CN1328319C - 用于控制细胞向内生长和组织再生的合成基质 - Google Patents

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Abstract

生物材料包括可从至少第一种和第二种前体分子的反应获得的三维聚合物网络。第一种前体分子是包含分子量基本上类似的至少三个分支的至少三官能的支化组分和第二种前体分子是至少双官能的组分。第一种和第二种前体分子的官能团的当量比率是在0.9至1.1之间。第一种前体分子的分支的分子量，第二种前体分子的分子量和分支点的官能度进行选择，以使得聚合物网络的水含量是在吸水完成之后聚合物网络的总重量的平衡量wt%-92wt%之间。本发明教导了改进可用于伤口愈合应用中的合成底物的特性的方法。

Description

用于控制细胞向内生长和组织再生的合成基质
作为用于伤口愈合应用和组织再生的三维支架或基质(有或者没有生物活性因子附着于其上面)的生物材料的使用在以前已经描述了。对于在身体内的应用，刚好在身体内需要的位点上基质的原地形成常常是非常有利的，与预先形成的生物材料的植入相比，它需要介入外科手术，具有困难的消毒事项和常常无法与缺陷的形状很好地匹配。然而，在身体内的应用限制了同时关于交联化学以及关于为了基质的原地形成所需要的前体分子的性质所作的化学方面的选择。
对于前体分子，已经使用了各种途径。一种途径采用天然存在的前体，另一种途径集中于完全地合成的，例如不是天然存在的前体，和在另一个途径中，可以使用天然存在的和合成的离析物或一种或另一种的修饰的结合。
以天然存在或化学修饰天然存在的蛋白质，如胶原，变性胶原(明胶)和尤其血纤蛋白为基础的基质已经成功地试验。尤其已经用以血纤蛋白为基础的基质实现了良好愈合响应。其它的例子包括碳水化合物，如纤维素，藻酸盐和透明质酸。潜在问题如免疫原性，昂贵的生产，有限的利用率，批次可变性和提纯问题能够限制从天然存在的前体形成的基质的使用。
由于这些问题，以合成前体分子为基础的基质已经为了在身体中和/或在身体上的组织再生而进行了开发。
形成用于身体中的合成的基质的交联反应包括(i)在含有不饱和双键的两种或多种前体之间的自由基聚合，如在Hern，Hubbell，J.Biomed.Mater.Res.39：266-276，1998中所述，(ii)亲核取代反应，例如在US5,874,500中公开的在包含胺基的前体和包含琥珀酰亚胺基的前体之间的反应，(iii)缩合和加成反应和(iv)在强亲核试剂和共轭的不饱和基团或键(作为强亲电子试剂)之间的Michael型加成反应，如在作为亲核试剂的包含硫醇或胺基的前体分子和作为亲电子试剂的包含丙烯酸酯或乙烯基砜基团的前体分子之间的反应。迈克尔(Michael)型加成反应描述在WO00/44808中，它的内容被引入这里供参考。Michael型加成反应允许至少第一和第二前体组分在生理条件下以非常自选择性(self-selectively)的方式，甚至在敏感的生物材料存在下，进行就地交联。即第一前体组分与第二前体组分比与在敏感的生物环境中的其它组分更快得多地进行反应以及第二前体组分与第一前体组分比与在身体中存在的敏感的生物环境中的其它组分更快得多地进行反应。当一种的前体组分具有至少两个官能团时，和至少一种的另一种前体组分具有两个以上的官能团时，该体系将自有选择地反应而形成交联的三维生物材料。
虽然近年来为了改进合成基质的伤口愈合性能已经取得一些进展，但是仍然无法达到从天然存在的前体分子或聚合物制得的基质(尤其血纤蛋白基质)显示的愈合效果。
本发明的目的是改进合成基质的伤口愈合能力，尤其对于在骨头中的缺陷。尤其应该提供一种合成基质，它允许不进行自然愈合响应的组织的应用和愈合。
本发明的再一目的是改进该基质形态，尤其针对细胞浸润改进基质性能。
在本发明的又一个目的中，基质网络的结构和功能应该优化。
这些目的是由包含可从至少第一和第二种前体分子的反应获得的三维聚合物网络的生物材料来实现，其中第一种前体分子是包括在分子量上基本上类似的至少三个分支(arms)的至少三官能支化聚合物和其中第二前体分子是至少双官能分子，其中第一和第二种前体分子的官能团的当量比率是在0.9和1.1之间，和其中第一种前体分子的分支的分子量，和第二种前体分子的分子量和分支点的官能度进行选择，以使得聚合物网络的水含量是在吸水完成之后聚合物网络总重量的平衡量wt％至92wt％之间。
对于大多数的愈合指标，细胞向内生长进入或细胞迁移进入基质中的速率连同基质的调整的降解速率对于总体愈合响应是重要的。基质被细胞侵入的潜力主要是网络密度，即在分支点或节点之间的间距的问题。如果相对于细胞的尺寸该现有空间是小的或如果基质的降解(它在基质内产生更多空间)速率是太低的，则观察到非常有限的愈合响应。在自然界中发现的愈合基质，例如与在身体内的创伤响应所形成的血纤蛋白基质，已知是由非常疏松网络组成，该网络非常容易被细胞侵入。该浸润受到细胞粘附的配位体促进，其是血纤蛋白网络的整体组成部分。
与血纤蛋白基质不同，从合成亲水性前体分子制得的基质，如聚乙二醇，会在聚合物网络的形成之后在水相环境中溶胀。为了在身体内基质的就地形成过程中实现足够短的凝胶化时间(在7-8之间的pH和在36-38℃范围内的温度下3-10分钟)和定量反应，前体分子的起始浓度必须是足够的高。在网络形成之后所推想的溶胀没有发生，必要的起始浓度将导致形成了对于细胞浸润而言太致密的基质。因此，聚合物网络的溶胀对于扩大和加宽在分支点之间的间距是重要的。
与前体分子的起始浓度无关，从相同的合成前体分子制得的水凝胶将在平衡状态下溶胀到相同的水含量。这意味着，前体分子的起始浓度越高，水凝胶的最终体积越高，当它达到它的平衡状态时。如果在身体内可用的空间太小而无法有足够的溶胀，则细胞浸润(infiltration)的速率和因此愈合响应将减少。结果，在两个矛盾的要求之间的最适宜点，对于在身体内的应用，必须找到。一方面该起始浓度必须是足够的高以确保必要的凝胶化时间，这另一方面能够导致一种基质，该基质为了在缺陷中可用的空间而需要太多的空间以获得必要的水含量和因此保持太致密而无法让细胞浸润。良好的细胞浸润和后续的愈合响应已经对于一些生物材料观察到，其中水凝胶的水浓度是在吸水完成之后聚合物网络和水的总重量的平衡水含量和92wt％之间。优选该水含量是在吸水完成之后聚合物网络和水的总重量的93-95wt％之间。吸水的完成能够实现，这是因为达到平衡浓度或是因为可用空间无法满足进一步体积增加。因此优选的是尽可能低地选择前体组分的起始浓度。
在凝胶化时间和低起始浓度之间的平衡必须通过前体分子的结构来优化。尤其，第一种前体分子的分支的分子量，第二种前体分子的分子量和支化度，即分支点的官能度因此必须调节。实际的反应机理对于这一相互关系有较少的影响。
随着聚合物网络的总体支化度的增加，互连链节(interlinks)的分子量即链节的长度必须增加。
如果第一种前体分子是在各分支的末端具有官能团的三或四分支聚合物或第二种前体分子是线性双官能分子，则第一种前体分子的分支的分子量和第二种前体分子的分子量优选进行选择以使得在网络的形成之后在分支点之间的链节具有在10-13kD之间(在链节是线性、未支化的条件下)，优选在11-12kD之间的范围内的分子量。这使得第一和第二种前体分子的总和的起始浓度是在所述第一种和第二种前体分子的总重量的在8-12wt％之间，优选在9-10wt％之间的范围内(在网络形成之前)。对于第一种前体组分的支化度增加到8和第二种前体分子仍然是线性双官能分子的情况，在分支点之间的链节的分子量优选被增加到在18到24kD之间的分子量。对于第二种前体分子的支化度从线性提高到三或四分支前体组分的情况，链节的分子量即长度因此增加。
第一种和第二前体分子是选自蛋白质，肽，聚氧化烯，聚(乙烯醇)，聚(乙烯-共聚-乙烯基醇)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共聚-丙烯酸)，聚(乙基基质唑啉)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯-共聚-乙烯基吡咯烷酮)，聚(马来酸)，聚(乙烯-共聚-马来酸)，聚(丙烯酰胺)，或聚(环氧乙烷)-共聚-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物。特别优选的是聚乙二醇。
最优选，第一种前体分子是聚乙二醇。
第二种前体分子最优选是选自聚乙二醇或肽。
官能化聚乙二醇(PEG)已经显示在合成生物材料的合成中兼顾了特别有用的各项性能。它的高亲水性，对于哺乳动物酶的低降解性和低毒性使得该分子特别可用于在身体内的应用。人们能够根据所选择的反应机理可以容易地购买或合成线性(意指有两个末端)或支化(意指有两个以上末端)PEG和然后将PEG端基官能化。
