WO2014157186A1 - 温度応答性ポリマーを含む低膨潤度の新規ハイドロゲル - Google Patents

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WO2014157186A1
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temperature
tetra
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gel
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崇匡 酒井
雄一 鄭
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国立大学法人 東京大学
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    • C08G65/33337—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing imide group cyclic

Definitions

  • the present invention relates to a hydrogel containing a temperature-responsive polymer, which can suppress swelling in a solution and maintain its shape and mechanical properties.
  • hydrogel which is a gel material containing a hydrophilic polymer having a network structure
  • Hydrogel has excellent water retention and biocompatibility characteristics, so it can be used not only for medical purposes such as sealing, adhesion prevention, drug delivery and contact lenses, but also for various applications such as sensors and surface coatings.
  • expected materials for example, Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Document 1).
  • the hydrogel is an open-type substance whose volume is occupied by water.
  • the hydrogel swells in water due to the osmotic pressure resulting from the concentration difference between the gel and the external environment. There was a problem that sufficient mechanical strength could not be obtained.
  • the present invention maintains the original shape at a living body temperature by controlling the degree of swelling of the gel in water and has high breaking strength. It is an object to provide a novel hydrogel composition.
  • the present inventors combined a polymer having a polyethylene glycol skeleton capable of forming a hydrogel with a temperature-responsive polymer having a phase transition temperature, and crosslinked these to form a network structure. It has been found that the degree of swelling of the gel in the solution can be controlled by making the hydrogel it has. Based on these findings, the present invention has been completed.
  • a hydrogel comprising a four-branched polymer having a polyethylene glycol skeleton and a temperature-responsive four-branched polymer having a phase transition temperature as a constituent component, and having a network structure in which the ends of the polymer are crosslinked by covalent bonds Relates to the composition.
  • a preferred embodiment of the hyde gel composition of the present invention is: (2) The hyde gel composition according to (1), wherein the phase transition temperature in the temperature-responsive four-branched polymer is a lower critical solution temperature (LCST); (3) The hide gel composition according to (1), wherein the phase transition temperature in the temperature-responsive four-branched polymer is in the range of 5 to 40 ° C.
  • LCST lower critical solution temperature
  • each m is the same or different and is an integer of 25 to 250;
  • Each X 1 is the same or different and is a C 1 -C 7 alkylene group, C 2 -C 7 alkenylene group, —NH—R a —, —CO—R a —, —R b —O—R c —, —R b —NH—R c —, —R b —CO 2 —R c —, —R b —CO 2 —NH—R c —, —R b —CO—R c —, or —R b —CO —NH—R c —, wherein R a represents a C 1 -C 7 alkylene group, R b represents a C 1 -C 3 alkylene group, and R
  • each Y 1 is a nucleophilic functional group selected from the group consisting of an amino group, —SH, and —CO 2 PhNO 2 ; or an N-hydroxy-succinimidyl (NHS) group, a sulfosuccinimidyl group , Maleimidyl group, phthalimidyl group, imidazolyl group, and nitrophenyl It is an electrophilic functional group selected from the group consisting of.
  • the temperature-responsive four-branched polymer is a polymer represented by the following formula (II) (Here, in formula (II), Each n is the same or different and is an integer of 25 to 250; Each R 1 is the same or different and is a C 1 -C 5 alkyl group; Each X 2 is the same or different and is a C 1 -C 7 alkylene group, C 2 -C 7 alkenylene group, —NH—R a —, —CO—R a —, —R b —O—R c —, —R b —NH—R c —, —R b —CO 2 —R c —, —R b —CO 2 —NH—R c —, —R b —CO—R c —, or —R b —CO —NH—R c —, wherein R a represents a C 1 -C 7 alkylene group, R b
  • each Y 2 is a nucleophilic functional group selected from the group consisting of an amino group, —SH, and —CO 2 PhNO 2 ; or an N-hydroxy-succinimidyl (NHS) group, a sulfosuccinimidyl group , Maleimidyl group, phthalimidyl group, imidazolyl group, and nitrophenyl It is an electrophilic functional group selected from the group consisting of.
  • the temperature-responsive four-branched polymer represented by the formula (II) is a copolymer comprising a combination of a monomer component in which R 1 is methyl and a monomer component in which R 1 is ethyl.
  • each Y 1 is selected from the group consisting of N-hydroxy-succinimidyl (NHS) group, sulfosuccinimidyl group, maleimidyl group, phthalimidyl group, imidazolyl group, and nitrophenyl group
  • Each Y 2 is a nucleophilic functional group selected from the group consisting of an amino group, —SH, and —CO 2 PhNO 2 ;
  • hydrogel composition is a degree of swelling in the range of volume change of 0.8 to 1.5 with respect to the volume at the time of gel preparation.
