、［６］または［７］記載のシュワン細胞活性化
剤。
【０００６】以下に、本発明を更に詳細に説明する。本
発明のスクリーニング法は、シュワン細胞においてＮＧ
Ｆ又はＢＤＮＦの産生促進作用を示す物質を選抜するこ
とにより行われる。さらに、このようにして選抜した物
質について二次スクリーニングを行う場合は、ミエリン
タンパク質Ｐ０（Protein Zero）やガラクトシルセラミ
ド等のミエリン鞘に特有の構成成分の発現誘導能を示す
か或いは更にミエリン鞘形成を促進するかを指標にして
選抜することにより実施することができる。
発明のスクリーニング法は、シュワン細胞においてＮＧ
Ｆ又はＢＤＮＦの産生促進作用を示す物質を選抜するこ
とにより行われる。さらに、このようにして選抜した物
質について二次スクリーニングを行う場合は、ミエリン
タンパク質Ｐ０（Protein Zero）やガラクトシルセラミ
ド等のミエリン鞘に特有の構成成分の発現誘導能を示す
か或いは更にミエリン鞘形成を促進するかを指標にして
選抜することにより実施することができる。
【０００７】本明細書中において、「シュワン細胞活性
化作用を有する物質」とは、上記［１］もしくは［２］
記載の方法により選抜される物質であればいかなるもの
であってもよく、化学合成物質、発酵生産物、遺伝子産
物などが挙げられ、公知物質であってもよく、或いは将
来見出される新規な物質であってもよい。初代培養シュ
ワン細胞は、ラット等の哺乳動物細胞の坐骨神経細胞か
ら採取したものを培養して用いることができる。例え
ば、新生児ラット（１〜５日齢）より坐骨神経を採取
し、コラゲナーゼにより分散する。翌日ＤＮＡ合成阻害
剤入りの培地と交換し、３〜５日間培養し非シュワン細
胞を除去する（この段階で純度９０％以上のシュワン細
胞を得ることができる）。シュワン細胞の増殖を促すた
めフォルスコリン入りの培地と交換し、約１週間培養す
る。シュワン細胞を休眠状態に戻すためフォルスコリン
を除去した培地にて３〜４日間培養する。このようにし
て、母ラット一腹当たり約２×１０７cellsのシュワン
細胞を調製することが可能であり、それを用いて、９６
穴プレートを１５枚程度スクリーニングすることが可能
である。
化作用を有する物質」とは、上記［１］もしくは［２］
記載の方法により選抜される物質であればいかなるもの
であってもよく、化学合成物質、発酵生産物、遺伝子産
物などが挙げられ、公知物質であってもよく、或いは将
来見出される新規な物質であってもよい。初代培養シュ
ワン細胞は、ラット等の哺乳動物細胞の坐骨神経細胞か
ら採取したものを培養して用いることができる。例え
ば、新生児ラット（１〜５日齢）より坐骨神経を採取
し、コラゲナーゼにより分散する。翌日ＤＮＡ合成阻害
剤入りの培地と交換し、３〜５日間培養し非シュワン細
胞を除去する（この段階で純度９０％以上のシュワン細
胞を得ることができる）。シュワン細胞の増殖を促すた
めフォルスコリン入りの培地と交換し、約１週間培養す
る。シュワン細胞を休眠状態に戻すためフォルスコリン
を除去した培地にて３〜４日間培養する。このようにし
て、母ラット一腹当たり約２×１０７cellsのシュワン
細胞を調製することが可能であり、それを用いて、９６
穴プレートを１５枚程度スクリーニングすることが可能
である。
【０００８】ＮＧＦ又はＢＤＮＦの定量は一般的方法に
従って実施することができ、例えば、上記のようにして
調製したシュワン細胞を９６穴プレートの１穴当たり１
〜２×１０４cells播種し、被験物質存在下或いは非存
在下（コントロール）にて４８〜７２時間培養し、培養
上清液中のＮＧＦ或いはＢＤＮＦ量をＥＬＩＳＡ法で定
量することにより行うことができる。シュワン細胞活性
化作用を有する物質は、ＮＧＦ又はＢＤＮＦの産生量を
指標にして選抜することができる。例えば、コントロー
ルと比較してＮＧＦ又はＢＤＮＦの産生量が２倍以上と
なるものを活性ありとして選抜することができる。二次
スクリーニングでは坐骨神経を挫滅したラット等の哺乳
動物を用いる。培養シュワン細胞においてＢＤＮＦ或い
はＮＧＦ産生促進作用を示した物質を、坐骨神経を挫滅
したラット等の哺乳動物に経口、皮下或いは浸透圧ポン
プを用いて投与し、７〜１４日後、坐骨神経を採取しｍ
ＲＮＡを調製後、ミエリン構成成分(P0, Ceramide gala
ctosyl transferase等)の発現を、例えばｍＲＮＡレベ
ルで定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量化し、発現の上昇の
有無を判定する。このようにして選抜される薬剤は直
接、シュワン細胞を活性化し、神経栄養因子産生を誘導
する。さらに、シュワン細胞のミエリン鞘形成を促進す
ることにより神経の成熟を促進する。
従って実施することができ、例えば、上記のようにして
調製したシュワン細胞を９６穴プレートの１穴当たり１
〜２×１０４cells播種し、被験物質存在下或いは非存
在下（コントロール）にて４８〜７２時間培養し、培養
上清液中のＮＧＦ或いはＢＤＮＦ量をＥＬＩＳＡ法で定
量することにより行うことができる。シュワン細胞活性
化作用を有する物質は、ＮＧＦ又はＢＤＮＦの産生量を
指標にして選抜することができる。例えば、コントロー
ルと比較してＮＧＦ又はＢＤＮＦの産生量が２倍以上と
なるものを活性ありとして選抜することができる。二次
スクリーニングでは坐骨神経を挫滅したラット等の哺乳
動物を用いる。培養シュワン細胞においてＢＤＮＦ或い
はＮＧＦ産生促進作用を示した物質を、坐骨神経を挫滅
したラット等の哺乳動物に経口、皮下或いは浸透圧ポン
プを用いて投与し、７〜１４日後、坐骨神経を採取しｍ
ＲＮＡを調製後、ミエリン構成成分(P0, Ceramide gala
ctosyl transferase等)の発現を、例えばｍＲＮＡレベ
ルで定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量化し、発現の上昇の
有無を判定する。このようにして選抜される薬剤は直
接、シュワン細胞を活性化し、神経栄養因子産生を誘導
する。さらに、シュワン細胞のミエリン鞘形成を促進す
ることにより神経の成熟を促進する。
【０００９】本発明のスクリーニング法で選抜されるシ
ュワン細胞活性化物質としては、例えば前記式（１）で
表される化合物などが挙げられる。式（１）において、
アシルアミノ基におけるアシル基としては、例えばアル
カノイル基、置換アルカノイル基、アルケノイル基、ア
ロイル基、置換アロイル基などが挙げられる。アルカノ
イル基としては、例えばアセチル、プロピオニル、ブチ
リル、２−メチルプロパノイル、バレリル、２，２−ジ
メチルプロパノイルなどの直鎖状又は分岐鎖状の炭素原
子数８以下のアルカノイル基が挙げられる。置換アルカ
ノイル基としては、例えばフェニルアセチル、トリルア
セチル、ナフチルアセチルなどの炭素原子数１０以下の
アリール基で置換されたアセチル基などが挙げられる。
アルケノイル基としては、例えばアクリロイル、メタク