在本发明的优选实施方案中，该组成进行选择使之包括作为第一种前体分子的三官能化三分支15kD聚合物，即各分支具有5kD的分子量，和作为第二种前体分子的具有在0.5至1.5kD之间，甚至更优选在1kD左右的分子量的双官能化线性分子。优选，第一种和第二种前体组分是聚乙二醇。优选地，第一种前体组分包括作为官能团的共轭不饱和基团或键，最优选丙烯酸酯或乙烯基砜，而第二种前体分子的官能团包括亲核基团，优选硫醇或氨基。在本发明的另一个优选实施方案中，第一种前体分子是在各分支的末端具有官能团的四分支20kD(各分支具有5kDa的分子量)聚合物，和作为第二种前体分子，具有在1至3kDa之间，优选在1.5-2kD之间的分子量的双官能化线性分子。优选地，第一种前体分子是聚乙二醇和第二种前体分子是肽。在两个优选实施方案中，第一和第二种前体分子的总和的起始浓度是第一种和第二种前体分子和水的总重量的在8-11wt％之间，优选在9-10wt％之间(在聚合物网络的形成之前)，优选在5-8wt％之间，以实现低于10分钟的凝胶化时间。这些组成在混合之后在pH8.0和37℃下具有约3-10分钟的凝胶化时间。同样在这一实施方案中，第一种前体组分的优选官能团是共轭的不饱和基团如丙烯酸酯或乙烯基砜，和对于第二种前体组分，官能团是亲核基团，最优选硫醇基。
产生三维网络的反应机理能够在各种反应机理如取代反应，自由基反应和加成反应当中选择。
对于取代，缩合和加成反应，一种前体分子包括亲核基团和另一前体分子包括亲电子基团，优选共轭的不饱和基团或键。
对于自由基反应，两种前体分子包括不饱和键，优选共轭的不饱和键。
优选地，该共轭的不饱和基团或共轭的不饱和键是选自丙烯酸酯，乙烯基砜，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，丙烯腈，乙烯基砜，2-或4-乙烯基吡啶_，马来酰亚胺和醌。
该亲核基团优选是选自硫醇基团，氨基和羟基。
在本发明中的特别优选的反应机理是在共轭的不饱和基团或键和强亲核试剂之间的Michael型加成反应，如在WO00/44808中所述。对于Michael型加成反应，第一种前体分子优选包括共轭的不饱和基团和尤其乙烯基砜或丙烯酸酯基团和第二种前体分子包括硫醇基团。两种前体组分的末端连接得到稳定的三维网络。加成到共轭的不饱和基团上的这一Michael型加成反应是在生理条件下以定量的产率进行，没有产生任何副产物。
该愈合速率进一步取决于对细胞分泌蛋白酶类如基质金属蛋白酶(MMP)的基质敏感性，这允许它们经历细胞介导的降解和重塑。总而言之，身体对基质的愈合响应显然是更好的，同时发生的细胞浸润和基质降解的速率更快。在组织再生中显示的差性能合成基质应归因于在基质网络的结构和它的功能之间的弱相互关系。
正如前面早已提到的，这一速度比率能够通过如下来确定：
-细胞浸润的前体聚合物的结构(即链长度和分支的数量)
-以共价键方式键接于网络上以增加细胞浸润的粘合配位体(adhesionligands)的亲合性和浓度
对于酶促可降解的凝胶的情况，该蛋白酶底物对于由细胞分泌的所需蛋白酶的降解的特异性以及所使用的蛋白酶底物的酶促活性(Km/kcat)或酶水解动力学
-对于水解方式可降解的凝胶的情况，基质对生理条件的敏感性。
-以及：调高基质金属蛋白酶MMP(例如生长因子)的表达和分泌的或下调或抑制(例如抑制剂)它们的分子的添加。
这些因素的微调基本上与所使用的交联化学无关。
定义：
“生物材料”是指一种材料，它用于干扰生物系统以便永久或暂时地取决于该材料来评价、处理、增强或替换身体的任何组织、器官或功能。在本发明的上下文中，术语“生物材料”和“基质”是同义地使用并指被水溶胀但不溶于水中的交联聚合物网络，即在体内停留一段时间以便对于受损伤的或缺损的软和硬组织发挥一定支撑功能的水凝胶。
“强亲核试剂”是指能够在极性键形成反应中给予亲电子试剂以电子对的分子。优选该强亲核试剂是在生理pH下比H2O更具亲核性。强亲核试剂的例子是硫醇和胺。
“共轭的不饱和键”是指碳-碳，碳-杂原子或杂原子-杂原子多重键与单键的交替，或官能团对高分子如合成聚合物或蛋白的连接。此类键能够经历加成反应。
“共轭的不饱和基团”是指含有碳-碳，碳-杂原子或杂原子-杂原子多重键与单键的交替的分子或分子区域，它们具有能够经历加成反应的多重键。共轭的不饱和基团的例子包括，但不限于乙烯基砜，丙烯酸酯，丙烯酰胺，醌，和乙烯基吡啶_，例如，2-或4-乙烯基吡啶_和衣康酸酯。
“合成前体分子”是指在自然界不存在的分子。
“天然存在的前体组分或聚合物”是指能够在自然界中找到的分子。
“官能化”是指以一种可导致官能团或结构部分的连接的方式的改性。例如，分子可以由使分子产生强亲核性或共轭的不饱和的分子的引入来官能化。优选，分子例如PEG被官能化而变成硫醇，胺，丙烯酸酯，或醌。
尤其蛋白质也可以通过二硫键的部分或完全还原产生游离的硫醇来有效地官能化。
“官能度”是指在分子上反应活性部位的数目。
“分支点的官能度”是指从分子中的一个点延伸的分支的数量。
“粘合位点(adhesion site)”是指肽序列，在细胞表面上的分子例如粘合促进受体结合于它。粘合位点的例子包括，但不限于，粘连蛋白的RGD序列，和层粘连蛋白的YIGSR序列。优选地，粘合位点被收入到本发明的生物材料中。
“生长因子结合部位”是指肽序列，其中生长因子或结合了生长因子的分子结合于它。例如，该生长因子结合部位可以包括肝素结合部位。这一部位可结合肝素，进而结合肝素结合性生长因子，例如，bFGF，VEGF，BMP或TGFβ。
“蛋白酶结合部位”是指肽序列，它是酶的底物。
“生物活性”是指被所感兴趣的蛋白质介导的官能化情况。在一些实施方案中，这包括通过测量多肽与另一种多肽的相互作用所分析的情况。它也包括分析所感兴趣的蛋白质对细胞生长，分化，死亡，迁移，粘合，与其它蛋白质的相互作用，酶活性，蛋白质磷酸化或脱磷酸化作用，转录或翻译的影响。
“敏感的生物分子”是指在细胞中或在身体中发现的分子，或它能够用作细胞或身体的治疗剂，它可以在其存在下与其它分子反应。敏感的生物分子的例子包括，但不限于，肽，蛋白质，核酸，和药物。在本发明中生物材料能够在敏感的生物材料存在下制备，没有不利地影响该敏感的生物材料。
这里使用的“再生”是指生长恢复了组织的一部分或全部。例如，本发明体现特征在于损伤，肿瘤切除，或脊柱融合术之后再生骨头或再生皮肤以协助糖尿病患者足溃疡，褥疮，和静脉机能不全的愈合的方法。可以再生的其它组织包括，但不限于，神经，血管，和软骨组织。
“多官能的”是指一个以上的亲电子和/或亲核的官能团/每分子(即单体，低聚物和聚合物)。
“自选择性反应”是指组合物的第一种前体组分与组合物的第二种前体组分比与在混合物中或在反应的位点中存在的其它化合物快得多地反应，反之亦然。这里所使用的亲核试剂优先结合于亲电子试剂上，而不是结合于其它生物化合物上，而亲电子试剂优先结合于强亲核试剂上而不是结合于其它生物化合物上。
“交联”是指在属于至少前体组分的亲核基团和亲电子基团之间共价键的形成，以便引起分子量的增加。
“聚合物网络”是指一种过程的产物，在该过程中基本上全部的单体，低聚物或聚合物经由它们的可利用的官能团由分子间共价键所键接，导致形成一个极大的分子。
“生理的(Physiological)”是指在活的脊椎动物中找到的条件。尤其，生理条件是指在人体中的条件，如温度，pH，等等。生理温度是指尤其在35℃到42℃之间的温度范围，优选在37℃左右。
“交联密度”被定义为在各自分子的两个交联点之间的平均分子量(Mc)。
“当量重量”被定义为mmol的官能团/g的物质。
“溶胀”是指水被生物材料吸取后体积和质量的增加。术语“水吸取”和“溶胀”在整个申请中同义地使用。
“平衡状态”被定义一种状态，其中当在恒定(konstant)条件下在水中贮存时水凝胶没有经历质量增加或损失。
该合成生物材料能够经过设计，引入自然系统的许多方面。通过特定的受体-配体结合诱导细胞粘附的肽和能够使基质经历细胞触发的由基质金属蛋白酶(MMP)实施的重塑的那些组分都被引入。MMP底物经过选择，因为-作为在哺乳动物组织中的主要蛋白质-它们的降解在天然ECM转换中(例如在伤口愈合过程中)以及在组织再生的进行中起着关键作用。其它酶种类也可通过底物的引入定位(targeted)，该底物是所需的具体酶所特定的。这些水凝胶是，在活体外和活体内在三维空间中细胞迁移的机理和速度能够容易地通过基质的特性和组成来控制，与任何游离或基质相关的外源信号分子如生长因子或细胞活素的添加无关。
