JP2005508237A - 制御した細胞内殖および組織再生のための合成マトリクス - Google Patents

Abstract

【課題】細胞内殖および組織再生を制御するための合成マトリクスを提供する。
【解決手段】少なくとも第１および第２の前駆体分子の反応から得られる３次元ポリマー性ネットワークを含む生体材料。該第１前駆体分子は、少なくとも、分子量が実質的に同じ少なくとも３つの腕部を含む３官能性分岐成分であり、また該第２前駆体分子は、少なくとも、２官能性の成分である。該第１および第２の前駆体分子の官能基の当量の比率は０．９と１．１との間の範囲内である。該第１前駆体分子の腕部の分子量、該第２前駆体分子の分子量、および分岐点の官能性は、該ポリマー性ネットワークの含水量が、水の取り込み完了後、該ポリマー性ネットワークの全重量の平衡重量％と９２重量％との間であるように選択される。本発明は、創傷治療用途のために有用な合成マトリクスの特徴を改良する方法を教示する。

Description

【背景技術】
【０００１】
創傷治癒用途および組織再生のための３次元スカフォードまたはマトリクス（結合された生体活性因子を有するまたは有さない）として作用する生体材料の使用は、以前に記載されている。体内での適用のために、侵襲的な外科手術を必要とし、困難な滅菌問題を有し、またしばしば欠損の形状に非常に良くは合致しない予め成形された生体材料の移植と比較して、体内の必要な部位での正確なマトリクスの現場での形成は、しばしば非常に好ましい。しかしながら、体内での適用は、架橋性化学物質に関して、並びにマトリクスの現場形成のために必要な前駆体分子の性質の双方に関して化学物質の選択を制限する。該前駆体分子に関して、様々なアプローチが用いられている。あるものは天然前駆体を利用し、他のものは完全に合成の、例えば天然でない前駆体に着目し、またさらに他のアプローチにおいては、天然と合成の抽出物または一方または他方の変性物の組み合わせが使用される。
コラーゲン、変性コラーゲン（ゼラチン）および特にフィブリンのような天然または化学変性された天然タンパク質をベースとするマトリクスは首尾良く試験されている。特に、良好な治癒応答がフィブリンをベースとするマトリクスで達成されている。他の例は、セルロースのような炭水化物、アルギニン酸塩およびヒアルロン酸を包含する。免疫原生、高費用の生産、制限された利用可能性、バッチ間での変化、および精製問題のような潜在的な問題が、天然前駆体から形成されるマトリクスの使用を制限し得る。
【０００２】
これらの関心ために、合成前駆体分子をベースとするマトリクスが、身体の内外での組織再生のために開発されている。
【０００３】
体内での用途のための合成マトリクスを形成する架橋反応は、（ｉ）ヘルン、ハッブルのJ. Biomed. Mater. Res. 39:266-276, 1998に記載される不飽和二重結合を含有する２つ以上の前駆体の間の遊離ラジカル重合、（ｉｉ）米国特許第５８７４５００号明細書に開示される例えばアミン基を含む前駆体とスクシニミジル基を含む前駆体との間の求核置換反応、（ｉｉｉ）縮合および付加反応、および（ｉｖ）求核部としてチオール基またはアミン基を含む前駆体分子と求電子部としてアクリレート基またはビニルスルホン基を含む前駆体分子との反応のような、強い求核基と共役不飽和の基または結合（強い求電子基として）との間のミカエル型付加反応を包含する。ミカエル型付加反応は、国際公開第００／４４８０８号パンフレットにおいて記載され、その内容は参照により本明細書中に組み込まれる。ミカエル型付加反応は、生理的条件下、非常に自己選択的な方法で、敏感な生物学的材料の存在下でさえ、少なくとも第１および第２の前駆体成分の現場での架橋を可能にし、即ち、該第１前駆体成分は第２前駆体成分と、敏感な生物学的環境中の他の成分より遥かにより高速で反応し、そして該第２前駆体成分は第１前駆体成分と、体内に存在する敏感な生物学的環境中の他の成分より遥かにより素早く反応する。前駆体成分の一方が少なくとも２つの官能性を有し、そして少なくとも１つの他の前駆体成分が２より大きい官能性を有するとき、該系は自己選択的に反応して、架橋した３次元生体材料を形成するだろう。
【非特許文献１】
J. Biomed. Mater. Res. 39:266-276, 1998
【特許文献１】
米国特許第５８７４５００号明細書
【特許文献２】
国際公開第００／４４８０８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
近年、合成マトリクスの創傷治癒特性を改良するための進歩がなされているが、該特性は依然として、天然前駆体分子またはポリマーから作られたマトリクス、特にフィブリンマトリクスが示す治癒結果には至っていない。
【０００５】
本発明の目的は、特に骨の欠損のための合成マトリクスの創傷治癒能力を改良することである。特に、自然治癒応答を受けない組織への適用および治癒を可能にする合成マトリクスが提供される。
【０００６】
他の目的は、マトリクス形態を改良すること、特に細胞浸潤に関するマトリクス特性を改良することである。
【０００７】
本発明のさらなる他の目的において、マトリクスネットワークの構造および機能が最適化される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これらの目的は、少なくとも第１および第２の前駆体分子の反応から得られる３次元ポリマー性ネットワークを含む生体材料であって、該第１前駆体分子は、少なくとも、分子量が実質的に同じ少なくとも３つの腕部を含む３官能性の分岐したポリマーであり、また該第２前駆体分子は、少なくとも、２官能性の分子であり、該第１および第２の前駆体分子の官能基の当量の比率は０．９と１．１との間であり、そして該第１前駆体分子の腕部の分子量、該第２前駆体分子の分子量、および分岐点の官能性は、該ポリマー性ネットワークの含水量が、水の取り込み完了後、該ポリマー性ネットワークの全重量の平衡重量％と９２重量％との間であるように選択される、生体材料により解決される。
【０００９】
殆どの治癒指標のために、マトリクスの適合された崩壊速度と組み合わせた細胞内殖または細胞のマトリクス中への移動の速度は、全体の治癒応答に重要である。マトリクスが細胞により侵入されることとなる可能性は、主にネットワーク密度、即ち分岐点または交点の間の間隔の問題である。存在する間隔が細胞の寸法に関して小さ過ぎる場合、またはマトリクス内でより多くの間隔を生じることとなるマトリクスの崩壊の速度が低速過ぎる場合、非常に制限された治癒応答が観察される。体内での損傷に応答して形成される自然に見出される治癒マトリクス、例えばフィブリンマトリクスは、細胞が非常に容易に侵入できる非常に弛緩したネットワークからなることが知られている。浸潤は、フィブリンネットワークの一体化された部分である細胞付着のためのリガンドにより促進される。
【００１０】
フィブリンマトリクス以外で、ポリエテングリコールのような合成親水性前駆体分子から作製されたマトリクスは、水性環境中でポリマー性ネットワークの成形後に膨潤する。十分に短いゲル化時間（７と８との間のｐＨおよび３６ないし３８℃の範囲内の温度で３分と１０分の間）および体内でのマトリクスの現場での形成の間の定量的な反応を達成するために、該前駆体分子の開始濃度は十分に高くなければならない。想定されたネットワーク形成後の膨潤が起こらないと、必要な開始濃度は細胞浸潤のためには濃密過ぎるマトリクスを導く。それ故、該ポリマー性マトリクスの膨潤は、該分岐点間の間隔を拡大するおよび広げるために重要である。
該前駆体分子の開始濃度に関わらず、同じ合成前駆体分子から作製されるヒドロゲルは平衡状態では同じ含水量まで膨潤する。これは、該前駆体分子の開始濃度が高ければ高いほど、その平衡状態に到達したときにヒドロゲルの最終体積はより大きくなることを意味する。体内で利用可能な空間が十分な湿潤を可能にするためには小さ過ぎる場合、細胞浸潤の速度および結果としての治癒応答は減少する。結果として、体内での適用のために２つの矛盾した要求の間の最適点を見出さねばならない。一方で、開始濃度は必要なゲル化時間を保証するために十分に高くなければならず、他方で、それは必要な含水量を達成するために欠損中で利用可能な空間について大き過ぎる空間を要し、そしてそれ故に、細胞浸潤のためには濃密過ぎるままのマトリクスを導き得る。良好な細胞浸潤および引き続く治癒応答は、ヒドロゲルの水濃度が、水取り込み完了後、該ポリマー性ネットワークと該水との全重量の平衡含水量と９２重量％との間の範囲内にある生体材料で観察された。好ましくは、該含水量は、水取り込み完了後、該ポリマー性ネットワークと該水との全重量の９３重量％と９５重量％の間である。水取り込みの完了は、平衡濃度が達成されるので、または利用可能な空間がさらなる体積増加を可能にしないので達成できる。従って、該前駆体成分の開始濃度ができるだけ低くなるように選択することが好ましい。
【００１１】
ゲル化時間と低い開始濃度との間のバランスは、前記前駆体分子の構造により最適化されなればならない。特に、前記第１前駆体分子の腕部の分子量、前記第２前駆体分子の分子量、および分岐の度合い、即ち前記分岐点の官能性は、応じて調節されなければならない。実際の反応機構はこの相互作用に小さな影響を有する。
【００１２】
前記ポリマー性ネットワークの全体の分岐度の増加と共に、相互結合部の分子量、即ち該結合部の長さも増加しなければならない。
【００１３】
前記第１前駆体分子は各腕部の末端で官能基を有する３または４腕のポリマーであり、また前記第２前駆体分子は線状の２官能性分子である場合、該第１前駆体分子の腕部の分子量および該第２前駆体分子の分子量は、好ましくは、ネットワーク形成後の分岐点間の結合部が１０ないし１３ｋＤの間（リンク部が線状で分岐していない条件下）、好ましくは１１と１２ｋＤとの間、の範囲内の分子量を有するように選択される。これは、第１および第２の前駆体分子の合計の開始濃度を、溶液中の該第１および第２の前駆体分子の全重量（ネットワーク形成前）の８と１２重量％との間、好ましくは９と１０重量％との間の範囲内にする。該第１前駆体成分の分岐度が８に増加し、そして該第２前駆体分子が線状の２官能性分子のままである場合、該分岐点の間の結合部の分子量は、好ましくは１８と２４ｋＤとの間の分子量に増加する。該第２前駆体分子の分岐度が線状から３または４腕の前駆体成分に増加する場合、分子量、即ち該結合部の長さは応じて増加する。
【００１４】
前記第１および第２の前駆体分子は、タンパク質、ペプチド、ポリオキシアルキレン類、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−アクリル酸）、ポリ（エチロキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレン−コ−ビニルピロリドン）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（エチレン−コ−マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）、またはポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー類からなる群より選択される。特に好ましいのはポリエチレングリコールである。