リロイル、クロトノイル、イソクロトノイルなどの１以
上の二重結合を有する直鎖状又は分岐鎖状の炭素原子数
８以下のアルケノイル基が挙げられる。アロイル基とし
ては、例えばベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ナ
フトイルなどの炭素原子数１１以下のアロイル基が挙げ
られる。アロイル基の置換基としては、例えばハロゲン
原子、水酸基、アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
基、ニトロ基などが挙げられる。ハロゲン原子として
は、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子などが挙げ
られる。アルコキシ基としては、例えばメトキシ、エト
キシ、プロポキシ、ブトキシ、イソプロポキシ、イソブ
トキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどの
直鎖状又は分岐鎖状の炭素原子数６以下のアルコキシ基
などが挙げられる。置換アミノ基としては、例えばメチ
ルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルア
ミノなどのモノ−もしくはジ−低級アルキルアミノ基お
よび例えば２，２−ジメチルプロピリデンアミノ、ベン
ジリデンアミノ、２−フェニルエチリデンアミノなどの
炭素原子数８以下の置換アミノ基が挙げられる。環状イ
ミド基としては、例えばサクシンイミド基、シクロヘキ
サンジカルボキシイミド基、フタルイミド基、５−ノル
ボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基などの炭素原
子数１０以下の環状イミド基が挙げられる。低級アルキ
ル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、２−メチルプロピル、２−メチルブチル、ペンチル
などの直鎖状又は分岐鎖状の炭素原子数５以下の低級ア
ルキル基が挙げられる。
ュワン細胞活性化物質としては、例えば前記式（１）で
表される化合物などが挙げられる。式（１）において、
アシルアミノ基におけるアシル基としては、例えばアル
カノイル基、置換アルカノイル基、アルケノイル基、ア
ロイル基、置換アロイル基などが挙げられる。アルカノ
イル基としては、例えばアセチル、プロピオニル、ブチ
リル、２−メチルプロパノイル、バレリル、２，２−ジ
メチルプロパノイルなどの直鎖状又は分岐鎖状の炭素原
子数８以下のアルカノイル基が挙げられる。置換アルカ
ノイル基としては、例えばフェニルアセチル、トリルア
セチル、ナフチルアセチルなどの炭素原子数１０以下の
アリール基で置換されたアセチル基などが挙げられる。
アルケノイル基としては、例えばアクリロイル、メタク
リロイル、クロトノイル、イソクロトノイルなどの１以
上の二重結合を有する直鎖状又は分岐鎖状の炭素原子数
８以下のアルケノイル基が挙げられる。アロイル基とし
ては、例えばベンゾイル、トルオイル、キシロイル、ナ
フトイルなどの炭素原子数１１以下のアロイル基が挙げ
られる。アロイル基の置換基としては、例えばハロゲン
原子、水酸基、アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ
基、ニトロ基などが挙げられる。ハロゲン原子として
は、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子などが挙げ
られる。アルコキシ基としては、例えばメトキシ、エト
キシ、プロポキシ、ブトキシ、イソプロポキシ、イソブ
トキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどの
直鎖状又は分岐鎖状の炭素原子数６以下のアルコキシ基
などが挙げられる。置換アミノ基としては、例えばメチ
ルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルア
ミノなどのモノ−もしくはジ−低級アルキルアミノ基お
よび例えば２，２−ジメチルプロピリデンアミノ、ベン
ジリデンアミノ、２−フェニルエチリデンアミノなどの
炭素原子数８以下の置換アミノ基が挙げられる。環状イ
ミド基としては、例えばサクシンイミド基、シクロヘキ
サンジカルボキシイミド基、フタルイミド基、５−ノル
ボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基などの炭素原
子数１０以下の環状イミド基が挙げられる。低級アルキ
ル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、２−メチルプロピル、２−メチルブチル、ペンチル
などの直鎖状又は分岐鎖状の炭素原子数５以下の低級ア
ルキル基が挙げられる。
【００１０】前記式（１）で表される化合物は、分子内
に酸性基または塩基性基を有する場合は塩を形成するこ
とができる。例えば分子内にアミノ基を有する場合は、
塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの鉱酸との塩；ギ
酸、酢酸、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、クエン
酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、グルタミン酸
などの有機カルボン酸との塩；メタンスルホン酸、ベン
ゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ヒドロキシ
ベンゼンスルホン酸、ジヒドロキシベンゼンスルホン酸
などのスルホン酸との塩などを形成することができる。
式（１）の化合物またはその塩は、例えば水和物などの
溶媒和物であってもよい。
に酸性基または塩基性基を有する場合は塩を形成するこ
とができる。例えば分子内にアミノ基を有する場合は、
塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの鉱酸との塩；ギ
酸、酢酸、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、クエン
酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、グルタミン酸
などの有機カルボン酸との塩；メタンスルホン酸、ベン
ゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ヒドロキシ
ベンゼンスルホン酸、ジヒドロキシベンゼンスルホン酸
などのスルホン酸との塩などを形成することができる。
式（１）の化合物またはその塩は、例えば水和物などの
溶媒和物であってもよい。
【００１１】前記式（１）の化合物は、例えばＷＯ９９
／６１０１９号公報に記載の方法により、またはそのよ
うな方法に準じて製造することができる。また、環状イ
