DE202008005131U1

DE202008005131U1 - Synthetische Matrix für das gesteuerte Einwachsen von Zellen und Geweberegeneration

Info

Publication number: DE202008005131U1
Application number: DE200820005131
Authority: DE
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ; Universitaet Zuerich
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ; Universitaet Zuerich
Priority date: 2008-04-14
Filing date: 2008-04-14
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2018-04-15

Abstract

Biomaterial umfassend ein dreidimensionales polymeres Netzwerk erhalten durch die Reaktion einer Zusammensetzung von mindestens einem ersten Vorläufermolekül mit einer oder mehreren nukleophilen Gruppen und einem zweiten Vorläufermolekül mit einer oder mehreren elektrophilen Gruppen und einer basischen Lösung, wobei
das erste Vorläufermolekül ein lineares Polyethylenglycol-Dithiol ist,
das zweite Vorläufermolekül ein Pentaerythritol-Polyethylenglycol-Ether-Tetra-Acrylat ist
und wobei die Summe der Gewichte des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls im Bereich von 8% bis 16% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung liegt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polymermatrizen, insbesondere synthetische Polymermatrizen für Wundheilungsanwendungen und Geweberegeneration.
Die Verwendung von Biomaterialien als dreidimensionale Gerüste oder Matrizen (mit angehängtem oder ohne bioaktiven Faktor) für Wundheilungsanwendungen und Geweberegeneration ist in der Literatur beschrieben worden. Für die Anwendung im Körper ist die in situ Bildung der Matrix an einer bestimmten Stelle des Körpers oft zu bevorzugen gegenüber der Implantation von vorgefertigten Biomaterialien, die invasive Chirurgie bedingen, die schwierig zu sterilisieren sind und oft nicht genau zur Form des Defekts passen. Zudem limitiert das Erfordernis der Biokompatibilität die Wahl der Chemie sowohl in Bezug auf die Natur der Vorläufermoleküle als auch in Bezug auf die Chemie der Vernetzung, die zur in situ Bildung der Matrix verwendet wird.
Verschiedene Vorläufermoleküle, die in der Lage sind an einer gewünschten Stelle des Körpers Matrizen zu bilden, sind beschrieben worden. Natürlich vorkommende Materialien, synthetische Materialien, semi-synthetische Materialien und Kombinationen davon sind verwendet worden. Matrizen basierend auf natürlich vorkommenden oder chemisch modifizierten natürlich vorkommenden Proteinen, wie z. B. Collagen, denaturiertes Collagen (Gelatine) und insbesondere Fibrin, sind mit einigem Erfolg verwendet worden. Andere Beispiele schliessen Kohlenhydrate wie Cellulose, Alginate und Hyaluronsäure ein.
Natürlich vorkommende Materialien leiden jedoch an einer ganzen Reihe von Nachteilen, wie z. B. Immunogenizität, kostspieligen Herstellungsverfahren, begrenzter Erhältlichkeit, „Batch"-Variabilität und der Schwierigkeit, die Materialien zu reinigen. Diese Nachteile können die Verwendung von Matrizen, die aus natürlich vorkommenden Vorläufern gebildet werden, beschränken. In einem Versuch, die mit natürlich vorkommenden Materialien verknüpften – Probleme zu überwinden, wurden Matrizen basierend auf synthetischen Vorläufermolekülen zur Geweberegeneration im und/oder am Körper entwickelt. Die Vernetzungsreaktionen, die zur Bildung der synthetischen Matrizen im Körper verwendet wurden, schliessen ein, (i) Radikal-Polymerisation zwischen zwei oder mehr Doppelbindungen enthaltenden Vorläufern, wie in Hubbell et al., J. Biomed. Mater. Res. 39: 266–276, 1998 beschrieben, (ii) nukleophile Substitutionsreaktionen, z. B. zwischen einem Vorläufer, der eine nukleophile Gruppe wie eine Aminogruppe enthält, und einem Vorläufer, der eine elektrophile Gruppe wie eine Succinimidyl-Gruppe wie im U.S. Patent Nr. 5,874,500 von Rhee et al. offenbart, (iii) Kondensations- und Additionsreaktionen und (iv) Additionsreaktionen vom Michael-Typ zwischen einem starken Nukleophil (z. B. Thiol- oder Aminogruppen) und einem starken Elektrophil (z. B. konjugierten ungesättigten Gruppen, wie z. B. Acrylat- oder Vinylsulfon-Gruppen). Additionsreaktionen vom Michael-Typ sind in WO00/44808 beschrieben, dessen Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Additionsreaktionen vom Michael-Typ erlauben unter physiologischen Bedingungen die in situ Vernetzung von mindestens einem ersten und einem zweiten Vorläufermolekül in einer selbst-selektiven Art und Weise. Daher reagieren die Vorläufermoleküle sogar in der Anwesenheit von reaktiven biologischen Materialien unter Bildung der Matrix viel schneller miteinander, als sie mit anderen Molekülen in der biologischen Umgebung reagieren. Wenn eines der Vorläufermoleküle eine Funktionalität von mindestens zwei und mindestens eines der Vorläufermoleküle eine Funktionalität von mehr als zwei hat, wird das System selbst-selektiv unter Bildung eines vernetzten dreidimensionalen Biomaterials reagieren. Obschon in den vergangenen Jahren Fortschritte in der Verbesserung der Wundheilungseigenschaften von synthetischen Matrizen gemacht wurden, stimmen ihre Eigenschaften mit Matrizen, die aus natürlich vorkommenden Vorläufermolekülen oder Polymeren hergestellt wurden, immer noch nicht überein. Es besteht ein Bedürfnis nach synthetischen Matrizen, die Eigenschaften entsprechend jenen von Matrizen hergestellt aus natürlich vorkommenden Materialien haben.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, Matrizen, insbesondere synthetische Matrizen, zur Verfügung zu stellen, die Eigenschaften entsprechend Matrizen hergestellt aus natürlich vorkommenden Materialien haben, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, die Heilungskapazität von synthetischen Matrizen, insbesondere die Heilung von Defekten in Knochen, zu verbessern.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, synthetische Matrizen zur Verfügung zu stellen, welche die Heilung von Gewebe erleichtern, das nicht einer natürlichen Heilungsreaktion unterliegt.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, die Matrix-Morpholgie hinsichtlich einer Optimierung der Heilungsreaktion, insbesondere hinsichtlich Zell-Infiltration, Gelbildung und Abbauzeit zu verbessern.
Zusammenfassung der Erfindung
Verfahren zur Herstellung von Biomaterialien zur Verwendung als Wundheilungsmaterialien und/oder Geweberegenerations-Gerüsten, Bausätze, welche die Vorläufermoleküle zur Herstellung der Biomaterialien enthalten, und die daraus hervorgehenden Biomaterialien werden hierin beschrieben. Die Biomaterialien werden aus mindestens einem ersten und einem zweiten Vorläufermolekül gebildet. Das erste Vorläufermolekül enthält mindestens zwei nukleophile Gruppen und das zweite Vorläufermolekül enthält mindestens zwei elektrophile Gruppen. Die nukleophilen und elektrophilen Gruppen der ersten und zweiten Vorläufermoleküle bilden unter physiologischen Bedingungen miteinander kovalente Bindungen aus. Die Vorläufermoleküle werden aufgrund der gewünschten Eigenschaften des Biomaterials ausgewählt. Die Summe der Gewichte der ersten und zweiten Vorläufermoleküle ist im Bereich von 8 bis 16 Gewichtsprozent der Zusammensetzung, bevorzugt von etwa 10 bis etwa 15%, bevorzugter von etwa 12 bis etwa 14% des Gewichts der Zusammensetzung. Das Verhältnis der funktionellen Gruppen der elektrophilen Gruppen (zweites Vorläufermolekül) und der nukleophilen Gruppen (erstes Vorläufermolekül) ist im Bereich von 0.7 bis 1.1, bevorzugt zwischen 0.9 und 1.1, bevorzugter 1.0 (z. B. stöchiometrisches Verhältnis). Das erste und/oder zweite Vorläufermolekül kann kovalent an eines oder mehrere Moleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelladhäsionspeptiden, Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktor-ähnlichen Peptiden gebunden sein.
Die Konzentration der Vorläufermoleküle in der Zusammensetzung wird so gewählt, dass die Gelbildungs-Geschwindigkeit (d. h., die Zeit bis zum Erreichen des Gelpunkts) und die Abbaugeschwindigkeit der Matrix sowie die Schwellbarkeit und die Festigkeit der Matrix optimiert sind. Vorzugsweise werden das Molekulargewicht des ersten Vorläufermoleküls, das Molekulargewicht des zweiten Vorläufermoleküls und die Funktionalität der Verzweigungspunkte so gewählt, dass der Wassergehalt des polymeren Netzwerks zwischen 80 und 98 Gewichtsprozent, bevorzugt zwischen 85 und 96 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt zwischen 87 und 95 Gewichtsprozent des Gesamtgewichtes des polymeren Netzwerks nach Beendigung der Wasseraufnahme im Körper ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wassergehalt in seinem Gleichgewichts-Gewicht nach Beendigung der Wasseraufnahme im Körper. Die Beendigung der Wasseraufnahme kann entweder durch das Erreichen der Gleichgewichtskonzentration oder dadurch, dass der zur Verfügung stehende Raum keine weitere Volumenzunahme erlaubt, erreicht werden.
Die Vorläufermoleküle können einzeln als trockene Pulver und/oder in gepufferten Lösungen, typischerweise mit einem sauren pH, aufbewahrt werden. Die Vorläufermoleküle können vor Gebrauch für Minuten oder Stunden in Kontakt sein. In einer Ausführungsform wird eine Mischung aus dem ersten Vorläufermolekül und dem zweiten Vorläufermolekül zusammen mit einem Aktivator, einer Pufferlösung mit einem basischen pH, gesprayt, um das Biomaterial mit einem dreidimensionalen Netzwerk in situ an der benötigten Stelle im Körper zu bilden. Alternativ können die zwei Vorläufermoleküle durch Spritze-zu-Spritze-Mischung gemischt werden. Die gemischten Vorläufermoleküle (zusammen mit allfälligen Additiven und biologisch aktiven Wirkstoffen) werden dann in eine Mischvorrichtung transferiert, die den Aktivator, die basische Pufferlösung, in einem getrennten Kompartiment enthält, gemischt und an der Stelle eingesetzt. Für Zusammensetzungen mit langsameren Gelbildungszeiten können die Vorläufermoleküle und der Aktivator ex vivo gemischt und an der Stelle, wo sie verabreicht werden sollen, eingesetzt werden, bevor erhebliche Vernetzung stattgefunden hat.
Die Biomaterialien können zum induzieren von gesteuertem Einwachsen von Zellen und von Geweberegeneration in einer Reihe von Geweben, z. B. Knochen, verwendet werden. Die Biomaterialien können auch in Wundheilungsanwendungen verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Graph, der das Elastizitätsmodul von Hydrogelen aus PEG-Molekülen mit unterschiedlicher Struktur (d. h. Molekulargewicht und Anzahl der Arme) und einem MMP-sensitiven Dithiol-Peptid zeigt.
2 zeigt Quellungsmessungen von Hydrogelen aus PEG-Molekülen mit unterschiedlicher Struktur (d. h. Molekulargewicht und Anzahl der Arme) und einem MMP-sensitiven Dithiol-Peptid.
3 ist ein Graph, der die Quellung (in % vom Anfangswert) gegen die Inkubationszeit von PEG-Matrizen mit darin enthaltenen Oligopeptiden mit unterschiedlichen Substrat-Aktivitäten zeigt.
4 ist ein Graph, der die radiale Invasion (in μm) als Funktion der Inkubationszeit für Matrizen mit unterschiedlichem Grad an MMP-Aktivität zeigt.
5 ist ein Graph, der die radiale Invasionsgeschwindigkeit (μm/Stunde) als Funktion der RGD-Dichte (μM) zeigt.
6 ist ein Graph, der die radiale Invasion (μm) gegen die Inkubationszeit von MMP-sensitiven Hydrogelen, die Vorläufermoleküle mit unterschiedlichem Molekulargewicht enthalten, zeigt.
7A ist ein Graph, der die zelluläre Invasion (in mm) als Funktion der Inkubationszeit in Hydrogelen zeigt, die MMP-sensitiv und sehr locker vernetzt sind (d. h. die eine grosse Menge von Defekten aufweisen). 7B ist ein Graph, der die radiale Invasion (als Prozentsatz der radialen Invasion von Fibrin) von nicht-abbaubaren Materialien zeigt.
8 zeigt die Heilungsresultate nach 8 Wochen in 8 mm Schaf-Bohr-Defekten („sheep drill defect"). Spezifisch zeigt 8 den Prozentanteil des Defekts, der mit kalzifiziertem Gewebe gefüllt ist, für Materialien mit verschiedenen Vernetzungsdichten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
„Biomaterial" oder „pharmazeutische Zusammensetzung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Material, welches dazu bestimmt ist, sich mit biologischen Systemen zu verbinden, um ein beliebiges Gewebe, Organ oder eine Funktion des Körpers zu behandeln, evaluieren, vermehren oder zu ersetzen, abhängig vom Material entweder permanent oder vorübergehend. „Biomaterial", „Matrix, „Hydrogel" oder „Gerüst" werden synonym verwendet und bezeichnen ein vernetztes polymeres Netzwerk, das in Wasser quellt, sich aber nicht löst, z. B. ein Hydrogel, das im Körper eine gewisse Zeit verbleibt und bestimmte unterstützende Funktionen für traumatisiertes, defektes oder verletztes Weich- oder Hartgewebe erfüllt. Der Ausdruck „Zusammensetzung" bezeichnet die gesamte Zusammensetzung vor Erreichen des Gelbildungspunktes.
„Biokompatibilität" oder „biokompatibel", wie hierin verwendet, bezeichnet die Fähigkeit eines Materials, mit einer entsprechenden Wirts-Reaktion in einer spezifischen Anwendung zu funktionieren. Im breitesten Sinne bedeutet dies das Fehlen von nachteiligen Effekten auf den Körper in einer Art und Weise, welche die Vorteile des Materials und/oder der Behandlung des Patienten überwiegen könnten.
„Starkes Nukleophil", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Molekül, welches in der Lage ist, an ein Elektrophil in einer eine polare Bindung bildenden Reaktion ein Elektronenpaar abzugeben. Bevorzugt ist das starke Nukleophil nukleophiler als H₂O bei physiologischem pH. Beispiele für starke Nukleophile sind Thiole und Amine.
„Elektrophile Gruppe", wie hierin verwendet, soll ein Molekül bezeichnen, welches in der Lage ist, in einer eine polare Bindung bildenden Reaktion ein Elektronenpaar von einem Nukleophil zu akzeptieren. Die Ausdrücke Elektrophil und elektrophile Gruppe werden synonym verwendet.
„Konjugierte ungesättigte Bindung", wie hierin verwendet, bezeichnet alternierende Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Heteroatom- oder Heteroatom-Heteroatom- Mehrfach-Bindungen und Einfach-Bindungen oder die Bindung einer funktionellen Gruppe an ein Makromolekül, wie z. B. ein synthetisches Polymer oder ein Protein. Solche Bindungen können Additions-Reaktionen eingehen.
„Konjugierte ungesättigte Gruppe", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Molekül oder einen Bereich eines Moleküls, das oder der alternierende Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Heteroatom- oder Heteroatom-Heteroatom-Mehrfach-Bindungen und Einfach-Bindungen enthält, das oder der eine Mehrfach-Bindung enthält, die Additions-Reaktionen eingehen kann. Beispiele solcher konjugierter, ungesättigter Gruppen schliessen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Vinylsulfone, Acrylate, Acrylamide, Chinone und Vinylpyridinia, z. B. 2- oder 4-Vinylpyridinium und Itaconate.
„Synthetisches Vorläufermolekül" oder „synthetisches Polymer", wie hierin verwendet, bezeichnet Moleküle, die in der Natur nicht existieren.
„Natürlich vorkommendes Vorläufermolekül" oder „natürlich vorkommendes Polymer", wie hierin verwendet, bezeichnet Moleküle, die in der Natur aufgefunden werden können.