【００１５】
最も好ましくは、前記第１前駆体分子はポリエチレングリコールである。
前記第２前駆体分子は最も好ましくはポリエチレングリコールまたはペプチドより選択される。
【００１６】
官能化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、合成生体材料の形成において特に好ましい特性を組み合わせることが示されている。その高い親水性、哺乳類の酵素による低い崩壊性、および低い毒性は、該分子を体内での適用のために特に有用にする。線状の（２つの末端を有することを意味する）または分岐した（２つ以上の末端を意味する）ＰＥＧ類を容易に購入または合成でき、そして該ＰＥＧ末端基を選択した反応機構に従って官能化できる。
【００１７】
本発明の好ましい態様において、前記第１前駆体分子として前記３官能性で３腕の１５ｋＤポリマー、即ち、各腕部が５ｋＤの分子量を有するもの、および第２前駆体分子として０．５ないし１．５ｋＤの間、さらにより好ましくは１ｋＤ付近の範囲内の分子量の２官能性の線状分子を含む組成物が選択される。好ましくは、該第１および第２の前駆体成分はポリエチレングリコールである。好ましくは、該第１前駆体成分は官能基として共役不飽和の基または結合、最も好ましくはアクリレートまたはビニルスルホンを含み、そして該第２前駆体分子の官能基は求核基、好ましくはチオール基またはアミノ基を含む。本発明の他の好ましい態様において、該第１前駆体分子は各腕部の末端で官能基を有する４腕の２０ｋＤ（各腕部５ｋＤａの分子量）ポリマーであり、そして該第２前駆体分子として、１ないし３ｋＤａの間、好ましくは１．５と２ｋＤとの間の範囲内の分子量の２官能性線状分子である。好ましくは、該第１の前駆体分子はポリエチレングリコールであり、そして該第２の前駆体分子はペプチドである。双方の好ましい態様において、第１および第２の前駆体分子の合計の開始濃度は、該第１および第２の前駆体分子並びに水（ポリマー性ネットワーク形成前）の全重量の８ないし１１重量％、好ましくは９と１０重量％の間、１０分以下のゲル化時間を達成するために好ましくは５と８重量％の間の範囲である。これらの組成物は、ｐＨ８．０および３７℃で、混合後約３〜１０分のゲル化時間を有する。同様に、この態様において、該第１前駆体成分のために好ましい官能基はアクリレート類またはビニルスルホン類のような共役不飽和基であり、また第２前駆体成分のためには求核基、最も好ましくはチオール基である。
【００１８】
前記３次元ネットワークを製造する反応機構は、置換反応、遊離ラジカル反応および付加反応のような様々な反応機構の中から選択できる。
【００１９】
置換、縮合および付加の反応の場合、前記前駆体分子の一方は求核基を含み、そして他方の前駆体分子は求電子基、好ましくは共役不飽和の基または結合を含む。
【００２０】
遊離ラジカル反応の場合、双方の前駆体分子は不飽和結合、好ましくは共役不飽和結合を含む。
【００２１】
好ましくは、前記共役不飽和基または共役不飽和結合は、アクリレート類、ビニルスルホン類、メタクリレート類、アクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリロニトリル類、ビニルスルホン類、２−または４−ビニルピリジン類、マレイミド類およびキノン類からなる群より選択される。
【００２２】
前記求核基は、好ましくは、チオール基、アミノ基およびヒドロキシル基からなる群より選択される。
【００２３】
本発明に関して特に好ましい反応機構は、国際公開第００／４４８０８号パンフレットにおいて記載されるような共役不飽和の基または結合と強い求核部との間のミカエル型付加反応である。ミカエル型付加反応のためには、前記第１前駆体分子は好ましくは共役不飽和基、また特にビニルスルホン基またはアクリレート基を含み、そして前記第２前駆体分子はチオール基を含む。該２つの前駆体成分の末端架橋は安定な３次元ネットワークを生じる。この共役不飽和基へのミカエル型付加は、定量的な収率で生理的条件下で何れの副生物も生じずに起こる。
【００２４】
治癒速度はさらに、細胞媒介崩壊および再構築を受けることを可能にするマトリクスメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰ類）のような細胞分泌プロテアーゼ類へのマトリクスの感受性に依存する。要約すると、マトリクスに対する身体の治癒応答が明らかにより良好になればなる程、細胞浸潤およびマトリクス崩壊の速度はより同調する。組織再生においてマトリクスが示す貧弱な性能は、マトリクスネットワークの構造とその機能との間の貧弱な相関のためである。
【００２５】
上記で既に述べたように、この速度率は
−細胞浸潤のための前駆体ポリマーの構造（即ち、鎖長および腕部の数）、
−ネットワークに共有結合した細胞浸潤を増加させるための付着リガンドの親和性および濃度、
酵素崩壊性ゲルの場合、細胞により分泌される所望のプロテアーゼによる崩壊に対するプロテアーゼ基質の特異性および酵素活性（Ｋｍ／Ｋｃａｔ）または用いられるプロテアーゼ基質の酵素加水分解の活動
−加水分解崩壊性ゲルの場合、生理的条件に対するマトリクスの感受性、
−およびまた、マトリクスメタロプロテアーゼ類であるＭＭＰＳ類（例えば成長因子）の発現および分泌を上方調節するか、またはそれを下方調節または阻害（例えば阻害剤）する分子の添加
により調節できる。
【００２６】
これらの因子の良好な調節は、主に、使用される架橋性化学物質とは独立している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
定義：
“生体材料”により、材料が永続的であるか一時的であるかに依存して、身体の何れかの組織、器官または機能を評価、治療、増強または置換するために生体系と連結することが意図される材料を意味する。本発明に関し、用語“生体材料”および“マトリクス”は類義語のように使用され、そして水で膨潤するが、水中に溶解しない架橋したポリマー性ネットワーク、即ち、外傷または欠損を受けた軟質および硬質の組織のための特定の支持機能を満たす特定の時間の間、体内に留まるヒドロゲルを意味する。
“強い求核部”により、極性結合形成反応において求電子部に電子対を供与できる分子を意味する。好ましくは、該強い求核部は、生理ｐＨでＨ₂Ｏより求核性である。強い求核部の例はチオール類およびアミン類である。
“共役不飽和結合”により、炭素−炭素、炭素−ヘテロ原子またはヘテロ原子−ヘテロ原子の多重結合と単結合との交互反復、または合成ポリマーまたはタンパク質のような高分子への官能基の結合を意味する。そのような結合は、付加反応を受けることができる。
“共役不飽和基”により、付加反応を受けることができる多重結合を有する、炭素−炭素、炭素−ヘテロ原子またはヘテロ原子−ヘテロ原子の多重結合と単結合との交互反復を含む分子または分子の領域を意味する。共役不飽和基の例は、それらに制限されること無く、ビニルスルホン類、アクリレート類、アクリルアミド類、キノン類、およびビニルピリジン類、例えば２−または４−ビニルピリジン類およびイタコネート類を包含する。
“合成前駆体分子”により、自然界に存在しない分子を意味する。
“天然前駆体成分またはポリマー”により、自然界で見出される分子を意味する。
“官能化”により、官能性の基または部分の結合を生じる方法で変性することを意味する。例えば分子は、分子を強い求核性または共役不飽和にする分子の導入により官能化され得る。好ましくは、分子、例えばＰＥＧは、チオール、アミン、アクリレート、またはキノンとなるように官能化される。
タンパク質は特に、ジスルフィド結合の部分的または完全な還元により効率良く官能化されて遊離チオールを生じ得る。
“官能性”により、分子上の反応性部位の数を意味する。
“分岐点の官能性”により、分子中の１点から伸びる腕部の数を意味する。
【００２８】
“付着部位”により、分子、例えば細胞の表面上の付着促進受容体が結合するペプチド配列を意味する。付着部位の例は、それらに制限されること無く、フィブロネクチンからのＲＧＤ配列、およびラミニンからのＴＩＧＳＲ配列を包含する。好ましい付着部位は、本発明の生体材料中に組み込まれる。
“成長因子結合部位”により、成長因子が、または成長因子を結合する分子が結合するペプチド配列を意味する。例えば、該成長因子結合部位は、ヘパリン結合部位を包含し得る。この部位はヘパリンを結合し、そしてヘパリンはヘパリン結合成長因子、例えばｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ、またはＴＧＦβを結合する。
“プロテアーゼ結合部位”により、酵素のための基質であるペプチド配列を意味する。
“生物学的活性”により、興味のあるタンパク質により媒介される機能事象を意味するう。幾つかの態様において、これは、ポリペプチドと他のポリペプチドとの相互作用を測定することにより評価される事象を包含する。同様に、興味のあるタンパク質が細胞の成長、分化、死、移動、付着、他のタンパク質との相互作用、酵素活性、タンパク質のリン酸化または脱リン酸化、転写、または翻訳について有する効果を評価することを包含する。
“敏感な生物学的分子”により、細胞中、または体内で見出されるか、または細胞または身体のための治療剤として使用でき、存在により他の分子と反応し得る分子を意味する。敏感な生物学的分子の例は、それらに制限されること無く、ペプチド、タンパク質、核酸、および薬剤を包含する。本発明において、生体材料は、敏感な生物学的材料の存在下、該敏感な生物学的材料に悪影響すること無く作製できる。
本明細書中で使用されるとき、“再生”は、組織の一部または全部が成長し直すことを意味する。例えば、本発明は、外傷、腫瘍除去、または脊椎固定術の後に骨を再生する方法、または糖尿病脚部潰瘍、床擦れ、および静脈不全の治癒において補助となるための皮膚を再生する方法を特色とする。再生され得る他の組織は、それらに制限されること無く、神経、血管、および軟骨組織を包含する。
“多官能性”は、分子（即ちモノマー、オリゴマーおよびポリマー）当り、１つより多い求電子性および／または求核性の官能基を意味する。
“自己選択性反応”は、組成物中の第１前駆体成分が該組成物中の第２前駆体成分と、および前記第２前駆体成分も前記第１前駆体成分と混合物中または反応の場所の双方で存在する他の化合物よりもより遥かに高速で反応することを意味する。本明細書中で使用されるとき、求核部は、他の生物学的化合物よりむしろ、求電子部と優先的に結合し、そして求電子部は、他の生物学的化合物よりむしろ、強い求核部と優先的に結合する。
“架橋”は、少なくとも前駆体成分に属して分子量を増加させる求核基と求電子基との間の共有結合の形成を意味する。