ミド化合物も、同様に同公報記載の方法に準じて、次の
ようなルートで製造することができる。
／６１０１９号公報に記載の方法により、またはそのよ
うな方法に準じて製造することができる。また、環状イ
ミド化合物も、同様に同公報記載の方法に準じて、次の
ようなルートで製造することができる。
【化３】 （式中、Ａ１およびＡ２は分子内酸無水物または環状イ
ミド基を形成するジカルボン酸残基を表す。） アミノ基のイミド化およびニトロ基の還元は、通常の一
般的な反応を組み合わせて実施すればよい。
ミド基を形成するジカルボン酸残基を表す。） アミノ基のイミド化およびニトロ基の還元は、通常の一
般的な反応を組み合わせて実施すればよい。
【００１２】本発明のスクリーニング方法で選抜される
シュワン細胞活性化物質は、神経軸索の脱落変性を抑制
すると同時に神経再生を促進する作用を有するので、例
えば糖尿病性ニューロパチー、外傷性神経障害、制癌剤
ニューロパチー、重金属性ニューロパチーなどの末梢神
経障害の治療剤として有用である。これらの疾患におい
ては、特に、軸索（神経）の変性・脱落及び脱髄（ミエ
リン鞘の崩壊）を伴い知覚異常障害（触覚、痛覚等）や
運動神経機能障害が現れる。糖尿病性ニューロパチーは
糖尿病の三大合併症の一つであり、自覚症状を呈する頃
には神経はかなりのダメージを受けている。外傷性神経
障害は、種々の外傷（突発性事故、交通事故、スポーツ
外傷等）による神経繊維の切断や圧迫に起因して生じる
神経障害であり、麻痺が残る場合もある。
シュワン細胞活性化物質は、神経軸索の脱落変性を抑制
すると同時に神経再生を促進する作用を有するので、例
えば糖尿病性ニューロパチー、外傷性神経障害、制癌剤
ニューロパチー、重金属性ニューロパチーなどの末梢神
経障害の治療剤として有用である。これらの疾患におい
ては、特に、軸索（神経）の変性・脱落及び脱髄（ミエ
リン鞘の崩壊）を伴い知覚異常障害（触覚、痛覚等）や
運動神経機能障害が現れる。糖尿病性ニューロパチーは
糖尿病の三大合併症の一つであり、自覚症状を呈する頃
には神経はかなりのダメージを受けている。外傷性神経
障害は、種々の外傷（突発性事故、交通事故、スポーツ
外傷等）による神経繊維の切断や圧迫に起因して生じる
神経障害であり、麻痺が残る場合もある。
【００１３】本発明医薬は、例えば錠剤、カプセル剤、
散剤、顆粒剤、坐剤、軟膏剤、クリーム剤、吸入剤、注
射剤などの通常の剤形で経口的に又は非経口的（例えば
靜脈内、筋肉内、吸入、点鼻、経皮など）に投与するこ
とができる。このような剤形は、通常の担体、賦型剤、
結合剤などと有効成分を配合することにより製造するこ
とができる。所望により、これらの製剤に、助剤、安定
剤、湿潤剤ないし乳化剤、緩衝剤、その他慣用の添加剤
を加えることができる。化合物（１）の投与量、投与回
数は患者の症状、年令、体重、投与形態などに応じて増
減するが、通常は、経口投与の場合は成人に対し１日当
り約1μｇ〜約1000 ｍｇ、好ましくは約10μｇ〜約100
ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。経
皮投与の場合は成人に対し１日当り約1μｇ〜約1000 ｍ
ｇ、好ましくは約10μｇ〜約100 ｍｇを１回又は数回に
分けて投与することができる。
散剤、顆粒剤、坐剤、軟膏剤、クリーム剤、吸入剤、注
射剤などの通常の剤形で経口的に又は非経口的（例えば
靜脈内、筋肉内、吸入、点鼻、経皮など）に投与するこ
とができる。このような剤形は、通常の担体、賦型剤、
結合剤などと有効成分を配合することにより製造するこ
とができる。所望により、これらの製剤に、助剤、安定
剤、湿潤剤ないし乳化剤、緩衝剤、その他慣用の添加剤
を加えることができる。化合物（１）の投与量、投与回
数は患者の症状、年令、体重、投与形態などに応じて増
減するが、通常は、経口投与の場合は成人に対し１日当
り約1μｇ〜約1000 ｍｇ、好ましくは約10μｇ〜約100
ｍｇを１回又は数回に分けて投与することができる。経
皮投与の場合は成人に対し１日当り約1μｇ〜約1000 ｍ
ｇ、好ましくは約10μｇ〜約100 ｍｇを１回又は数回に
分けて投与することができる。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定さ
れるものではない。被験物質 被験化合物１：
明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定さ
れるものではない。被験物質 被験化合物１：
【化４】 被験化合物２：
【化５】 被験化合物３：
【化６】 被験化合物４：
【化７】 被験化合物５：
【化８】 被験化合物６：
【化９】 被験化合物７：
【化１０】 被験化合物８：
【化１１】 被験化合物９：
【化１２】 被験化合物１０：
【化１３】 被験化合物１１：
【化１４】
【００１５】実施例１：培養シュワン細胞におけるＢＤ
ＮＦ及びＮＧＦ産生促進作用の測定 １０匹の新生児Wistarラット（２日齢）より坐骨神経２
０本を採取し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
で洗浄後、Ｉ型コラゲナーゼを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含
有する３ｍｌのＰＢＳに移し、３７℃でインキュベート
した。４０分後、これに２．５％トリプシン溶液を１０
０μｌ添加し、さらに２０分間３７℃でインキュベート
した。これに、牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％加えたＤ
−ＭＥＭ培地（ライフテックオリエンタル社）３ｍｌを
添加した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を１ｍｌ
添加し、ピペッティングにより細胞を分散懸濁させた。
１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を加えて細胞密度を３
×１０５個／ｍｌとした後、培養フラスコ（旭テクノグ
ラス社製３１６０−２２５）に移し、５％炭酸ガスイン
キュベーターにて３７℃でインキュベートした。翌日、
培地を１０μＭのシトシンアラビノシド入りの１０％Ｆ
ＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地と交換し、５％炭酸ガスインキ
ュベーターにてさらに４日間インキュベートした。この
操作により、増殖性を有する非シュワン細胞は死滅し
た。培地を１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地に交換後、
５％炭酸ガスインキュベーターにて３７℃、１２時間イ
ンキュベートした。培地を除去し、ＰＢＳでゆすいだ
後、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳを添加し、３７℃