„Funktionalisieren", wie hierin verwendet, bezeichnet das Modifizieren in einer Art und Weise, die in der Anlagerung einer funktionellen Gruppe oder eines funktionellen Restes resultiert. Zum Beispiel kann ein Molekül durch die Einführung eines Moleküls, welche dieses Molekül zu einem starken Nukleophil oder Elektropil macht, funktionalisiert werden. Zum Beispiel wird ein Molekül, wie PEG, funktionalisiert, um daraus ein Thiol, Amin, Acrylat oder Chinone zu machen. Proteine können durch teilweise oder vollständige Reduktion von Disulfid-Bindungen zur Bildung freier Thiole wirksam funktionalisiert werden.
„Funktionalität", wie hierin verwendet, bezeichnet die Anzahl von reaktiven Stellen auf einem Vorläufermolekül.
„Funktionalität von Verzweigungspunkten", wie hierin verwendet, bezeichnet die Anzahl der Arme, die von einem Punkt im Molekül ausgehen.
„Adhäsionsstelle", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Peptid-Sequenz, an welche ein Molekül, z. B. ein adhäsionsfördernder Rezeptor auf der Oberfläche einer Zelle, bindet. Adhäsionsstellen schliessen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, die RGD-Sequenz von Fibronectin und die YIGSR (SEQ ID Nr. 1) von Laminin. Vorzugsweise sind Adhäsionsstellen im Biomaterial der vorliegenden Erfindung eingebaut.
„Wachstumsfaktorbindungsstelle", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Peptid-Sequenz, an welche ein Wachstumsfaktor oder ein Molekül/Moleküle, welches einen Wachstumsfaktor bindet/binden, bindet. Zum Beispiel kann die Wachstumsfaktorbindungsstelle eine Heparin-Bindungsstelle einschliessen. Diese Stelle wird Heparin binden, welches seinerseits heparin-bindende Wachstumsfaktoren bindet, z. B., bFGF, VEGF, BMP oder TGFβ.
„Protease-Bindungsstelle", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Peptid-Sequenz, die ein Substrat für ein Enzym ist.
„Biologisches Molekül", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Molekül, das in einer Zelle oder in einem Körper gefunden wird, oder welches als therapeutisches, prophylaktisches oder diagnostisches Agens für eine Zelle oder einen Körper verwendet werden kann, und welches mit anderen Molekülen in seiner Umgebung reagieren kann. Beispiele für biologische Moleküle schliessen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und Arzneimittel, wie z. B. synthetische, semi-synthetische oder natürlich vorkommende organische oder anorganische Moleküle.
"Regenerieren", wie hierin verwendet, bezeichnet die teilweise oder vollständige Neubildung von Gewebe. Gewebe, die regeneriert werden können, schliessen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein, Knochen, Nerven, Blutgefässe und Knorpelgewebe.
„Multifunktionell", wie hierin verwendet, bezeichnet mehr als eine elektrophile und/oder nukleophile funktionelle Gruppe pro Molekül (z. B. Monomer, Oligomer und Polymer).
„Selbst-selektive Reaktion", wie hierin verwendet, meint, dass das erste Vorläufermolekül der Zusammensetzung viel schneller mit dem zweiten Vorläufermolekül der Zusammensetzung und umgekehrt reagiert, als sie mit anderen Verbindungen reagieren, die in der Mischung und/oder an der Stelle der Reaktion vorhanden sind.
„Entsprechendes Gegenstück", wie hierin verwendet, bezeichnet den Reaktionspartner von einem Vorläufermolekül. Das entsprechende Gegenstück der elektrophilen Gruppe ist die nukleophile Gruppe und umgekehrt.
„Selbst-selektive Reaktion", wie im Allgemeinen hierin verwendet, meint, dass das erste Vorläufermolekül der pharmazeutischen Zusammensetzung viel schneller mit dem zweiten Vorläufermolekül der pharmazeutischen Zusammensetzung und umgekehrt reagiert, als sie mit anderen Verbindungen reagieren, die sowohl in der pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder an der Stelle der Reaktion vorhanden sind. Wie hierin verwendet, bindet die nukleophile Gruppe des ersten Vorläufermoleküls bevorzugter an die elektrophile Gruppe des zweiten Vorläufermoleküls als an andere biologische Verbindungen, und die elektrophile Gruppe des zweiten Vorläufermoleküls bindet bevorzugter an die nukleophile Gruppe des ersten Vorläufermoleküls als an andere biologische Verbindungen.
„Vernetzung", wie im Allgemeinen hierin verwendet, meint die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen einem Vorläufermolekül, das nukleophile Gruppen enthält, und einem Vorläufermolekül, das elektrophile Gruppen enthält, was in einer Zunahme des Molekulargewichtes des Materials resultiert. „Vernetzung" kann auch die Bildung von nichtkovalenten Bindungen, wie z. B. ionischen Bindungen, oder Kombinationen von kovalenten und nicht-kovalenten Bindungen bezeichnen.
„Polymeres Netzwerk", wie hierin verwendet, bezeichnet das Produkt eines Prozesses, in dem im Wesentlichen alle Monomere, Oligomere oder Polymere über ihre erhältlichen funktionellen Gruppen durch intermolekulare Bindungen ein Makromolekül bilden.
„Physiologisch", wie hierin verwendet, bezeichnet die Bedingungen, wie sie in lebenden Wirbeltieren gefunden werden. Insbesondere bezeichnen physiologische Bedingungen die Bedingungen im menschlichen Körper, wie z. B. Temperatur, pH, usw. „Physiologische Temperaturen", wie hierin verwendet, bezeichnen Temperaturen in einem Bereich von 35°C bis 42°C, bevorzugt etwa 37°C.
„Vernetzungsdichte", wie hierin verwendet, bezeichnet das durchschnittliche Molekulargewicht zwischen zwei Vernetzungen (M_c) der betreffenden Moleküle.
„Quellung", wie hierin verwendet, bezeichnet die Zunahme des Volumens und der Masse aufgrund der Wasseraufnahme durch das Biomaterial. Die Ausdrücke „Wasseraufnahme" und „Quellung" werden synonym verwendet.
„Gelpunkt" oder „Gelbildung", wie hierin verwendet, bezeichnet den Schnittpunkt des Viskositätsmoduls („viscous modulus") und des Komplexmoduls („complex modulus") und die Zunahme der Viskosität. Daher ist der Gelpunkt der Punkt, an dem eine Flüssigkeit anfängt, die semisoliden Charakteristika eines Gels anzunehmen.
„In situ Bildung", wie im Allgemeinen hierin verwendet, bezeichnet die Fähigkeit einer Mischung von Vorläufermolekülen, die vor und zum Zeitpunkt ihrer Injektion im Wesentlichen nicht vernetzt sind, bei physiologischer Temperatur und an der Stelle der Injektion im Körper miteinander kovalente Bindungen zu bilden.
„Gleichgewichtszustand", wie hierin verwendet, bezeichnet den Zustand, in dem ein Hydrogel keine Massezunahme oder Masseabnahme erfährt, wenn es unter konstanten Bedingungen in Wasser aufbewahrt wird.
„Gewichtsprozent der Vorläufermoleküle", wie hierin verwendet, bezeichnet die Summe des Gewichts des ersten Vorläufermoleküls und des zweiten Vorläufermoleküls in Prozent des Gewichts der ganzen Zusammensetzung (%(w/w)).
Die Zusammensetzung kann auch Lösungsmittel, Additive, Hilfsstoffe, etc. enthalten. Die Gewichtsprozente werden durch Zusammenzählen des Gewichts des ersten Vorläufermoleküls und zweiten Vorläufermoleküls, dividiert durch die Summe der Gewichte von allen Molekülen der Zusammensetzung und multiplizieren mit 100, berechnet. Alternativ können die Gewichtsprozente auch als Funktion des gesamten Volumens (%(w/v)) ausgedrückt werden. Gewichtsprozente pro Volumen werden durch Zusammenzählen des Gewichts des ersten Vorläufermoleküls und des zweiten Vorläufermoleküls, Dividieren der Summe durch das gesamte Volumen der Zusammensetzung und Multiplizieren mit 100 berechnet.
II. Zusammensetzungen
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Herstellung von in situ vernetzbaren Biomaterialien, die zum gesteuerten Einwachsen von Zellen und zur Geweberegeneration verwendet werden, sind hierin beschrieben. Die Zusammensetzung enthält optional Additive, Farbstoffe und/oder biologisch aktive Agentien. Das Biomaterial enthält ein dreidimensionales polymeres Netzwerk, das durch die Reaktion von mindestens einem ersten synthetischen Vorläufermolekül enthaltend n nukleophile Gruppen und einem zweiten Vorläufermolekül, enthaltend m elektrophile Gruppen, wobei die Summe von n + m mindestens fünf ist und wobei die Summe der Gewichte des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls im Bereich von etwa 8% bis 16% des Gewichts (Gewichtsprozent), bevorzugt von etwa 10 bis etwa 15% des Gewichts, besonders bevorzugt von etwa 12% bis etwa 14.5% des Gewichts der gesamten Zusammensetzung ist, sind hierin beschrieben.
A. Vorläufermoleküle
Das erste Vorläufermolekül enthält mindestens zwei nukleophile Gruppen, und das zweite Vorläufermolekül enthält mindestens zwei elektrophile Gruppen. Das erste und zweite Vorläufermolekül werden so ausgewählt, dass die nukleophilen und elektrophilen Gruppen unter physiologischen Bedingungen kovalente Bindungen miteinander bilden. Dies kann durch eine Reihe von verschiedenen Reaktionsmechanismen erreicht werden. Beispiele schliessen nukleophile Substitutionsreaktionen, Additionsreaktionen, Kondensationsreaktionen und freie Radikalpolymerisation ein. In einer Ausführungsform bilden die Vorläufermoleküle durch eine Michael-Addition zwischen den nukleophilen Resten eines Vorläufermoleküls und den konjugierten ungesättigten Resten des anderen Moleküls kovalente Bindungen. Die Michael-Additions-Reaktion beinhaltet die Reaktion eines Nukleophils, wie z. B. eines Thiols, Amins oder einer Hydroxylgruppe, mit einem konjugierten ungesättigten Rest, wie z. B. ein α-ungesättigtes Carbonyl enthaltenden Rest.
Die Vorläufermoleküle sind multifunktionelle Monomere, Oligomere und/oder Polymere. Die Vorläufermoleküle können synthetisch, semi-synthetisch, natürlich vorkommend oder Kombinationen davon sein. Bevorzugt ist das Molekulargewicht des ersten Vorläufermoleküls im Bereich zwischen 2 bis 12 kD, bevorzugt zwischen 3 bis 11 kD und besonders bevorzugt zwischen 5 bis 10 kD. Das bevorzugte Molekulargewicht des zweiten Vorläufermoleküls ist über jenem des ersten Vorläufermoleküls, und bevorzugt im Bereich zwischen 10 bis 25 kD, besonders bevorzugt zwischen 12 bis 20 kD und ganz besonders bevorzugt zwischen 14 bis 18 kD.
Beispiele von ersten und zweiten Vorläufermolekülen schliessen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein, Proteine, Peptide, Polyoxyalkylene, Poly(Vinylalkohol), Poly(Ethylen-co-Vinylalkohol), Poly(Acrylsäure), Poly(Ethylen-co-Acrylsäure), Poly(Ethyloxazolin), Poly(Vinylpyrrolidon), Poly(Ethylen-co-Vinylpyrrolidon), Poly(Maleinsäure), Poly(Ethylen-co-Maleinsäure), Poly(Acrylamid), oder Poly(Ethylenoxid)-co-Poly(Propylenoxid)-Blockcopolymere. In einer Ausführungsform sind das erste und das zweite Vorläufermolekül so modifiziert, dass sie nukleophile beziehungsweise elektrophile Gruppen enthalten.
Die Summe der Funktionalität des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls ist grösser oder gleich 5. In einer Ausführungsform hat das erste Vorläufermolekül eine Funktionalität von vier und das zweite Vorläufermolekül eine Funktionalität von drei. In einer weiteren Ausführungsform hat das erste Vorläufermolekül eine Funktionalität von 2 und das zweite Vorläufermolekül eine Funktionalität von vier. In noch einer weiteren Ausführungsform haben beide Vorläufermoleküle eine Funktionalität von vier oder mehr. Ein kleines und kompaktes Molekül wird ein polymeres Netzwerk mit grösserer Festigkeit bilden als ein längeres Molekül, obschon die Funktionalität, Molekulargewicht und Reaktionspartner für beide Moleküle gleich sein können. Als eine allgemeine Leitlinie wird das Verhältnis zwischen dem ersten und zweiten Vorläufermolekül so gewählt, dass die Mehrheit der funktionellen Gruppen von beiden Molekülen mit ihrem entsprechenden Gegenstück reagieren. Das Äquivalenzgewicht der elektrophilen Gruppen (zweites Vorläufermolekül) und der nukleophilen Gruppen (erstes Vorläufermolekül) ist im Bereich zwischen 0.7 und 1.1, bevorzugt zwischen 0.9 und 1.1 und besonders bevorzugt etwa 1.0 (d. h. stöchiometrisches Verhältnis).
a. Nukleophile Gruppen
Die nukleophilen Gruppen des ersten Vorläufermoleküls sind imstande, mit elektrophilen Gruppen zu reagieren, wie z. B. konjugierten ungesättigten Gruppen, nach einer ganzen Reihe von Reaktionsmechanismen, vorzugsweise in selbst-selektiv Weise im menschlichen Körper durch eine nukleophile Substitution oder eine Additions-Reaktion vom Michael-Typ. Die Nukleophile, die nützlich sind, sind jene, die gegenüber konjugierten ungesättigten Gruppen über Additionsreaktionen reaktiv sind, insbesondere über eine selbst-selektive Additions-Reaktion vom Michael-Typ unter Bedingungen menschlicher oder tierischer Körper. Die Reaktivität des Nukleophils hängt von der Identität der ungesättigten Gruppe ab. Die Identität der ungesättigten Gruppe ist als erstes durch ihre Reaktion mit Wasser bei physiologischem pH beschränkt. Daher sind nützliche Nukleophile generell nukleophiler als Wasser bei physiologischem pH. Bevorzugte Nukleophile werden üblicherweise in biologischen Systemen gefunden, aber werden aus Gründen der Toxikologie üblicherweise nicht frei ausserhalb von Zellen in biologischen System gefunden. Geeignete Nukleophile schliessen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein, -SH, -NH₂, -OH, -PH₂ und -CO-NH-HH₂.
In einer Ausführungsform sind die Nukleophile Amino- oder Thiolgruppen.
Die Nützlichkeit von spezifischen Nukleophilen hängt von der angestrebten Situation und der gewünschten Selbst-Selektivität ab. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleophil ein Thiol. Amine und/oder Hydroxylgruppen können jedoch auch wirksame Nukleophile sein. Thiole sind in biologischen Systemen ausserhalb von Zellen in gepaarter Form als Disulfid-Bindungen vorhanden. Wenn der höchste Grad an Selbst-Selektivität gewünscht ist (z. B. wenn die Gelbildung in Anwesenheit von Gewebe durchgeführt wird und die chemische Modifikation dieses Gewebes nicht gewünscht ist), dann verhält sich ein Thiol als starkes Nukleophil.
Es gibt jedoch andere Situationen, in denen der höchste Grad an Selbst-Selektivität nicht notwendig ist. In solchen Fällen können Amine und/oder Hydroxylgruppen als adäquate Nukleophile dienen. Hier ist dem pH besondere Aufmerksamkeit zu widmen, insofern als das deprotonierte Amin ein viel stärkeres Nukleophil ist als das protonierte Amin. So hat zum Beispiel das alpha Amin einer typischen Aminosäure (pK so tief wie 8.8 für Asparagin, mit einem durchschnittlichen pH von 9.0 für alle 20 üblichen Aminosäuren, mit Ausnahme von Prolin) einen wesentlich tieferen pK als das epsilon Amin der Seitenkette von Lysin (pK 10.80). Als solches kann, wenn dem pK des Amins, das als starkes Nukleophil verwendet wird, besondere Aufmerksamkeit gewidmet wird, eine beachtliche Selbst-Selektivität erhalten werden. Durch die Wahl eines Amins mit einem tiefen pK und dann der Formulierung des endgültigen Vorläufers, so dass der pH nahe dem pK ist, kann man die Reaktion der ungesättigten Gruppe mit dem eingesetzten Amin gegenüber anderen im System vorhandenen Aminen begünstigen. In Fällen, in denen keine Selbst-Selektivität gewünscht ist, ist der pK des als Nukleophil verwendeten Amins weniger wichtig. Um eine akzeptabel schnelle Reaktionsgeschwindigkeit zu erhalten, ist der pH so einzustellen, dass er gleich dem pH der endgültigen Vorläufer-Lösung ist, so dass eine adäquate Anzahl von diesen Aminen deprotoniert ist.