在酶促可降解的基质的形成中，尤其基质肽提供非常适当的结构单元。直接了当地合成含有两种或多种半胱氨酸残基的肽，然后这一组分能够容易地用作包括亲核基团的第二前体分子。例如，具有两个自由半胱氨酸残基的肽在与三分支15-20k PEG三丙烯酸酯在生理或稍高的pH(例如，8-9；该凝胶化也在甚至更高的pH下很好地进行，但是有自选择性的潜力损失)下混合时将容易地形成水凝胶。全部的碱都能够使用，然而优选使用叔胺。三乙醇胺是最优选的。当第一种和第二液体前体分子一起混合时，它们在几分钟的时间中反应而形成具有网络的节点的由PEG链的网络组成的弹性凝胶，其中肽作为连接链节(connecting links)。该肽能够被选择为蛋白酶底物，从而使该网络能够被细胞浸润和降解，差不多就像它们在蛋白质基网络中的那样。该凝胶化是自选择性的，意味着该肽主要与PEG组分反应而不与其它组分反应，和该PEG组分主要与肽反应而不与其它组分反应。在又一个实施方案中，双官能化试剂能够引入以便为其它物质(例如，组织表面)提供化学键接。
在再一个优选实施方案中，供细胞粘附用的肽位点被引入到基质中，即结合到在细胞表面上的粘合-促进受体上的肽类被引入到本发明的生物材料中。促进肽的此类粘合是选自粘连蛋白的RGD序列，和层粘连蛋白的YIGSR序列。与以上一样，这能够例如简单地通过将含有半胱氨酸的肽与包括共轭的不饱和基团的前体分子如PEG二丙烯酸酯或三丙烯酸酯、PEG二丙烯酰胺或三丙烯酰胺或PEG二醌或三醌进行混合来实现，几分钟过后与包含亲核基团的前体组分如含有硫醇的前体组分的剩余部分进行混合。在该第一步骤中，粘合促进肽将被引入到用共轭的不饱和加以多官能化的前体的一端；当剩余的多硫醇被加入到体系中时，形成了交联网络。制备网络的该方式的另一个重要的含意是侧挂(pendant)的生物活性配位体如粘合信号的引入的效率。无论如何，这一步骤毫无疑问是定量的，因为未键接的配位体(例如粘合位点)能够抑制细胞与基质的相互作用。如后面所述，用此类侧挂的低聚肽的前体衍生化是在第一个步骤中以多分支的亲电子前体与硫醇相比的化学计量大过量(最低：40倍)来进行，并因此明确地定量的。以上为了防止所不需要的抑制作用，这一成就是生物学上更重要的：细胞行为对于配位体密度的小变化是非常敏感的以及所引入的配位体的精确认识有助于设计和了解细胞-基质相互作用。总而言之，以共价键方式键接于基质上的粘合位点的浓度显著地影响细胞浸润的速率。例如对于给定的水凝胶，RGD浓度范围能够引入基质，以最佳方式支持细胞向内生长和细胞迁移。粘合位点像RGD的最佳浓度范围对于在吸水完成之后水含量在平衡浓度至92wt％之间的基质来说是在0.04至0.05mM之间和甚至更优选0.05mM。
在本发明的又一个优选实施方案中，生长因子或生长因子样肽以共价的方式附着于该基质上。对于骨头愈合，使用TGFβ，BMPs，IGFs，PDGFs，尤其BMP2，BM7，TGFβ1，TGFβ3，IGF1，PDGF AB，人生长释放因子，PTH 1-84，PTH 1-34和PTH 1-25的指示单元。出乎意料地，PTH(PTH 1-84，PTH 1-34和PTH 1-25)显示特别良好的骨形成，当以共价键方式连接于合成基质时。通过以共价键方式将PTH 1-34(氨基酸序列SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF)连接于能够被细胞浸润和然后降解的合成基质上来达到最佳结果。生长因子类或生长因子样肽类是以至少一个附加的半胱氨酸基团(-SH)来表达或化学合成，半胱氨酸基团直接或经由接头(linker)序列被连接于蛋白质或肽上。该接头序列能够另外包括酶促可降解的氨基酸顺序，以使得该生长因子能够以基本上自然的形式由酶从基质上分裂下来。对于PTH 1-34的情况，PTH 1-34在合成基质上的键接可通过将附加的氨基酸序列连接于含有至少一个半胱氨酸的PTH1-34的N-末端上而成为可能。半胱氨酸的硫醇基能够与合成聚合物上的共轭的不饱和键反应而形成共价键。可能性(a)仅仅半胱氨酸连接于该肽上，在可能性(b)中酶促可降解的，尤其血纤蛋白溶酶可降解的序列是作为接头被连接在半胱氨酸和肽如CGYKNR之间。该序列GYKNR使得该键可以被血纤蛋白溶酶降解。
对于骨头愈合，生长因子类和生长因子样肽会促进骨形成。然而已经显示，通过选择合适的基质，能够观察到骨形成，即使没有生长因子类或生长因子样蛋白质连接于它。基质从具有末端共轭不饱和键的四分支20kD聚乙二醇和在末端有硫醇基的线性聚乙二醇获得，以相对于在溶胀之前两反应物加上水的总重量而言7.5wt％的起始浓度，和在一定范围中的浓度的细胞粘附肽导致40％钙化组织。
该基质进一步含有添加剂，象填料，X射线造影剂，触变剂，等等。
在作为伤口愈合应用的基质的水凝胶的设计中，几个因素，其中包括例如粘合肽的浓度，密度，包含蛋白酶序列的肽的动力学降解性，全部在功能配方(functional formulation)中有影响。从这一信息，基质能够针对特定的愈合应用来设计。这是重要的，因为用于一种应用的理想配方并不证明是全部其它应用的理想配方。
对于骨头，通过将细胞迁移的速率和基质降解的速率保持在快的水平上，能够实现优异的愈合结果。对于骨缺陷，用蛋白酶降解位点GCRPQGIWGQDRC和0,050mM GRGDSP交联的具有约20000D的分子量的四分支聚乙二醇得到了特别好的愈合结果，其中PEG和肽的起始浓度低于该分子和水(在溶胀之前)的总重量的10wt％。该凝胶具有有用的稠度和让成骨细胞和前体细胞容易地浸润该基质中。
混合和应用模式
需要避免的是，在混合物应用于身体上之前该前体分子在允许该分子发生聚合的条件下彼此结合或接触。在总体意义上，这可通过包含彼此分开的至少第一种和第二种前体分子的体系来实现，其中至少第一种和第二种前体分子在允许该前体分子的聚合的条件下通过混合而形成三维网络。第一种和第二种前体分子优选在没有氧和光的条件下和在低温下例如在+4℃左右贮存，以避免在使用之前该官能团的分解。优选地，各前体组分的官能团的含量是在使用之前立即测量，和第一种和第二种前体组分(和其它前体组分，当合适时)的比率是根据预定的官能团的当量重量比率来调节。第一种和第二种前体分子能够溶于碱溶液中。或前体组分和碱溶液能够独立地在双向的注射器中贮存，其具有被与注射器体壁正交的可调的隔片分开的双腔室。一个腔室能够含有固体粉末形式的前体组分，另一个腔室含有合适量的碱溶液。如果压力被施加于注射器体的一端，则该隔板移动和释放在注射器壁中的突起(bulges)，以使得缓冲剂能够飘浮到含有相应前体分子的腔室中，该前体分子在与碱溶液接触之后会溶解。双向的注射器体用于以同样方式的其它前体分子的贮存和溶解。如果两种前体组分溶解，两种双向的注射器体连接于双向的连接装置，和通过将内容物压挤穿过连接于连接装置上的注射针来混合该内容物。该连接装置另外能够包括静态混合器以改进内容物的混合。
首先，有生物活性肽的前体溶液，例如在侧翼有单个半胱氨酸和/或生长因子类或生长因子样肽的细胞表面上的结合于粘合促进受体的结合剂，与包含共轭的不饱和键的前体组分，尤其第一种前体组分，如多分支PEG前体，进行反应。在第二步骤中，通过例如这一改性PEG前体溶液与含有蛋白酶底物的二硫醇-肽(或含有至少两个亲核基团的任何其它实体)的混合来形成水凝胶。如前面所示，它是自选择性的，即丙烯酸酯与硫醇比与胺(常常在生物系统中存在，例如在赖氨酸上的ε胺侧链)更快得多地反应。而硫醇与乙烯基砜比与丙烯酸酯更快速地反应。而且，很少的细胞外蛋白质含有游离的硫醇和1，4-共轭不饱和键很少能在生物环境中发现，这使得凝胶在其它蛋白质、细胞和组织存在下可以就地形成或直接在外科现场形成。
本发明的其它方面是制备用于愈合应用的药物组合物的方法，该方法包括以下步骤
a)提供至少一种第一种三官能三分支前体分子，优选包括共轭的不饱和基团；
b)提供至少一种第二双官能的前体分子，它优选包括亲核基团，该基团能够在生理条件下与步骤a)的共轭不饱和基团形成共价键；
c)将第一种前体分子溶解在碱溶液中；
d)将第二种前体分子溶解在碱溶液中；
e)任选地将添加剂象触变剂或填料混入到在步骤c或d中获得的溶液中；
f)将在步骤c)中获得的溶液加入到输送装置中，优选加入到注射器中；
g)将在步骤d)中获得的混合物加入到输送装置中，优选加入到注射器中。
第一种和第二种前体组分的起始浓度是在8-11wt％范围内，优选在9-10wt％范围内，基于第一种和第二种前体分子和水的总重量(在聚合物网络形成之前)计。第一种和第二种前体组分，该填料和碱是选自以上描述的那些。在混合之前，全部的组分灭菌。这优选通过前体分子的过滤消毒和填料的γ照射来实现。在步骤f)和g)中获得的混合物能够长时间贮存，优选在低温下。