で５分間インキュベートした。ピペッティングにより細
胞を剥がし、剥がれた細胞を集め、１０００ｒｐｍで５
分間遠心分離した。上清液を捨て、５μＭフォルスコリ
ン入りの１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を加えて細胞
密度を２．５×１０４個／ｍｌとした。これを３ｍｌず
つ２５ｃｍ２のポリリジンコートフラスコ（住友ベーク
ライト社製ＭＳ−０２０５Ｌ）に移し、５％炭酸ガスイ
ンキュベーターにて３７℃でインキュベートした。３日
毎に５μＭフォルスコリン入りの１０％ＦＣＳ含有Ｄ−
ＭＥＭ培地に交換した。８日後、ほぼコンフルエントに
なったことを顕微鏡観察で確認した後、培地を除去し、
ＰＢＳでゆすいだ後、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ
を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。ピペッ
ティングにより細胞を剥がし、剥がれた細胞を集め、１
０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清液を捨て、１
０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を加えて細胞密度を１×
１０５個／ｍｌとした。これを１００μｌずつ９６穴の
ポリリジンコートマイクロプレート（住友ベークライト
社製ＭＳ−００９６Ｌ）に移し、５％炭酸ガスインキュ
ベーターにて３７℃でインキュベートした。２日目と４
日目に１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培地交
換した。４日目の培地交換が終わった後、１０％ＦＣＳ
含有Ｄ−ＭＥＭ培地に溶解した被験物質を添加し、５％
炭酸ガスインキュベーターにて３７℃で３日間インキュ
ベートした。インキュベート後、上清液を回収し、ＢＤ
ＮＦ及びＮＧＦ量を市販ＥＬＩＳＡアッセイキット（プ
ロメガ社Ｇ６９８１及びＧ３５６０）を用いて定量し
た。結果を以下に示す。
ＮＦ及びＮＧＦ産生促進作用の測定 １０匹の新生児Wistarラット（２日齢）より坐骨神経２
０本を採取し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
で洗浄後、Ｉ型コラゲナーゼを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含
有する３ｍｌのＰＢＳに移し、３７℃でインキュベート
した。４０分後、これに２．５％トリプシン溶液を１０
０μｌ添加し、さらに２０分間３７℃でインキュベート
した。これに、牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％加えたＤ
−ＭＥＭ培地（ライフテックオリエンタル社）３ｍｌを
添加した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上
清液を捨て、１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を１ｍｌ
添加し、ピペッティングにより細胞を分散懸濁させた。
１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を加えて細胞密度を３
×１０５個／ｍｌとした後、培養フラスコ（旭テクノグ
ラス社製３１６０−２２５）に移し、５％炭酸ガスイン
キュベーターにて３７℃でインキュベートした。翌日、
培地を１０μＭのシトシンアラビノシド入りの１０％Ｆ
ＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地と交換し、５％炭酸ガスインキ
ュベーターにてさらに４日間インキュベートした。この
操作により、増殖性を有する非シュワン細胞は死滅し
た。培地を１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地に交換後、
５％炭酸ガスインキュベーターにて３７℃、１２時間イ
ンキュベートした。培地を除去し、ＰＢＳでゆすいだ
後、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳを添加し、３７℃
で５分間インキュベートした。ピペッティングにより細
胞を剥がし、剥がれた細胞を集め、１０００ｒｐｍで５
分間遠心分離した。上清液を捨て、５μＭフォルスコリ
ン入りの１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を加えて細胞
密度を２．５×１０４個／ｍｌとした。これを３ｍｌず
つ２５ｃｍ２のポリリジンコートフラスコ（住友ベーク
ライト社製ＭＳ−０２０５Ｌ）に移し、５％炭酸ガスイ
ンキュベーターにて３７℃でインキュベートした。３日
毎に５μＭフォルスコリン入りの１０％ＦＣＳ含有Ｄ−
ＭＥＭ培地に交換した。８日後、ほぼコンフルエントに
なったことを顕微鏡観察で確認した後、培地を除去し、
ＰＢＳでゆすいだ後、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ
を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。ピペッ
ティングにより細胞を剥がし、剥がれた細胞を集め、１
０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清液を捨て、１
０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を加えて細胞密度を１×
１０５個／ｍｌとした。これを１００μｌずつ９６穴の
ポリリジンコートマイクロプレート（住友ベークライト
社製ＭＳ−００９６Ｌ）に移し、５％炭酸ガスインキュ
ベーターにて３７℃でインキュベートした。２日目と４
日目に１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培地交
換した。４日目の培地交換が終わった後、１０％ＦＣＳ
含有Ｄ−ＭＥＭ培地に溶解した被験物質を添加し、５％
炭酸ガスインキュベーターにて３７℃で３日間インキュ
ベートした。インキュベート後、上清液を回収し、ＢＤ
ＮＦ及びＮＧＦ量を市販ＥＬＩＳＡアッセイキット（プ
ロメガ社Ｇ６９８１及びＧ３５６０）を用いて定量し
た。結果を以下に示す。
【００１６】