“ポリマー性ネットワーク”は、実質的に全てのモノマー、オリゴマーまたはポリマーがそれらの利用可能な官能基を通した分子間共有結合により結合して、１つの巨大分子を生じるプロセスの生成物を意味する。
“生理的”は、生存中の脊椎動物中で見出すことができるような条件を意味する。特に生理的条件は、温度、ｐＨ等ようなヒトの身体中の条件に関する。生理的温度は特に３５℃ないし４２℃の間の範囲内、好ましくは３７℃付近の温度を意味する。
“架橋密度”は、それぞれの分子の２つの架橋部の間の平均分子量（Ｍ_c）として定義される。
“当量”は、官能基のｍｍｏｌ／基質のｇとして定義される。
“膨潤”は、生体材料による水の取り込みによる体積および質量の増加を意味する。用語“水取り込み”および“膨潤”は本出願を通して類義語のように使用される。
“平衡状態”は、水中で一定条件下で貯蔵されたとき、ヒドロゲルが質量の増加または減少を受けない状態として定義される。
【００２９】
前記合成生体材料は、自然系の多くの観点を組み込むように設計できる。特異的な受容体−リガンド結合を通して細胞付着を誘導するペプチド、およびマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によりマトリクスに細胞−誘発再構築を可能にする成分が組み込まれる。ＭＭＰ基質は、哺乳類組織中の主なタンパク質として、それらの崩壊が自然ＥＣＭ交代（例えば、創傷治癒の間）に、また同様に組織再生の誘導において鍵となる役割を果たすので選択される。他の酵素類もまた、所望の特別な酵素に特異的な基質の組み込みにより標的とされ得る。これらのヒドロゲルは、インビトロおよびインビボの双方における３次元での細胞移動の機構および速度が、マトリクスの特徴および組成により、成長因子またはサイトカインのような何れかの遊離またはマトリクスに関連した外因性信号分子の添加と独立して容易に制御できる。
【００３０】
酵素崩壊性マトリクスの形成において、特にマトリクスペプチドが非常に都合が良い構成ブロックを与える。２つ以上のシステイン残基を含有するペプチドの合成は簡単であり、そしてこの成分はその後、求核基を含む第２前駆体分子として容易に役立つことができる。例えば、２つの遊離システイン残基を有するペプチドは、３腕の１５ないし２０ｋＰＥＧトリアクリレートと、生理的または僅かに高いｐＨ（例えば、８ないし９、ゲル化は同様にさらに高いｐＨでさえも良好に進行するが、自己選択性の潜在的な損失がある）で混合すると、容易にヒドロゲルを形成する。全ての塩基が使用されるが、しかしながら好ましくは第３アミンが適用される。トリエタノールアミンが最も好ましい。前記第１および第２の液体前駆体分子を一緒に混合すると、それらは数分間にわたり反応して、ＰＥＧ鎖のネットワークからなり、ネットワークの交点を伴い、接続結合部としてペプチドを持つ弾性ゲルを形成する。該ペプチドは、プロテアーゼ基質として、タンパク質ベースのネットワーク中でするのと同様に、前記ＰＥＧ鎖のネットワークが細胞により浸潤および崩壊できるように選択できる。ゲル化は自己選択性であり、ペプチドが殆ど該ＰＥＧ成分と反応して他の成分とは反応せず、そして該ＰＥＧ成分は殆ど該ペプチドと反応して他の成分とは反応しないことを意味する。さらなる他の態様において、２官能性剤が組み込まれて、他の種（例えば組織表面）との化学結合を与え得る。
【００３１】
さらなる好ましい態様において、細胞付着のためのペプチド部位、即ち細胞の表面上の付着促進受容体に結合するペプチドが、マトリクス中、即ち本発明の生体材料中に組み込まれる。そのような付着促進ペプチドは、フィブロネクチンからのＲＧＤ配列、ラミニンからのＹＩＧＳＲ配列からなる群より選択される。上記したように、これは、例えば単純にシステイン含有ペプチドを、ＰＥＧジアクリレートまたはトリアクリレート、ＰＥＧジアクリルアミドまたはトリアクリルアミド、またはＰＥＧジキノンまたはトリキノンのような共役不飽和基を含む前駆体分子と数分間、トリオール含有前駆体成分のような求核基を含む前駆体成分の残部と混合する前に混合することによりなすことができる。この第１工程の間、付着促進ペプチドは、共役した不飽和性で多官能化された前駆体の一端部に組み込まれ、残存する多チオールが系に添加されたとき、架橋ネットワークが形成される。ネットワークがここで生成される方法の他の重要な意味は、付着信号のようなペンダント型生体活性リガンドの組み込みの効率の良さである。何れかの手段により、この工程は、例えば未結合リガンド（例えば付着部位）が細胞とマトリクスとの相互作用を阻害するかもしれないので、定量的でなければならない。後に記載するように、そのようなペンダント型オリゴペプチドを持つ前駆体の誘導は、第１工程で、チオールを越える化学量論的に大過剰（最小：４０倍）の多腕求電子前駆体中で行われ、そして従って明らかに定量的である。望ましくない阻害を防止するために、この遂行は生物学的さらにより顕著であり、細胞の挙動はリガンド密度の小さな変化に対して極度に敏感であり、そして組み込まれたリガンドの正確な知識は、細胞−マトリクス相互作用の設計および理解を助ける。要約すると、該マトリクスに共有結合した付着部位の濃度は、細胞浸潤の速度に顕著に影響する。例えば、所定のヒドロゲルについて、該マトリクス中に組み込まれることができるＲＧＤ濃度範囲は、最適な方法で細胞内殖および細胞移動を支持する。ＲＧＤのような付着部位の最適濃度範囲は０．０４と０．０５ｍＭの間であり、そしてさらに好ましくは、水取り込み終了後、平衡濃度と９２重量％との間の含水量を有するマトリクスについて、０．０５ｍＭである。
【００３２】
本発明のさらに好ましい態様において、成長因子類または成長因子様のペプチドは、前記マトリクスに共有結合される。骨治癒指標のために、ＴＧＦβ、ＢＭＰ類、ＩＧＦ類、ＰＤＧＦ類、特にＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、ＩＧＦ１、ＰＤＧＦＡＢ、ヒト成長放出因子、ＰＴＨ１−８４、ＰＴＨ１−３４およびＰＴＨ１−２５が用いられる。意外にも、ＰＴＨ（ＰＴＨ１−８４、ＰＴＨ１−３４およびＰＴＨ１−２５）は、合成マトリクスに共有結合されたとき、特に良好な骨形成を示した。最良の結果は、ＰＴＨ１−３４（アミノ酸配列ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ）を、細胞により浸潤され、そしてその後崩壊できる合成マトリクスに共有結合することにより達成された。タンパク質またはペプチドに直接または結合配列を通して結合された少なくとも１つのさらなるシステイン基（−ＳＨ）を持つ成長因子類または成長因子様のペプチドが発現または化学合成される。該結合配列はさらに、酵素崩壊性アミノ酸配列を含み、該成長因子が該マトリクスから酵素により実質的に自然形態で開裂されることができる。ＰＴＨ１−３４の場合、合成マトリクスへのＰＴＨ１−３４についての結合は、少なくとも１つのシステインを含むＰＴＨ１−３４のＮ−末端にさらなるアミノ酸配列を結合することにより可能となる。該システインのチオール基は、該合成ポリマー上の共有不飽和結合と反応して、共有結合を形成できる。（ａ）システインのみが該ペプチドに結合されているかもしれないし、（ｂ）酵素崩壊性、特にプラスミン崩壊性の配列が結合部としてシステインとペプチドとの間にＣＧＹＫＮＲのように結合されるかもしれない。配列ＧＹＫＮＲは、該結合部をプラスミン崩壊性にする。
【００３３】
骨治癒に関し、成長因子類および成長因子様のペプチドが骨形成を促進する。しかしながら、正しいマトリクスを選択することにより、骨形成は、結合された成長因子類および成長因子様のペプチド無しでさえ観察できる。膨潤以前に双方の反応物と水の和の全重量の７．５重量％の開始濃度での末端共役不飽和結合を有する４腕２０ｋＤポリエチレングリコールおよび末端でチオール基を有する線状ポリエチレングリコール、並びに間の濃度の細胞付着ペプチドから得たマトリクスは、４０％の石灰化組織を生じる。
【００３４】
前記マトリクスはさらに、充填剤、Ｘ線コントラスト剤、チキソトロープ剤等の添加剤を含有できる。
【００３５】
創傷治癒用途のためのマトリクスとしてのヒドロゲルの設計において、付着ペプチドの濃度、密度、プロテアーゼ配列を含むペプチドの動力学的崩壊性を包含する幾つかの因子の全てが機能形成に影響を有する。この情報から、マトリクスは特別な治癒用途のために設計できる。これは、１つの用途のための理想的な配合は全ての他の用途のための理想的な配合であると証明されないので極めて重要である。
【００３６】
骨について、優秀な治癒結果が細胞移動の速度およびマトリクス崩壊の速度を高速に保つことにより達成できる。骨欠損について、プロテアーゼ崩壊部位ＧＣＲＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣと架橋した約２００００Ｄの分子量を持つ４腕ポリエチレングリコールおよび０．０５０ｍＭのＧＲＧＤＳＰが、該分子および水の全重量（膨潤前）の１０重量％以下のＰＥＧおよびペプチドの開始濃度で、特に良好な治癒結果を与える。該ゲルは有用な統一性を有し、そして骨芽細胞および前駆体細胞が該マトリクスが容易にマトリクスを浸潤することを可能にする。
【００３７】
混合および適用方法
前記前駆体分子が、前記混合物の身体への適用の前に、前記分子の重合を可能にする条件下で、互いに一緒になるかまたは接触することは回避されるべきである。全体の意味で、これは、少なくとも、互いに分離された第１および第２の前駆体分子を含み、該少なくとも第１および第２の前駆体分子が該前駆体分子の重合を可能にする条件下での混合により３次元ネットワークを形成することにより達成される。該第１および第２の前駆体分子は、使用の前の官能基の分解を回避するために、好ましくは、酸素および光の排除下および低温、例えば＋４℃付近で貯蔵される。好ましくは、各前駆体成分の官能基の含量は使用の直前に測定され、そして第１および第２の前駆体成分（および適当なときには他の前駆体成分）の比率が、該官能基の所定の当量比率に従って調節される。該第１および第２の前駆体分子は基礎液中に溶解できる。または該前駆体成分および基礎液は、シリンジ本体壁への調節可能な矩形隔壁により分離された２つのチャンバーを有する２連シリンジ中に別個に貯蔵できる。該チャンバーの一方は固形ペレット化形態にある前駆体成分を含有でき、他方のチャンバーは適した量の基礎液を含有する。該シリンジ本体の一端に圧力が加えられた場合、該隔壁は移動し、そして基礎液との接触により溶解される対応する前駆体分子を含有するチャンバー中に緩衝液が流れるようにシリンジ壁中の湾曲部を開放する。２連シリンジ本体は、同じ方法で他の前駆体分子の貯蔵および溶解に使用される。双方の前駆体成分が溶解した場合、双方の２連シリンジ本体は、２方向結合装置に結合され、そして内容物が該接続装置に結合された注射針を通して搾り出すことにより混合される。該接続装置はさらに静的ミキサーを含んで該内容物の混合を向上できる。
【００３８】