Polyethylenglycol und Derivate davon können gemäss den Verfahren, die z. B. in Kapitel 22 von POLY(ETHYLENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, ed., Plenum Press, NY (1992) ausgeführt sind, chemisch so modifiziert werden, dass sie mehrere primäre Amino- oder Thiolgruppen enthalten. Polyethylenglycole, die so modifiziert wurden, dass sie zwei oder mehr primäre Aminogruppen enthalten, werden hierin als „Multi-Amino-PEGS" bezeichnet. Polyethylenglycole, die so modifiziert wurden, dass sie zwei oder mehr Thiolgruppen enthalten, werden hierin als „Multi-Thiol-PEGS" bezeichnet. Wie hierin verwendet, schliesst der Ausdruck „Polyethylenglycol(e)" modifizierte und/oder derivatisierte Polyethylenglycol(e) ein, wie zum Beispiel Blockcopolymere, in denen einer der Blöcke PEG ist.
Verschiedene Formen von Multi-Amino-PEG sind kommerziell erhältlich von Nektar Therapeutics, Inc., San Carlos, Calif. (durch seine Acquisition von Shearwater Polymers, Huntsville, Ala.) und von Texaco Chemical Company, Houston, Tex. unter der Bezeichnung "Jeffamine". Multi-Amino-PEGS, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schliessen Texacos Jeffamine Diamine („D"-Serie) und Triamine („T"-Serie) ein, die zwei beziehungsweise drei primäre Aminogruppen pro Molekül enthalten. Polyamine, wie zum Beispiel Ethylendiamin (H₂N–CH₂CH₂-NH₂), Tetramethylendiamin (H₂N--(CH₂)₅--NH₂), Pentamethylendiamin (Cadaverin) (H₂N--(CH₂)₅-NH₂)-, Hexamethylendiamin (H₂N--(CH₂)₆-NH₂), Bis(2-hydroxyethyl)amin (HN--(CH₂CH₂OH)₂), Bis(2-aminoethyl)amin (HN--(CH₂CH₂NH₂)₂), und Tris(2-aminoethyl)amin (N--(CH₂CH₂NH₂)₃) können auch als die synthetischen Polymere, enthaltend mehrere nukleophile Gruppen, verwendet werden. In einer Ausführungsform ist das erste Vorläufermolekül ein Polyethylenglycol mit zwei oder mehr nukleophilen Gruppen. Es wurde gezeigt, dass funktionalisierte Polyethylenglycole (PEG) bei der Bildung von Biomaterialien besonders günstige Eigenschaften in sich vereinigen. Seine hohe Hydrophilie, sein bekannter Stoffwechselweg und die geringe Toxizität machen das Molekül besonders nützlich für Anwendungen im Körper. Man kann ohne Weiteres lineare (gemeint mit zwei Enden) oder verzweigte (gemeint mit mehr als zwei Enden) PEGs kaufen oder synthetisieren und die Endgruppen des PEG nach dem Reaktionsmechanismus der Wahl funktionalisieren.
b. Elektrophile Gruppen
Die elektrophilen Gruppen des zweiten Vorläufermoleküls sind imstande, mit den nukleophilen Gruppen des ersten Vorläufermoleküls unter physiologischen Bedingungen kovalente Bindungen zu bilden. Bevorzugt enthält das zweite Vorläufermolekül zwei oder mehr elektrophile Gruppen. In einer Ausführungsform sind die elektrophilen Gruppen konjugierte ungesättigte Gruppen.
Es ist möglich, mit einer grossen Anzahl von konjugierten ungesättigten Verbindungen nukleophile Additions-Reaktionen, insbesondere Michael-Additionsreaktionen durchzuführen. In den unten gezeigten Strukturen ist eine monomere, oligomere oder polymere Struktur mit P angegeben. Verschiedene bevorzugte Möglichkeiten für die spezifische Identität von P werden hierin weiter diskutiert. P kann an reaktive konjugierte ungesättigte Gruppen gekoppelt sein, einschliesslich, aber nicht beschränkt darauf, die in Tabelle 1 mit 1 bis 20 nummerierten Strukturen. Tabelle 1: Molekulare Strukturen enthaltend P und konjugierte ungesättigte Gruppen
Reaktive Doppelbindungen können konjugiert sein zu einer oder mehreren Carbonyl-Gruppen in einer linearen Keton-, Ester- oder Amidstruktur (1a, 1b, 2) oder zu zwei in einem Ringsystem, wie in Malein- oder Parachinoid-Derivaten (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Im letzteren Fall kann der Ring fusioniert sein und ein Naphthochinon (6, 7, 10) oder ein 4,7-Benzimidazoldion (8), und die Carbonyl-Gruppen können zu einem Oxim (9, 10) umgewandelt sein. Die Doppelbindung kann zu einer Heteroatom-Heteroatom-Doppelbindung konjugiert sein, wie einem Sulfon (11), einem Sulfoxid (12), einem Sulfonat oder Sulfonamid (13), oder einem Phosphonat oder Phosphonamid (14). Schliesslich kann die Doppelbindung zu einem elektronenarmen aromatischen System konjugiert sein, wie zum Beispiel einem 4-Vinylpyridiniumion (15). Dreifachbindungen können in Konjugation mit Carbonyl- oder Heteroatom-basierten Mehrfachbindungen (16, 17, 18, 19, 20) verwendet werden.
Strukturen, wie zum Beispiel 1a, 1b und 2, basieren auf der Konjugation von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen mit einer oder mehreren elektronen-ziehenden Gruppen. Eine davon ist immer Carbonyl, die Reaktivität erhöhend von einem Amid, zu einem Ester, und dann zu einer Phenon-Struktur. Die nukleophile Addition ist leichter mit abnehmender sterischer Hinderung oder zunehmender elektronen-ziehender Kraft in der alpha-Position. Zum Beispiel existiert die folgende Beziehung, CH₃<H<COOW<CN, wobei CH₃ die geringste elektronen-ziehende Kraft und CN die grösste elektronen-ziehende Kraft hat.
Die höhere Reaktivität, die durch die Verwendung der letzten beiden Strukturen erhalten wird, kann durch variieren der Sperrigkeit der Substituenten in der beta- Position, wo der nukleophile Angriff stattfindet, moduliert werden; die Reaktivität nimmt in der Reihenfolge P<W<Ph<H ab. Daher kann die Position von P zur Einstellung der Reaktivität gegenüber Nukleophilen verwendet werden. Diese Familie von Verbindungen schliesst einige Verbindungen ein, für welche sehr viel über ihre Toxikologie und Verwendung in der Medizin bekannt ist. Zum Beispiel werden wasserlösliche Polymere mit Acrylaten oder Methacrylaten an ihren Enden (über den freie-Radikal-Mechanismus) in vivo polymerisiert. Daher wurden Acrylat- und Methacrylat-enthaltende Polymere in klinischen Produkten im Körper verwendet, jedoch mit einem dramatisch unterschiedlichen chemischen Reaktions-Schema.
Die Strukturen 3–10 zeigen gegenüber Nukleophilen eine sehr hohe Reaktivität, aufgrund sowohl der cis-Konfiguration der Doppelbindung als auch des Vorhandenseins von zwei elektronen-ziehenden Gruppen. Ungesättigte Ketone reagieren schneller als Amide oder Imide, aufgrund der stärkeren Elektronegativität von diesen Carbonyl-Gruppen. Daher reagieren Cyclopentadion-Derivate schneller als solche von Maleimid (3), und Parachinone reagieren schneller als Malein-Hydrazide (4) und Cyclohexanone, aufgrund der ausgedehnteren Konjugation. Die höchste Reaktivität wird von Naphthochinonen (7) gezeigt. P kann in Positionen angeordnet werden, wo es die Reaktivität der ungesättigten Gruppe nicht reduziert, das heisst, im gegenüberliegenden Teil des Rings (3, 5), an einem anderen Ring (7, 8) oder via eine O-Verbindung über Para-Chinone oder Mono-Oxime (9, 10). Um die Geschwindigkeit der nukleophilen Additionsreaktion zu vermindern, kann P auch an die reaktive Doppelbindung gebunden werden (6, 8).
Die Aktivierung von Doppelbindungen zur nukleophilen Addition kann durch die Verwendung von heteratom-basierten elektronenziehenden Gruppen erhalten werden. In der Tat zeigen heteroatom-enthaltende Analoga von Ketonen (11, 12), Estern und Amiden (13, 14) ein ähnliches elektronenziehendes Verhalten. Die Reaktivität gegenüber nukleophiler Addition erhöht sich mit der Elektronegativität der Gruppe. Daher haben die Strukturen die folgende Beziehung, 11>12>13>14, wobei 11 die am elektronegativsten und 14 die am wenigsten elektronegative ist. Die Reaktivität gegenüber nukleophiler Addition wird auch durch die Bindung mit einem aromatischen Ring verstärkt. Eine starke Aktivierung von Doppelbindungen kann auch durch die Verwendung von elektronen-ziehenden Gruppen, basierend auf aromatischen Ringen, erhalten werden. Jede aromatische Struktur, die ein pyridiniumähnliches Kation (z. B. Derivate von Chinolin, Imidazol, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin und ähnlichen sp²-Stickstoff enthaltenden Verbindungen) enthält, polarisiert die Doppelbindung stark und macht rasche Michael-Typ Additionen möglich.
Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindungen konjugiert mit Kohlenstoff- oder Heteroatom-basierten elektronenziehenden Gruppen können leicht mit Schwefel-Nukleophilen reagieren, und ergeben Produkte von einfacher oder doppelter Addition. Die Reaktivität wird durch Substituenten in einer ähnlichen Weise beeinflusst, wie für oben diskutierte Doppelbindung-enthaltende analoge Verbindungen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die elektrophilen Gruppen Acrylat-Gruppen.
Polyethylenglycol kann gemäss den Verfahren, die z. B. in Kapitel 22 von POLY(ETHYLENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, ed., Plenum Press, NY (1992) ausgeführt sind, chemisch so modifiziert werden, dass es mehrere elektrophile Gruppen enthält. Verschiedene Formen von multi-elektrophilem PEG sind kommerziell erhältlich von Nektor Therapeutics, Inc. von San Carlos, Calif. (durch seine Aquisition von Shearwater Polymers von Huntsville, Ala.).
Die Bildung von geordneten Aggregaten (Liposomen, Micellen) oder die einfache Phasentrennung in wässriger Umgebung erhöht die lokale Konzentration von ungesättigten Gruppen und damit die Reaktionsgeschwindigkeit. In diesen Fällen hängt das Letztere auch vom Partitions-Koeffizienten der Nukleophile ab, der sich für Moleküle mit verstärktem lipophilen Charakter erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Matrix durch die Reaktion eines Vier-Arm-Polyoxyalkylen-Moleküls als das erste Vorläufermolekül, am Ende jedes Armes funktionalisiert mit einer elektrophilen Gruppe, und als das zweite Vorläufermolekül ein lineares bifunktionelles Polyoxyalkylen, an den Enden mit nukleophilen Gruppen funktionalisert, gebildet, wobei die Summe des Gewichts von dem ersten und zweiten Vorläufermolekül im Bereich von 8 bis 16%, bevorzugt von 10 bis 15 Gewichts-%, besonders bevorzugt zwischen 12 und 14.5 Gewichts-% des gesamten Gewichts der Zusammensetzung (vor der Netzwerkbildung) ist. Das erste Vorläufermolekül hat typischerweise ein Molekulargewicht zwischen 1 bis 4.5 kDa, bevorzugt zwischen 1.5 bis 4kDa, besonders bevorzugt von etwa 3.4 kDa und das zweite Vorläufermolekül hat ein Molekulargewicht von 10 bis 20 kDa, bevorzugt von etwa 15 kDa.
Wenn das erste Vorläufermolekül ein Drei-Arm- oder ein Vierarm-Polymer mit einer funktionellen Gruppe am Ende eines jeden Armes ist und das zweite Vorläufermolekül ein lineares bifunktionelles Molekül ist, dann wird das Molekulargewicht der Arme des ersten Vorläufermoleküls und das Molekulargewicht des zweiten Vorläufermoleküls vorzugsweise so gewählt, dass die Verbindungen zwischen den Verzweigungspunkten nach der Bildung des Netzwerks ein Molekulargewicht im Bereich von 10 bis 13 kDa (unter der Bedingung, dass die Verbindungen linear und nicht verzweigt sind), bevorzugt zwischen 11 bis 12 kDa, haben. Dies erlaubt eine Startkonzentration der Summe des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls im Bereich von 8 bis 16%, bevorzugt von 10 bis 15%, und besonders bevorzugt von 14 bis 14.5% des gesamten Gewichts der Zusammensetzung (vor der Netzwerkbildung). Wenn der Verzweigungsgrad des ersten Vorläufermoleküls auf 8 erhöht wird und das zweite Vorläufermolekül immer noch ein lineares bifunktionelles Molekül ist, wird das Molekulargewicht der Verbindungen zwischen den Verzweigungspunkten vorzugsweise auf ein Molekulargewicht von 18 bis 24 kDa erhöht. Wenn der Verzweigungsgrad des zweiten Vorläufermoleküls von linear auf einen Drei- oder Vier-Arm-Vorläufer erhöht wird, erhöht sich das Molekulargewicht, d. h. die Länge der Verbindungen entsprechend. In einer weiteren Ausführungsform ist das erste Vorläufermolekül ein trifunktionelles Drei-Arm-15 kDa-Polymer, d. h. jeder Arm hat ein Molekulargewicht von 5 kDa, und das zweite Vorläufermolekül ist ein bifunktionelles lineares Molekül mit einem Molekulargewicht von 0.5 bis 1.5 kDa, bevorzugt von etwa 1 kDa. Das erste und zweite Vorläufermolekül sind bevorzugt Polyethylenglycol.
B. Aktive Wirkstoffe
Das Biomaterial kann auch bioaktive Wirkstoffe enthalten, derartige kleine Moleküle oder Peptide, die langsam vom Biomaterial diffundieren können und damit dem Gewebe helfen, zu regenerieren und heilen. In derartigen Fällen funktioniert das Biomaterial sowohl als Geweberegenerations-Gerüst als auch als Wundheilungsmaterial als auch als Wirkstoff abgebende Matrix. Die bioaktiven Faktoren und/oder kleinen Moleküle können einfach in das Biomaterial gemischt werden, oder sie können kovalent an das Biomaterial gebunden und durch hydrolytischen oder enzymatischen Abbau freigesetzt werden.
Zelladhäsionspeptide, Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktor-ähnliche Peptide können in die Zusammensetzung aufgenommen werden. Die Peptide können mit den Vorläufermolekülen gemischt oder kovalent an die Vorläufermoleküle gekoppelt werden.
Zum Beispiel können Peptide, die durch spezifische Rezeptor-Ligand-Bindung Zelladhäsion induzieren, und Moleküle, welche der Matrix ermöglichen, Zell-gesteuerten Umbau durch Matrix-Metalloproteinasen (MMP) durchzumachen, in die Zusammensetzung aufgenommen werden. MMPs sind bedeutende Proteine in Säugetiergeweben und der Abbau von MMP-Substraten spielt eine wichtige Rolle im natürlichen ECM-Umsatz (z. B. während der Wundheilung) und der Geweberegeneration. Auf andere Enzymklassen kann durch die Aufnahme von Substraten, die spezifisch für das gewünschte Enzym sind, in die Zusammensetzung auch abgezielt werden. In diesen Hydrogelen kann der Mechanismus und die Geschwindigkeit, mit welcher Zellen in drei Dimensionen wandern, sowohl in vitro als auch in vivo leicht durch die Charakteristika und die Zusammensetzung der Matrix gesteuert werden, unabhängig von der Zugabe von freien oder Matrix-assoziierten exogenen Signal-Molekülen, wie z. B. Wachstumsfaktoren oder Cytokinen.