【表１】 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 被験物質 添加濃度 ＢＤＮＦ産生量（注） ＮＧＦ産生量（注） 化合物No. （μｇ／ｍｌ） （％） （％） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― １ ０．０３ １０５．８ ＮＴ ０．１ ２１７．９ １３５．１ ０．３ ３８４．９ ８２．９ １ ３５３．９ １８９．１ ３ １２７．７ ２０２．７ １０ ２５．２ １０８．２ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ２ ０．０３ ９０．７ １１５．５ ０．１ １０１．４ １０７．７ ０．３ １４３．２ １００．０ １ ２８７．８ １５９．５ ３ ３８９．８ ２４２．５ １０ ４０５．８ ２２６．９ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ３ ０．０３ ９９．０ １２１．２ ０．１ １０１．０ １３１．１ ０．３ １３８．３ １３１．１ １ ３８２．０ １９０．６ ３ ２４８．５ ６４．３ １０ ７６．０ ２４．０ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ４ ０．０３ １５７．７ ２６６．５ ０．１ ２２１．８ ４５３．２ ０．３ １７８．６ ３５９．８ １ １４１．７ ２７９．８ ３ ８４．４ ２１９．９ １０ ４３．３ ６６．７ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ５ ０．１ １１９．９ ＮＴ ０．３ ２６５．７ ＮＴ １ ２２５．１ ＮＴ ３ １６６．１ ＮＴ １０ ４２．４ ＮＴ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ６ ０．１ ９７．２ ＮＴ ０．３ １７０．５ ＮＴ １ ２３５．１ ＮＴ ３ １３１．５ ＮＴ １０ ４７．４ ＮＴ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ７ ０．１ ８３．０ １１１．２ ０．３ １１２．１ １１６．８ １ ９２．２ １０５．６ ３ １２７．６ １０８．４ １０ ２３２．０ １５６．０ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ８ ０．１ １７６．４ ＮＴ ０．３ １８５．６ ＮＴ １ １９４．１ ＮＴ ３ ２３８．４ ＮＴ １０ ２３９．９ ＮＴ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ９ ０．１ １１５．０ ＮＴ ０．３ １４８．７ ＮＴ １ ３１８．１ ＮＴ ３ ２９６．４ ＮＴ １０ ２３６．５ ＮＴ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― １０ ０．１ ８９．３ ２３３．３ ０．３ ９７．６ ２７５．６ １ １３８．３ ２４４．０ ３ ３７６．７ ２１２．３ １０ ３２１．８ ８７．７ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― １１ ０．１ ８２．６ １１４．３ ０．３ ８９．０ １１６．１ １ ９０．５ １０８．９ ３ １３２．４ １０３．６ １０ ２８５．２ １５０．１ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― （注）：ＰＢＳ添加を１００％とした相対値
【００１７】実施例２：ラット坐骨神経挫滅モデルにお
ける坐骨神経中のＢＤＮＦ及びＮＧＦ含量の増加作用の
測定 ７週令のWistarラットをペントバルビタール麻酔下にて
坐骨神経を露出し、腓骨神経、脛骨神経及び腓腹神経の
分岐点より15mm上流を5 mm幅ピンセットを用いて30秒間
挫滅した。挫滅３日後に挫滅部位に被験物質及び対照と
してのPBSを投与した。被験物質は10μg/ml、30μg/m
l、100μg/mlおよび300μg/mlの各濃度になるようにPBS
に溶解した。投与方法は、被験物質溶液及び対照共に10
0μlをゼルフォーム（ゼラチンスポンジ；ファルマシア
・アップジョン社製）に浸し、坐骨神経傷害部位に静置
することにより行った。また、ゼルフォームが外れない
ように、坐骨神経及びゼルフォームを長さ20 mmのシリ
コンチューブ内に包み込んだ。挫滅７日後(投与４日後)
に障害部位より前後1 cmを含む坐骨神経を取り出した。
取り出した坐骨神経の湿重量を測定し、30倍量の氷冷 e
xtraction buffer（100 mM tris-HCl(pH 7.0) in 2% BS
A, 1 M NaCl, 0.2% NaN3 ,4 mM EDTA, 2% Triton X-10
0）及びプロテアーゼ阻害剤( 5μg/ml aprotinin , 0.5
μg/ml antipain, 157μg/ml benzamidine, 0.1μg/ml
pepstatin A, 5.2μg/ml PMSF)を添加した。glass-gla
ss homogenizer(相互理科)を用いて坐骨神経をホモジナ
イズ後、4 M NaOHを用いてpHを11に合わせ懸濁した。1
3,000 gにて4℃、15分間遠心後、上清を採取した。この
上清に氷酢酸を添加しpHを３に合わせ再び懸濁した。1
3,000 gにて4℃、15分間遠心後、上清を採取した。4 M
NaOHを用いて中性に戻した上清サンプルのＢＤＮＦ及び
ＮＧＦ量を上述のプロメガ社製ＥＬＩＳＡアッセイキッ
トを用いて定量した。結果を図１に示す。被験化合物１
は坐骨神経挫滅モデルにおいて、坐骨神経中のＢＤＮＦ
及びＮＧＦ含量を増加させた。
ける坐骨神経中のＢＤＮＦ及びＮＧＦ含量の増加作用の
測定 ７週令のWistarラットをペントバルビタール麻酔下にて
坐骨神経を露出し、腓骨神経、脛骨神経及び腓腹神経の
分岐点より15mm上流を5 mm幅ピンセットを用いて30秒間
挫滅した。挫滅３日後に挫滅部位に被験物質及び対照と
してのPBSを投与した。被験物質は10μg/ml、30μg/m
l、100μg/mlおよび300μg/mlの各濃度になるようにPBS
に溶解した。投与方法は、被験物質溶液及び対照共に10
0μlをゼルフォーム（ゼラチンスポンジ；ファルマシア
・アップジョン社製）に浸し、坐骨神経傷害部位に静置
することにより行った。また、ゼルフォームが外れない
ように、坐骨神経及びゼルフォームを長さ20 mmのシリ
コンチューブ内に包み込んだ。挫滅７日後(投与４日後)
に障害部位より前後1 cmを含む坐骨神経を取り出した。
取り出した坐骨神経の湿重量を測定し、30倍量の氷冷 e
xtraction buffer（100 mM tris-HCl(pH 7.0) in 2% BS
A, 1 M NaCl, 0.2% NaN3 ,4 mM EDTA, 2% Triton X-10
0）及びプロテアーゼ阻害剤( 5μg/ml aprotinin , 0.5
μg/ml antipain, 157μg/ml benzamidine, 0.1μg/ml
pepstatin A, 5.2μg/ml PMSF)を添加した。glass-gla
ss homogenizer(相互理科)を用いて坐骨神経をホモジナ
イズ後、4 M NaOHを用いてpHを11に合わせ懸濁した。1
3,000 gにて4℃、15分間遠心後、上清を採取した。この