最初に、生体活性ペプチド、例えば単一のシステインおよび／または成長因子類または成長因子様のペプチドにより枝分かれされた細胞表面上の付着促進受容体へのバインダーを伴う前駆体溶液は、共役不飽和結合を含む前駆体成分と、特に、多腕ＰＥＧ前駆体のような前記第１前駆体成分と反応させられる。第２の工程において、ヒドロゲルが、例えばこの変性されたＰＥＧ前駆体溶液を、プロテアーゼ基質（または少なくとも２つの求核部を含有する何れかの他のもの）を含有するジチオールペプチドと混合することにより形成される。上記で示したように、それは自己選択的、即ちアクリレート類はチオール類と、アミン類（しばしば生体系中に存在する、例えばリシン上のイプシロンアミン側鎖）とよりも遥かに高速で反応する。そしてチオール類は、アクリレート類とよりもより高速でビニルスルホン類と反応する。さらに、遊離チオールおよび１，４−共役不飽和部を含有する非常に僅かな細胞外タンパク質が、ゲルを現場形成させる生物学的環境中、およびタンパク質、細胞および組織の存在下での直接の外科手術部位に稀に見出される。
【００３９】
本発明のさらなる部分は、治癒用途での使用のための医薬組成物を生成する方法であって、
ａ）好ましくは共役不飽和基を含む少なくとも１種の第１の３官能性３腕前駆体分子を準備する工程と、
ｂ）好ましくは生理的条件下で工程ａ）の共役不飽和基と共有結合を形成できる求核基を含む少なくとも１種の第２の２官能性前駆体分子を準備する工程と、
ｃ）該第１前駆体分子を基礎液中に溶解する工程と、
ｄ）該第２前駆体分子を基礎液中に溶解する工程と、
ｅ）所望によりチキソトロープ剤または充填剤のような添加剤を工程ｃまたはｄで得た何れかの溶液中に混合する工程と、
ｆ）工程ｃ）で得た溶液を送達装置中、好ましくはシリンジ中に充填する工程と、
ｇ）工程ｄ）で得た混合物を送達装置中、好ましくはシリンジ中に充填する工程とを含む、方法である。
【００４０】
前記第１および第２の前駆体成分の開始濃度は、該第１および第２の前駆体分子および水（ポリマーネットワークの形成前）の全重量の８ないし１１重量％、好ましくは９と１０重量％の間の範囲内である。該第１および第２の前駆体成分、該充填剤およびベースは、上記したものより選択される。全ての成分は混合前に滅菌される。これは好ましくは、該前駆体分子の滅菌および該充填剤のガンマ線照射によりなされる。工程ｆ）およびｇ）で得られる混合物は、長時間にわたり好ましくは低温で貯蔵できる。
【００４１】
適用の直前に、工程ｆ）およびｇ）で得た送達装置中の内容物が互いに混合される。前記シリンジは２方向接続装置により連続でき、そして該シリンジの内容物は、静的混合物を通し２方向接続装置の出口で搾り出すことにより混合される。混合された成分は、静的ミキサーを注射針に接続することにより、体内の必要な部位に直接注射されるか、または該混合物は、後に注射針に接続される他のシリンジ中に搾り出される。
【００４２】
本発明のさらなる部分は、前記第１および第２の前駆体分子と基礎液とを含み、該第１および第２の前駆体分子の合計は、該キット中に存在する該第１および第２の前駆体分子並びに該基礎液の全重量の８と１２重量％との間、また好ましくは９ないし１０重量％の範囲内である部材のキットである。
【００４３】
本発明のさらなる部分は、第１および第２の前駆体分子と基礎液とを含み、該第１および第２の前駆体分子の合計は、創傷治癒目的のためのマトリクスの製造のために存在する該第１および第２の前駆体分子並びに該基礎液の全重量の８と１２重量％との間、また好ましくは９ないし１０重量％の範囲内である組成物の使用である。
【００４４】
図面の説明
図１は、異なる構造（即ち、分子量および腕部の数）を持つＰＥＧ分子およびＭＭＰ−感受性ジチオールペプチドにより作製されたヒドロゲルの流動性測定値を図示する。ＰＥＧ構造（即ち、分子量および腕部の数）は、ネットワークの粘性と直接に相関する。一定の前駆体濃度（例えば、１０％ｗ／ｗ）で分子の鎖長および腕部の数を変化させることにより、弾性係数Ｇ’は、腕部の長さの減少または架橋部位の官能性の増加と共に増加する。前駆体パラメータとネットワーク特性との間の相関は、ヒドロゲルの良好に特徴付けられた微細構造に帰することができる。
【００４５】
図２は、異なる構造（即ち、分子量および腕部の数）を持つＰＥＧ分子およびＭＭＰ−感受性ジチオールペプチドにより作製されたヒドロゲルの膨潤測定値を図示する。膨潤比率は、ネットワーク構造と直接に相関した。膨潤比率は、腕部の長さの減少または架橋部位の官能性の増加と共に増加する。
【００４６】
図３は、ＭＭＰ−崩壊性および組み込まれたオリゴペプチドの酵素活性に対するその感受性を図示する。崩壊の動力学は、プロテアーゼ基質ペプチドのアミノ酸配列に対応する異なる活性（即ち、酵素活性）を持つＭＭＰ−基質を含有するヒドロゲルの膨潤、即ち重量変化により評価した。
【００４７】
図４は、異なるＭＭＰ活性を持つペプチドを含有するヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。ＭＭＰ−基質を含有するヒドロゲル中への細胞侵入は、該ＭＭＰ−基質の酵素活性に対応する。
【００４８】
図５は、様々な密度の付着リガンドを含有するヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。侵入速度は、２相状態で組み込まれたＲＧＤ部位の密度により調整される。
【００４９】
図６は、様々な分子量の前駆体分子を含有するＭＭＰ−感受性かつ付着性のヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。合成ゲル中への細胞侵入は分子量と共に増加する。それ以下で細胞侵入が停止する閾値分子量（４腕ＰＥＧ１０ｋＤ）が見出された。
【００５０】
図７は、ＭＭＰ−感受性かつ非常に弛緩して架橋しているか（即ち多量の欠陥を含有する）（７Ａ）、または細胞誘導ＭＭＰ類により非崩壊性である（７Ｂ）ヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。細胞侵入速度は、ネットワーク構造を弛緩させることにより、例えばゲル中に欠陥を導入することにより増加できる。非タンパク質分解性細胞侵入は、非常に弛緩したＸ結合ネットワークを持つヒドロゲル内で生じる。この例では、高い度合いの欠陥（約１０より大きなＱ）が必要であった。細胞形態は、タンパク質分解崩壊性マトリクスのものとは異なる。細胞は非常に薄くかつ錐形で、そして殆ど完全に直線かつクラスターの半径方向外側に移動した。それ故、細胞浸潤の機構は、主にタンパク質分解性から非タンパク質分解性のものに切り換えることができる。
【００５１】
図８は、３〜５週で致命的な寸法のラットの頭蓋欠損での治癒結果を図示する。８ｍｍの欠損をラットの頭蓋中に生成し、そしてその後、５μｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を伴う予め重合させたゲルを該欠損中に配置した。非−ＭＭＰ−感受性ＰＥＧ−（ＳＨ）２（Ａ）および、高速崩壊性基質Ａｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ（Ｂ）および低速崩壊性オリゴペプチドＡｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ（Ｃ）を包含する２つの異なる酵素活性を持つＭＭＰ基質を含有するゲルを試験した。動物を終了点で安楽死させ、そしてその後結果を放射線写真および組織学で分析した。治癒応答は、組み込んだ基質の酵素活性に依存した。非崩壊性ゲルは細胞浸潤を示さず（Ａ）、そして移植物を取り囲む骨の層が形成した。低速崩壊性ゲル（Ｂ）はより多くの細胞浸潤を示し、そして該マトリクスは部分的に再構築され、一方、最も高速崩壊性ゲル（Ｃ）は、元来の骨に類似した形態を持つ新たに形成した骨と非常に少量の残存するマトリクスを示した。ここで、完全な欠損の架橋が観察された。
【００５２】
図９は、３〜５週で致命的な寸法のラットの頭蓋欠損での治癒結果を図示する。８ｍｍの欠損をラットの頭蓋中に生成し、そしてその後、５μｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を伴う予め重合させたゲルを該欠損中に配置した。４腕１５ｋＰＥＧＶＳで作製したコラゲナーゼ崩壊性ゲル（Ａ）、４腕２０ｋＰＥＧＶＳで作製したコラゲナーゼ崩壊性ゲル（Ｂ）、および３．４ｋＰＥＧジチオールおよび４腕１５ｋＰＥＧアクリレートで作製した加水分解崩壊性ゲル（Ｃ）を包含する、異なる構造を持つゲルを試験した。動物を終了点で安楽死させ、そしてその後結果を放射線写真および組織学で分析した。各動物において、本発明者等は、この早い時点で明らかに形態が異なる該欠損の完全な架橋を見出した。より低速の崩壊性ゲル（Ａ）はより少ない細胞浸潤を示し、そしてより多くの残存マトリクスを示したが、より高速の崩壊性ゲル（Ｃ）は、元来の骨に類似した形態を持つ新規に形成した骨を示した。
【００５３】
図１０は、８週で８ｍｍのヒツジのドリル欠損での治癒結果を図示する。異なる構造および酵素崩壊性を持つ５つの異なる合成マトリクスを、その治癒応答について２０μｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２を添加することにより試験した。該ゲルを、最低の細胞浸潤を有するＳＲＴ１および最高の細胞浸潤を有するＳＲＴ５での増加する細胞浸潤能力により等級付けした。治癒応答は、細胞をマトリクスに浸潤させる能力と非常に良く相関することを見出すことができ、最も応答性のマトリクスは最も高い治癒潜在能力を与えた。
【００５４】
実施例
実施例１：ベース試薬の調製
ＰＥＧ−ビニルスルホンの調製
市販で入手可能な分岐ＰＥＧ類（４腕ＰＥＧ；分子量１４８００、４腕ＰＥＧ；分子量１００００、８腕ＰＥＧ；分子量２００００、シェアウォータ・ポリマーズ、ハンツビル、ＡＬ、ＵＳＡ）をＯＨ末端で官能化した。
ＰＥＧビニルスルホンは、アルゴン雰囲気下、前駆体ポリマー（モレキュラーシーブ上で予備乾燥した）のジクロロメタン溶液をＮａＨと、そして、水蒸発後、ジビニルスルホンと反応させることにより生成した（モル比：ＯＨ１：ＮａＨ５：ジビニルスルホン５０）。反応を室温で３日間、アルゴン雰囲気下で一定に攪拌しながら行った。濃酢酸での反応溶液の中和後、該溶液を濾紙を通して透明になるまで濾過した。変化したポリマーを氷冷したジエチルエーテル中の沈殿により単離した。生成物をジクロロメタン中に再溶解し、そしてジエチルエーテル中で（完全な洗浄しながら）２回再沈殿させて、全ての過剰なジビニルスルホンを除去した。最後に生成物を真空下で乾燥した。該変化を¹ＨＮＭＲで確認した。生成物は、６．２１ｐｐｍ（２つの水素原子）および６．９７ｐｐｍ（１つの水素原子）での特徴的なビニルスルホンピークを示した。末端基転換の度合いは１００％であるとこを見出した。
【００５５】
ＰＥＧ−アクリレートの調製