In einer Ausführungsform ist ein Peptid, welches ein Protease-Substrat ist, eines der Vorläufermoleküle, so dass das Netzwerk von Zellen infiltriert und abgebaut werden kann. Ein Fachmann kann leicht Peptide, die zwei oder mehr Cystein-Reste enthalten, synthetisieren, und dieses Molekül kann als ein Vorläufermolekül, das nukleophile Gruppen enthält, dienen. Zum Beispiel wird ein Peptid mit zwei freien Cystein-Resten leicht ein Hydrogel bilden, wenn es mit einem Drei- oder Vierarm-Polyethylenglycol (PEG) von 15 bis 20 k, endfunktionalisiert mit Acrylatgruppen, bei physiologischem oder leicht höherem pH (z. B. 8 bis 9; die Gelbildung verläuft auch bei höheren pHs, jedoch potentiell auf Kosten der Selbst-Selektivität) gemischt wird. Wenn das erste und zweite Vorläufermolekül in flüssiger Form zusammen gemischt werden, reagieren sie über einen Zeitraum von einigen Minuten und bilden ein elastisches Gel, bestehend aus einem Netzwerk von PEG-Ketten, welche die Knoten des Netzwerks tragen, und Peptiden als verbindenden Verknüpfungen.
Die Gelbildung ist selbst-selektiv, damit ist gemeint, dass das Peptid hauptsächlich mit dem PEG-Molekül und mit keinen anderen Molekülen reagiert, und dass das PEG-Molekül hauptsächlich mit dem Peptid und mit keinem anderen Molekül reagiert. In einer weiteren Ausführungsform können bifunktionelle Verbindungen eingebaut werden, um die chemische Bindung zu anderen Spezies (z. B. einer Gewebeoberfläche) zur Verfügung zu stellen.
In einer weiteren Ausführungsform werden Peptid-Stellen für die Zelladhäsion, wie zum Beispiel Peptide, die an adhäsionsfördernde Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen binden, in die Matrix eingebaut. Beispiele von adhäsionsfördernden Peptiden schliessen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein, die RGD-Sequenz von Fibronectin und die YIGSR-Sequenz (SEQ ID NR: 1) von Laminin. Zum Beispiel können die adhäsionfördernden Peptide kovalent an eines der Vorläufermoleküle gekoppelt sein. Dies kann zum Beispiel dadurch gemacht werden, dass Cystein-enthaltende Peptide einfach mit einem elektrophile Gruppen enthaltenden Vorläufermolekül, wie zum Beispiel PEG-Diacrylat oder -Triacrylat, PEG-Diacrylamid oder -Triacrylamid oder PEG-Dichinon oder -Trichinon, einige Minuten vor dem Mischen mit dem verbleibenden, die nukleophilen Gruppen enthaltenden Vorläufermolekül gemischt werden.
In einer anderen Ausführungsform werden Wachstumsfaktoren oder Wachstumsfaktor-ähnliche Peptide kovalent an eines der Vorläufermoleküle gebunden oder physisch in das Biomaterial aufgenommen. Beispiele von Klassen von Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktor-ähnlichen Peptiden schliessen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein, TGF, BMPs, IGFs und PDGFs. Beispiele von spezifischen Wachstumsfaktoren oder Wachstumsfaktor-ähnlichen Peptiden schliessen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein, BMP 2, BMP 7, TGF 1, TGF 3, IGF 1, PDGF AB, humanen Wachstumsauslösenden Faktor („human growth releasing factor), PTH 1-84, PTH 1-34 und PTH 1-25. PTH (PTH 1-84, PTH 1-34 und PTH 1-25) zeigte besonders gute Knochenbildung, wenn es kovalent an eine synthetische Matrix gebunden war. Beste Resultate wurden erreicht durch die kovalente Bindung von PTH 1-34 (Aminosäuresequenz SVSEIQLMHNLGKHLNSMERV EWLRKKLQDVHNF; SEQ ID NR: 2) an eine synthetische Matrix, die von Zellen infiltriert und anschliessend abgebaut werden konnte. Die Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktorähnlichen Peptide werden rekombinant exprimiert oder chemisch synthetisiert, mit mindestens einer zusätzlichen Cystein-Gruppe, enthaltend eine freie Thiolgruppe (d. h. – SH) entweder direkt oder über eine Verbindungs-Sequenz an das Protein oder das Peptid gebunden. Die Verbindungs-Sequenz kann zusätzlich eine enzymatisch abbaubare Aminosäuresequenz enthalten, wie zum Beispiel Plasmin-abbaubare Sequenzen, so dass der Wachstumsfaktor durch Enzyme von der Matrix im Wesentlichen in seiner nativen Form abgespalten werden kann. Zum Beispiel ist die Sequenz GYKNR (SEQ ID NR: 3) eine Plasmin-abbaubare Sequenz. Der Wachstumsfaktor oder das Wachstumsfaktor-ähnliche Peptid können durch die Bindung einer zusätzlichen Aminosäuresequenz an den N-Terminus der Moleküle, die mindestens ein Cystein enthält, an die Matrix gekoppelt werden. Die Thiol-Gruppe des Cysteins kann mit einer elektrophilen Gruppe des anderen Vorläufermoleküls, wie zum Beispiel einer konjugierten ungesättigten Gruppe, reagieren, um eine kovalente Verbindung zu bilden. Ein Fachmann kann leicht die Konzentration von Adhäsionspeptiden und/oder Wachstumsfaktoren oder Wachstumsfaktor-ähnlichen Pepiden, die Dichte des Materials der Matrix und die Kinetik der Abbaubarkeit von Protease-Sequenzen enthaltenden Peptiden bestimmen, die für die beabsichtigte Anwendung am besten ist.
C. Additive
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann weiter enthalten organische und/oder anorganische Additive, wie zum Beispiel thixotrope Stoffe, röntgenstrahlenundurchlässige oder fluoreszierende Stoffe, um die Effizienz der Anwendung zu verfolgen oder um einen potentiell nicht sofort sichtbaren Verlust zu entdecken, Stabilisatoren für die Stabilisierung der Vorläufermoleküle, wie Radikalfängern, z. B. butyliertes Hydroxytoluol oder Dithiothreitol, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern, und/oder Füllstoffe, die in einer Zunahme der mechanischen Eigenschaften (höchste Kompressionsfestigkeit und Young's Modulus E) des Biomaterials verglichen mit den mechanischen Eigenschaften des polymeren Netzwerks resultieren. Abhängig von der Anwendung kann die pharmazeutische Zusammensetzung (und damit das Biomaterial) einen Farbstoff, vorzugsweise einen organischen, enthalten. In einer Ausführungsform wird Methylenblau als Farbstoff zugegeben. Methylenblau funktioniert nicht nur als Farbstoff, sondern auch als Stabilisator für Thiol enthaltende Vorläufermoleküle, da es sich als Reduktionsmittel und Indikator für die Disulfid-Bildung verhält (da es nach Reduktion farblos wird). Ein anderer bevorzugter Farbstoff ist Lissamin-Grün.
D. Basen
Die in situ Vernetzung des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls findet unter basischen aber immer noch physiologischen Bedingungen statt. Eine ganze Reihe von Basen erfüllt das Erfordernis, die Reaktion unter physiologischen Bedingungen zu katalysieren, ohne für den Körper des Patienten schädlich zu sein, und funktioniert daher als Aktivierungsmittel bei der Bildung des Biomaterials. Geeignete Basen schliessen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, tertiäre Alkylamine, wie zum Beispiel Tributylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin oder N,N-Dimethylbutylamin. Für eine gegebene pharmazeutische Zusammensetzung (und hauptsächlich abhängig vom Typ der Vorläufermoleküle) hängt die Gelbildungszeit von der Menge und dem Typ der Base ab. Daher kann die Gelbildungszeit der pharmazeutischen Zusammensetzung dem Bedürfnis der Anwendung durch Variieren der Basenkonzentration und des Basentyps gesteuert und angepasst werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Base, als Aktivierungsmittel der kovalenten Vernetzungs-Reaktion, aus wässrigen Pufferlösungen ausgewählt, die ihren pH und pK-Wert im gleichen Bereich haben. Der pK-Bereich ist bevorzugt zwischen 9 und 13. Wenn die Base zwei pK-Werte im basischen Bereich hat, ist der erste bevorzugt zwischen 8.5 bis 10, wogegen der zweite zwischen 10 und 13 ist. Natriumcarbonat, Natriumborat und Glycin sind bevorzugte Beispiele.
III. Biomaterialien
Die Eigenschaften der Matrizen sind abhängig von der Konzentration der Vorläufermoleküle in der Zusammensetzung. Durch die Wahl eines Gewichtsbereiches der kombinierten Vorläufermoleküle von 8 bis 16 Gewichtsprozent, bevorzugt von 10 bis 15 Gewichts-%, besonders bevorzugt von 12 bis 14.5 Gewichts-% vom gesamten Gewicht der Zusammensetzung kann sowohl die Gelbildungsrate und die Abbaurate der Matrix als auch die Quellbarkeit und die Festigkeit optimiert werden. Ist die Konzentration der Vorläufermoleküle zu gering, ist die Geschwindigkeit, mit welcher sich die Vorläufermoleküle vernetzen, um unter physiologischen Bedingungen ein Hydrogel zu bilden, für medizinische Anwendungen zu langsam und die Abbaugeschwindigkeit des Biomaterials in vivo zu schnell, um eine bedeutsame Heilungsantwort zu erreichen. Wenn die Konzentration der Vorläufermoleküle über den idealen Bereich hinausgeht, kann die Quellung der Matrizen im Körper übermässig werden und daher einen Druck auf das umgebende Gewebe aufbauen. Die Unfähigkeit des Materials, aufgrund von Druck des umgebenden Gewebes zu quellen, kann die Heilungsantwort verhindern, da die für die Heilung benötigten Zellen und anderen Materialien nicht in die Matrix eindringen können. Für die meisten Heilungsindikationen ist die Geschwindigkeit des Einwachsens oder Wanderns der Zellen in die Matrix in Kombination mit der Abbaugeschwindigkeit der Matrix entscheidend für die gesamte Heilungsantwort. Das Potential von Matrizen, von Zellen durchdrungen zu werden, ist primär eine Frage der Dichte des Netzwerks, d. h. dem Raum zwischen den Verzweigungspunkten oder -knoten. Ist der vorhandene Raum zu klein im Vergleich mit der Grösse von Zellen oder ist die Abbaugeschwindigkeit der Matrix, was in der Schaffung von mehr Raum innerhalb der Matrix resultiert, zu langsam, wird nur eine sehr begrenzte Heilungsantwort beobachtet werden können. In der Natur gefundene Heilungsmatrizen, z. B. Fibrin-Matrizen, welche als Antwort auf die Verletzung des Körpers gebildet werden, sind dafür bekannt, aus einem Netzwerk zu bestehen, welches ein ideales Substrat für die Invasion von Zellen ist. Die Infiltration kann durch Liganden für Zelladhäsion gefördert werden, die ein integrierter Bestandteil des Fibrin-Netzwerks sind. Wenn n und/oder m des ersten und/oder zweiten Vorläufermoleküls grösser als zwei sind, sind die Molekulargewichte der Arme eines vorgegebenen Vorläufers im Wesentlichen ähnlich zu einander. „Im Wesentliche ähnlich", wie hierin verwendet, bedeutet, dass die Molekulargewichte von den Armen eines vorgegebenen Vorläufers in einem Bereich von +/– 10 Gew.-% voneinander sind. In einer Ausführungsform sind die Molekulargewichte der Arme von den Vorläufermolekülen identisch. Das Verhältnis der nukleophilen und elektrophilen Gruppen des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls ist bevorzugt zwischen 0.9 und 1.1, bevorzugter ist das Verhältnis 1 und daher keine funktionellen Gruppen unreagiert vorhanden. Vorzugsweise werden das Molekulargewicht der Arme des ersten Vorläufermoleküls, das Molekulargewicht der Arme des zweiten Vorläufermoleküls und die Funktionalität der Verzweigungspunkte so gewählt, dass der Wassergehalt des polymeren Netzwerks zwischen 80 und 98% nach Gewicht, bevorzugt zwischen 85% und 96% nach Gewicht, bevorzugter zwischen 87% und 95% nach Gewicht des gesamten Gewichts des polymeren Netzwerks nach vollständiger Wasseraufnahme im Körper ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wassergehalt in seinem Gleichgewicht nach vollständiger Wasseraufnahme im Körper. Vollständige Wasseraufnahme kann entweder dadurch erzielt werden, dass die Gleichgewichtskonzentration erreicht wurde oder weil der vorhandene Platz keine weitere Volumenzunahme erlaubt.
Matrizen, die aus einem hydrophilen Vorläufermolekül, z. B. funktionalisiertem Polyethylenglycol, hergestellt werden, quellen in wässriger Umgebung nach der Bildung des polymeren Netzwerks. Um unter physiologischen Bedingungen (z. B. pH bis 8, bevorzugt zwischen 7 und 8 und einer Temperatur zwischen 36 und 38°C) eine genügend kurze Gelbildungszeit (zwischen 3 bis 15 Minuten, bevorzugt 3 bis 10 Minuten, besonders bevorzugt zwischen 5–10 Minuten) zu erreichen, müssen die Ausgangskonzentrationen der Vorläufermoleküle in einem optimalen Konzentrationsbereich liegen. Quellung des polymeren Netzwerks ist wichtig, um den Raum zwischen den Verzweigungspunkten zu vergrössern und auszuweiten, um die Zell-Wanderung zu erleichtern.
Unabhängig von der Ausgangskonzentration der Vorläufermoleküle quellen Hydrogele, hergestellt aus den gleichen synthetischen Vorläufermolekülen, im Gleichgewichtszustand bis zum gleichen Wassergehalt. Dies bedeutet, dass je höher die Startkonzentration der Vorläufermoleküle ist, desto grösser ist das Endvolumen der Matrizen, wenn es seinen Gleichgewichtszustand erreicht hat. Wenn der im Körper erhältliche Raum zu klein ist, um ein genügendes Quellen der Matrix zu gestatten, wird die Geschwindigkeit der Zellinfiltration und, als Konsequenz, die Heilungsantwort abnehmen. Als Konsequenz muss das Optimum zwischen drei sich widersprechenden Erfordernissen für Anwendungen im Körper gefunden werden. Auf der einen Seite müssen die Startkonzentrationen genügend hoch sein, um die nötige Gelbildungszeit zu gewährleisten. Dies kann jedoch Matrizen ergeben, die mehr Raum erfordern, um den nötigen Wassergehalt zu erreichen als im Defekt vorhanden ist, und die daher zu dicht für die Zellinfiltration bleiben und Abbaugeschwindigkeiten haben, die zu lang sind.
Die Beziehung zwischen Abbau der Matrix und Zellinfiltration kann durch (1) Variieren der Struktur (d. h. der Kettenlänge und Anzahl Arme) des Vorläufer-Polymers für die Zellinfiltration; (2) Variieren der Affinität und Konzentration von Adhäsionliganden, die kovalent an das Netzwerk gebunden sind, um die Zellinfiltration zu erhöhen; (3) Variieren, im Falle von enzymatisch abbaubaren Gelen, der Spezifität des Protease-Substrats zum Abbau durch eine gewünschte Protease, sezerniert durch die Zellen, und der enzymatischen Aktivität (Km/kcat) oder der Kinetik der enzymatischen Hydrolyse des verwendeten Protease-Substrats; (4) Variieren, im Falle von hydrolytisch abbaubaren Gelen, die Empfindlichkeit der Matrix gegenüber Hydrolyse unter physiologischen Bedingungen; und (5) kovalente Kopplung von Molekülen an die Matrix, welche die Expression und Sekretion von Matrix-Metalloproteasen (MMPs) fördern oder hemmen (z. B. Wachstumsfaktoren). Diese Faktoren sind weitgehend von der zur Bildung des Biomaterials verwendeten Vernetzungschemie abhängig (d. h., ob die Vorläufermoleküle durch Michael-Additions-, Substitutions, Additions- oder Kondensations-Chemie vernetzt werden).