上清に氷酢酸を添加しpHを３に合わせ再び懸濁した。1
3,000 gにて4℃、15分間遠心後、上清を採取した。4 M
NaOHを用いて中性に戻した上清サンプルのＢＤＮＦ及び
ＮＧＦ量を上述のプロメガ社製ＥＬＩＳＡアッセイキッ
トを用いて定量した。結果を図１に示す。被験化合物１
は坐骨神経挫滅モデルにおいて、坐骨神経中のＢＤＮＦ
及びＮＧＦ含量を増加させた。
【００１８】実施例３：ラット坐骨神経挫滅モデルにお
けるミエリン構成成分(P0)発現増加作用の測定 ７週令のWistarラットをペントバルビタール麻酔下にて
坐骨神経を露出し、腓骨神経、脛骨神経及び腓腹神経の
分岐点より15mm上流を5 mm幅ピンセットを用いて30秒間
挫滅した。挫滅３日後に挫滅部位に被験物質及び対照と
してのPBSを投与した。被験物質は10μg/ml、30μg/m
l、100μg/mlおよび300μg/mlの各濃度になるようにPBS
に溶解した。投与方法としては、被験物質溶液及び対照
共に100μlをゼルフォームに浸し、坐骨神経傷害部位に
静置することにより行った。また、ゼルフォームが外れ
ないように、坐骨神経及びゼルフォームを長さ20 mmの
シリコンチューブ内に包み込んだ。挫滅７日後(投与４
日後)に坐骨神経を取り出し、RNAzolB(コスモバイオ社
製)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAは直ちにGeneA
mp RNA PCR kit(PERKIN ELMER社製)を用いてcDNAにし
た。P0及びCyclophilinを検出するためのRT-PCR反応
は、0.5μM primer {(P0: 5’-TGCTCTTCTACCTGATCCGG-
3’, 5’-GAAGCTCCATCTCGATGACC-3’)(Cyclophilin:
5’-GTCTGCTTCGAGCTGTTTGCAG-3’, 5’-GGGTGCTCTCCTGA
GCTACAG-3’)}、2mM MgCl2, ×10 PCR buffer,cDNA sol
ution, 2.5U Ampli Taq DNA polymeraseを添加し、 DN
A Thermal Cyclerにて〔94℃, 1min、60℃, 1min、72
℃, 1.5min〕を１サイクルとして、Cyclophilinは22 cy
cle、 P0は22 cycle行った。この反応によりP0は312 b
p、Cyclophilinは511 bpの断片が増幅される。定量方法
は各PCR産物に対してエチジウムブロマイドにて染色を
行った後、agarose gel電気泳動を行い泳動像をポラロ
イド（登録商標）カメラにて撮影し、これらの写真をス
キャナーに取り込み画像化した。NIH image画像解析ソ
フト（National Institutes of Healthが無料で配布し
ている画像解析ソフト）で泳動バンドの濃さを数値化し
た。house keeping geneの1つであるCyclophilinの数値
でPOのPCR産物の数値を割り、数値のnormalizationを行
った。結果を図２示す。被験化合物１は、有髄線維の成
熟の指標であるミエリン蛋白Ｐ０の発現を上昇させるこ
とが明らかになった。
けるミエリン構成成分(P0)発現増加作用の測定 ７週令のWistarラットをペントバルビタール麻酔下にて
坐骨神経を露出し、腓骨神経、脛骨神経及び腓腹神経の
分岐点より15mm上流を5 mm幅ピンセットを用いて30秒間
挫滅した。挫滅３日後に挫滅部位に被験物質及び対照と
してのPBSを投与した。被験物質は10μg/ml、30μg/m
l、100μg/mlおよび300μg/mlの各濃度になるようにPBS
に溶解した。投与方法としては、被験物質溶液及び対照
共に100μlをゼルフォームに浸し、坐骨神経傷害部位に
静置することにより行った。また、ゼルフォームが外れ
ないように、坐骨神経及びゼルフォームを長さ20 mmの
シリコンチューブ内に包み込んだ。挫滅７日後(投与４
日後)に坐骨神経を取り出し、RNAzolB(コスモバイオ社
製)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAは直ちにGeneA
mp RNA PCR kit(PERKIN ELMER社製)を用いてcDNAにし
た。P0及びCyclophilinを検出するためのRT-PCR反応
は、0.5μM primer {(P0: 5’-TGCTCTTCTACCTGATCCGG-
3’, 5’-GAAGCTCCATCTCGATGACC-3’)(Cyclophilin:
5’-GTCTGCTTCGAGCTGTTTGCAG-3’, 5’-GGGTGCTCTCCTGA
GCTACAG-3’)}、2mM MgCl2, ×10 PCR buffer,cDNA sol
ution, 2.5U Ampli Taq DNA polymeraseを添加し、 DN
A Thermal Cyclerにて〔94℃, 1min、60℃, 1min、72
℃, 1.5min〕を１サイクルとして、Cyclophilinは22 cy
cle、 P0は22 cycle行った。この反応によりP0は312 b
p、Cyclophilinは511 bpの断片が増幅される。定量方法
は各PCR産物に対してエチジウムブロマイドにて染色を
行った後、agarose gel電気泳動を行い泳動像をポラロ
イド（登録商標）カメラにて撮影し、これらの写真をス
キャナーに取り込み画像化した。NIH image画像解析ソ
フト（National Institutes of Healthが無料で配布し
ている画像解析ソフト）で泳動バンドの濃さを数値化し
た。house keeping geneの1つであるCyclophilinの数値
でPOのPCR産物の数値を割り、数値のnormalizationを行
った。結果を図２示す。被験化合物１は、有髄線維の成
熟の指標であるミエリン蛋白Ｐ０の発現を上昇させるこ
とが明らかになった。
【００１９】実施例４：有髄線維密度の測定 ７週令のWistarラットをペントバルビタール麻酔下にて
坐骨神経を露出し、腓骨神経、脛骨神経及び腓腹神経の
分岐点より15mm上流を5 mm幅ピンセットを用いて30秒間
挫滅した。被検物質は2.5μg/ml、25μg/mlおよび82.5
μg/mlの各濃度になるようにPBSに溶解後、浸透圧ポン
プ(alzet社製機種番号2ML2)を用いて5 μl/hr(120 μl/
day)の流速にて14日間挫滅部位に持続投与した。対照は
PBSを用い同様の方法にて投与した。投与14日後に坐骨
神経を摘出し、2.5 %グルタルアルデヒド (in 0.1Mリン
酸緩衝液、pH 7.4)中で一昼夜固定した。坐骨神経を障
害部位から5mmと7mmの遠位部位をカッターナイフで切断
し、坐骨神経を切り出した。切り出した坐骨神経を2%
オスミウム酸で２時間処理後、0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.