ＰＥＧアクリレートを、アルゴン雰囲気下、前駆体ポリマーの共沸乾燥したトルエン溶液とアクリロイルクロリドとを、トリエチルアミンの存在下で反応させることにより生成した（モル比：ＯＨ１：アクリロイルクロリド２：トリエチルアミン２．２）。反応を、攪拌しながら一晩、暗所中、室温で進行させた。生じた淡黄色溶液を中性アルミニウム床を通して濾過し、溶媒の蒸発後、反応生成物をジクロロメタン中に溶解し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。収率：８８％、ＯＨのアクリレートへの転換率：１００％（¹Ｈ−ＮＭＲ分析から）。
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：３．６（３４１Ｈ（１４８００、４腕：３３７Ｈ理論値）、２３０（１００００、４腕：２２７Ｈ理論値）、または２１０Ｈ（２００００、８腕：２２７Ｈ理論値）、ＰＥＧ鎖プロトン）、４．３（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ₂−ＣＨ ₂−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ₂）、５．８（ｄｄ、１Ｈ、ＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＯＯ−）、６．１および６．４（ｄｄ、１Ｈ、ＣＨ ₂＝ＣＨ−ＣＯＯ−）ｐｐｍ。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲプレート上のフィルム）：２９９０〜２７９０（ν、Ｃ−Ｈ）、１７２４（ν、Ｃ＝Ｏ）、１４６０（ν、ＣＨ₂）、１３４４、１２８１、１２４２、１０９７（ν、Ｃ−Ｏ−Ｃ）、９５２、８４２（ν、Ｃ−Ｏ−Ｃ）ｃｍ^-1。
【００５６】
ペプチド合成
全てのペプチドは、固体樹脂上に、自動ペプチド合成機（９０５０ペップ・プラス・シンセサイザー、ミリポア社、フラミンハム、ＵＳＡ）を使用して、標準９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化学物質で合成した。疎水性スカベンジャーおよび開裂保護基を、冷ジエチルエーテル中での該ペプチドの沈殿および脱イオン水中での溶解により除去した。凍結乾燥後、該ペプチドを０．０３Ｍトリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．０）中に再溶解し、そしてＨＰＬＣ（ウォーターズ、ミルフォード、ＵＳＡ）を使用してサイズ排除カラム上、流し緩衝液としてのＴＢＳ、ｐＨ７．０を用いて精製した。
【００５７】
実施例２：共役付加反応によるヒドロゲル形成
ペプチド−結合求核部とＰＥＧ−結合共役不飽和部との共役付加により形成されたタンパク質分解性細胞移動を可能にするＭＭＰ−感受性ゲル
ゲルの合成を、全てチオール−ＰＥＧのビニルスルホン−官能化ＰＥＧへのミカエル型付加反応を通して達成した。第１工程において、付着ペプチドをペンダント型（例えばペプチドＡｃ−ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ₂）に、多腕ＰＥＧビニルスルホンに結合し、そしてその後この前駆体を、ジチオール−含有ペプチド（例えばＭＭＰ基質Ａｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＡＧＦＤＲＣＧ−ＮＨ₂）と架橋させた。３次元インビトロ研究のための典型的なゲル調製において、４腕−ＰＥＧ−ビニルスルホン（分子量１５０００）をＴＥＯＡ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）中に溶解して、１０％（ｗ／ｗ）溶液を与えた。ゲルに細胞付着性を付与するために、溶解したペプチドＡｃ−ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ₂（同じ緩衝液）をこの溶液に添加した。該付着ペプチドを３０分間３７℃で反応させた。その後、架橋ペプチドＡｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ−ＮＨ₂を上記溶液と混合し、そしてゲルを合成した。ゲル化は数分内に生じるが、しかしながら、架橋反応を１時間３７℃で行って、完全な反応を保証した。
【００５８】
ＰＥＧ−結合求核部とＰＥＧ−結合共役不飽和部との共役付加により形成された非タンパク質分解性細胞移動ＭＭＰ−非感受性ゲル
ゲルの合成を、同様に、全てチオール−ＰＥＧのビニルスルホン−官能化ＰＥＧへのミカエル型付加反応を通して達成した。第１工程において、付着ペプチドをペンダント型（例えばペプチドＡｃ−ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ₂）に、多腕ＰＥＧビニルスルホンに結合し、そしてその後この前駆体を、ＰＥＧ−ジチオール（分子量３．４ｋＤ）と架橋させた。３次元インビトロ研究のための典型的なゲル調製において、４腕−ＰＥＧ−ビニルスルホン（分子量１５０００）をＴＥＯＡ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ８．０）中に溶解して、１０％（ｗ／ｗ）溶液を与えた。ゲルに細胞付着性を付与するために、溶解したペプチドＡｃ−ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ₂（同じ緩衝液中）をこの溶液に添加した。該付着ペプチドを３０分間３７℃で反応させた。その後、該ＰＥＧ−ジチオール前駆体を上記溶液と混合し、そしてゲルを合成した。ゲル化は数分内に生じるが、しかしながら、架橋反応を１時間３７℃で行って、完全な反応を保証した。
【００５９】
実施例３：縮合反応によるヒドロゲル形成
多重アミンを含有するペプチドＸ−結合部と求電子活性ＰＥＧとの縮合反応により形成されたタンパク質分解性細胞移動を可能にするＭＭＰ−感受性ゲル
ＭＭＰ−感受性ヒドロゲルを同様に、２つのＭＭＰ基質および３つのＬｙｓ（Ａｃ−ＧＫＧＰＱＧＩＡＧＱＫＧＰＱＧＩＡＧＱＫＧ−ＮＨ₂）を含有するＭＭＰ−感受性オリゴペプチドと市販で入手可能な（シェアウォーター・ポリマーズ社）２官能性２重エステルＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ−ＨＢＳ−ＣＭ−ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ）との間の縮合反応を行うことにより生成した。第１工程において、付着ペプチド（例えばペプチドＡｃ−ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ₂）を、ＮＨＳ−ＨＢＳ−ＣＭ−ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳの小画分と反応させ、そしてその後この前駆体を、３つのε−アミン（および１つの第１アミン）を持つペプチドＡｃ−ＧＫＧＰＱＧＩＡＧＱＫＧＰＱＧＩＡＧＱＫＧ−ＮＨ₂と混合することにより架橋させてネットワーク化した。３次元インビトロ研究のための典型的なゲル調製において、双方の成分を１０ｍＭのＰＢＳ中にｐＨ７．４で溶解して１０％（ｗ／ｗ）溶液を与え、そしてヒドロゲルを１時間未満の内に形成した。
ミカエル型反応により形成される本発明のヒドロゲルと対照的に、細胞または組織のような生体材料中に存在するアミンが２官能性活性化２重エステルと同様に反応するので、このアプローチにおける所望の自己選択性は保証されない。これは同様に、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、またはＰＥＧニトロフェニルカーボネートのような求電子官能性を持つ他のＰＥＧ類についても真実である。
【００６０】
ＰＥＧ−アミン架橋剤と求電子活性ＰＥＧとの縮合反応により形成された非タンパク質分解性細胞移動ＭＭＰ−非感受性ゲル
ヒドロゲルを同様に、市販で入手可能な分岐ＰＥＧ−アミン（ジェフアミンズ社）と同じ２官能性２重−エステル−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ−ＨＢＳ−ＣＭ−ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ）との間の縮合反応を行うことにより生成した。第１工程において、付着ペプチド（例えばペプチドＡｃ−ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ₂）を、ＮＨＳ−ＨＢＳ−ＣＭ−ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳの小画分と反応させ、そしてその後この前駆体を、多腕−ＰＥＧアミンと混合することにより架橋させてネットワーク化した。３次元インビトロ研究のための典型的なゲル調製において、双方の成分を１０ｍＭのＰＢＳ中にｐＨ７．４で溶解して１０％（ｗ／ｗ）溶液を与え、そしてヒドロゲルを１時間未満の内に形成した。
また、ミカエル型反応により形成される本発明のヒドロゲルと対照的に、細胞または組織のような生体材料中に存在するアミンが２官能性活性化２重エステルと同様に反応するので、このアプローチにおける所望の自己選択性は保証されない。これは同様に、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、またはＰＥＧニトロフェニルカーボネートのような求電子官能性を持つ他のＰＥＧ類についても真実である。
【００６１】
実施例４：様々なマクロマーとチオール−含有ＭＭＰ感受性−ペプチドとの共役付加により作製されたヒドロゲルの平衡膨潤測定
ヒドロゲル構造−機能研究を、前駆体パラメータとネットワーク特性との間の関連が確立でき、そしてゲルの良好に特徴付けられたマクロ構造に帰することができるか否かを試験するために行った。
【００６２】
ヒドロゲル形成および平衡膨潤測定
ゲルを空気中およびエタノール中で、また膨潤の前後および凍結乾燥後に、補助密度決定キットを持つ秤を使用して秤量した。アルキメデスの浮力原理に基づいて、架橋後のゲル体積および膨潤後のゲル体積を計算した。試料を２４時間蒸留水中で膨潤させた。架橋密度および架橋部の間の分子量（Ｍ_c）を、フローリー−レーネルのモデルおよびペッパス−メレルによるその変形型に基いて計算した。
【００６３】
ＰＥＧマクロマー構造（即ち分子量および腕部の数）はネットワークの膨潤特徴と直接に相関する
マクロマーの鎖長および腕部の数を一定の前駆体濃度（１０％ｗ／ｗ）で変化させることにより、膨潤速度（およびそれ故のＸ架橋密度およびＸ架橋部間の分子量）は顕著に変化した（図１）。膨潤速度は、腕部の長さの減少またはＸ架橋剤の官能性の増加と共に増加した。
【００６４】
実施例５：様々なマクロマーとチオール−含有ＭＭＰ−感受性ペプチドとの共役付加により作製されたヒドロゲルの粘弾性測定測定