紧接着在应用之前，在步骤f)和g)中获得的输送装置的内容物被彼此混合在一起。注射器能够由双向的连接设备来互联以及注射器的内容物通过将静态混合物推挤穿过双向的连接设备的出口而混合。通过将静态混合器连接于注射针将混合的组分直接在身体需要的部位注入或该混合物被挤入到另外的注射器中，后者然后连接于注射针。
本发明的再一部分是包括第一种和第二种前体分子和碱溶液的部分的试剂盒(kit)，其中第一种和第二种前体分子的总和是在8-12wt％范围内和优选在9-10wt％范围内，基于在该试剂盒中存在的第一种和第二种前体分子和碱溶液的总重量计。
本发明的再一部分是包括第一种和第二种前体分子和碱溶液的组合物的用途，其中第一种和第二种前体分子的总和是在8-12wt％范围内和优选在9-10wt％范围内，基于为了制造用于伤口愈合目的的基质所存在的第一种和第二种前体分子和碱溶液的总重量计。
附图的描述
图1显示了由具有不同结构(即分子量和分支数量)的PEG分子和MMP敏感性二硫醇肽制造的水凝胶的流变性能测量结果。PEG结构(即分子量m.w.和分支的数量)直接与网络的粘弹特性有关。通过在恒定的前体浓度(例如10％w/w)下改变分子的链长度和分支的数量，弹性模数G’随着分支长度的减少或随着交联位点的官能度的增加而提高。在前体参数和网络性能之间的相互关系能够归因于水凝胶的充分表征的微观结构。
图2显示了由具有不同结构(即分子量和分支数量)的PEG分子和MMP敏感性二硫醇肽制造的水凝胶的溶胀测量结果。溶胀比直接与网络结构有相互关系。该溶胀比随着分支长度的减少或随着该交联位点的官能度的增加而提高。
图3显示了MMP降解性和它对所引入的低聚肽的酶活性的敏感性。由溶胀分析的降解动力学，即含有具有不同活性的MMP底物的水凝胶的重量变化，对应于蛋白酶底物肽的氨基酸序列(即酶活性)。
图4显示了在含有具有不同MMP活性的肽的水凝胶内的细胞侵入的测量结果。细胞侵入到含有MMP底物的水凝胶中是响应后者的酶活性。
图5显示了在含有各种密度的粘合配位体的水凝胶内的细胞侵入的测量结果。侵入速率是由以双相方式的所引入RGD位点的密度来介导的。
图6显示了在含有各种分子量的前体分子的MMP-敏感性和粘性的水凝胶内的细胞侵入的测量结果。细胞在合成凝胶中的侵入会随分子量提高而增加。发现阈值分子量(4分支PEG10kD)，低于它则细胞侵入会停止。
图7显示了在水凝胶内的细胞侵入的测量结果，该水凝胶是MMP敏感性的和非常松散交联的(即含有大量缺陷)(7A)或无法由细胞衍生的MMP(7B)降解。细胞侵入速率能够通过稀松化该网络结构，例如通过在凝胶中引入缺陷，来增大。在具有非常松散X-连接网络的水凝胶内发生非蛋白水解性细胞侵入。在这一实施例中，高度的缺陷(Q大于约ca.10)是需要的。细胞形态与在蛋白质水解方式可降解的基质中的一种细胞形态不同。细胞是非常薄和梭形的并且从簇(cluster)中几乎完全直线和径向地向外迁移。因此，细胞浸润的机理能够从主要的蛋白水解型转换到非蛋白水解型。
图8显示了在临界尺寸鼠颅骨缺陷中在3-5周的愈合结果。8mm缺陷是在鼠头盖骨中产生的，然后将预聚合的凝胶与5μg/mL的rhBMP-2加入到该缺陷中。含有具有两种不同酶活性的非-MMP敏感性PEG-(SH)2(A)和MMP底物的凝胶进行测试，其中包括快速降解底物，Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG，(B)和较缓慢降解型低聚肽Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG(C)。该动物是试验终点被杀死，然后以放射照片和显微解剖学来分析结果。该愈合响应取决于所引入底物的酶活性。不可降解的凝胶没有显示任何细胞浸润(A)和形成了包围该植入物的骨层。较缓慢降解型凝胶(B)显示更多细胞浸润和该基质是部分地重塑的，而最快速降解型凝胶(C)显示了与最初骨头有类似形态的新形成的骨和非常少的剩余基质。这里，观察到了缺陷的完全桥连。
图9显示了在临界尺寸鼠颅骨缺陷中在3-5周的愈合结果。8mm缺陷是在鼠头盖骨中产生的，然后将预聚合的凝胶剂与5μg/mL的rhBMP-2加入到该缺陷中。具有不同结构的凝胶进行试验，其中包括用4分支15K peg VS制备的胶原酶可降解的凝胶(A)，用4分支20KpegVS制备的胶原酶可降解的凝胶(B)和用3.4Kpeg二硫醇和4分支15KPEG丙烯酸酯制备的水解方式可降解的凝胶(C)。该动物是试验终点被杀死，然后以放射照片和显微解剖学来分析结果。在各动物中看到了在这一早期终点中缺陷的完全桥连但有不同的形态差异。较缓慢降解型凝胶(A)显示较少细胞浸润和更多剩余基质，而最快速降解型凝胶(C)显示了与最初骨头有类似形态的新形成的骨。
图10显示了在8mm绵羊钻开(drill)缺陷内在8周中的愈合结果。具有不同结构和酶促降解性的五种不同的合成基质通过添加20μg/mL的rhBMP-2来试验它们的愈合响应。这些凝胶由增加的细胞浸润能力来排序，其中SRT1具有最低的细胞浸润和SRT5具有最高的细胞浸润。能够看出，该愈合响应与细胞浸润基质的能力极其恰当地相关，其中最具响应性的基质提供最高愈合潜力。
实施例
实施例1：碱性试剂的制备
PEG-乙烯基砜的制备
市场上可买到的支化PEG(4分支PEG，分子量14,800，4分支PEG，分子量10,000和8分支PEG，分子量20,000；Shearwater Polymers，Huntsville，AL，USA)是在该OH末端被官能化。
PEG乙烯基砜是在氩气氛中通过前体聚合物(预先在分子筛上干燥)的二氯甲烷溶液与NaH反应，和然后，在氢放出后，与二乙烯基砜(摩尔比率：OH1∶NaH5∶二乙烯基砜50)反应，来生产。该反应是在室温下在氩气中以恒定的搅拌进行反应3天。在反应溶液用浓乙酸中和之后，该溶液经滤纸过滤，一直到透明为止。衍生的聚合物是通过在冰冷的二乙醚中沉淀来分离的。该产品再溶解在二氯甲烷中和重新在二乙醚中沉淀(彻底地洗涤)，两次，以除去全部过量的二乙烯基砜。最后，该产品在真空下干燥。该衍生化是用1H NMR证实。该产品显示了在6.21ppm(两个氢)和6.97ppm(一个氢)处的特征乙烯基砜峰。端基转化率发现是100％。
PEG-丙烯酸酯的制备
PEG丙烯酸酯是在氩气氛中通过在三乙胺(摩尔比率：OH1∶丙烯酰氯2∶三乙胺2.2)存在下由前体聚合物的共沸干燥的甲苯溶液与丙烯酰氯反应来生产的。该反应在黑暗中在室温下在搅拌下进行一夜。所获得的浅黄色溶液经中性矾土床过滤；在溶剂蒸发之后，反应产物溶于二氯甲烷中，用水洗涤，在硫酸钠上干燥和在冷二乙醚中沉淀。产率：88％；从OH到丙烯酸酯的转化率：100％(来自1H-NMR分析)
1H-NMR(CDCl3)：3.6(341H(14800 4分支：337H理论值)，230(10000 4分支：227H理论值)，或210H(20000 8分支：227H理论值)，PEG链质子)，4.3(t，2H，-CH2-C H 2-O-CO-CH＝CH2)，5.8(dd，1H，CH，＝C H-COO-)，6.1和6.4(dd，1H，C H 2＝CH-COO-)ppm。
FT-IR(在ATR板上的膜)：2990-2790(υC-H)，1724(υC-O)，1460(υ，CH2)，1344，1281，1242，1097(υC-O-C)，952，842(υ，C-O-C)cm-1。
肽合成
全部肽是利用标准9-芴甲氧羰基化学方法使用自动化的肽合成仪(9050 Pep Plus Synthesizer，Millipore，Framingham，USA)在固体树脂上合成的。疏水性清除剂和分裂的保护基通过该肽在冷二乙醚中的沉淀和在去离子水中的溶解被除去。在冷冻干燥后，将肽再溶解在0.03M Tris缓冲盐水(TBS，pH7.0)中和通过使用HPLC(Waters；Milford，USA)在尺寸排阻色谱柱上提纯，其中用TBS，pH7.0作为流动的缓冲剂。
实施例2：利用共轭加成反应的水凝胶形成
通过与肽连接的亲核试剂和允许蛋白水解方式细胞迁移的PEG连接的共轭不饱和键的共轭加成来形成的MMP敏感性凝胶。凝胶的合成是完全通过硫醇-PEG的Michael型加成到乙烯基砜官能化PEG上来完成的。在第一步骤中，粘合肽以侧挂方式(例如肽Ac-GCGYGRGDSPG-NH2)连接于多分支PEG-乙烯基砜上和然后该前体与含有二硫醇的肽(例如MMP底物Ac-GCRDGPQGIAGFDRCG-NH2)交联。在3维体外试验的典型的凝胶制备中，将4分支的PEG-乙烯基砜(分子量15000)溶于TEOA缓冲剂(0.3M，pH8.0)中得到10％(w/w)溶液。为了使凝胶变成细胞粘合性，溶解的肽Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(相同的缓冲剂)被加入该溶液中。该粘合肽在37℃下反应30分钟。然后，该交联剂肽Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2与以上溶液混合，合成了凝胶。凝胶化在几分钟内发生，然而，该交联反应在37℃下进行一小时以确保完全的反应。