Der Reaktionsmechanismus zur Herstellung des dreidimensionalen Netzwerks kann aus einer Reihe dem Fachmann bekannter Reaktionsmechanismen, wie zum Beispiel Substitutionsreaktionen, Kondensationsreaktionen, freie Radikalreaktionen und Additionsreaktionen ausgewählt werden. Im Falle von Substitutions-, Kondensations- und Additionsreaktionen enthält eines der Vorläufermoleküle nukleophile Gruppen und das andere Vorläufermolekül enthält elektrophile Gruppen, bevorzugt konjugierte ungesättigte Gruppen oder Bindungen. Im Falle von freien Radikalreaktionen umfassen beide Vorläufermoleküle ungesättigte Bindungen, bevorzugt konjugierte ungesättigte Bindungen. Ein besonders bevorzugter Reaktionsmechanismus ist die Michael-Typ Additionsreaktion zwischen einer konjugierten ungesättigten Gruppe oder Bindung und einem starken Nukleophil, wie in WO 00/44808 beschrieben. Für Michael-Typ Additionsreaktionen enthält das erste Vorläufermolekül bevorzugt Amino- oder Thiolgruppen, und das zweite Vorläufermolekül enthält bevorzugt konjugierte ungesättigte Gruppen, wie z. B. Vinylsulfan- oder Acrlylatgruppen. Das End-Verbinden der beiden Vorläufermoleküle ergibt ein stabiles dreidimensionales Netzwerk. Diese Michael-Typ Addition an konjugierte ungesättigte Gruppen läuft unter physiologischen Bedingungen in quantitativer Ausbeute ab, ohne Nebenprodukte zu erzeugen.
IV. Herstellungsmethoden
A. Lagerung
Die ersten und zweiten Vorläufermoleküle werden vorzugsweise unter Ausschluss von Sauerstoff und Licht und bei niedrigen Temperaturen, z. B. um +4°C, gelagert, um eine Zersetzung der funktionellen Gruppen vor der Verwendung zu verhindern. Die Vorläufer können als trockene Pulver oder in gepufferten Lösungen gelagert werden. Falls die Vorläufermoleküle in der gepufferten Lösung gelagert werden, ist der pH der Lösung typischerweise sauer, z. B. um 5.5. Der Gehalt an funktionellen Gruppen von jedem Vorläufer-Molekül wird unmittelbar vor der Verwendung gemessen und das Verhältnis von erstem und zweitem Vorläufer-Molekül (und anderen Vorläufermoleküle, wenn zutreffend) wird entsprechend der vorbestimmten Equivalent-Gewichts-Verhältnisse der funktionellen Gruppen angepasst.
B. Herstellung von Zusammensetzungen für Wundheilung und Geweberegeneration
Um das Biomaterial zu bilden, können die ersten und zweiten Vorläufermoleküle in einer basenhaltigen Lösung gelöst werden. Alternativ können Vorläufer-Molekül-Lösungen mit einer Puffer-Lösung gemischt werden, die einen basischen pH hat. Zum Beispiel können die Vorläufermoleküle und die Basen/Puffer-Lösung separat in zweiteiligen Spritzen gelagert werden, die zwei Kammern haben, die durch eine verstellbar Unterteilung senkrecht zur Bodenwand der Spritze getrennt sind. Eine der Kammern kann das Vorläufer-Molekül in fester pulverisierter Form enthalten, die andere Kammer enthält eine passende Menge an Basen/Puffer-Lösung. Wenn Druck auf das eine Ende des Spritzenkörpers ausgeübt wird, bewegt sich die Unterteilung und setzt Ausbuchtungen in der Spritzenwand frei, so dass Puffer in die Kammer, die das entsprechende Vorläufer-Molekül enthält, freigesetzt wird, welches sich beim Kontakt mit der Basen/Puffer-Lösung löst, um eine Lösung zu bilden. Ein zweiteiliger Spritzenkörper wird für die Lagerung und das Lösen des anderen Vorläufer-Moleküls in der gleichen Weise verwendet. Wenn beide Vorläufermoleküle gelöst sind, werden beide Spritzenkörper an einem Zweiweg-Verbindungseinheit angebracht und die Inhalte werden gemischt, indem sie durch die Injektionsnadel gedrückt werden, die an der Verbindungseinheit befestigt ist. Die Verbindungseinheit kann zusätzlich einen statischen Mischer umfassen, um das Mischen der Inhalte zu verbessern. Die gemischten Moleküle werden direkt an der benötigten Stelle im Körper injiziert werden, indem der statische Mischer mit der Injektionsnadel verbunden wird oder indem die Mischung in eine weitere Spritze gedrückt wird, welche dann mit der Injektionsnadel verbunden wird.
In einer Ausführungsform wird eine Lösung von bioaktiven Peptiden, zum Beispiel solche, die mit Adhäsions-fördernde Rezeptoren auf der Zelloberfläche reagieren, die flankiert von einem einzelnen Cystein und/oder Wachstumsfaktoren oder Wachstumsfaktor-ähnlichen Peptiden sind, mit dem Vorläufer-Molekül zur Reaktion gebracht, das konjugierte elektrophile Gruppen umfasst, um die Peptide kovalent mit dem Vorläufer-Molekül zu koppeln. Im zweiten Schritt wird ein Hydrogel gebildet, indem die Peptid-enthaltende Vorläufer-Lösung mit einer Lösung gemischt wird, die das nucleophile Gruppen enthaltende Vorläufer-Molekül enthält. Die Vernetzungsreaktion ist selbst-selektiv; sehr wenige extrazelluläre Proteine enthalten freie Thiole, und 1,4-konjugierte Unsättigungen werden selten in biologischen Umgebungen gefunden, so dass Gele in situ und direkt an der Operationsstelle in Gegenwart von anderen Proteinen, Zellen und Geweben gebildet werden können.
Die Ausgangskonzentration des ersten und zweiten Vorläufer-Moleküls ist im Bereich von 8 bis 16 Gewichtsprozent, vorzugsweise 10 bis 15 Gewichtsprozent, insbesondere zwischen 12 und 14.5 Gewichtsprozent des Gesamtgewichts der Zusammensetzung (vor der Netzwerk-Bildung). Alle Moleküle werden vor dem Mischen sterilisiert. Vorzugsweise wird dies durch Sterilfiltration der Vorläufermoleküle und Gamma-Bestrahlung der Additive/Füllstoffe gemacht.
V. Kits („Bausätze") zum Bilden von in situ vernetzbaren Zusammensetzungen
Das Kit enthält mindestens ein erstes und ein zweites Vorläufer-Molekül. Das Kit kann auch ein oder zwei Einrichtungen enthalten, wie Spritzen, um die ersten und zweiten Moleküle zu verabreichen. Das Kit kann auch eine Base und/oder Puffer enthalten für das Polymerisieren des Vorläufer-Moleküls. Optional enthalten das/die erste und/oder zweite Vorläufer-Molekül(e) ein oder mehrere Additive und/oder biologisch aktive Wirkstoffe, wie Zelladhäsions-Peptide, Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktor-ähnliche Peptide. Die aktiven Wirkstoffe können mit den ersten und/oder zweiten Vorläufermolekülen gemischt sein oder können kovalent an das erste oder zweite Vorläufer-Molekül gebunden sein. In einer Ausführungsform ist ein oder beide der Vorläufer-Komponenten kovalent an ein oder mehrere Zelladhäsions-Peptide, Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktor-ähnliche Peptide und Kombinationen davon gebunden. Die Vorläufermoleküle können vor der Verabreichung an einen Patienten in die eine oder mehreren Einrichtungen hineingegeben werden.
VI. Verwendungsmethoden
A. Wundheilung/Gewebe-Regeneration
Die multifunktionalen Vorläufermoleküle werden ausgewählt und zugeschnitten, um Biomaterialien mit den gewünschten Eigenschaften zu produzieren. Die Vorläufermoleküle können in situ unter physiologischen Bedingungen vernetzt werden für spezifische Wundheilungs- und/oder Gewebe-Verletzungs/Fehler-Bedingungen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Biomaterialien dazu benutzt, kontrolliertes Einwachsen von Zellen und Gewebe-Regeneration von einer Auswahl an Geweben, wie Knochen, zu induzieren. Die Zusammensetzungen können ein oder mehrere aktive Wirkstoffe enthalten, welche aus der Matrix freigesetzt werden, um die Wundheilung zu unterstützen.
Falls nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie allgemein von einem Fachmann auf dem Gebiet verstanden werden, zu dem die offenbarte Erfindung gehört. Hier zitierte Publikationen und die Materialien, für welche sie zitiert werden, werden spezifisch durch Bezugnahme eingeschlossen.
Fachmänner auf diesem Gebiet werden viele Equivalente zu den hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung erkennen, oder in der Lage sein, diese unter Verwendung von reiner Routine-Experimentation zu ermitteln. Es ist beabsichtigt, solche Equivalente durch die folgenden Ansprüche zu umfassen.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung von grundlegenden Reagentien
Herstellung von PEG-Vinylsulfonen
Handelsübliche verzweigte Polyethylenglycole (PEGs) (4-Arm-PEG, Molekulargewicht 14'800, 4-Arm-PEG, Molekulargewicht 10'000 und 8-Arm-PEG, Molekulargewicht 20'000; Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA) wurden an den OH-Termini funktionalisiert.
PEG-Vinylsulfone wurden hergestellt unter einer Argon-Atmosphäre durch Reaktion einer Methylenchlorid-Lösung der Vorläufer-Polymere (vorgängig über Molekularsieb getrocknet) mit NaH und dann, nach der Wasserstoff-Entwicklung, mit Divinylsulfon (molare Verhältnisse; OH 1: NaH 5: Divinylsulfon 50). Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur während drei Tagen unter Argon und mit konstantem Rühren durchgeführt. Nach der Neutralisierung der Reaktionslösung mit konzentrierter Essigsäure wurde die Lösung durch Papier gefiltert, bis sie klar war. Das derivatisierte Polymer wurde durch Fällen in eiskaltem Diethylether isoliert. Das Produkt wurde zweimal wieder in Methylenchlorid gelöst und erneut in Diethylether gefällt (mit gründlichem Waschen), um alles überschüssige Divinylsulfon zu entfernen. Schliesslich wurde das Produkt unter Vakuum getrocknet. Die Derivatisierung wurde mit ¹H NMR bestätigt. Das Produkt zeigte charakteristische Vinylsulfon Peaks bei 6.21 ppm (zwei Wasserstoffatome) und 6.97 ppm (ein Wasserstoffatom). Der Grad der Umsetzung der terminalen Gruppe wurde auf 100% bestimmt.
Herstellung von PEG-Acrylaten
PEG-Acrylate wurden unter Argon-Atmosphäre durch Reaktion einer Lösung der Vorläufer-Polymere in azeotropisch getrocknetem Toluol mit Acryloylchlorid in Gegenwart von Triethylamin (molare Verhältnisse: OH 1: Acryloylchlorid 2: Triethylamin 2.2) hergestellt. Die Reaktion lief bei Rühren über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur ab. Die resultierende blass gelbe Lösung wurde durch eine Schicht von neutralem Aluminiumoxid filtriert; nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Reaktionsprodukt in Methylenchlorid gelöst, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und in kaltem Diethylether gefällt. Ausbeute: 88%; Umsetzung von OH zu Acrylat: 100% (aus der ¹H NMR Analyse).
¹H-NMR (CDCl₃): 3.6 (341H (14800 4-Arm: 337H theor.), 230 (10000 4-Arm: 227H theor.), or 210H (20000 8-Arm: 227H theor.), PEG Ketten Protonen), 4.3 (t, 2H, -CH₂-CH₂-O-CO-CH=CH₂), 5.8 (dd, 1H, CH₂=CH-COO-), 6.1 and 6.4 (dd, 1H, CH₂=CH-COO-) ppm.
FT-IR (Film auf ATR Platte): 2990-2790 (υ C-H), 1724 (υ C=O), 1460 (υ_s CH₂), 1344, 1281, 1242, 1097 (υ_as C-O-C), 952, 842 (υ_s C-O-C) cm^–1.
Peptid-Synthese
Alle Peptide wurden auf einem festen Harz synthetisiert unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers (9050 Pep Plus Synthesizer, Millipore, Framingham, USA) mit standardmässiger 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Chemie. Hydrophobe Radikalfänger („scavenger") und abgespaltete Schutzgruppen wurden durch Fällen des Peptids in kaltem Diethylether und Lösen in deionisiertem Wasser entfernt.
Nach einer Lyophilisierung wurden die Peptide wieder in 0.03 M Tris-gepufferter Salzlösung (TBS, pH 7.0) gelöst und mittels HPLC (Waters; Milford, USA) auf einer Grössenausschluss-Säule (size exclusion column) mit TBS, pH 7 als fliessendem Puffer gereinigt.
Beispiel 2: Hydrogel-Bildung durch konjugierte Additions-Reaktionen
MMP-empfindliche Gele, die durch konjugierte Addition mit einem Peptid-verbundenen Nucleophil und einer PEG-verbundenen konjugierten Unsättigung gebildet werden, die eine proteolytische Zellwanderung erlauben
Die Synthese von Gelen wird vollständig durch eine Michael-Typ Additions-Reaktion eines PEG-Thiols an ein Vinylsulfon-funktionalisiertes PEG erreicht. In einem ersten Schritt wurden Adhäsions-Peptide hängend (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂) (SEQ ID Nr: 4) an einem Multiarm-PEG-Vinylsulfon befestigt und dann wurde dieser Vorläufer mit einem Dithiol-haltigen Peptid (z. B. das MMP-Substrat Ac-GCRDGPQGIAGFDRCG-NH₂) (SEQ ID Nr: 5) vernetzt. In einer typischen Gel-Herstellung für dreidimensionale in vitro-Studien wurde ein 4-Arm-PEG-Vinylsulfon (Molekulargewicht 15'000) in einem TEOA-Puffer (0.3 M. pH 8.0) gelöst, um eine 10%ige Lösung (w/w) zu geben. Um die Gels zelladhäsiv zu machen, wurde das gelöste Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂ (SEQ ID Nr: 4) (gleicher Puffer) zu dieser Lösung zugegeben. Das Adhäsions-Peptid wurde während 30 Minuten bei 37°C reagieren gelassen. Anschliessend wurde das Vernetzer-Peptid Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂ (SEQ ID Nr: 6) mit der obigen Lösung gemischt und Gels wurden synthetisiert. Die Gelbildung erfolgte innerhalb von wenigen Minuten, jedoch wurde die Vernetzungs-Reaktion während einer Stunde bei 37°C durchgeführt, um eine vollständige Reaktion zu garantieren.
MMP-unempfindliche Gel, die durch konjugierte Addition mit einem Peptid-verbundenen Nucleophil und einer PEG-verbundenen konjugierten Unsättigung gebildet werden, die eine non-proteolytische Zellwanderung erlauben
Die Synthese von Gelen wird ebenfalls vollständig durch eine Michael-Typ Additions-Reaktion eines PEG-Thiols an ein Vinylsulfon-funktionalisiertes PEG erreicht. In einem ersten Schritt wurden Adhäsions-Peptide hängend (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂) (SEQ ID Nr: 4) an einem Multiarm-PEG-Vinylsulfon befestigt und dann wurde dieser Vorläufer mit einem PEG-Dithiol (Molekulargewicht 3.4 kD) vernetzt. In einer typischen Gel-Herstellung für dreidimensionale in vitro-Studien wurde ein 4-Arm-PEG-Vinylsulfon (Molekulargewicht 15'000) in einem TEOA-Puffer (0.3 M, pH 8.0) gelöst, um eine 10%ige Lösung (w/w) zu geben. Um die Gele zelladhäsiv zu machen, wurde das gelöste Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂ (SEQ ID Nr: 4) (im gleichen Puffer) zu dieser Lösung zugegeben. Das Adhäsions-Peptid wurde während 30 Minuten bei 37°C reagieren gelassen. Anschliessend wurde der PEG-Dithiol-Vorläufer mit der obigen Lösung gemischt und Gels wurden synthetisiert. Die Gelbildung erfolgte innerhalb von wenigen Minuten, jedoch wurde die Vernetzungs-Reaktion während einer Stunde bei 37°C durchgeführt, um eine vollständige Reaktion zu garantieren.