ヒドロゲルの動力学的粘弾特性を、プレート−プレート形状を持つボーリンＣＶＯ１２０高解像度流動計を使用して、３７℃およびｐＨ７．４で加湿雰囲気下、該プレートの間で小変形振動剪断実験を行って研究した。ＰＥＧ−多アクリレートおよびペプチド前駆体溶液（各３０μＬ）を下側プレートに適用し、ピペット先端で簡単に混合した。上側プレート（直径２０ｍｍ）をその後直ちに０．１ｍｍの測定ギャップ寸法まで降下させた。短時間の予備−剪断期間の後（該前駆体の混合を確証するため）、動力学的振動測定を開始した。貯蔵（Ｇ’）および損失（Ｇ”）の係数の発生および０．５Ｈｚの一定周波数での位相角（δ）を記録した。振幅掃引を、該パラメータ（周波数および変化）が線形粘弾性レジメ内にあることを確認するために行った。
【００６５】
ＰＥＧマクロマー構造（即ち分子量および腕部の数）はネットワークの粘弾特徴と直接に相関する
マクロマーの鎖長および腕部の数を一定の前駆体濃度（例えば１０％ｗ／ｗ）で変化させることにより、剪断係数（Ｇ’およびＧ”）は顕著に変化し、そしてＧ’は、腕部の長さの減少またはＸ架橋剤の官能性の増加と共に増加し、再度、ゲルの良好に特徴付けられたミクロ構造に帰することができる前駆体パラメータとネットワーク特性との明らかな相関があることが暗示された（図２）。
【００６６】
実施例６：様々な酵素活性のＭＭＰ基質配列を持つ２つのシステイン残基を含有するペプチドとの間の共役付加により形成されたゲルのヒトＭＭＰ−１による生化学的崩壊
酵素による崩壊を、ＭＭＰ−感受性ヒドロゲルを活性化されたＭＭＰ−１のタンパク質分解作用に暴露することにより生化学的に評価した。３つの異なる酵素活性を持つ基質を持つヒドロゲルを試験した（Ｋ_m／Ｋ_cat＝８４０％、１００％、０％）。ＭＭＰ−１によるヒドロゲルの崩壊は崩壊の間の膨潤を測定することにより決定した。
【００６７】
ＭＭＰ−崩壊性および組み込まれたオリゴペプチドの酵素活性に対するその感受性の説明
異なる活性を持つＭＭＰ−基質を含有するヒドロゲルの分解動力学（湿潤、即ち重量変化）は、プロテアーゼ基質ペプチドのアミノ酸配列（即ち酵素活性）に対応する。それ故、タンパク質分解性ゲル破壊の動力学は、非常に単純な手段により設計できる（図３）。
【００６８】
実施例７：マトリクスの３次元細胞侵入能力を評価するための合成ＰＥＧ−ベースのヒドロゲル内でのｈＦＦ−フィブリンの埋め込みおよび培養
ヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦ類）の略集密的培養物をトリプシン化し、遠心分離し、そして滅菌ＰＢＳ中のヒト血清からの２％（ｍ／ｖ）フィブリノーゲン（フルカ社、スイス国）中に３００００細胞／μＬの濃度に再懸濁した。ｈＦＦ−フィブリノーゲン懸濁液のゲル化を誘発するために、トロンビン（シグマＴ−６８８４、スイス国）およびＣａ⁺⁺を、それぞれ２ＮＩＨ単位／ｍＬおよび２．５ｍＭの最終濃度まで添加し、そして細胞懸濁液と素早く混合した。ゲル化の前に、この細胞−フィブリノーゲン前駆体の２μＬ滴を、顕微鏡スライド上で約１５分間、３７℃でゲル化した。ｈＦＦ−フィブリンクラスターを、ゲル化の前に３ないし４のクラスターを前駆体溶液中に配置することにより、２５μＬのＰＥＧ−ベースのヒドロゲル内に埋め込んだ。そのようなＰＥＧ−ベースのヒドロゲル内に埋め込んだｈＦＦ−フィブリンクラスターを、血清−含有ＤＭＥＭ、１２ウェル組織培養プレートで３０日間まで培養した。該クラスターからの合成ゲルマトリクス中への細胞侵入を、その中心面に焦点を当てて画像形成および記録した。外殖の透過深度を定量するために、焦点の中心面でのｈＦＦ分岐の先端により規定されるｈＦＦ外殖の範囲と同様に、元来のｈＦＦ−フィブリンクラスターの範囲を中心面で測定した。これら２つの面積を円形領域として近似し、それらの理論半径を互いから減じて、平均ｈＦＦ外殖長さを得た。
細胞が該クラスターから成長するという事実は、共役不飽和基へのミカエル型付加が自己選択的である、即ちアクリレートまたはビニルスルホンはチオールと、細胞表面上に存在するアミンとよりも遥かに高速で反応することを暗示する。それ故、そのような材料は、例えば現場でのゲル化により組織欠損を充填するために臨床的に使用できる。
【００６９】
実施例８：組み込んだプロテアーゼ基質の酵素活性によるＭＭＰ−感受性ヒドロゲル中への細胞侵入速度の変化
様々なＭＭＰ活性を持つＭＭＰ−感受性ヒドロゲルの調製
骨格中に３つの異なるＭＭＰ−活性オリゴペプチド基質を持つヒドロゲルを以下のように調製した：始めに、付着ペプチドＡｃ−ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ₂を４腕−ＰＥＧ−ビニルスルホン（分子量１５０００）に、０．１ｍＭの濃度で、ＰＥＧ前駆体（ＴＥＯＡ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ８．０））を同様に同じ緩衝液中に溶解した該付着ペプチドと混合することによりペンダント型に結合した。反応を３０分間３７℃で行った。その後、異なる活性のＭＭＰ−感受性ペプチド（例えばＡｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ−ＮＨ₂）を依然としてミカエル型反応性を有する上記溶液と混合し、そしてゲルを実施例７に記載した方法に従って細胞−フィブリンクラスターの周囲で形成した。試料を同様に平行して硬化させ、そして膨潤を測定して細胞移動の差異が酵素活性の変化に明らかに帰される（そしてネットワーク構造、即ちＸ−結合密度に帰されない）ことを保証した。
【００７０】
所定の付着性およびネットワーク構造での細胞侵入速度は組み込まれたペプチド基質のＭＭＰ活性により合理的に調節できる
実施例６で記載した生化学的測定から予期されるように、ＭＭＰ−基質を含有するヒドロゲル中への細胞侵入は、後者の酵素活性に対応する（図４）。それ故、タンパク質分解性ゲル破壊の動力学は、非常に単純な手段により設計できる。ミカエル型付加によりヒドロゲルを形成できる１つの合成基質は、天然コラーゲンＩ型（１α）鎖に見出される配列から誘導されたペプチド（ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＡＧＱＤＲＣＧ）よりも顕著に高速に分解することが識別された（ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ）。さらに、細胞−分泌ＭＭＰ類に感受性でないペプチドが識別された。
【００７１】
実施例９：付着部位密度によるＭＭＰ−感受性ヒドロゲルへの細胞侵入速度の変化
様々な付着部位密度を持つＭＭＰ−感受性ヒドロゲルの調製
様々な密度の付着ペプチドＡｃ−ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ₂を持つヒドロゲルを以下のように調製した：始めに、様々な濃度で付着ペプチドを４腕−ＰＥＧ−ビニルスルホン（分子量２００００）に、ＰＥＧ前駆体（ＴＥＯＡ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ８．０））を同様に同じ緩衝液中に溶解した該付着ペプチドと混合することによりペンダント型に結合した。反応を３０分間３７℃で行った。その後、ＭＭＰ−感受性ペプチドＡｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ−ＮＨ₂を依然としてミカエル型反応性を有する上記溶液と混合し、そしてゲルを実施例７に記載した方法に従って細胞−フィブリンクラスターの周囲で形成した。試料を同様に平行して硬化させ、そして膨潤を測定して、膨潤後に付着部位密度が全てのゲル中で一定となり、そしてそれ故、細胞移動の差異がネットワーク構造の変化に明らかに帰されることを保証した。
【００７２】
所定のＭＭＰ−感受性およびネットワーク構造での細胞侵入速度はネットワークの付着性により合理的に調節できる
３次元細胞侵入は、組み込まれたＲＧＤ部位の密度により調整される（図５）。ｈＦＦ侵入速度は２相性で付着リガンドの濃度に依存する。本発明者等は、その濃度の前後に比べ顕著により高い移動速度を示す濃度レジメを見出した。それ故、タンパク質分解性ゲル破壊の動力学は同様に、該付着部位密度により設計できる。
【００７３】
実施例１０：用いたマクロマーの分子量（構造および腕部の数）によるＭＭＰ−感受性ヒドロゲルへの細胞侵入速度の変化
様々なネットワーク構造を持つＭＭＰ−感受性ヒドロゲルの調製
様々なＰＥＧ−ＶＳマクロマー（４腕２０ｋＤ、４腕１５ｋＤ、４腕１０ｋＤ、８腕２０ｋＤ）を持つヒドロゲルを以下のように調製した：始めに、０．１ｍＭの所定濃度（膨潤したネットワークに関して）での付着ペプチドをマクロマーに、ＰＥＧ前駆体（ＴＥＯＡ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ８．０））を同様に同じ緩衝液中に溶解した該付着ペプチドと混合することによりペンダント型に結合した。反応を３０分間３７℃で行った。その後、ＭＭＰ−感受性ペプチドＡｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ−ＮＨ₂を依然としてミカエル型反応性を有する上記溶液と混合し、そしてゲルを実施例７に記載した方法に従って細胞−フィブリンクラスターの周囲で形成した。試料を同様に平行して硬化させ、そして膨潤を測定して、細胞移動の差異が付着性の変化に明らかに帰される（そしてネットワーク構造の差異、即ちペンダント型付着部位を持つ様々なグラフト密度によるＸ−架橋密度に帰されない）ことを保証した。
【００７４】
所定のネットワークの付着性およびＭＭＰ−感受性での細胞侵入速度は組み込まれたペプチド基質のＭＭＰ活性により合理的に調節できる
合成ゲル中への細胞侵入は、同様にネットワーク構造により調整される（図６）。一定のＲＧＤ密度でかつ同じＭＭＰ基質についてのｈＦＦ侵入速度は、分子量と共に増加する。それ以下で細胞侵入が本質的に停止する閾値分子量（４腕ＰＥＧ１０ｋＤ）が見出された。それ故、タンパク質分解性ゲル破壊の動力学は同様に該ネットワーク構造により設計できる。
【００７５】
実施例１１：例えば欠陥の生成を通したネットワーク構造の弛緩、およびタンパク質分解性から非タンパク質分解性への細胞移動の切替えによる細胞浸潤の増加
非−タンパク質分解性の細胞浸潤を可能にするＭＭＰ−非−感受性かつ付着性のヒドロゲルの調製および多量の欠陥（ここではぶら下がった端部）を含有するＭＭＰ−感受性かつ付着性のヒドロゲルの調製
非−ＭＭＰ感受性ヒドロゲルを以下のように調製した：始めに、４腕ＰＥＧ−ＶＳ２０ｋＤマクロマーのＶＳ−群の幾つかの既知の画分を、３７℃で３０分間、アミノ酸システインと反応させて、欠陥を持つネットワーク（即ち、弾性の活性鎖として寄与しないペンダント型鎖）を生成するために、ネットワーク形成前にビニルスルホン感応性を“消した”。その後、０．１ｍＭの所定濃度（膨潤したネットワークに関して）で付着ペプチドを、予め変成させたＰＥＧ前駆体（ＴＥＯＡ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ８．０））を同様に同じ緩衝液中に溶解させた該付着ペプチドと混合することにより、４腕ＰＥＧ−ＶＳ２０ｋＤマクロマーにペンダント型に結合した。該反応を３０分間３７℃で行った。その後、この前駆体をＰＥＧ−ジチオール（分子量３．４ｋＤ）で架橋した。試料の膨潤を平行して同様に行い、細胞移動の差異がネットワーク構造の変化（即ちネットワークを弛緩させる欠陥の生成）に明らかに帰されるように制御した。