  • the present invention by controlling the degree of swelling of the hydrogel, the problems of strength and sustained usability in conventional hydrogels can be solved, and when introduced into a biological condition / body fluid immersion environment, In addition, it is possible to provide a novel hydrogel composition having a high breaking strength comparable to that of human cartilage while maintaining the original shape at the living body temperature.
  • the temperature-responsive polymer contracts at a certain temperature or higher and the gel
  • the swelling of other hydrophilic polymer segments is suppressed, and the swelling of the entire gel can be suppressed.
  • the degree of swelling / shrinkage of the entire hydrogel can be reduced depending on the desired application. It becomes possible to control.
  • FIG. 1 shows the structure of a hydrogel composition of the present invention comprising a four-branched hydrophilic polymer having a polyethylene glycol skeleton and a temperature-responsive four-branched polymer, and the temperature-responsive polymer component in the gel depends on the temperature.
  • FIG. 2 is a graph plotting the ratio of the temperature dependence of the volume change (expansion degree) in the hydrogel composition of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the measurement results of the stress-strain curve in the hydrogel composition of the present invention.
  • the hydrogel composition of the present invention comprises, as constituent components, a) a four-branched hydrophilic polymer having a polyethylene glycol skeleton, and b) a temperature-responsive four-branched polymer having a phase transition temperature. It has a network structure in which the ends are covalently crosslinked.
  • Hydrophilic polymer component having a polyethylene glycol skeleton The hydrophilic polymer component used in the hydrogel composition of the present invention has a polyethylene glycol skeleton, the hydrophilic polymers at the ends thereof, and / or the temperatures described below. It has a network structure by crosslinking with a responsive polymer. Preferably, it is a hydrophilic polymer capable of forming a hydrogel by containing water.
  • the “hydrogel” is a gel-like substance containing a hydrophilic polymer containing a large amount of water, and the “gel” generally means a dispersion having a high viscosity and losing fluidity. .
  • polymers capable of forming such a hydrogel include those in which polymer components having four polyethylene glycol branches are cross-linked to form a uniform network structure network.
  • a gel composed of a tetra-branched polyethylene glycol skeleton is generally known as a Tetra-PEG gel, and has an electrophilic functional group such as an active ester structure and a nucleophilic functional group such as an amino group at each end.
  • a network structure network is constructed by an AB-type cross-end coupling reaction between two types of four-branched polymers having the following.
  • Tetra-PEG gels have been reported by previous studies to have an ideal uniform network structure with no heterogeneity in the polymer network in the size region of 200 nm or less (Matsunaga et al., Macromolecules, Vol. 42, No. 4, pp. 1344-1351, 2009).
  • Tetra-PEG gel can be easily prepared in situ by simple two-component mixing of each polymer solution, and the gelation time can be controlled by adjusting the pH and ionic strength during gel preparation. It is. And since this gel has PEG as a main component, it is excellent also in biocompatibility.
  • the four-branched hydrophilic polymer having a polyethylene glycol skeleton used in the hydrogel composition of the present invention is a compound having a structure represented by the following general formula (I).
  • each m may be the same or different. As the value of each m is closer, a uniform three-dimensional structure can be taken and the strength becomes higher. For this reason, in order to obtain a highly strong gel, it is preferable that it is the same. If the value of each m is too high, the strength of the gel becomes weak, and if the value of each m is too low, the gel is difficult to form due to steric hindrance of the compound. Therefore, each m has an integer value of 25 to 250, preferably 35 to 180, more preferably 50 to 115, and particularly preferably 50 to 60.
  • the molecular weight is 5 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 4 Da, preferably 7.5 ⁇ 10 3 to 3 ⁇ 10 4 Da, and more preferably 1 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 4 Da.
  • each X 1 is a linker moiety that connects the functional group and the core portion.
  • Each X 1 may be the same or different, but is preferably the same in order to produce a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
  • Each X 1 represents a C 1 -C 7 alkylene group, a C 2 -C 7 alkenylene group, —NH—R a —, —CO—R a —, —R b —O—R c —, —R b —NH.
  • R a represents a C 1 -C 7 alkylene group
  • R b represents a C 1 -C 3 alkylene group
  • R c represents a C 1 -C 5 alkylene group.
  • C 1 -C 7 alkylene group means an alkylene group having 1 to 7 carbon atoms which may have a branch, and is a straight chain C 1 -C 7 alkylene group or one or two It means a C 2 -C 7 alkylene group having 2 or more branches (the number of carbons including branches is 2 or more and 7 or less).
  • Examples of C 1 -C 7 alkylene groups are a methylene group, an ethylene group, a propylene group and a butylene group.