4)で洗浄し、エタノール希釈系列(60 %〜100%エタノー
ル)を用いて脱水した。脱水した坐骨神経は包埋板にの
せ、エポキシ樹脂(ナカライ社製ルベアックエポン812)
を包埋板に添加後、60℃, 48時間静置し、坐骨神経を包
埋した。ウルトラミクロトームを用いて、包埋した坐骨
神経サンプルを1 mm切り出した後(切り出し方法：ウル
トラミクロトームを用いて1 μmの厚さで1000枚切片を
切る)、0.5μmの厚さで坐骨神経の輪切り切片を作製
し、スライドガラスに張り付けた。有髄線維を染色する
ために、1 %トルイジンブルー溶液をスライドガラスに
張り付けた切片上に滴下し80℃, 10分間処理した。処理
後脱イオン水で洗浄し、封入剤(エンテラン)を切片上に
滴下しカバーガラスをスライドガラス上にのせ切片を封
入した。坐骨神経の切片は、顕微鏡下(20倍の倍率)にて
ポラロイドカメラを用いて写真撮影した。坐骨神経内の
有髄線維数は、写真上にてコロニーカウンターを用いて
有髄線維全てをカウントして算出した。一方で、写真を
スキャナーを用いて取り込み、NIH image(上述の画像解
析ソフト)を用いて坐骨神経の面積を算出した。有髄線
維密度は、有髄線維数を坐骨神経の面積で割って算出し
た。結果を図３に示す。被験化合物１の坐骨神経再生促
進作用が明らかになった。
坐骨神経を露出し、腓骨神経、脛骨神経及び腓腹神経の
分岐点より15mm上流を5 mm幅ピンセットを用いて30秒間
挫滅した。被検物質は2.5μg/ml、25μg/mlおよび82.5
μg/mlの各濃度になるようにPBSに溶解後、浸透圧ポン
プ(alzet社製機種番号2ML2)を用いて5 μl/hr(120 μl/
day)の流速にて14日間挫滅部位に持続投与した。対照は
PBSを用い同様の方法にて投与した。投与14日後に坐骨
神経を摘出し、2.5 %グルタルアルデヒド (in 0.1Mリン
酸緩衝液、pH 7.4)中で一昼夜固定した。坐骨神経を障
害部位から5mmと7mmの遠位部位をカッターナイフで切断
し、坐骨神経を切り出した。切り出した坐骨神経を2%
オスミウム酸で２時間処理後、0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.
4)で洗浄し、エタノール希釈系列(60 %〜100%エタノー
ル)を用いて脱水した。脱水した坐骨神経は包埋板にの
せ、エポキシ樹脂(ナカライ社製ルベアックエポン812)
を包埋板に添加後、60℃, 48時間静置し、坐骨神経を包
埋した。ウルトラミクロトームを用いて、包埋した坐骨
神経サンプルを1 mm切り出した後(切り出し方法：ウル
トラミクロトームを用いて1 μmの厚さで1000枚切片を
切る)、0.5μmの厚さで坐骨神経の輪切り切片を作製
し、スライドガラスに張り付けた。有髄線維を染色する
ために、1 %トルイジンブルー溶液をスライドガラスに
張り付けた切片上に滴下し80℃, 10分間処理した。処理
後脱イオン水で洗浄し、封入剤(エンテラン)を切片上に
滴下しカバーガラスをスライドガラス上にのせ切片を封
入した。坐骨神経の切片は、顕微鏡下(20倍の倍率)にて
ポラロイドカメラを用いて写真撮影した。坐骨神経内の
有髄線維数は、写真上にてコロニーカウンターを用いて
有髄線維全てをカウントして算出した。一方で、写真を
スキャナーを用いて取り込み、NIH image(上述の画像解
析ソフト)を用いて坐骨神経の面積を算出した。有髄線
維密度は、有髄線維数を坐骨神経の面積で割って算出し
た。結果を図３に示す。被験化合物１の坐骨神経再生促
進作用が明らかになった。
【００２０】
【図１】各々、被験化合物１の坐骨神経挫滅モデルラッ
トにおける坐骨神経中のＢＤＮＦ含量及びＮＧＦ含量の
増加作用を棒グラフで示した図である。棒グラフ中のエ
ラーバーは標準誤差を示す。
トにおける坐骨神経中のＢＤＮＦ含量及びＮＧＦ含量の
増加作用を棒グラフで示した図である。棒グラフ中のエ
ラーバーは標準誤差を示す。
【図２】被験化合物１の坐骨神経挫滅モデルラットにお
ける末梢神経ミエリン構成成分P0の発現増強作用を棒グ
ラフで示した図である。棒グラフ中のエラーバーは標準
誤差を示す。
ける末梢神経ミエリン構成成分P0の発現増強作用を棒グ
ラフで示した図である。棒グラフ中のエラーバーは標準
誤差を示す。
【図３】被験化合物１の坐骨神経挫滅モデルラットにお
ける坐骨神経再生促進作用を棒グラフで示した図であ
る。棒グラフ中のエラーバーは標準誤差を示す。**はst
udentのt検定をした結果、コントロールに対して統計的
に有意(**P<0.01)であることを示す。
ける坐骨神経再生促進作用を棒グラフで示した図であ
る。棒グラフ中のエラーバーは標準誤差を示す。**はst
udentのt検定をした結果、コントロールに対して統計的
に有意(**P<0.01)であることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０７ Ａ６１Ｐ 43/00 １０７ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/68 33/68 // Ｃ０７Ｄ 235/18 Ｃ０７Ｄ 235/18 403/14 403/14 (72)発明者 岸野 晶祥 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内 (72)発明者 中山 智加男 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内 (72)発明者 熊谷 和夫 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友製 薬株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FA11 FB01 FB02 FB03 4C063 CC26 DD07 EE01 4C084 AA17 NA14 ZA202 ZB222 ZC352 ZC542 4C086 AA01 AA02 BC39 MA01 MA04 NA14 ZA20 ZB21 ZC54
Claims (8)
- 【請求項１】 被験物質を、分散させた哺乳動物の初代
培養シュワン細胞と共に培養し、培養上清中のＢＤＮＦ
又はＮＧＦ含量を指標にしてシュワン細胞活性化作用を
有する物質を選抜することを特徴とする、シュワン細胞
活性化剤のスクリーニング方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法で選抜した被験物質
を、更にＧａｌＣ発現誘導能または／及びミエリン鞘形
成促進作用を指標にしてシュワン細胞活性化作用を有す
る物質を選抜することを特徴とする、シュワン細胞活性
化剤のスクリーニング方法。 - 【請求項３】 請求項１もしくは２記載の方法により選
抜されたシュワン細胞活性化作用を有する物質を含有す
るシュワン細胞活性化剤。 - 【請求項４】 培養上清中のＢＤＮＦ又はＮＧＦ含量
が、未添加の場合と比較して２倍以上となる作用を有す
ることで特徴づけられる、請求項３記載のシュワン細胞