通过与PEG连接的亲核试剂和允许非蛋白水解方式细胞迁移的PEG连接的共轭不饱和键的共轭加成来形成的MMP非敏感性凝胶。
凝胶的合成也完全通过硫醇-PEG的Michael型加成到乙烯基砜官能化PEG上来完成的。在第一步骤中，粘合肽以侧挂方式(例如肽Ac-GCGYGRGDSPG-NH2)连接于多分支PEG-乙烯基砜上和然后该前体用PEG-二硫醇(例如分子量3.4kD)交联。在3维体外试验的典型的凝胶制备中，将4分支的PEG-乙烯基砜(分子量15000)溶于TEOA缓冲剂(0.3M，pH8.0)中得到10％(w/w)溶液。为了使凝胶变成细胞粘合性，溶解的肽Ac-GCGYGRGDSPG-NH2(在相同的缓冲剂中)被加入该溶液中。该粘合肽在37℃下反应30分钟。然后，该PEG-二硫醇前体与以上溶液混合，合成了凝胶。凝胶化在几分钟内发生，然而，该交联反应在37℃下进行一小时以确保完全的反应。
实施例3：由缩合反应的水凝胶形成
通过与含有多个胺的肽X-接头和允许蛋白水解方式细胞迁移的亲电活性PEG的缩合反应所形成的MMP敏感性凝胶
MMP敏感性水凝胶也可通过进行在含有两个MMP底物和三个Lys(Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH2)的MMP敏感性低聚肽与市场上可买到的(Shearwater polymers)双官能的双酯PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS)之间的缩合反应来产生。在第一步骤中，粘合肽类(例如肽Ac-GCGYGRGDSPG-NH2)与小比例的NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS反应和然后这一前体通过与携带三个ε-胺(和一个伯胺)的肽Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH2混合而交联到网络上。在3维体外试验的典型的凝胶制备中，两组分被溶于pH7.4的10mM PBS中而得到10％(w/w)溶液，和在短于一个小时的时间内形成水凝胶。
与由Michael型反应形成的本凝胶相反，在这一途径中的所需自选择性无法保证，因为在生物材料如细胞或组织中存在的胺类也与双官能活化双酯反应。这对于携带吸电子官能团的其它PEG，如PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)，或PEG硝基苯基碳酸酯也是如此。
通过与PEG-胺交联剂和允许非蛋白水解方式细胞迁移的亲电活性PEG的缩合反应所形成的MMP非敏感性水凝胶通过进行在市场上可买到的支化PEG-胺(Jeffamines)和相同的双官能双酯PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS)之间的缩合反应也形成水凝胶。在第一步骤中，该粘合肽(例如该肽Ac-GCGYGRGDSPG-NH2)与小部分的NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS反应，然后该前体通过与多分支PEG-胺混合而交联形成网络。在3维体外试验的典型的凝胶制备中，两组分被溶于pH7.4的10mM PBS中而得到10％(w/w)溶液，和在短于一个小时的时间内形成水凝胶。再次，与由Michael型反应形成的本凝胶相反，在这一途径中的所需自选择性无法保证，因为在生物材料如细胞或组织中存在的胺类也与双官能活化双酯反应。这对于携带吸电子官能团的其它PEG，如PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)，或PEG硝基苯基碳酸酯也是如此。
实施例4：由与各种大单体(macromer)和含硫醇的MMP敏感性肽的共轭加成所制备的水凝胶的平衡溶胀测量
进行水凝胶结构-官能团研究以便试验在前体参数和网络性能之间的联系是否建立并有助于形成凝胶的充分表征的微观结构。
水凝胶形成和平衡溶胀测量
凝胶是在溶胀之前和之后和在冷冻干燥之后通过使用带有附加的密度测定装备的天平在空气和乙醇中被称重。以阿基米德浮力原理为基础，计算在交联之后的凝胶体积和在溶胀之后的凝胶体积。样品在蒸馏水中溶胀24小时。交联密度和在交联点之间的分子量是以Flory-Rehner模型和由Peppas-Merrill设计的它的改进型为基础来计算。
PEG大单体结构(即分子量和分支的数量)直接与网络的溶胀特性有关
通过改变在恒定的前体浓度(10％w/w)下大单体的链长度和分支数量，该溶胀比(和因此X-连接点密度和在X-连接点之间的分子量)显著地被改变(图1)。该溶胀比随着分支长度的减少或随着X-接头的官能度的增加而提高。
实施例5：由与各种大单体和含硫醇的MMP敏感性肽的共轭加成所制备的水凝胶的粘弹性测量
水凝胶的动态粘弹性能通过使用具有板-板几何结构的BohlinCVO 120高分辨率流变仪，在37℃和pH7.4下和在板之间的加湿气氛中，进行微小应变振荡剪切实验来研究。PEG-多丙烯酸酯和肽前体溶液(各36μL)被施涂于底板上和用移液管尖端简单地混合。该顶板(20mm直径)然后立刻下降到0.1mm的标定间隙尺寸。在短的预剪切时间(以确保前体的混合)之后，开始进行动态振动测量。记录在0.5Hz的恒定频率下的储能模量(G’)和损耗模量(G”)和相角(δ)的演变。进行振幅扫描，以证实该参数(频率和应变)是在线性粘弹性范围之内。
PEG大单体结构(即分子量和分支的数量)直接与网络的粘弹性特性有关
通过改变在恒定前体浓度(例如10％w/w)下大单体的链长度和分支的数量，剪切模量(G’和G”)显著地改变以及随分支长度的减少或X-接头的官能度的增加而提高的G’暗示了在前体参数和网络性能之间有明显的相互关系，这有助于凝胶的充分表征的微观结构(图2)。
实施例6：凝胶的人MMP-1的生化降解，该凝胶是由与含有两个半胱氨酸残基的肽类的共轭加成所形成，其中在它们之间有各种酶活性的MMP底物序列
酶催降解通过以生物化学方式由MMP敏感性水凝胶暴露于活化MMP-1的蛋白水解作用来进行分析。携带具有三种不同的酶活性的底物的水凝胶进行试验(KM/Kcat＝840％，100％，0％)。水凝胶被MMP-1的降解是通过测定在降解过程中溶胀的变化来测定的。
MMP-降解性和它对所引入的低聚肽的酶促活性的敏感性的证明
含有具有不同活性的MMP底物的水凝胶的降解动力学(溶胀，即重量变化)对应于蛋白酶底物肽的氨基酸序列(即酶活性)。因此，蛋白水解途径凝胶断裂的动力学能够由非常简单的方式(图3)来进行工程设计。
实施例7：hFF-血纤蛋白簇在合成PEG型水凝胶内的包埋和培养，以分析基质的三维细胞侵入
人包皮成纤维细胞(hFF)的近-铺满培养物(near-confluentcultures)接受胰蛋白酶化、离心处理和再悬浮于在无菌PBS中的来自人血浆的2％(m/v)血纤蛋白原(Fluka，Switzerland)中达到30000个细胞/μl的浓度。为了诱导hFF-血纤蛋白原悬浮液的凝胶化，凝血酶(Sigma T-6884，Switzerland)和Ca++被添加而分别达到2NIH单位/mL和2.5mM的最终浓度，并且快速地与该细胞悬浮液混合。在凝胶化之前，2μl滴的这一细胞-血纤蛋白原前体在37℃下在载玻片上凝胶化达到大约15分钟。通过在凝胶化之前将三到四个簇放置于前体溶液中，hFF-血纤蛋白簇被包埋在25μl PEG-型水凝胶内。包埋在PEG型水凝胶内的此类hFF-血纤蛋白簇在12孔组织培养板中用含血清的DMEM培养多达30天。从该簇中进入合成凝胶底物中的细胞侵入是以它们的在焦点上的中心面来成像和记录。为了定量长出的穿透深度，最初的hFF-血纤蛋白簇的面积是在中心面中测量的，这是hFF长出的面积，由在焦点的中心平面中hFF分支的尖头(tips)所界定。这两个面积近似为圆形面积，并且它们的理论半径彼此减去而得到平均hFF长出(outgrowth)长度。
细胞从簇中长出的事实暗示了Michael型加成到共轭的不饱和基团上的反应是自选择性的，即丙烯酸酯或乙烯基砜与硫醇反应比与在细胞表面上存在的胺反应更快得多。因此，此类材料能够在临床上例如通过就地凝胶化来填充组织缺陷。
实施例8：利用所引入蛋白酶底物的酶活性，改变细胞进入MMP敏感性水凝胶中的侵入速率
具有各种MMP活性的MMP敏感性水凝胶的制备