  • C 1 -C 7 alkylene groups are —CH 2 —, — (CH 2 ) 2 —, — (CH 2 ) 3 —, —CH (CH 3 ) —, — (CH 2 ) 3 —, — ( CH (CH 3 )) 2 —, — (CH 2 ) 2 —CH (CH 3 ) —, — (CH 2 ) 3 —CH (CH 3 ) —, — (CH 2 ) 2 —CH (C 2 H 5 )-,-(CH 2 ) 6 -,-(CH 2 ) 2 -C (C 2 H 5 ) 2- , and-(CH 2 ) 3 C (CH 3 ) 2 CH 2- .
  • the “C 2 -C 7 alkenylene group” is an alkenylene group having 2 to 7 carbon atoms in the form of a chain having one or two or more double bonds in the chain or having a branched chain. And a divalent group having a double bond formed by removing 2 to 5 hydrogen atoms of adjacent carbon atoms from an alkylene group.
  • the alkylene group and the alkenylene group may have one or more arbitrary substituents.
  • substituents include an alkoxy group, a halogen atom (which may be a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom), an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, and an acyl group.
  • a group, an aryl group, and the like can be mentioned, but are not limited thereto.
  • the alkyl group has two or more substituents, they may be the same or different. The same applies to the alkyl moiety of other substituents containing an alkyl moiety (for example, an alkyloxy group or an aralkyl group).
  • a functional group when defined as “may have a substituent”, the type of substituent, the substitution position, and the number of substituents are not particularly limited, When it has two or more substituents, they may be the same or different.
  • substituent group include, but are not limited to, an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a halogen atom, a sulfo group, an amino group, an alkoxycarbonyl group, and an oxo group. These substituents may further have a substituent.
  • Each Y 2 is for forming a network structure network by AB type cross-end coupling reaction which is a cross-linking reaction by a covalent bond as described above, and is selected from a nucleophilic functional group or an electrophilic functional group Is done.
  • a four-branched hydrophilic polymer having a polyethylene glycol skeleton has an electrophilic functional group at the terminal, and in this case, Y 2 of the temperature-responsive four-branched polymer described below is a nucleophilic functional group. It is a group.
  • the end of the hydrophilic polymer is an amino group and the end of the temperature-responsive polymer is an ester structure containing N-hydroxy-succinimidyl (NHS), the end of each polymer is crosslinked by an amide bond. Form a gel.
  • N-hydroxy-succinimidyl N-hydroxy-succinimidyl
  • the reverse combination is also possible from the viewpoint of ease of synthesis and the like.
  • a hydrophilic polymer having a terminal nucleophilic functional group and a hydrophilic polymer having an electrophilic functional group may be used in combination.
  • the ratio of the hydrophilic polymer component and the temperature-responsive polymer component in the hydrogel composition can be appropriately changed.
  • an amino group is preferable when the terminal of the hydrophilic polymer is a nucleophilic functional group.
  • a nucleophilic functional group other than an amino group can be used as the functional group as long as a cross-linking having a high-strength steric structure is obtained.
  • examples of such a nucleophilic functional group include —SH or —CO 2 PhNO 2 (Ph represents an o-, m-, or p-phenylene group).
  • a nuclear functional group can be used as appropriate.
  • the functional groups may be the same or different, but are preferably the same. When the functional groups are the same, the reactivity with the nucleophilic functional group to be subjected to the crosslinking reaction becomes uniform, and it becomes easy to obtain a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
  • an N-hydroxy-succinimidyl (NHS) group is preferable.
  • active ester groups having electrophilicity include a sulfosuccinimidyl group, a maleimidyl group, a phthalimidyl group, an imidazolyl group, and a nitrophenyl group, and those skilled in the art can appropriately use known active ester groups.
  • the functional groups may be the same or different, but are preferably the same. When the functional groups are the same, the reactivity with the nucleophilic functional group to be subjected to the crosslinking reaction becomes uniform, and it becomes easy to obtain a high-strength gel having a uniform three-dimensional structure.
  • the temperature-responsive polymer component used in the hydrogel composition of the present invention is a polymer having a phase transition temperature in a solution and is crosslinked by crosslinking with the hydrophilic polymer component. It is a polymer that can form
  • the polymer having such a phase transition temperature is preferably a polymer (can include both natural products and synthetic polymers) having a lower critical solution temperature (LCST) or an upper critical solution temperature (UCST).
  • LCST lower critical solution temperature
  • UST upper critical solution temperature
  • the “polymer having the lower critical solution temperature” is solubilized in a solvent such as water at a certain temperature or lower, but reversibly shrinks within the molecule or aggregates between the molecules at a certain temperature or higher. Thus, it is insoluble in the solvent and has the property of showing phase separation.
  • “polymer having the upper critical solution temperature” is solubilized in a solvent such as water above a certain temperature, but reversibly contracts within the molecule or intermolecularly below a certain temperature. It has the property of aggregating and insolubilizing in the solvent and showing phase separation.
  • the phase transition temperature in the temperature-responsive polymer component is 5 to 40 ° C., preferably 10 to 35 ° C. in water.