活性化剤。 - 【請求項５】 シュワン細胞活性化作用を有する物質
が、分子量１０００以下の低分子化合物である請求項３
記載のシュワン細胞活性化剤。 - 【請求項６】 末梢神経障害治療剤である請求項３記載
のシュワン細胞活性化剤。 - 【請求項７】 末梢神経障害が糖尿病性ニューロパチー
または外傷性神経障害である請求項６記載のシュワン細
胞活性化剤。 - 【請求項８】 シュワン細胞活性化作用を有する物質が
式 【化１】 （式中、Ｒ１はアシルアミノ基または環状イミド基を表
す。Ｒ２及びＲ３は、互いに独立して、水素原子または
ハロゲン原子を表す。Ｒ４はアシルアミノ基または環状
イミド基を表す。Ｒ５は水素原子または低級アルキル基
を表す。）で表される化合物またはその塩である請求項
３、６または７記載のシュワン細胞活性化剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001121861A JP2002318231A (ja) | 2001-04-20 | 2001-04-20 | シュワン細胞活性化剤及びそのスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001121861A JP2002318231A (ja) | 2001-04-20 | 2001-04-20 | シュワン細胞活性化剤及びそのスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002318231A true JP2002318231A (ja) | 2002-10-31 |
Family
ID=18971652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001121861A Pending JP2002318231A (ja) | 2001-04-20 | 2001-04-20 | シュワン細胞活性化剤及びそのスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002318231A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1562605A2 (en) * | 2002-10-08 | 2005-08-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Compounds for modulation of cholesterol transport |
| EP1547996A4 (en) * | 2002-08-30 | 2006-08-02 | Bf Res Inst Inc | DIAGNOSTIC PROBES AND REMEDIES FOR DISEASES HAVING PRION PROTEIN ACCUMULATION AND METHOD OF MARKING |
| JP2017171595A (ja) * | 2016-03-22 | 2017-09-28 | 雪印メグミルク株式会社 | Ｂｄｎｆ産生促進剤 |
| JP2021000144A (ja) * | 2014-09-12 | 2021-01-07 | ザ アドミニストレイターズ オブ ザ テューレイン エデュケイショナル ファンド | 神経ミクロ生理学的システム及びこれを使用する方法 |
| JP2021017420A (ja) * | 2019-07-22 | 2021-02-15 | 国立大学法人九州大学 | 脳由来神経栄養因子産生促進剤、神経成長因子産生促進剤、酸化ストレス抑制剤及びそれらの使用 |
| EP4265247A1 (en) * | 2022-04-22 | 2023-10-25 | Université Paris Cité | Compounds inducing production of proteins by immune cells |
| EP4265246A1 (en) * | 2022-04-22 | 2023-10-25 | Université Paris Cité | Compounds inducing production of proteins by immune cells |
-
2001
- 2001-04-20 JP JP2001121861A patent/JP2002318231A/ja active Pending
Cited By (13)
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| JP7214081B2 (ja) | 2014-09-12 | 2023-01-30 | ザ アドミニストレイターズ オブ ザ テューレイン エデュケイショナル ファンド | 神経ミクロ生理学的システム及びこれを使用する方法 |
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| JP7025112B2 (ja) | 2016-03-22 | 2022-02-24 | 雪印メグミルク株式会社 | Ｂｄｎｆ産生促進剤 |
| JP2017171595A (ja) * | 2016-03-22 | 2017-09-28 | 雪印メグミルク株式会社 | Ｂｄｎｆ産生促進剤 |
| JP2021017420A (ja) * | 2019-07-22 | 2021-02-15 | 国立大学法人九州大学 | 脳由来神経栄養因子産生促進剤、神経成長因子産生促進剤、酸化ストレス抑制剤及びそれらの使用 |
| JP7367959B2 (ja) | 2019-07-22 | 2023-10-24 | 国立大学法人九州大学 | 脳由来神経栄養因子産生促進剤、神経成長因子産生促進剤、酸化ストレス抑制剤及びそれらの使用 |
| EP4265247A1 (en) * | 2022-04-22 | 2023-10-25 | Université Paris Cité | Compounds inducing production of proteins by immune cells |
| EP4265246A1 (en) * | 2022-04-22 | 2023-10-25 | Université Paris Cité | Compounds inducing production of proteins by immune cells |
| WO2023203162A1 (en) * | 2022-04-22 | 2023-10-26 | Universite Paris Cite | Compounds inducing production of proteins by immune cells |
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|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
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