水凝胶制备如下，在骨架中有三种不同的MMP-活性低聚肽底物：首先，在0.1mM的浓度下粘合肽Ac-GCGYGRGDSPG-NH2以侧挂方式连接于4分支-PEG-乙烯基砜(分子量15000)，这通过PEG前体(TEOA缓冲剂(0.3M，pH8.0))与也溶于相同缓冲剂中的粘合肽混合来实现。反应在37℃下进行30分钟。
然后，具有不同活性的MMP敏感性肽(例如Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)与仍然具有Michael型反应性的以上溶液混合，然后根据在实施例7中所述的方法在细胞-血纤蛋白簇周围形成了凝胶。各样品也平行地固化并测量溶胀以确保在细胞迁移上的差异能够清楚地归因于酶活性的变化(和不是在网络结构中的差异，即X-连接点密度)。
在网络的给定粘合性和结构下的细胞侵入速率能够利用所引入的肽底物的MMP活性来合理地调节。
正如从实施例6中所述的生物化学测量所预期的那样，细胞在含有MMP-底物的水凝胶中的侵入对应于后者的酶活性(图4)。因此，蛋白水解途径凝胶断裂的动力学能够由非常简单的方式来进行工程设计。能够由Michael型加成形成水凝胶的-种合成底物可以鉴别(GCRDGPQGIWGQDRCG)，它比从天然胶原型I(1α)链中见到的序列所衍生的肽(GCRDGPQGIAGQDRCG)更快速地降解。而且，对细胞分泌MMP不敏感的肽进行鉴别。
实施例9：通过粘合点密度改变细胞侵入MMP敏感性水凝胶中的速率
具有各种粘合点密度的MMP敏感性水凝胶的制备
水凝胶制备如下，有不同密度的粘合肽Ac-GCGYGRGDSPG-NH2：首先，在各种浓度下粘合肽以侧挂方式连接于4分支-PEG-乙烯基砜(分子量20000)上，这通过PEG前体(TEOA缓冲剂(0.3M，pH8.0))与也溶于相同缓冲剂中的粘合肽混合来实现。反应在37℃下进行30分钟。然后，MMP敏感性肽Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2与仍然具有Michael型反应性的以上溶液混合，然后根据在实施例7中所述的方法在细胞-血纤蛋白簇周围形成了凝胶。各样品也平行地固化并测量溶胀以确保粘合点密度在溶胀之后的全部凝胶中是恒定的和因此在细胞迁移上的差异清楚地归因于网络结构的变化。
在给定的MMP敏感性和网络结构下的细胞侵入速率能够通过网络的粘合性来合理地调节
三维细胞侵入是通过所引入的RGD位点的密度来调节(图5)。HFF侵入速率以双相方式取决于粘合配位体的浓度。
发现了浓度范围，它显示处比低于或高于该特殊浓度时高得多的迁移速率。因此，蛋白水解途径凝胶断裂的动力学也能够由粘合点密度来进行工程设计。
实施例10：由所使用的大单体的分子量(结构和分支的数量)改变细胞进入到MMP敏感性水凝胶中的浸润速率
具有各种网络结构的MMP敏感性水凝胶的制备
水凝胶制备如下，用各种PEG-VS大单体(4分支20kD，4分支15kD，4分支10kD，8分支20kD)：首先，通过将PEG前体(TEOA缓冲剂(0.3M，pH8.0)与也溶于相同缓冲剂中的粘合肽混合，粘合肽在0.1mM的给定浓度(关于溶胀网络)下以侧挂方式连接于大单体。反应在37℃下进行30分钟。然后，MMP敏感性肽Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2与仍然具有Michael型反应性的以上溶液混合，然后根据在实施例7中所述的方法在细胞-血纤蛋白簇周围形成了凝胶。各样品也平行地固化并测量溶胀以确保在细胞迁移上的差异能够清楚地归因于粘合性的变化(和不是在网络结构中的差异，即X-连接点密度，归因于具有侧挂粘合位点的各种接枝密度)。
在网络的给定粘合性和MMP敏感性下的细胞侵入速率能够利用所引入的肽底物的MMP活性来合理地调节。
细胞在合成凝胶中的侵入也通过网络结构来调节(图6)。在恒定RGD密度下和对于相同的MMP底物的HFF侵入速率会随着分子量提高而提高。发现阈值分子量(4分支PEG10kD)，低于它则细胞侵入会基本上停止。因此，蛋白水解途径凝胶断裂的动力学也能够由网络结构来进行工程设计。
实施例11：通过松开网络结构(例如通过缺陷的产生)来增加细胞浸润，和将细胞迁移从蛋白水解型转换成非蛋白水解型机理
允许非蛋白水解型细胞浸润的MMP-非敏感性和粘合性水凝胶的制备和含有大量缺陷(这里：悬挂端(dangling ends))的MMP-敏感性和粘合性凝胶的制备
非-MMP敏感性水凝胶制备如下：首先，几个已知的分数(fraction)的VS组的4分支PEG-VS 20kD大单体在37℃下与氨基酸半胱氨酸反应30分钟以在网络形成之前“消灭”乙烯基砜官能度，以便产生具有缺陷的网络(即不构成弹性活性链的侧挂链)。然后，通过将预先改性的PEG前体(TEOA缓冲剂(0.3M，pH8.0))与也溶于相同的缓冲剂中的粘合肽混合，粘合肽在0.1mM的给定浓度(对于溶胀网络)下以侧挂方式连接于4分支PEG-VS 20kD大单体上。反应在37℃下进行30分钟。然后，这一前体与PEG-二硫醇(分子量3.4kD)交联。各样品的溶胀也平行地进行以便控制：细胞迁移的差异能够清楚地归因于网络结构的变化(即松开网络的缺陷的产生)。
类似地，通过首先让PEG-VS大单体与氨基酸半胱氨酸反应以在网络形成之前“消灭”乙烯基砜官能团，来以大量的缺陷产生MMP敏感性水凝胶。利用粘合位点和交联的官能化是如前面所述来进行的。
非-蛋白水解型细胞侵入发生在具有非常稀松的X-连接的网络的水凝胶中以及细胞侵入能够通过松开MMP敏感性凝胶的网络来加速
网络能够以非-MMP敏感性分子来生产，该分子仍然允许三维细胞侵入发生(图7B)。然而，非常高度的缺陷，即非常稀松的X-连接的网络是需要的(G大于大约10)。细胞形态与在蛋白质水解方式可降解的底物中的细胞形态不同。细胞是非常薄和梭形的并且从簇中几乎完全直线和径向地向外迁移。因此，细胞浸润的机理能够从主要的蛋白水解型转换到非蛋白水解型。通过在交联之前用氨基酸Cys封闭VS-基团，能够产生具有非常稀松的X-连接的层次结构的MMP敏感性凝胶。此类底物的细胞侵入显著增加，与“完美”网络相比(7A)。事实上，细胞侵入速率几乎接近血纤蛋白的速率。
实施例12：4分支PEG-衣康酸酯20K的水凝胶
水凝胶是用被衣康酸酯官能化的4分支PEG(MW 20K)和双官能的硫醇来制备的，以具有半胱氨酸残基的肽形式，例如乙酰基-GCRDGPQGIWGQDRCG-CONH或作为硫醇-PEG-硫醇，例如线性，MW 3.4K。
4分支PEG-衣康酸酯的合成
4-氢-1-甲基衣康酸酯(AM 022/6)
将102.1g(0.65mol)的衣康酸二甲基酯和35.0g(0.18mol)的甲苯-4-磺酸一水合物溶于在装有回流冷凝器、温度计和磁力搅拌棒的1000ml圆底烧瓶内的50ml的水和250ml的甲酸中。
通过将烧瓶浸入120℃的油浴中使溶液轻度回流，并搅拌45分钟。然后，通过在搅拌的同时将浅黄色、透明的反应混合物倾倒在300g的冰中，该反应被骤冷。所获得的透明水溶液被转移到分液漏斗中，和产物通过用200ml二氯甲烷洗涤三次来萃取。合并的有机层在MgSO4上干燥，和溶剂通过旋转蒸发被除去，得到64.5g的粗制产物。水层再一次用200ml的二氯甲烷萃取，得到另外6.4g的粗制产物。典型的酸性气味表明了一些甲酸在这些级分中的存在，它可通过将合并的级分溶于150ml二氯甲烷中和用50ml饱和NaCl水溶液洗涤两次而被除去。用MgSO4干燥有机层和蒸发溶剂可得到60.1g的透明和无色油，它在减压下蒸馏，得到55.3g的透明和无色油。根据1H NMR分析，该产品有91％的4-氢-1-甲基衣康酸酯，大约5％的1-氢-4-甲基衣康酸酯，和大约4％的衣康酸二甲酯。
凝胶形成
简短地说，这些前体溶液按照端基的化学当量平衡以1∶1进行混合。由于是硫醇反应到乙烯基砜和丙烯酸酯上所需要的，缓冲剂形式的三乙醇胺(TEOA)的存在是促进在硫醇和衣康酸酯之间的Michael反应所需要的。
PEG-衣康酸酯的凝胶形成速率取决于碱催化剂的量以及取决于体系的pH。表1给出了一直到10％PEG-衣康酸酯/PEG-硫醇水凝胶的凝胶化开始所经历的时间(分钟)与在室温下(～23℃)和37℃(温育箱/水浴*)下的TEOA缓冲剂pH和浓度的关系。凝胶化的开始被定义为当液体前体溶液粘附于用于探测样品的移液管尖头时的时刻。
表1
碱/缓冲剂  pH  凝胶化的开始，分钟
室温 0.15M TEOA  10.2  6
(23℃)  9.5  10
 9.1  17
 8.6  25
 8.4  ＞40
0.3M  9.0  8
 8.6  12.5
 8.4  30.5
37℃ 0.3M  ＞9.5  3.5
 9.0  ＜7.5/5
 8.6  11/9
 8.4  24/20
 8.2  45/n.a.