Beispiel 3: Hydrogel-Bildung durch Kondensations-Reaktionen
MMP-empfindliche Gele, die durch Kondensations-Reaktionen mit multiplen Aminen, die einen Peptid-Vernetzer enthalten, und einem elektrophil aktiven PEG gebildet werden, die eine proteolytische Zellwanderung erlauben MMP-empfindliche Hydrogele wurden auch durch Durchführen einer Kondensations-Reaktion zwischen MMP-empfindlichen Oligopeptiden, die zwei MMP-Substrate und drei Lys enthalten (Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH₂) (SEQ ID Nr: 7), und einem handelsüblichen (Shearwater Polymers) bifunktionellen Doppelester PEG-N-Hydroxysuccinimid (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS) hergestellt. In einem ersten Schritt wurde ein Adhäsions-Peptid (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂) (SEQ ID Nr: 4) mit einer kleinen Fraktion von NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS zur Reaktion gebracht, und dann wurde dieser Vorläufer zu einem Netzwerk vernetzt durch Mischen mit dem Peptid Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH2 (SEQ ID Nr: 8), das drei ε-Amine (und ein normales Amin) trägt. In einer typischen Gel-Herstellung für dreidimensionale in vitro-Studien wurden beide Moleküle in 10 mM PBS bei pH 7.4 gelöst, um eine 10%ige Lösung (w/w) zu geben, und die Hydrogele wurden innerhalb von weniger als einer Stunde gebildet.
Im Gegensatz zu den vorliegenden Hydrogelen, die durch Michael-Typ-Reaktion gebildet werden, ist die gewünschte Selbst-Selektivität bei diesem Ansatz nicht garantiert, da Amine, die in biologischen Materialien wie Zellen oder Geweben vorhanden sind, ebenfalls mit den bifunktionell aktivierten Doppelestern reagieren werden. Dies trifft auch für andere PEG's zu, die elektrophile Funktionalitäten tragen, wie PEG-Oxycarbonylimidazol (CDI-PEG) oder PEG-Nitrophenylcarbonat.
MMP-unempfindliche Hydrogele, die durch Kondensations-Reaktionen mit einem PEG-Amin-Vernetzer und einem elektrophil aktiven PEG gebildet werden, die eine non-proteolytische Zellwanderung erlauben Hydrogele wurden auch durch Durchführen einer Kondensations-Reaktion zwischen handelsüblichen verzweigten PEG-Aminen (Jeffamines) und dem gleichen bifunktionellen Doppelester PEG-N-Hydroxysuccinimid (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS) erhalten. In einem ersten Schritt wurden die Adhäsions-Peptide (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂) (SEQ ID Nr: 4) mit einer kleinen Fraktion von NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS zur Reaktion gebracht, und dann wurde dieser Vorläufer durch Mischen mit dem Multiarm-PEG-Amin zu einem Netzwerk vernetzt. In einer typischen Gel-Herstellung für dreidimensionale in vitro-Studien wurden beide Moleküle in 10 mM PBS bei pH 7.4 gelöst, um eine 10%ige Lösung (w/w) zu geben, und die Hydrogele wurden innerhalb von weniger als einer Stunde gebildet.
Wiederum ist, im Gegensatz zu den vorliegenden Hydrogels, die durch Michael-Typ-Reaktion gebildet werden, die gewünschte Selbst-Selektivität bei diesem Ansatz nicht garantiert, da Amine, die in biologischen Materialien wie Zellen oder Geweben vorhanden sind, ebenfalls mit den bifunktionell aktivierten Doppelestern reagieren werden. Dies trifft auch für andere PEG's zu, die elektrophile Funktionalitäten tragen, wie PEG-Oxycarbonylimidazol (CDI-PEG) oder PEG-Nitrophenylcarbonat.
Beispiel 4: Gleichgewichts-Quellungs-Messungen von Hydrogelen, die durch konjugierte Addition mit verschiedenen Makromeren und einem Thiol-haltigen MMP-empfindlichen Peptid gemacht worden sind
Hydrogel Struktur-Funktions-Studien wurden durchgeführt, um zu testen, ob eine Verbindung zwischen Vorläufer-Parametern und Netzwerk-Eigenschaften ermittelt werden und einer gut charakterisierten Mikrostruktur des Gels zugeordnet werden kann.
Hydrogel-Bildung und Gleichgewichts-Quellungs-Messungen
Gele wurden vor und nach dem Schwellen und nach dem Gefriertrocknen in Luft und Ethanol gewogen unter Verwendung einer Waage mit einer zusätzlichen Dichte-Bestimmungs-Einheit. Basierend auf Archimedes Auftriebs-Prinzip wurden das Gel-Volumen nach dem Vernetzen und das Gel-Volumen nach dem Schwellen berechnet. Proben wurden während 24 Stunden in destilliertem Wasser quellen gelassen. Die Vernetzungsdichte und das Molekulargewicht zwischen Vernetzungen (M_c) wurden basierend auf dem Flory-Rehner-Modell und seiner modifizierten Version von Peppas-Merrill berechnet.
Die PEG-Makromer-Struktur (d. h. Molekulargewicht und Anzahl Arme) korreliert direkt mit den Schwell-Eigenschaften des Netzwerks. Die Schwellrate erhöht sich mit einer Abnahme der Armlänge oder einer Zunahme an Funktionalität der Vernetzung. Durch Ändern der Kettenlänge und der Anzahl Arme des Makromers bei konstanter Vorläuferkonzentration (10% w/w) wurde die Schwellrate (und damit die Vernetzungsdichte und das Molekulargewicht zwischen Vernetzungen) signifikant verändert (1). Zum Beispiel nahm der elastische Modulus G' mit einer Abnahme der Armlänge oder einer Zunahme der Funktionalität der Vernetzungsstellen zu. Der Zusammenhang zwischen Vorläufer-Parametern und Netzwerk- Eigenschaften kann einer gut charakterisierten Mikrostruktur des Hydrogels zugeordnet werden.
Beispiel 5: Viskoelastische Messungen von Hydrogelen, die durch konjugierte Addition mit verschiedenen Makromeren und einem Thiol-haltigen MMP-empfindlichen Peptid gemacht worden sind
Dynamische viskoelastische Eigenschaften von Hydrogelen wurden mittels Oszillations-Scher-Experimenten mit geringer Belastung unter Verwendung eines Bohlin CVO 120 Hochauflösungs-Rheometers mit einer Platten-Platten-Geometrie bei 37°C und pH 7.4 mit einer feuchten Atmosphäre zwischen den Platten studiert. Die PEG-Multiacrylat- und Peptid-Vorläufer-Lösungen (je 30 μl) wurden auf die untere Platte aufgetragen und kurz mit einer Pipettenspitze gemischt. Die obere Platte (20 mm Durchmesser) wurde dann sofort abgesenkt auf einen Mess-Abstand von 0.1 mm. Nach einer kurz Vor-Scher-Zeit (um das Vermischen der Vorläufer sicherzustellen) wurde die dynamische Oszillations-Messung gestartet. Die Entwicklung der Lagerungs-(G') und Verlust-(G'') Moduli und der Phasenwinkel (6) bei einer konstanten Frequenz von 0.5 Hz wurden aufgezeichnet. Ein Amplituden-Durchlauf („amplitude sweep") wurde durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Parameter (Frequenz und Belastung) innerhalb des linearen viskoelastischen Systems sind. Die PEG-Makromer-Struktur (d. h. Molekulargewicht und Anzahl Arme) korreliert direkt mit den viskoelastischen Eigenschaften des Netzwerks.
Durch Ändern der Kettenlänge und der Anzahl Arme des Makromers bei konstanter Vorläufer-Konzentration (10% w/w) wurden die Scher-Moduli (G' und G'') signifikant verändert, und G' erhöhte sich mit einer Abnahme der Armlänge oder einer Zunahme der Funktionalität der Vernetzung, was wiederum impliziert, dass es eine klare Korrelation zwischen Vorläufer-Parametern und Netzwerk-Eigenschaften gibt, die gut charakterisierten Mikrostrukturen des Gels zugeordnet werden können (2). 2 zeigt, dass die Schwellrate zunimmt, wenn das Molekulargewicht der Arme abnimmt oder der Funktionalitäts-Grad zunimmt.
Beispiel 6: Biochemischer Abbau durch menschliches MMP-1 von Gelen, die durch konjugierte Addition mit Peptiden, die zwei Cystein-Reste enthalten, mit NMP-Substrat-Sequenzen von verschiedener Enzym-Aktivität gemacht worden sind
Enzymatischer Abbau wurde biochemisch untersucht, indem MMP-empfindliche Hydrogele der proteolytischen Aktivität von aktiviertem MMP-1 ausgesetzt wurden. Hydrogele, die Substrate mit drei verschiedenen enzymatischen Aktivitäten enthielten, wurden getestet (K_M/k_cat= 840%, 100%, 0%). Der Abbau von Hydrogelen durch MMP-1 wurde durch Messen der Änderung der Quellung während des Abbaus bestimmt.
Demonstration von MMP-Abbaubarkeit und ihrer Empfindlichkeit gegenüber der enzymatischen Aktivität der eingebauten Oligopeptide
Die Abbau-Kinetik (Schwellen, d. h. Gewichtsänderung) von Hydrogelen, die MMP-Substrate mit unterschiedlicher Aktivität enthalten, reagiert auf die Aminosäure-Sequenz des Protease-Substrat-Proteins (d. h. die enzymatische Aktivität). Die Kinetik von proteolytischem Gel-Abbau kann durch sehr einfache Mittel manipuliert werden (3). 3 zeigt die MMP-Abbaubarkeit und ihre Abhängigkeit von der enzymatischen Aktivität der eingebauten Oligopeptide. Der Schwell-Grad wird als Funktion der Inkubationszeit gemessen.
Beispiel 7: Einbetten und Kultur von hFF-Fibrin- Clustern innerhalb von synthetischen PEG-basierten Hydrogelen, um die dreidimensionale Zellinvasions-Kapazität der Matrix zu bestimmen
Beinahe konfluente Kulturen von menschlichen Vorhaut-Fibroblasten (hFFs) wurden trypsiniert, zentrifugiert und wieder suspendiert in 2% (m/v) Fibrinogen von menschlichem Plasma (Fluka, Schweiz) in einer sterilen, Phosphatgepufferten Lösung (PBS) auf eine Konzentration von 30'000 Zellen/μl. Um die Gelbildung der hFF-Fibrinogen-Suspension zu veranlassen, wurden Thrombin (Sigma T-6884, Schweiz) und Ca⁺⁺ zugegeben auf Endkonzentrationen von 2 NIH Einheiten/ml respektive 2.5 mM, und rasch mit der Zell-Suspension gemischt. Vor der Gelbildung wurden 2 μl-Tröpfchen dieses Zell-Fibrinogen-Vorläufers während 15 Minuten bei 37°C auf Mikroskop-Platten geliert. Die hFF-Fibrin-Cluster wurden innerhalb von 25 μl PEG-basierten Hydrogelen eingebettet, indem drei bis vier Cluster vor der Gelbildung in die Vorläufer-Lösung hineingegeben wurden. Solche innerhalb der PEG-basierten Hydrogels eingebetteten hFF-Fibrin-Cluster wurden für bis zu 30 Tage mit Serum-enthaltendem DMEM in den 12-Loch-Gewebe-Kulturplatten kultiviert. Zellinvasion aus dem Cluster in die synthetische Gel-Matrix wurde abgebildet und aufgezeichnet mit ihrer zentralen Ebene im Fokus. Um die Penetrationstiefe des Auswuchses zu quantifizieren, wurde der Bereich des ursprünglichen hFF-Fibrin-Clusters in der zentralen Ebene gemessen, und ebenso der Bereich des hFF-Auswuchses, definiert durch die Spitzen der hFF-Ausläufer in der zentralen Fokus-Ebene. Diese zwei Bereiche wurden als kreisförmige Bereiche angenähert, und ihre theoretischen Radien wurden voneinander subtrahiert, um eine durchschnittliche hFF-Auswuchslänge zu erhalten.
Die Tatsache, dass Zellen aus den Clustern herauswachsen, impliziert, dass Michael-Typ Addition an konjugierte ungesättigte Gruppen selbst-selektiv ist, d. h. Acrylate oder Vinylsulfone reagieren mit Thiolen viel schneller als mit Aminen, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind. Solche Materialien können also klinisch angewendet werden, zum Beispiel um Gewebefehler aufzufüllen durch in situ Gelbildung.
Beispiel 8: Änderung der Zellinvasionsrate in MMP-empfindliche Hydrogele durch die enzymatische Aktivität der eingebauten Protease-Substrate
Herstellung von MMP-empfindlichen Hydrogels mit verschiedener MMP-Aktivität
Hydrogele wurden wie folgt hergestellt, mit drei verschiedenen MMP-aktiven Substraten im Rückgrat („backbone"): Zuerst wurde das Adhäsions-Peptid (z. B. das Peptid Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂) (SEQ ID Nr: 4) an einem Multiarm-PEG-Vinylsulfon (Molekulargewicht 15'000) angehängt in einer Konzentration von 0.1 mM, indem der PEG-Vorläufer (TEOA Puffer (0.3 M, pH 8.0)) mit dem Adhäsions-Peptid, das ebenfalls im gleichen Puffer gelöst war, gemischt wurde. Die Reaktion wurde während 30 Minuten bei 37°C laufen gelassen. Dann wurden MMP-empfindliche Peptide unterschiedlicher Aktivität (z. B. Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂) (SEQ ID Nr: 6) mit der obigen Lösung gemischt, die immer noch Michael-Typ-Reaktivität besass, und Gels wurden gebildet um einen Zell-Fibrin-Cluster herum gemäss dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren. Proben wurden auch parallel ausgehärtet und das Schwellen wurde gemessen, um zu garantieren, dass Unterschiede in der Zell-Migration klar der Änderung in der enzymatischen Aktivität (und nicht den Unterschieden in im Aufbau des Netzwerks, d. h. den Vernetzungsdichten) zugeordnet werden können.
Zellinvasionsrate bei einer gegebenen Adhäsivität und Struktur des Netzwerks kann rational massgeschneidert werden durch die MMP-Aktivität des eingebauten Peptid-Substrats
Wie von den biochemischen, in Beispiel 6 beschriebenen Messungen her erwartet, entspricht die Zellinvasion in Hydrogelen, die MMP-Substrate enthalten, der enzymatischen Aktivität von letzteren (4). 4 ist ein Graph der Menge an radialer Invasion als Funktion der Inkubationszeit für Materialien, die Substrate mit hoher MMP-Aktivität, Substrate mit niedriger MMP-Aktivität und MMP-Substrate, die keine Aktivität haben, enthalten. Die Kinetik von proteolytischen Gel-Abbau kann also durch einfach Mittel manipuliert werden. Ein synthetisches Substrat, dass ein Hydrogel durch Michael-Typ-Addition bilden kann, wurde identifiziert (GCRDGPQGIWGQDRCG) (SEQ ID Nr: 9), das signifikant schneller abgebaut wird als das Peptid, das von einer Sequenz abgeleitet ist, die in der natürlichen Collagen Typ I (1α)-Kette gefunden wird (GCRDGPQGIAGQDRCG) (SEQ ID Nr: 10). Ausserdem wurde ein Peptid identifiziert, das nicht empfindlich ist auf zellabgesonderte MMP's.
Beispiel 9: Änderung der Zellinvasionsrate in MMP-empfindliche Hydrogele durch die Adhäsionsstellen-Dichte
Herstellung von MMP-empfindlichen Hydrogelen mit unterschiedlicher Adhäsionsstellen-Dichte
Hydrogele wurden wie folgt hergestellt, mit unterschiedlicher Dichte des Adhäsions-Peptids (Ac-GCGYGRGDSPG-NH₂) (SEQ ID Nr: 4): Zuerst wurden Adhäsions-Peptide in unterschiedlichen Konzentrationen an einem 4-Arm-PEG-Vinylsulfon (Molekulargewicht 20'000) angehängt, indem der PEG-Vorläufer (TEOA Puffer (0.3 M, pH 8.0)) mit dem Adhäsions-Peptid gemischt wurde, das auch im gleichen Puffer gelöst war. Die Reaktion wurde während 30 Minuten bei 37°C laufen gelassen. Dann wurde das MMP-empfindliche Peptid Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂ (SEQ ID Nr: 6) mit der obigen Lösung gemischt, die immer noch Michael-Typ-Reaktivität besass, und Gele wurden gebildet um einen Zell-Fibrin-Cluster herum gemäss dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren. Proben wurden auch parallel ausgehärtet und das Schwellen wurde gemessen, um zu garantieren, dass die Adhäsionsstellen-Dichte konstant war in allen Gelen nach dem Schwellen und daher Unterschiede in der Zell-Migration klar der Änderung im Aufbau des Netzwerks zugeordnet werden können.