同様に、始めに該ＰＥＧ−ＶＳマクロマーをアミノ酸システインと反応させて、ネットワーク形成の前にビニルスルホン官能性を“消す”ことにより、多量の欠陥を持つＭＭＰ感受性ヒドロゲルを生成した。付着部位および架橋での官能化は上記したように行った。
【００７６】
非−タンパク質分解性細胞侵入は非常に弛緩したＸ−架橋ネットワークを持つヒドロゲル内で生じ、また細胞侵入はＭＭＰ−感受性ゲルのネットワークの弛緩により加速できる
依然として３次元細胞侵入を生じさせる非−ＭＭＰ−感受性分子を持つネットワークが生成できる（図７Ｂ）。しかしながら、非常に高い度合いの欠陥、即ち非常に弛緩したＸ−架橋ネットワークが必要である（Ｇは約１０より大きい）。細胞形態は、タンパク質分解崩壊性マトリクスのものとは異なる。細胞は非常に薄くかつ錐形であり、そして殆ど完全に直線かつクラスターの半径方向外側に移動した。それ故、細胞浸潤の機構は、主にタンパク質分解性のものから非タンパク質分解性のものに切り換えることができる。架橋の前にＶＳ−基をアミノ酸Ｃｙｓでキャッピングすることにより、非常に弛緩したＸ−結合構造を持つＭＭＰ感受性ゲルが生成できる。そのようなマトリクスの細胞侵入は、“完全な”ネットワーク（７Ａ）と比較して顕著に増加した。実際、細胞侵入速度は殆どフィブリンのものに近づいた。
【００７７】
実施例１２：４−腕ＰＥＧ−イタコネート２０Ｋのヒドロゲル
イタコネートにより官能化された４−腕ＰＥＧ（ＭＷ２０Ｋ）と、システイン残基を持つペプチドの形態、例えばアセチル−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ−ＣＯＮＨにあるか、またはチオール−ＰＥＧ−チオール、例えば線状でＭＷ３．４ｋのものとしての２官能性チオールとでヒドロゲルを作製した。
【００７８】
４−腕ＰＥＧ−イタコネートの合成
４−水素−１−メチルイタコネート（ＡＭ０２２／６）
ジメチルイタコネート１０２．１ｇ（０．６５ｍｏｌ）およびトルエン−４−スルホン酸１水和物３５．０ｇ（０．１８ｍｏｌ）を、水５０ｍＬおよびギ酸２５０ｍＬ中に、還流冷却器、温度計、および磁気攪拌棒を備えた１０００ｍＬ丸底フラスコ中で溶解した。該溶液を、該フラスコを１２０℃で油浴中に浸漬することにより軽い還流とし、そして４５分間攪拌した。その後、淡黄色の透明な反応混合物を攪拌しながら氷３００ｇに注ぐことにより、反応を停止させた。生じた透明水溶液を分離ロートに移し、そして生成物を３回ジクロロメタン２００ｍＬで洗浄することにより抽出した。集めた有機相をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、そして溶媒を回転蒸発により除去し、粗生成物６４．５ｇを得た。該水相をもう１度ジクロロメタン２００ｍＬで抽出して、さらに粗生成物６．４ｇを得た。典型的な酸性の臭気は、該画分中の幾分かのギ酸の存在を示し、ギ酸は集めた画分をジクロロメタン１５０ｍＬ中に溶解し、そして２回飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄することにより除去した。有機相をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、そして溶媒を蒸発させて透明無色の油状物６０．１ｇを得て、該油状物を減圧下で蒸留して、透明無色の油状物５５．３ｇを得た。¹ＨＮＭＲ分析によれば、生成物は４−水素−１−メチルイタコネート９１％、１−水素−４−メチルイタコネート約５％、およびジメチルイタコネート４％からなる。
【００７９】
ゲル形成
簡単に、前駆体溶液を末端基の化学量論的バランスで１：１で混合した。チオールの反応のためにビニルスルホンおよびアクリレートに必要とされるように、緩衝液形態（ＴＥＯＡ）にあるトリエタノールアミンの存在を、チオールとイタコネートとの間のミカエル反応を促進するために必要とした。
【００８０】
ＰＥＧ−イタコネートのゲル−形成速度は、塩基性触媒の量並びに生じる系のｐＨに依存した。表１は、室温（〜２３℃）および３７℃（恒温機／水浴^*）でのＴＥＯＡ緩衝液ｐＨおよび濃度に関する、１０％ＰＥＧ−イタコネート／ＰＥＧ−チオールヒドロゲルについてのゲル化の開始までの時間を表す。ゲル化の開始は、液体前駆体溶液が試料を調査するために使用したピペット先端部に付着した時点として定義した。
【表１】

・注：水浴中での試料のゲル化速度は、一般に、おそらくより実際の反応温度についてのより良好な熱伝達のために、恒温機中のものより高速だった。
イタコネート−チオール反応は、他の官能化された末端基、例えばＶＳまたはＡｃの反応を通して形成された４腕２０ＫのＰＥＧゲルの典型的な特徴を持つヒドロゲルを生成した。物理的に、ゲルは、他の官能化された基の反応により形成されたＰＥＧゲルについて上記したように、透明かつ軟質であった。加えて、１０％および２０％のゲルは、３７℃で２４時間の生理食塩水中での静置後、顕著に膨潤した。
【００８１】
細胞培養
ＰＥＧ−イタコネート／ペプチドヒドロゲルは、同様に、添加したＲＧＤペプチドの存在下で、インビトロ細胞培養を支持した。
【００８２】
実施例１３：骨再生
ラット頭蓋骨の骨再生
動物を、ハロタン／Ｏ₂の導入および維持により麻酔した。外科手術範囲をクリップ止めし、そして無菌外科手術のためにヨウ素で準備した。線状切開を鼻骨から中矢状稜へ作製した。軟質組織を反転させ、そして骨膜を該部位（後頭骨、前頭骨および頭頂骨）から切開した。８ｍｍの開頭欠損を、歯科用ハンドピース中の穿孔器で、硬膜貫通を注意深く回避しながら生成した。外科手術範囲を生理食塩水でフラッシュして骨屑を除去し、そして予め形成したゲルを該欠損内に配置した。軟質組織を皮膚ステープルで閉じた。手術後、無痛法をブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）のＳＱ注射により行った。ラットを移植２１〜３５日後にＣＯ₂窒息により安楽死させた。５ｍｍの隣接骨と共に開頭部位を頭蓋骨から回収し、そして４０％エタノール中に置いた。全ての工程で、外科手術者は欠損の処理に関して無知であった。試料を引き続いて乾燥した：４０％エタノール（２ｄ）、７０％エタノール（３ｄ）、９６％エタノール（３ｄ）、および１００％エタノール（３ｄ）。乾燥した試料をキシレン中で脱脂した（３ｄ）。脱脂した試料をメチルメタクリレート（ＭＭＡ、フルカ６４２００）で飽和させ（３ｄ）、そしてその後、ＭＭＡ含有ジ−ベンゾイルペルオキシド（２０ｍｇ／ｍＬ、フルカ３８５８１）中に浸すことにより固定した。固定した試料を、ＭＭＡ、ジ−ベンゾイルペルオキシド（３０ｍｇ／ｍＬ）、および１００μＬ／ｍＬのプラストイドＮまたはジブチルタレート（メルク社）中に３７℃で埋め込んだ。断面（５μｍ）をトルイジンブルーＯおよびゴールドナートリクロムで染色した。組織スライドを走査し、そしてデジタル像をライカＱＷｉｎソフトウェアで加工した。
【００８３】
ラット頭蓋骨欠損モデルの骨治癒は幾つかのマトリクス特徴により調節できる
合成ヒドロゲルを新規骨形成を誘導するために使用した。組織学的な調製物は、治癒応答がヒドロゲルマトリクスの組成に大きく依存することを示した。移植物当たり５μｇのＢＭＰ−２の投与量で、高速崩壊性基質、Ａｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧを含有するＭＭＰ−感受性ペプチドおよび付着性ヒドロゲルは、細胞、主に線維芽細胞状細胞により浸潤され、そして結合組織性骨形成が観察された（図１０、Ｃ）。５週間で、移植材料は完全に再吸収され、そして新規な骨が欠損範囲を覆った。ここで、欠損の完全な架橋が観察された。ＭＭＰ−非感受性ＰＥＧ−（ＳＨ）２で作製された対照材料（図１０、Ａ）は、細胞浸潤を示さず、そして損なわれていないゲル移植物の周囲での骨形成のみを示した。より低速の崩壊性オリゴペプチドＡｃ−ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＡＧＱＤＲＣＧは、顕著により少ない細胞浸潤を導いた（図１０、Ｂ）。それ故、インビボでの治癒応答は、組み込まれた基質の酵素活性に依存した。
４腕ＰＥＧ−ＶＳ１５ｋＤで作製されたＭＭＰ−感受性崩壊性ゲル、４腕ＰＥＧ−ＶＳ−２０ｋＤ２０Ｋで作製されたＭＭＰ−感受性ゲル、およびＰＥＧ−ジチオール３．４ｋＤおよび４腕ＰＥＧ−アクリレートで作製された加水分解崩壊性ゲルを包含する異なる構造を持つゲルを試験した。各動物において、本発明者等はこの早期の時点での欠損の完全な架橋を見出したが、形態は明らかに異なっていた。より低速の崩壊性ゲルはより少ない細胞浸潤、およびより多い残存したマトリクスを示したが、一方、最も高速な崩壊性ゲルは、元来の骨に類似した形態を持つ新規に形成された骨を示した。
【００８４】
８ｍｍヒツジドリル欠損モデルの骨治癒
８ｍｍドリル欠損を、ヒツジの脛骨および大腿骨に形成し、そして様々な合成マトリクスを、２０μｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２の存在下、現場で重合して、これらのマトリクスが骨欠損の治癒を誘導する能力を試験した。本発明者等は、創傷治癒マトリクスについて、細胞が容易に合成マトリクス中に進入でき、そして該合成マトリクスを再構築できることを意味する強い細胞浸潤特徴を有することが重要であると提案する。前記したように、マトリクスの詳細、例えば組み込まれた崩壊部位、マトリクスの組成およびマトリクスの密度は機能的細胞浸潤について重要であることを、本発明者等はインビトロで示し、また他の者はインビボモデルで示した。上記で説明した開発プロセスにおいて、異なる細胞浸潤特徴を持つ一連の材料を開発した。この広範囲な一連の材料において、５つの材料をヒツジで試験し、細胞移動特性の範囲を示した。これらの材料はＳＲＴ１〜５と標識し、ＳＲＴ１が最も低速の細胞浸潤特徴を有した。浸潤の量はその後ＳＲＴ５に向けて増加し、ＳＲＴ５は最大量のマトリクス中への細胞浸潤を可能にする。動物をその後８週間治癒し、そして引き続いて安楽死させ、そして欠損領域をマイクロコンピューター化された局所解剖学（μＣＴ）を介した分析並びに組織学的分析のために切除した。
【００８５】
８ｍｍヒツジドリル欠損モデルの骨治癒は幾つかのマトリクス特徴により調整できる