 7.9  48/n.a.
附注：样品在水浴中的凝胶化速率一般比在温育箱中更快，很可能归因于反应的更实际温度的更佳热传递。
衣康酸-硫醇反应生产出典型属于4分支20K PEG凝胶的水凝胶，它是通过其它官能化端基例如VS或Ac的反应所形成。在物理上，该凝胶是透明和软的，正如前面对于由其它官能化基团的反应所形成的PEG凝胶所述。另外，在盐水中37℃下温育24小时之后，10％和20％凝胶显著地溶胀。
细胞培养
PEG-衣康酸酯/肽水凝胶也在所添加的RGD肽存在下接受活体外细胞培养。
实施例13：骨再生
在大鼠头盖骨中的骨再生
动物通过诱导来麻醉和用Halothan/O2维持。外科手术区域用无菌外科的碘圈定(clipped)和准备好。从鼻骨到中矢状脊作线性切口。该软组织反射和骨膜从位点(枕骨，额骨，和顶骨)上切割下来。用在牙科手持件(dental handpiece)中的环钻形成8mm颅骨切开缺陷，小心地避免硬脑膜穿孔。外科区域用盐水冲洗以除去骨头碎片并将预形成的凝胶放置于该缺陷中。该软组织用皮肤缝线闭合。在手术之后，由丁丙诺啡的SQ注射(0.1mg/kg)提供止痛。在植入后的21-35天由CO2窒息来杀死大鼠。有5-mm邻接骨头的颅骨切开术位点从颅骨上回收并放置于40％乙醇中。在全部的步骤中，外科医生对于缺陷的医治都不知情。样品顺序地干燥：40％乙醇(2d)，70％乙醇(3d)，96％乙醇(3d)，和100％乙醇(3d)。干燥的样品在二甲苯(3d)中脱去脂肪。脱去脂肪的样品用甲基丙烯酸甲酯(MMA，Fluka64200)饱和(3d)，然后通过浸泡(3d)在含有过氧化二苯甲酰(20mg/ml，Fluka 38581)的MMA中于4℃固定。固定的样品在37℃下被包埋在MMA，过氧化二苯甲酰(30mg/ml)，和100μl/ml plastoid N或邻苯二甲酸二丁基酯(Merck)中。切面(5μm)用Toluidineblue0和Goldner Trichrome染色。组织学载物片被扫描并用Leica QWin软件进行数字图象处理。
在大鼠头盖骨缺陷中的骨愈合能够通过几种底物特性来调控
合成水凝胶用于诱导活体内的重新骨形成。组织学标本表明愈合响应主要取决于该水凝胶底物的组成。在5μg BMP-2/每种含有快速降解型底物的植入MMP敏感性肽的剂量下，Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG，和粘合水凝胶被细胞浸润(主要为成纤维细胞状细胞)和观察到膜内骨形成(图10，C)。在5星期之后，植入材料完全地被再吸收，和新骨覆盖缺陷区域。这里，观察到了缺陷的完全桥连。用MMP非敏感性PEG-(SH)2制得的对照材料(图10，A)显示没有细胞浸润和仅仅在完整的凝胶植入物周围的骨形成。较慢降解型低聚肽Ac-GCRDGPQGIAGQDRCG导致显著低得多的细胞浸润(图10，B)。因此，活体内愈合响应取决于所引入底物的酶促活性。
具有不同结构的凝胶进行试验，其中包括用4分支PEG-VS 15kD制得的MMP敏感性可降解的凝胶，用4分支PEG-VS-20kD 20K制得的MMP敏感性凝胶，和用PEG-二硫醇3.4kD和4分支PEG-丙烯酸酯制得的水解方式可降解的凝胶。在各动物中我们看到了在这一早期终点中缺陷的完全桥连但有不同的形态差异。缓慢降解型凝胶显示较少细胞浸润和更多剩余底物，而最快速降解型凝胶显示了与最初骨头有类似形态的新形成的骨头。
在8-mm绵羊钻开缺陷模型中的骨愈合
8mm钻开缺陷是在绵羊的胫骨和股骨中产生，和各种合成底物在20μg/ml的rhBMP-2存在下就地聚合以试验这些底物诱导骨缺陷的愈合的能力。我们认为，对于伤口愈合底物来说重要的是具有强的细胞浸润特性，意味着细胞能够容易地进入和重新塑造该合成底物。正如前面早已描述的，我们已经在活体外和其它活体内模型中揭示，底物的细节，引入降解位点，底物的组成和作为例子的底物的密度，对于功能性细胞浸润是重要的。在以上给出的开发过程，我们开发出了一系列具有不同的细胞浸润特性的材料。在这一广泛系列中，五种材料在绵羊中进行试验，显现了一定范围的细胞迁移性能。这些材料用SRT1-5标记，其中SRT1具有最低的细胞浸润特性。浸润的量然后通过该系列来增加，导致SRT5，它允许在底物中的最大量的细胞浸润。该动物然后被允许愈合8星期和随后被杀死，缺陷区域被切除以便利用微型计算机化外形结构(μCT)和组织学分析方法来分析。
在8-mm绵羊钻开缺陷模型中的骨愈合能够通过几种底物特性来调控
被试验的五种材料探索在组成上的两种不同的变化。SRT1是引入到骨架中的有血纤蛋白溶酶降解位点的水凝胶，而SRT2是具有相同结构但在骨架中有胶原酶降解位点的水凝胶。
通过混合一种肽-各酶能够分裂它，它被两个硫醇封端-(半胱氨酸)，然后用RGD改性4分支15K peg乙烯基砜交联，来制备这些凝胶。能够看出，通过改变能够降解凝胶的酶的特异性，观察到不同的愈合响应，其中胶原酶可降解的序列表现更好。另外，同样探明了结构方面的效果。SRT2，SRT3和SRT4代表了具有下降交联密度的凝胶，和能够看出，随着交联密度下降，愈合速率提高。SRT3是从三硫醇肽和线性peg乙烯基砜形成，而SRT4与SRT2相同，只是它具有4分支20K peg而不是4分支15K peg，导致降低的交联密度。这显然有一个限制，因为最低的交联密度是获得凝胶化所需要的。最后，SRT5是从4分支15K Peg丙烯酸酯和3.4K peg二硫醇制造的水解方式可降解的基质。这些凝胶具有最快速的降解时间和因此具有最高的愈合速率。
在分析这些结果时，不可缺少的是考虑植入物的位置。这些植入物被放置在松质骨内和照这样，骨的全部体积没有被钙化组织充满。当正常松质骨由μCT分析时，该骨头体积分数是大约20％。当μCT用于试验在该分析中所测试的各种合成材料的结果时，在最初的缺陷中发现了新形成的钙化骨。在一些实例中，骨的量对于所使用的剂量是相当大的，同样导致大约20％钙化体积。对于所使用的凝胶的细胞浸润特性，在愈合响应中也有明显的趋势。对于细胞浸润表现有限的能力的凝胶显示出最低的愈合响应，其中新形成的钙化组织仅仅在缺陷的边缘处出现和在中心根本没有钙化组织。相反，具有较快速细胞浸润性能的材料显示出高得多的愈合响应，其中在所观察到的更快速细胞浸润和更好骨愈合之间有直接关系。
这些结果进一步通过显微解剖学来证实。当该组织切片被分析时，观察到在“SRT1”的中心的非骨空隙实际上代表了根本来降解的凝胶。在该系列的各样品中，观察凝胶，然而具有较快速细胞浸润性能的材料显示了在缺陷的中心内较少剩余凝胶和更多骨和前体骨。这清楚地说明，由外围细胞浸润进入底物中和后续的骨和骨基质的转化和形成来形成了骨头。在一些实例中，当细胞浸润进入底物中的速率是缓慢的时，有可能阻断和抑制再生。然而，当使用具有快速细胞浸润性能的底物时，骨头愈合的量显著地增加，导致优异的愈合响应。
第一前体分子的起始浓度在绵羊钻孔模型中的愈合响应中的影响
使用两种不同的起始浓度的酶催可降解性凝胶。在这些的每一种中，RGD和活性因子(Cp1PTH，在100μg/mL)的浓度保持不变。聚合物网络是从用20kD分子量的四个乙烯基砜端基官能化的四分支支化PEG(每一分支的分子量5kD)和下列序列Gly-Cys-Arg-Asp-(Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln)-Asp-Arg-Cys-Gly的二硫醇肽形成的。两前体组分溶于0.3M三乙醇胺中。官能化PEG(第一种前体分子)和二硫醇肽(第二种前体分子)的起始浓度是不同的。在一种情况下，浓度是组合物的总重量(第一和第二种前体组分+三乙醇胺)的12.6wt％。该12.6wt％对应于10wt％溶液，当以仅仅第一种前体组分(100mg/mL第一种前体分子)为基础计算时。第二种起始浓度是组合物的总重量(第一和第二种前体组分+三乙醇胺)的9.5wt％，这对应于总重量的以仅仅第一种前体分子(75mg/mL第一种前体分子)为基础的7.5wt％。这具有以下结果，二硫醇肽的量加以改变，使得在乙烯基砜和硫醇之间的摩尔比率得到维持。