Zellinvasionsrate bei einer gegebenen MMP-Empfindlichkeit und Aufbau des Netzwerks kann wie gewünscht (rational) massgeschneidert werden durch die Adhäsivität des Netzwerks
Dreidimensionale Zellinvasion wird durch die Dichte der eingebauten RGD-Stellen vermittelt (5). 5 ist ein Graph der Invasionsrate als Funktion der RGD-Dichte. Die hFF-Invasionsrate hängt in einer biphasischen Art und Weise von der Konzentration der Adhäsions-Liganden ab. Wir haben ein Konzentrations-System gefunden, das signifikant höhere Migrationsraten zeigt als unterhalb oder oberhalb der bestimmten Konzentration. Die Kinetik des proteolytischen Gel-Abbaus kann also durch die Adhäsionsstellen-Dichte manipuliert werden.
Beispiel 10: Änderung der Zellinvasionsrate in MMP-empfindlichen Hydrogelen durch das Molekulargewicht (Struktur und Anzahl Arme) des verwendeten Makromers
Herstellung von MMP-empfindlichen Hydrogelen mit unterschiedlicher Netzwerkarchitektur
Hydrogele wurden wie folgt hergestellt, mit verschiedenen PEG-VS Makromeren (4-Arm-20 kD, 4-Arm-15 kD, 4-Arm-10 kD, 8-Arm-20 kD): Als erstes wurden Adhäsionspeptide mit einer vorgegebenen Konzentration von 0.1 mM (im Hinblick auf das gequollene Netzwerk) an das Makromer durch Mischen des PEG-Vorläufers (TEOA-Puffer (0.3 M, pH 8.0)) mit dem im selben Puffer aufgelösten Adhäsionspeptid angebunden. Die Reaktion wurde während 30 Minuten bei 37°C laufen gelassen. Dann wurde das MMP-empfindliche Peptid Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂ (SEQ ID NR: 6) mit der oben genannten immer noch Michael-Typ-Reaktivität aufweisenden Lösung gemischt und es wurden Gele um Zell-Fibrin-Cluster gebildet, gemäss der Methode wie in Beispiel 7 beschrieben. Die Proben wurden parallel ausgehärtet und die Quellung wurde gemessen, um sicherzustellen, dass die Unterschiede in der Zellmigration einfach der Änderung in der Adhäsivität (und nicht Unterschieden in der Netzwerkarchitektur, d. h. in der Vernetzungsdichte aufgrund unterschiedlicher Dichten der aufgepfropften bzw. angebundenen Adhäsionsstellen.
Zellinvasionsrate bei einer vorgegebenen Adhäsivität und MMP-Empfindlichkeit des Netzwerks kann wie gewünscht zugeschnitten werden, durch die MMP-Aktivität des eingebauten Peptid-Substrats.
Zell-Invasion in synthetische Gele wird auch durch die Netzwerkarchitektur (6) vermittelt. 6 ist ein Graph, der das Ausmass der radialen Invasion als Funktion der Inkubationszeit für Materialien mit Armen von unterschiedlichem Molekulargewicht und erhöhtem Grad an Funktionalität zeigt. Die Zellinvasion in synthetische Gele nimmt mit dem Molekulargewicht zu. Die HFF-Invasionsrate stieg mit dem Molekulargewicht bei konstanter RGD-Dichte und für das gleiche MMP-Substrat an. Ein Schwellen-Molekulargewicht (4-Arm-PEG-10 kD), unterhalb dessen die Zellinvasion praktisch aufhörte, wurde gefunden. Daher kann die Kinetik des proteolytischen Gel-Abbaus auch durch die Netzwerk-Architektur gesteuert werden.
Beispiel 11: Steigende zelluläre Infiltration durch Auflockern der Netzwerkstruktur, beispielsweise durch Erzeugung von Defekten und Austauschen der Zellmigration von einem proteolytischen zu einem nicht-proteolytischen Mechanismus
Herstellung von MMP-nicht-empfindlichen und adhäsiven Hydrogelen, die eine nicht-proteolytische Zellinfiltration erlauben, und Herstellung von MMP-empfindlichen und adhäsiven Gelen, die eine grosse Anzahl von Defekten enthalten (hier: baumelnde Enden)
Nicht-MMP empfindliche Hydrogele wurden wie folgt hergestellt: Zuerst wurden einige bekannte Fraktionen von VS-Gruppen eines 4-armigen PEG-VS 20 kD Makromers bei 37°C für 30 Minuten mit der Aminosäure Cystein umgesetzt, um die Vinylsulfonfunktionalität vor. der Netzwerkbildung zu „töten", um ein Netzwerk mit Defekten zu bilden (d. h. hängende Ketten, die nicht als elastische aktive Ketten mitwirken konnten). Anschliessend, wurden die Adhäsionspeptide bei einer gegebenen Konzentration von 0.1 mM (bezogen auf das gequollene Netzwerk!) an einem 4-armigen PEG-VS 20 kD Makromer befestig, in dem der vorgängig modifizierte PEG-Vorläufer (TEOA Puffer (0.3 M, pH 8.0) mit dem Adhäsionspeptid, das ebenfalls im gleichen Puffer gelöst war, gemischt wurde. Die Reaktion fand während 30 Minuten bei 37°C statt. Nachher wurde der Vorläufer mit einem PEG-Dithiol (M.W. 3.4 kD) vernetzt. Das Quellen der Proben wurden parallel durchgeführt, um zu kontrollieren, dass die Unterschiede der Zellmigration einfach den Veränderungen in der Netzwerkarchitektur zuzuordnen waren (d. h. der Bildung von Defekten, die das Netzwerk auflockern).
MMP-empfindliche Hydrogele wurde ähnlich mit grossen Mengen von Defekten gebildet, in dem zuerst die PEG-VS Makromere mit der Aminosäure Cystein umgesetzt wurden, um die Vinylsulfonfunktionalitäten vor der Netzwerkbildung zu „töten". Die Funktionalisierung mit den Adhäsionsstellen und die Vernetzung wurde wie eben beschrieben durchgeführt.
Die nicht-proteolytische Zellinvasion innerhalb der Hydrogele findet bei einem sehr locker vernetzten Netzwerk statt und die zelluläre Invasion kann durch Auflockerung des Netzwerkes von MMP-empfindlichen Gelen beschleunigt werden.
Netzwerke können mit nicht-MMP-empfindlichen Molekülen so gebildet werden, dass immer noch eine dreidimensionale Zellinvasion stattfindet (7B). 7B ist eine Kurve, die die Menge der radialen Zellinvasion für eine nicht abbaubare Matrix zeigt (ausgedrückt als % der radialen Invasion in Fibrin). Ein sehr hoher Grad von Defekten ist jedoch notwendig, d. h. ein sehr locker vernetztes Netzwerk (G grösser als ungefähr 10). Die Zellmorphologie ist verschieden von der, die bei proteolytisch abbaubaren Matrixen gefunden wurde. Die Zellen sind sehr dünn und spindelförmig und migrieren beinahe vollständig direkt und radial aus dem Cluster. Der Mechanismus der zellulären Infiltration kann daher von einem vorwiegend proteolytischen zu einem nicht proteolytischen gewechselt werden. Durch überdecken der VS-Gruppen mit der Aminosäure Cys vor dem Vernetzen, können MMP-empfindliche Gele mit einer sehr locker vernetzen Architektur gebildet werden. Die zelluläre Invasion solcher Matrixen wird signifikant gesteigert im Vergleich zu dem „perfekten" Netzwerk (7A). 7A zeigt eine Kurve des radialen Abstandes der Zellinvasion in mm als Funktion der Inkubationszeit für eine stark fehlerhafte Matrix, für eine ideale Matrix und für Fibrin. Die Zellinvasionsraten für eine stark fehlerhafte Matrix kommen beinahe an die Fibrinrate.
Beispiel 12: Hydrogele von 4-armigen PEG-Itakonaten 20 K
Die Hydrogele wurden mit 4-armigen PEG (MW 20 K), die mit Itakonaten funktionalisiert waren, und bifunktionellen Thiolen, entweder in Form von Peptiden mit Cysteinresten, beispielsweise Acetyl-GCRDGPQGIWGQDRCG-CONH (SEQ ID NO: 6) oder als Thiol-PEG-Thiol, beispielsweise linear, MW 3.4 K, hergestellt.
Synthese der 4-armigen PEG-Itakonaten
4-Wasserstoff-1-Methylitakonat
102.1 g (0.65 mol) Dimethylitakonat und 35.0 g (0.18) Toluol-4-Sulfonsäure Monohydrat wurden in 50 ml Wasser und 250 ml Ameisensäure in einem 1000 ml Rundkolben gelöst, der mit einem Rückflusskühler, einem Thermometer und einem Magnetrührer versehen war. Die Lösung wurde leicht zum Rückflussieren gebracht, in dem der Kolben in ein Ölbad bei 120°C getaucht wurde und für 45 Minuten gerührt wurde. Anschliessend wurde die Reaktion abgebrochen, in dem die leicht gelbe, klare Reaktionsmischung unter Rühren in 300 g Eis gegossen wurde. Die entstehende klare wässrige Lösung wurde in einen Scheidetrichter transferiert und das Produkt durch dreimaliges Waschen mit 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel mit dem Rotationsverdampfer entfernt, wobei 64.5 g Rohprodukt erhalten wurde. Ein weiteres Extrahieren der wässrigen Phase mit 200 ml Dichlormethan führte zu weiteren 6.4 g Rohprodukt. Ein typischer saurer Geruch zeigte die Anwesenheit von Ameisensäure in den Fraktionen an, die durch Lösen der kombinierten Fraktionen in 150 ml Dichlormethan und zweimaligem Waschen mit einer gesättigten NaCl-Lösung entfernt wurde. Nach dem Trocknen der organischen Phasen über MgSO₄ und Verdampfen des Lösungsmittels wurden 60.1 g eines klaren, farblosen Öls erhalten, das unter reduziertem Druck destilliert wurde, was 55.3 g eines klaren und farblosen Öls ergab. Gemäss der ¹H-NMR Analyse besteht das Produkt aus 91% 4-Wasserstoff-1-Methyl-Itakonat, 5% 1-Wasserstoff-4-Methyl-Itakonat und 4% Dimethylitakonat.
Gelbildung
Kurz zusammengefasst, wurden die Vorläuferlösungen in stöchiometrischem Verhältnis bezüglich ihrer Endgruppen gemischt. Wie es auch für die Reaktion der Thiole mit den Vinylsulfonen und Acrylaten nötig war, war die Anwesenheit von Triethanolamin in gepufferter Form (TEOA) notwendig, um die Michaelreaktion zwischen den Thiolen und Itakonaten voranzutreiben.

Die Gelbildungsrate der PEG-Itakonate war abhängig von der Menge des Basenkatalysators sowie vom resultierenden pH des Systems. Tabelle 1 stellt die Zeit (Min.) am Anfang der Gelierung für 10% w/w PEG-Itakonat/PEG-Thiol Hydrogele bezüglich des pHs und der Konzentration des TEOA-Puffers bei Raumtemperatur (–23°C) und 37°C (Inkubator/Wasserbad*) dar. Der Anfang der Gelierung war als der Punkt definiert, an dem die flüssige Vorläuferlösung an der Pipettenspitze klebte, die verwendet wurde, um die Proben zu testen. Tabelle 1.

	Base/Puffer	pH	Anfang der Gelierung, Min
Raumtemperatur	0.15 M TEOA	10.2	6
(23°C)		9.5	10
		9.1	17
		8.6	25
		8.4	> 40
	0.3 M	9.0	8
		8.6	12.5
		8.4	30.5
37°C	0.3 M	> 9.5	3.5
		9.0	< 7.5/5
		8.6	11/9
		8.4	24/20
		8.2	45/n. a.
		7.9	48/n. a.

– Beachte: Die Gelierungszeiten waren in dem Wasserbad im Allgemeinen schneller als diejenigen im Inkubator, wahrscheinlich wegen der besseren Wärmeübertragung, die zu einer höheren tatsächlichen Reaktionstemperatur führt.

Die Itakonat-Thiolreaktion stellte Hydrogele her, die typische Charakteristika von 4-armigen 20 K PEG-Gelen aufwiesen, wie diejenigen, die durch Reaktion anderer funktionalisierter Endgruppen gebildet wurden, wie beispielsweise VS oder AC. Physikalisch waren die Gele klar und weich wie vorangehend für PEG-Gele beschrieben, die durch Reaktion anderer funktionalisierter Gruppen gebildet wurden. Zusätzlich quellten 10% und 20% w/w Gele signifikant nach einer Inkubation in einer Salzlösung bei 37°C für 24 Stunden.
Zellkultur
PEG-Itakonat/Peptidhydrogele unterstützten auch die in vitro Zellkulturen in Anwesenheit von zugegebenen RGD Peptiden.
Beispiel 13: Knochenregeneration
Knochenregeneration im Rattenschädel
Die Tiere wurden durch Induktion und Erhaltung mit Halothan/O₂ anästhesiert. Der Operationsbereich wurde geschoren und mit Iod für eine sterile Operation vorbereitet. Vom Nasenbein bis zum midsagittalen Kamm wurde ein linearer Schnitt gemacht. Das Weichgewebe wurde zurückgelegt und die Knochenhaut von der Seite freigelegt (Hinterkopf, stirnseitig, Scheitelbeinknochen). Ein ach mm grosser Schädeldefekt wurde mit einem Bohrer in einem dentalen Handteil hergestellt, wobei ein Durchbruch durch die Hirnhaut sorgfältig vermieden wurde. Der Operationsbereich wurde mit einer salzhaltigen Lösung gespült, um Knochentrümmer zu entfernen und ein hergestelltes Gel wurde innerhalb des Defektes platziert. Das Weichgewebe wurde mit Hautheftklammern geschlossen. Nach der Operation wurde mittels SQ Injektion von Buprenorphin (0.1 mg/kg) Schmerzfreiheit gewährleistet. 21–35 Tage nach der Implantation wurden die Ratten durch CO₂-Erstickung getötet. Schädelstücke mit 5 mm zusammenhängendem Knochen wurden vom Schädel entnommen und in 40% Ethanol gelegt. Bei sämtlichen Schritten hat der Operateur bezüglich der Behandlung der Defekte blind gearbeitet. Die Proben wurden sequenziell getrocknet: 40% Ethanol (2 d), 70% Ethanol (3 d), 96% Ethanol (3 d) und 100% Ethanol (3 d). Die getrockneten Proben wurden in Xylol (3 d) entfettet. Die entfetteten Proben wurden mit Methylmethacrylat (MMA, Fluka 64200) gesättigt (3 d) und anschliessend bei 4°C durch Tränken (3 d) in MMA enthaltend Dibenzoylperoxid (20 mg/ml, Fluka 38581) fixiert. Die fixierten Proben wurden in MMA, Dibenzoylperoxid (30 mg/ml) und 100 μl/ml Plastoid N oder Dibutylthalat (Merck) bei 37°C eingebettet. Schnitte (5 μg) wurden mit Toluidinblau O und Goldner Trichrom gefärbt. Die histologischen Schnitte wurden gescannt und die digitalen Bilden mit Leica QWin Software weiterverarbeitet.
Die Knochenheilung im Rattenschädeldefektmodel kann durch mehrere Matrixcharakteristika massgeschneidert angepasst werden
Synthetische Hydrogele wurden verwendet, um die de novo Knochenbildung in vivo zu induzieren.
Die histologischen Präparate zeigten, dass die Heilungsantwort im Wesentlichen von der Zusammensetzung der Hydrogel Matrix abhängt. Bei einer Dosis von 5 μg BMP-2 pro Implantat wurden Möp-empfindliche Peptide, enthaltend ein schnell abbaubares Substrat, Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG (SEQ ID NO: 11) und adhäsive Hydrogele durch die Zellen infiltriert, überwiegend wurden Fibroblasten ähnliche Zellen und intramembrane Knochenbildung beobachtet. Nach 5 Wochen waren die Implantatmaterialien vollständig resorbiert und neuer Knochen bedeckte den Defektbereich. Eine vollständige Überbrückung der Defekte wurde hier beobachtet. Kontrollmaterial hergestellt aus einem MMP-unempfindlichen PEG(SH)2 zeigte keine Zellinfiltration und nur Knochenbildung um die intakten Gelimplantate. Das langsamer abbaubare Oligopeptid Ac-GCRDGPQGIAGQDRCG (SEQ ID NO: 12) führte zu signifikant weniger Zellinfiltration. Folglich war die Heilungsantwort in vivo abhängig von der enzymatischen Aktivität des eingebauten Substrates.