試験した５つの材料は組成の２つの異なる変化を調査した。ＳＲＴ１は、骨格中に組み込まれたプラスミン崩壊部位を持つヒドロゲルであり、一方、ＳＲＴ２は、同一の構造を持つが、骨格中にコラゲナーゼ崩壊部位を持つ。これらのゲルは、各々対応する酵素が開裂でき、その後架橋する２つのチオール（システイン）により囲まれたペプチドを、ＲＧＤ変性４腕１５ＫのＰＥＧビニルスルホンと混合することにより作製される。ゲルを崩壊できる酵素の特異性を変化させることにより、異なる治癒応答が観察され、コラゲナーゼ崩壊性配列はより良好な性能を示した。加えて、構造観点の効果を同様に調査した。ＳＲＴ２、ＳＲＴ３およびＳＲＴ４は減少した架橋密度を持つゲルを示し、そして治癒の速度は架橋密度が減少すると増加することを見出すことができた。ＳＲＴ３はトリチオールペプチドおよび線状ＰＥＧビニルスルホンから作製され、一方、ＳＲＴ４は４腕１５ＫのＰＥＧの代わりに４腕２０ＫのＰＥＧを有することを除いてＳＲＴ２と同一であって、より低い架橋密度を導いた。これは、最小の架橋密度がゲル化を得るために要求されるので、明らかに制限を有する。最後に、ＳＲＴ５は、４腕１５ＫのＰＥＧアクリレートおよび３．４ＫのＰＥＧジチオールから作製された加水分解崩壊性混合物である。これらのゲルは最も高速の崩壊時間を有し、そしてそれ自体は最も高い治癒速度を有する。
【００８６】
これらの結果の分析では、何処に移植物が配置されたのかを考慮することが極めて重要である。これらの移植物は海綿質骨内に配置され、そしてそれ自体、骨の全体積は石灰化組織で充填されない。通常の海綿質骨をμＣＴにより分析すると、骨体積画分は約２０％である。μＣＴを評価において試験した様々な合成材料の結果を試験するために用いると、新規に形成された石灰化骨が元来の欠損内で見出される。幾つかの例において、骨の量は用いた投与量に非常に実質的であり、同様に約２０％の石灰化体積を導く。用いたゲルの細胞浸潤特徴に関し、治癒応答において同様に明らかな傾向がある。細胞の浸潤に制限された能力を与えるゲルは最も低い治癒応答を示し、新規に形成された石灰化組織は欠損の縁部でのみ現れ、そして中心では石灰化組織は全く現れなかった。対照的に、より高速の細胞浸潤特性を有する材料はより高速の治癒応答を示し、より高速の細胞浸潤とより良好な骨治癒との間の直接的な相関が観察された。
【００８７】
これらの結果はさらに組織学により確認された。組織学的断面を分析したとき、“ＳＲＴ１”の中心にある骨のない空隙は全く分解していないゲルを実際に表すことが観察された。前記一連の材料の各試料において、ゲルが観察され、しかしながら、より高速の細胞浸潤特性を持つ材料がより少ない残存するゲルおよび欠損の中心内でのより多い骨および骨前駆体を示した。これは、取り囲む細胞のマトリクス中への浸潤、および引き続く転換、および骨および骨マトリクスの形成により骨が形成されたことを明らかに説明する。マトリクス中への細胞の浸潤が低速である幾つかの例において、再生を阻止および抑制することが可能である。しかしながら、高速の細胞浸潤特性を有するマトリクスが用いられると、骨治癒の量は劇的に増大して優秀な治癒応答を導く。
【００８８】
ヒツジドリル穴モデルの治癒応答における第１前駆体分子の開始濃度の影響
２つの異なる開始濃度の酵素崩壊性ゲルを用いた。これらの各々で、ＲＧＤおよび活性因子（１００μｇ／ｍＬでのＣｐｌＰＴＨ）の濃度は一定に保った。ポリマー性ネットワークを、４つのビニルスルホン末端基で官能化された分子量２０ｋＤ（各々の腕部の分子量５ｋＤ）の４腕分岐ＰＥＧ、および以下の配列Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙのジチオールペプチドから形成した。双方の前駆体成分を０．３Ｍトリエタノールアミン中に溶解した。該官能化ＰＥＧ（第１前駆体分子）および該ジチオールペプチド（第２前駆体分子）の開始濃度を変化させた。１つの場合では、濃度は組成物（第１および第２の前駆体＋トリエタノールアミン）の全重量の１２．６重量％であった。１２．６重量％は、該第１前駆体成分のみに基づいて計算したとき、１０重量％溶液に相当する（１００ｍｇ／ｍＬの第１前駆体分子）。第２の開始濃度は、組成物（第１および第２の前駆体＋トリエタノールアミン）の全重量の９．５重量％であり、全重量の第１の前駆体成分のみに基づく７．５重量％に相当する（７５ｍｇ／ｍＬの第１前駆体分子）。これは、ジオールペプチドの量を、ビニルスルホネートとチオールとの間のモル比を維持するように変化したという結果となる。
【００８９】
１２．６重量％の開始濃度から開始したゲルは、ポリマー性ネットワークと水との合計の全重量の８．９重量％の濃度まで膨潤し、それ故マトリクスは９１．１の含水量を有した。９．５重量％の開始濃度から開始したゲルは、ポリマー性ネットワークと水との合計の全重量の７．４重量％の最終濃度に膨潤し、それ故９２．６の含水量を有していた。
【００９０】
この変化の効果を調査するために、これらの材料をヒツジドリル欠損で試験した。ここで７５０μＬの欠損を、ヒツジの大腿骨および上腕骨の骨幹の海綿質骨中に配置し、そして現場でゲル化する酵素分解性ゲルで充填した。以下の量の石灰化組織を観察し、各群Ｎ＝２でμＣＴにより決定した：
【表２】

【００９１】
ゲルをより低密度かつ細胞浸透についてより容易にすると、有効因子の添加で生じる治癒応答はより強くなる。８．５重量％以下の最終固形分濃度を有することの効果はこれらの結果から明らかである。
【００９２】
明らかなように、マトリクスの設計は創傷欠損の治癒を可能にするために重要である。これらのヒドロゲルの各々は、マトリクスを生成する用に末端結合したポリエチレングリコールの大きな鎖からなる。しかしながら、それらが酵素崩壊性部位を介してどの様に結合しているか、結合の密度、および幾つかの他の変量の詳細は、機能的治癒応答を可能にするために重要である。これらの差異は、ヒツジドリル欠損モデルで非常に明らかに観察される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、異なる構造（即ち、分子量および腕部の数）を持つＰＥＧ分子およびＭＭＰ−感受性ジチオールペプチドにより作製されたヒドロゲルの流動性測定値を図示する。
【図２】図２は、異なる構造（即ち、分子量および腕部の数）を持つＰＥＧ分子およびＭＭＰ−感受性ジチオールペプチドにより作製されたヒドロゲルの膨潤測定値を図示する。
【図３】図３は、ＭＭＰ−崩壊性および組み込まれたオリゴペプチドの酵素活性に対するその感受性を図示する。
【図４】図４は、異なるＭＭＰ活性を持つペプチドを含有するヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。
【図５】図５は、様々な密度の付着リガンドを含有するヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。
【図６】図６は、様々な分子量の前駆体分子を含有するＭＭＰ−感受性かつ付着性のヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。
【図７Ａ】図７Ａは、ＭＭＰ−感受性かつ非常に弛緩して架橋しているか（即ち多量の欠陥を含有する）ヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは，細胞誘導ＭＭＰ類により非崩壊性であるヒドロゲル内での細胞侵入の測定の結果を図示する。
【図８】図８は、３〜５週で致命的な寸法のラットの頭蓋欠損での治癒結果を図示する。
【図９】図９は、３〜５週で致命的な寸法のラットの頭蓋欠損での治癒結果を図示する。
【図１０】図１０は、８週で８ｍｍのヒツジのドリル欠損での治癒結果を図示する。

Claims (10)

1. 少なくとも第１および第２の前駆体分子の反応から得られる３次元ポリマー性ネットワークを含む生体材料であって、
   該第１前駆体分子は、少なくとも、分子量が実質的に同じ少なくとも３つの腕部を含む３官能性分岐成分であり、また該第２前駆体分子は、少なくとも、２官能性の成分であり、該第１および第２の前駆体分子の官能基の当量の比率は０．９と１．１との間の範囲内であり、そして該第１前駆体分子の腕部の分子量、該第２前駆体分子の分子量、および分岐点の官能性は、該ポリマー性ネットワークの含水量が、水の取り込み完了後、該ポリマー性ネットワークの全重量の平衡重量％と９２重量％との間であるように選択される、生体材料。
2. 前記含水量は、水の取り込み完了後、前記ポリマー性ネットワークの全重量の９３と９５重量％との間の範囲内である、請求項１記載の生体材料。
3. 前記官能基は前記第１および第２の前駆体分子の末端に位置する、請求項１記載の生体材料。
4. 前記第１前駆体分子の官能基は、アクリレート類、ビニルスルホン類、メタクリレート類、アクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリロニトリル類、ビニルスルホン類、２−または４−ビニルピリジン類、マレイミド類およびキノン類からなる群より選択される共役不飽和基または共役不飽和結合である、請求項１ないし３のうちの何れか１項に記載の生体材料。
5. 前記第２前駆体成分の官能基は求核基より選択される、請求項１記載の生体材料。
6. 前記求核基は、アミノ基、チオール基およびヒドロキシル基からなる群より選択される、請求項５記載の生体材料。
7. 前記官能基は、−ＣＯ₂Ｎ（ＣＯＣＨ₂）₂（スクシンイミジル基）、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨＯ、−ＣＨＯＣＨ₂、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ（イソシアネート基）、−Ｎ（ＣＯＣＨ）₂、−Ｓ−Ｓ−（Ｃ₅Ｈ₄Ｎ）からなる群より選択される求電子基である、請求項１記載の生体材料。
8. 前記第１および第２の前駆体分子の間の反応は、共役した不飽和基または結合と、チオール基およびアミノ基より選択される求核基との間のミカエル型付加反応である、請求項１ないし６のうちの何れか１項に記載の生体材料。
9. 前記第１および第２の前駆体成分の間の反応は置換反応または付加反応である、請求項６または７に記載の生体材料。
   治癒用途における使用のための医薬組成物を生成する方法であって、
   ａ）好ましくは共役不飽和基を含む少なくとも１種の第１の３官能性３腕前駆体分子を準備する工程と、
   ｂ）好ましくは生理的条件下で工程ａ）の共役不飽和基と共有結合を形成できる求核基を含む少なくとも１種の第２の２官能性前駆体分子を準備する工程と、
   ｃ）該第１前駆体分子を基礎液中に溶解する工程と、
   ｄ）該第２前駆体分子を基礎液中に溶解する工程と、
   ｅ）所望によりチキソトロープ剤または充填剤のような添加剤を工程ｃまたはｄで得た何れかの溶液中に混合する工程と、
   ｆ）工程ｃ）で得た溶液を送達装置中、好ましくはシリンジ中に充填する工程と、
   ｇ）工程ｄ）で得た混合物を送達装置中、好ましくはシリンジ中に充填する工程と、
   ｈ）工程ｃおよびｄで得た溶液を混合する工程とを含む、方法。
10. 第１および第２の前駆体分子と基礎液とを含む部材のキットであって、該第１および第２の前駆体分子の合計は、該キット中に存在する該第１および第２の前駆体分子並びに該基礎液の全重量の８ないし１２重量％、また好ましくは９ないし１０重量％の間の範囲内である、キット。

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