从12.6wt％的起始浓度开始的凝胶溶胀到聚合物网络+水的总重量的8.9wt％的浓度，因此该底物具有91.1的水含量。从9.5wt％的起始浓度开始的凝胶溶胀到聚合物网络+水的总重量的7.4wt％的最终浓度，因此具有92.6的水含量。
为了探索这一变化的效果，这些材料在绵羊钻孔缺陷中进行试验。这里，将750μl缺陷位于绵羊股骨和肱骨的骨干的松质骨中并填充就地凝胶化型酶催凝胶。获得如下数量的钙化组织，由μCT测定，其中各组在N＝2：
凝胶的起始浓度    钙化组织
12.6％            2.7％
9.5％             38.4％
为了使凝胶不太致密和更容易让细胞穿透，由活性因子的添加所引起的愈合响应是更强的。具有低于8.5wt％的最终固体浓度的效果可以从这些结果中清楚地看出。
显然，底物的设计对于使创伤缺陷中的愈合是重要的。这些水凝胶的每一种是由聚乙二醇的主链构成，末端连接而产生基质。然而，它们如何连接(经由酶催降解位点)的细节，接头的密度和几个其它变量对于功能性的愈合响应是重要的。这些差异在绵羊钻孔缺陷模型中完全清楚地观察到。

Claims (38)

1.适合于形成聚合物网络的部分的试剂盒，它包括按预定比例的至少第一种和第二种前体分子和碱溶液，其中第一种前体分于是包括在分子量上基本上类似的至少三个分支的至少三官能支化分子，第二种前体分子是至少双官能分子，其中所述官能团中的至少一种选自由丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯构成的组，并且其中前体溶液按照端基的化学当量平衡以1∶1进行混合。
2.根据权利要求1的部分的试剂盒，其中官能团位于第一种和第二种前体分子的末端。
3.根据权利要求1的部分的试剂盒，其中第一种前体分子是在各分支的末端含有官能团和具有15kD的分子量的三分支聚合物以及第二种前体分子是双官能线性分子，其中第二种前体分子的分子量是在0.5-1.5kD之间。
4.根据权利要求1的部分的试剂盒，其中第一种前体分子是在各分支的末端含有官能团和具有20kD的分子量的四分支聚合物以及第二种前体分子是双官能线性分子，其中第二种前体分子的分子量是在1-3kD之间。
5.根据权利要求4的部分的试剂盒，其中第二种前体分子的分子量是在1.5-2kD之间。
6.根据权利要求1-4中任何一项的部分的试剂盒，其中第一种前体分子的官能团是亲电子基团和第二种前体分子的官能团是亲核基团。
7.根据权利要求1-4中任何一项的部分的试剂盒，其中第一种前体分子的官能团是亲核基团和第二种前体分子的官能团是亲电子基团。
8.根据权利要求6的部分的试剂盒，其中亲核基团选自氨基-，硫醇基-和羟基。
9.根据权利要求7的部分的试剂盒，其中亲核基团选自氨基-，硫醇基-和羟基。
10.根据权利要求1-4中任何一项的部分的试剂盒，它适合于由自由基反应形成聚合物网络，其中第一种和第二种前体分子的官能团包括不饱和键。
11.根据权利要求10的部分的试剂盒，其中所述的不饱和键为共轭不饱和键。
12.根据权利要求1-4中任何一项的部分的试剂盒，其中第一种和第二前体分子是选自蛋白质，肽，聚氧化烯，聚(乙烯醇)，聚(乙烯-共聚-乙烯基醇)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共聚-丙烯酸)，聚(乙基_唑啉)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯-共聚-乙烯基吡咯烷酮)，聚(马来酸)，聚(乙烯-共聚-马来酸)，聚(丙烯酰胺)，或聚(环氧乙烷)-共聚-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物。
13.根据权利要求1-4中任何一项的部分的试剂盒，其中第一种前体分子是包含乙烯基砜或丙烯酸酯基团作为官能团的聚乙二醇和第二种前体分子是包含硫醇或胺基团作为官能团的聚乙二醇。
14.根据权利要求1-4中任何一项的部分的试剂盒，其中第一种前体分子是包含乙烯基砜基团的聚乙二醇和第二种前体分子是包含硫醇基团的肽，其中肽是金属蛋白酶的底物。
15.根据权利要求1-4中任何一项的部分的试剂盒，进一步包含以共价键连接于生物材料上的细胞粘合肽。
16.根据权利要求15的部分的试剂盒，其中细胞粘合肽是选自粘连蛋白的RGD序列，和层粘连蛋白的YIGSR序列。
17.根据权利要求1-4中任何一项的部分的试剂盒，进一步包括生长因子类或生长因子样肽。
18.根据权利要求17的部分的试剂盒，其中生长因子类或生长因子样肽是选自TGFβ，BMP，IGF，PDGF，人生长释放因子和PTH。
19.适合于形成聚合物网络的组合物，该组合物包括按预定比例的至少第一种和第二种前体分子和碱溶液，其中第一种前体分子是包括在分子量上基本上类似的至少三个分支的至少三官能支化分子，其中第二种前体分子是至少双官能分子，其中所述官能团中的至少一种选自由丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯构成的组，并且其中前体溶液按照端基的化学当量平衡以1∶1进行混合。
20.根据权利要求19的组合物，其中官能团位于第一种和第二种前体分子的末端。
21.根据权利要求19的组合物，其中第一种前体分子是在各分支的末端含有官能团和具有15kD的分子量的三分支聚合物以及第二种前体分子是双官能线性分子，其中第二种前体分子的分子量是在0.5-1.5kD之间。
22.根据权利要求19的组合物，其中第一种前体分子是在各分支的末端含有官能团和具有20kD的分于量的四分支聚合物以及第二种前体分子是双官能线性分子，其中第二种前体分子的分子量是在1-3kD之间。
23.根据权利要求22的组合物，其中第二种前体分子的分子量是在1.5-2kD之间。
24.根据权利要求19-23中任何一项的组合物，其中第一种前体分子的官能团是亲电子基团和第二种前体分子的官能团是亲核基团。
25.根据权利要19-23中任何一项的组合物，其中第一种前体分子的官能团是亲核基团和第二种前体分子的官能团是亲电子基团。
26.根据权利要求24的组合物，其中亲核基团选自氨基-，硫醇-和羟基。
27.根据权利要求25的组合物，其中亲核基团选自氨基-，硫醇-和羟基。
28.根据权利要求19-23中任何一项的组合物，它适合于由自由基反应形成聚合物网络，其中第一种和第二种前体分子的官能团包括不饱和键。
29.根据权利要求28的组合物，其中所述不饱和键为共轭不饱和键。
30.根据权利要求19-23中任何一项的组合物，其中第一种和第二前体分子是选自蛋白质，肽，聚氧化烯，聚(乙烯醇)，聚(乙烯-共聚-乙烯基醇)，聚(丙烯酸)，聚(乙烯-共聚-丙烯酸)，聚(乙基_唑啉)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯-共聚-乙烯基吡咯烷酮)，聚(马来酸)，聚(乙烯-共聚-马来酸)，聚(丙烯酰胺)，或聚(环氧乙烷)-共聚-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物。
31.根据权利要求19-23中任何一项的组合物，其中第一种前体分子是包含乙烯基砜或丙烯酸酯基团作为官能团的聚乙二醇和第二种前体分子是包含硫醇或胺基团作为官能团的聚乙二醇。
32.根据权利要求19-23中任何一项的组合物，进一步包含以共价键连接于生物材料上的细胞粘合肽。
33.根据权利要求32的组合物，其中细胞粘合肽是选自粘连蛋白的RGD序列，和层粘连蛋白的YIGSR序列。
34.根据权利要求19-23中任何一项的组合物，进一步包括生长因子类或生长因子样肽。
35.根据权利要求34的组合物，其中生长因子类或生长因子样肽是选自TGFβ，BMP，IGF，PDGF，人生长释放因子和PTH。
36.可由权利要求19-23中任何一项的组合物形成的生物材料。
37.根据权利要求19-23中任何一项的组合物在制造用于创伤愈合的药物中的用途。
38.根据权利要求37的用途，其中所述药物用于骨的愈合。
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