Gele mit verschiedener Struktur wurden getestet, einschliesslich MMP-empfindlicher degradierbarer Gele, die mit 4 armigen PEG-VS 15 kD hergestellt wurden, MMP-empfindlicher Gele, die mit 4-armigen PEG-VS 20 kD 20 K hergestellt wurden und hydrolytisch abbaubarer Gele, die mit PEG-Dithiol 3.4 kD und 4-armigem PEG-Acrylat hergestellt wurden, jedes bei 12% w/w der Gesamtzusammensetzung. Zu diesem frühen Zeitpunkt wurde in jedem Tier eine vollständige Überbrückung des Defekts beobachtet zusammen mit deutlichen morphologischen Unterschieden. Das langsamer abbaubare Gel zeigte weniger Zellinfiltration und mehr überbleibende Matrix, während das schnellste abbaubare Gel neu gebildeten Knochen mit einer ähnlichen Morphologie wie beim ursprünglichen Knochen zeigte.
Knochenheilung in dem 8 mm Schaf-Bohr-Defektmodell
8 mm Bohrdefekte wurden im Schienbein und Oberschenkel von Schafen hergestellt und verschiedene synthetische Matrixen wurden in situ in der Gegenwart von 20 μg/ml rhBMP-2 polymerisiert, um die Fähigkeit dieser Matrixen, die Heilung eines Knochendefektes zu induzieren, zu untersuchen. Wir schlugen vor, dass es wesentlich für die Wundheilung sei, dass die Matrix starke Zellinfiltationscharakteristika aufweist, das heisst, dass die Zellen leicht eintreten können und die synthetische Matrix neu gestalten. Wie vorher beschrieben, haben wir in vitro und in anderen in vivo Modellen gezeigt, dass die Details der Matrix, das Einbauen von Abbaustellen, die Zusammensetzung der Matrix und die Dichte der Matrix als Beispiel wesentlich für funktionierende Zellinfiltration sind. Mit dem Entwicklungsverfahren, das oben dargelegt wurde, wurde eine Serie von Materialien mit verschienenen Zellinfiltrationscharakteristiken entwickelt. Mit dieser extensiven Serie wurden fünf Materialien im Schaf getestet, wobei ein Bereich von Zellmigrationseigenschaften dargestellt wurde. Diese Materialien wurden mit SRT 1–5 bezeichnet, wobei SRT1 die kleinsten Zellinfiltrationscharakterisika aufweist. Die Menge der Infiltration steigt dann durch die Serie bis zu SRT5 an, die die grösste Menge Zellinfiltration in die Matrix erlaubt. Die Tiere wurden für 8 Wochen geheilt und anschliessend getötet und die Defektregion für eine Analyse mittels Mikro-computergestützter Topographie (μCT) sowie für eine histologische Analyse operativ entnommen.
Die Knochenheilung in dem 8 mm Schaf-Bohr-Defektmodell kann durch mehrere Matrixcharakteristika massgeschneidert angepasst werden.
Die fünf getesteten Materialen wurden mit zwei verschiedenen Änderungen in der Zusammensetzung erforscht. SRT1 ist ein Hydrogel mit einer Plasmin Abbaustelle, die im Rückgrad inkorporiert wurde, während SRT2 ein Hydrogel mit identischer Struktur, aber mit einer Collagenase Abbaustelle im Rückgrad ist. Diese Gele wurden durch Mischen eines Peptides hergestellt, wobei jedes entsprechende Enzym gespalten werden kann, das durch zwei Thiole umklammert ist (Cysteine), das dann mit RGD modifiziertem 4-armigem 15 K PEG Vinylsulfon vernetzt wird. Die Resultate werden in 8 gezeigt. Es kann gesehen werden, dass durch Veränderung der Spezifität des Enzyms, das das Gel abbaut, eine unterschiedliche Heilungsantwort beobachtet wird, wobei die Collagenase-Abbausequenz bessere Resultate ergibt.
Zusätzlich wurde der Effekt der strukturellen Aspekte ebenfalls erforscht. SRT2, SRT3 und SRT4 stellen Gele mit abnehmender Vernetzungsdichte dar und es kann festgestellt werden, dass die Heilungsrate erhöht wird, wenn die Vernetzungsdichte abnimmt. SRT3 wird von einem Trithiolpeptid und einem linearen PEG Vinylsulfon hergestellt, während SRT4 identisch zu SRT2 ist, mit der Ausnahme, dass es ein 4-armiges 20 K PEG anstelle eines 4-armigen 15 K PEG ist, was zu einer tieferen Vernetzungsdichte führt. Dies wird klar eine Grenze haben, da eine minimale Vernetzungsdichte erforderlich ist, um eine Gelierung zu erhalten. Schliesslich ist SRT5 eine hydrolytisch abbaubare Matrix hergestellt von einem 4-armigen 15 K PEG-Acrylate und einem 3.4 K PEG Dithiol. Diese Gele haben die schnellste Abbauzeit und als solche die höchste Heilungsrate.
Durch Analyse dieser Resultate ist es wichtig zu beachten, wo die Implantate angeordnet waren. Diese Implantate waren innerhalb des fehlenden Knochens angeordnet und als solches, wird das gesamte Volumen des Knochens nicht mit kalzifiziertem Gewebe gefüllt. Wenn normal fehlender Knochen mittels μCT analysiert wird, ist die Knochenvolumenfraktion ungefähr 20%. Wenn μCT angewendet wurde, um die Resultate von verschiedenen synthetischen Materialien, die in der Untersuchung getestet. wurden, zu testen, wurde neu gebildeter kalzifizierter Knochen innerhalb des ursprünglichen Defekts gefunden. In einigen Beispielen war die Menge des Knochens sehr substantiell für die angewendete Dosis, was zu ungefähr 20% kalzifiziertem Volumen geführt hat. Es gab ebenso einen klaren Trend bei der Heilungsantwort bezüglich der Zellinfiltrationscharakteristika der angewendeten Gele. Gele, die eine beschränkte Eignung für Zellinfiltration haben, zeigten die geringste Heilungsantwort, wobei sich neu gebildetes Gewebe nur an den Wänden des Defektes zeigte und kein kalzifiziertes Gewebe im Zentrum. Im Gegensatz dazu zeigten Materialien mit einer schnellen Zellinfiltration höhere Heilungsantworten mit einer direkten Korrelation zwischen schneller Zellinfiltration und besseren Knochenheilung.
Die Resultate wurden weiter mittels Histologie bestätigt. Beim Analysieren der histologischen Schnitte wurde beobachtet, dass der knochenlose Hohlraum im Zentrum von „SRT1" ein Gel darstellt, das sich überhaupt nicht abgebaut hat. In jeder Probe der Serie wurde ein Gel beobachtet, jedoch zeigten Materialien mit schnellen Zellinfiltrationseigenschaften weniger verbleibendes Gel und mehr Knochen und Knochenvorläufer innerhalb des Zentrums des Defektes. Dies zeigt deutlich, dass der gebildete Knochen durch Infiltration der umliegenden Zellen in die Matrix und nachfolgender Umwandlung und Bildung von Knochen und Knochenmatrix gebildet wurde. In einigen Beispielen, in denen die Infiltration der Zellen in die Matrix langsam ist, ist es möglich die Regeneration zu blockieren und inhibieren. Wenn jedoch eine Matrix angewendet wird, die schnelle Zellinfiltrationseigenschaften hat, kann die Menge der Knochenheilung einschneidend verbessert werden, was zu einer exzellenten Heilungsantwort führt.
Einfluss der Ausgangskonzentration des ersten Vorläufermoleküls bei der Heilungsantwort in einem Schaf-Bohrloch-Modell
Zwei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen von enzymatisch abbaubaren Gelen wurden angewendet. In jeder davon wurde die Konzentration von RGD und des aktiven Faktors (CplPTH bei 100 μg/ml) konstant gehalten. Das polymerische Netzwerk wurde durch ein vierarmiges verzweigtes PEG, funktionalisiert mit vier Vinylsulfonendgruppen, mit einem Molekulargewicht von 20 kD (Molekulargewicht von jedem der Arme 5 kD) und einem Dithiolpeptid der nachfolgenden Sequenz Gly-Cys-Arg-Asp-(Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln)-Asp-Arg-Cys-Gly (SEQ ID NO:9) gebildet. Beide Vorläufermoleküle wurden in 0.3 M Triethanolamin gelöst. Die Ausgangskonzentration des funktionalisierten PEGs (erstes Vorläufermolekül) und des Dithiolpeptides (zweites Vorläufermolekül) wurden variiert. In einem Fall war die Konzentration 12.6 Gewichts% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung. Die zweite Ausgangskonzentration war 9.5 Gewichts% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung. Dies hat zur Konsequenz, dass die Menge des Dithiolpeptides verändert wurde, sodass das molare Verhältnis zwischen Vinylsulfonen und Thiolen erhalten blieb.
Das Gel, das bei einer Ausgangskonzentration von 12.6 Gewichts% begann, quellte zu einer Konzentration von 8.9 Gewichts% des Gesamtgewichts des polymerischen Netzwerkes plus Wasser, das heisst, die Matrix hatte einen Wassergehalt von 91.1. Das Gel, das bei einer Ausgangskonzentration von 9.5 Gewichts% begann, quellte zu einer Endkonzentration von 7.4 Gewichts% des Gesamtgewichts des polymeren Netzwerks plus Wasser, das heisst, hatte einen Wassergehalt von 92.6.
Um den Effekt dieser Veränderung zu erklären, wurden die Materialen in dem Schaffbohrdefekt getestet. Hier wurde ein 750 μl Defekt in dem fehlenden Knochen der Diaphyse des Oberschenkels und des Oberarms des Schafes gelegt und in situ mit einem gelierenden enzymatischen Gel gefüllt. Die folgende Menge an kalzifiziertem Gewebe wurde erhalten, bestimmt mittels μCT mit jeder Gruppe bei N = 2:

Ausgangskonzentration des Gels Gewebe Kalzifiziertes

12.6% 2.7%

9.5% 38.4%
Je weniger dicht und einfacher für ein Zelleindringen die Gele hergestellt werden, desto stärker war die Heilungsantwort mit der Zugabe eines aktiven Faktors. Der Effekt einer festen Endkonzentration unter 8.5% ist offensichtlich durch diese Resultate.
Offensichtlich ist demnach das Design einer Matrix wesentlich, um eine Heilung bei Wunddefekten sicherzustellen. Jedes dieser Hydrogele war aus langen Polyethylenglykolketten zusammengesetzt, wobei die Enden verknüpft waren, um eine Matrix zu bilden. Die Details jedoch, wie sie mittels enzymatischen Abbaustellen verknüpft waren, Dichte der Verbindungsmoleküle und mehrere andere Variablen waren wesentlich, um eine funktionelle Heilungsantwort sicherzustellen. Diese Unterschiede waren sehr klar in dem Schafbohr-Defekt-Modell zu erkennen.
Beispiel 14: Hydrogele aus 4-Arm-PEG-Acrylaten
110 mg von Pentaerythritol-Polyethylenglycol-Ether-Tetra-Acrylat (4-Arm-PEG-Acrylat; MW = 15 kDa) wurden in 0.5 ml IRIS/HCl-Puffer (pH 8.0) durch Mischen („vortexing") während 10–15 Sekunden gelöst (Lösung ACR). 45 mg von linearem Polyethylenglycol-Dithiol wurden in 0.5 ml IRIS/HCl-Puffer (pH 8.0) durch Mischen („vortexing") während 10–15 Sekunden gelöst (Lösung SH). 500 μl von der Lösung ACR wurden mit 500 μl von der Lösung SH in einem Eppendorf-Röhrchen gemischt und während 10 Sekunden gemischt.
Die Gewichtsprozent der beiden Vorläufermoleküle, vor dem Vernetzen, betrug 13.74 Gewichts-% des Gewichts der gesamten Zusammensetzung. Die Lösung der beiden Vorläufermoleküle hatte eine Gelbildungszeit von 3 bis 4 Minuten bei pH 8.0 und bei einer Temperatur zwischen 18°C und 30°C. Die Gelbildungszeit von einem 27.5% PEG-Gel (gesamter PEG-Gehalt) in Triethanolamin war im Durchschnitt 60% schneller als die Gelbildungsgeschwindigkeit des 13.74% w/w PEG-Gel, wogegen ein 10.8% w/w PEG-Gel in Triethanolamin eine Gelbildungsgeschwindigkeit hatte, die etwa 30% langsamer als jene des Referenz-Gels von 13.74% w/w war. Die längere Gelbildungszeit des 10.8% w/w synthetischen Gels wurde durch Erhöhen des pHs des Triethanolamin-Puffers auf 8.5 verkürzt. Dieser pH ist jedoch weniger biokompatibel als derjenige, der in der aktuellen Formulierung verwendet wird. Im Weiteren ist die höhere Reaktivität der Vorläufer bei diesem pH für die zahlreicheren Defekte im resultierenden Netzwerk verantwortlich, da die PEG-Moleküle keine Zeit mehr haben, sich in der Lösung neu zu ordnen, um so zu gewährleisten, dass jede reaktive Gruppe auf dem ersten Vorläufermolekül mit ihrem Gegenstück auf dem zweiten Vorläufermolekül reagieren wird. Das Vorhandensein von Unvollkommenheiten in dem Gel wird durch eine kürzere Abbauzeit in vitro widerspiegelt (Abbau-Puffer: physiologische Phosphat-Pufferlösung). Triethanolamin ist zudem aufgrund seiner Empfindlichkeit gegenüber Licht und Luft in seiner Handhabung schwierig.
Die 13.74% w/w PEG-Gele zeigen eine Gelbildungszeit, Handhabbarkeit und Abbau-Eigenschaften, die für klinische Anwendungen geeignet sind. Das 13.74% w/w Gel erreicht sein Gleichgewicht nach 24 Stunden mit einer Volumenzunahme von 300–400%, wenn es während eines Abbau-Versuchs in Phosphat-Puffer bei einem pH von 7.4 (physiologischer Phosphat-Puffer) eingetaucht wird.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- US 5874500 [0004]
- WO 00/44808 [0004, 0088]

Claims

Biomaterial umfassend ein dreidimensionales polymeres Netzwerk erhalten durch die Reaktion einer Zusammensetzung von mindestens einem ersten Vorläufermolekül mit einer oder mehreren nukleophilen Gruppen und einem zweiten Vorläufermolekül mit einer oder mehreren elektrophilen Gruppen und einer basischen Lösung, wobei das erste Vorläufermolekül ein lineares Polyethylenglycol-Dithiol ist, das zweite Vorläufermolekül ein Pentaerythritol-Polyethylenglycol-Ether-Tetra-Acrylat ist und wobei die Summe der Gewichte des ersten und des zweiten Vorläufermoleküls im Bereich von 8% bis 16% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung liegt.
Biomaterial nach Anspruch 1, wobei eines oder beide der Vorläufermoleküle kovalent an eines oder mehrere Moleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelladhäsionspeptiden, Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktor-ähnlichen Peptiden, gebunden ist.
Kit zur Herstellung des Biomaterials nach einem der Ansprüche 1 oder 2, umfassend ein erstes Vorläufermolekül mit einer oder mehreren nukleophilen Gruppen und ein zweites Vorläufermolekül mit einer oder mehreren elektrophilen Gruppen, wobei das erste Vorläufermolekül ein lineares Polyethylenglycol-Dithiol ist, das zweite Vorläufermolekül ein Pentaerythritol-Polyethylenglycol-Ether-Tetra-Acrylat ist.
Kit nach Anspruch 3, wobei das Äquivalenzgewicht der elektrophilen Gruppen des zweiten Vorläufermoleküls und der nukleophilen Gruppen des ersten Vorläufermoleküls im Bereich zwischen 0.7 und 1.1, bevorzugt zwischen 0.9 und 1.1 und besonders bevorzugt etwa 1.0 ist.
Kit nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei das Kit eine Pufferlösung umfasst.