  • the temperature is 10 to 35 ° C, more preferably 25 to 35 ° C.
  • the temperature is preferably such that the temperature-responsive polymer component in the gel contracts at the temperature at which the hydrogel is used.
  • the temperature-responsive polymer component is also a four-branched polymer. It is preferable for constituting a hydrogel.
  • the temperature-responsive four-branched polymer having a phase transition temperature used in the hydrogel composition of the present invention is, in one aspect, a compound having a polyalkyl glycidyl ether skeleton structure represented by the following general formula (II): It is.
  • each R 1 is a C 1 -C 5 alkyl group which may be the same or different, and is preferably methyl or ethyl.
  • the temperature-responsive four-branched polymer represented by formula (II) is a copolymer comprising a combination of a monomer component in which R 1 is methyl and a monomer component in which R 1 is ethyl.
  • the ratio of R 1 in such a copolymer it becomes possible to change the phase transition temperature of the entire temperature-responsive polymer to a desired one.
  • the molar ratio of the monomer component in which R 1 is methyl and the monomer component in which R 1 is ethyl is preferably 1: 9 to 3: 7, and preferably 2: 8.
  • a final hydrogel is formed by forming a gel using a temperature-responsive polymer component together with a hydrophilic polymer component capable of forming a hydrogel.
  • the degree of swelling in the gel composition can be controlled. For example, by using a Tetra-PEG gel of the formula (I) as a hydrophilic polymer component and substituting a part thereof with a temperature-responsive polymer component of the formula (II), a uniform network of a conventional Tetra-PEG gel is obtained. While maintaining the structure, it is possible to impart temperature responsiveness to the gel.
  • the temperature-responsive polymer component in the gel contracts depending on the temperature, thereby causing a volume phase transition as the entire gel, thereby suppressing swelling of the entire gel, It becomes possible to avoid a change in shape and a decrease in mechanical strength due to expansion.
  • the hydrophilic PEG phase is uniformly dispersed in the network structure, that is, the segment of the amphiphilic temperature-responsive polymer component is always surrounded by the segment of the hydrophilic polymer component. .
  • the degree of swelling of the gel in the contracted state can be adjusted by adjusting the amount of the temperature-responsive polymer component introduced into the Tetra-PEG gel or by using the temperature-responsive polymer component having an appropriate phase transition temperature. It is.
  • the volume of the hydrogel composition in the range of 30 to 40 ° C. in the aqueous solution is preferably the volume at the time of gel preparation.
  • the degree of swelling is in the range of 0.85 to 1.5 volume change. More preferably, the degree of swelling is 0.9 to 1.2.
  • the amount of the temperature-responsive polymer component to be introduced can be appropriately adjusted according to the desired degree of swelling.
  • the four-branched polymer having the polyethylene glycol skeleton and the temperature-responsive four-branched polymer are used. Is a molar ratio of 10:90 to 90:10, more preferably 30:70 to 70:30. As described above, the range of the molar ratio can be appropriately changed by adjusting the terminal functional groups in the hydrophilic polymer and the temperature-responsive polymer.
  • hydrogel composition which makes a hydrophilic polymer component and a temperature-responsive polymer component 60:40 can be obtained.
  • the hydrogel composition of the present invention preferably has a compressive breaking strength of 10 to 100 MPa, preferably 10 MPa or more, more preferably 60 MPa or more, exceeding that of living cartilage.
  • a hydrogel having such a compressive breaking strength By using a hydrogel having such a compressive breaking strength, it can be suitably used in a bone defect or a bone deformed portion where a high load is applied.
  • the compression breaking strength can be examined by a known method using a known measuring instrument.
  • An example of the compression rupture strength measuring device is a compression tester (Rheo Meter: CR-500DX-SII) manufactured by Sun Scientific.
  • the compression breaking strength refers to the maximum stress at which a gel sample breaks when a compressive load is applied to the gel sample.
  • the compression rupture strength can be represented by a value obtained by dividing a compressive force when a uniaxial load is applied to a cylindrical gel sample by a cross-sectional area perpendicular to the axis.
  • the hydrogel composition of the present invention can be produced by a method known in the technical field using the above-mentioned polymer.
  • the polymer component of the formula (I) and an appropriate buffer solution (“first buffer solution”) ) And a solution (“second solution”) containing the polymer component of formula (II) and a suitable buffer (“second buffer”) is preferred.
  • the pH of the first buffer solution is 5 to 9 and the concentration is 20 to 200 mM
  • the pH of the second buffer solution is 5 to 9 and the concentration of the second buffer solution is 20 to 200 mM.
  • the pH of the solution containing the polymer whose terminal is an amino group needs to be higher than the pH of another solution whose terminal is an electrophilic functional group.
  • the amino groups of the first solution are likely to be in a cationic state and are likely to repel each other, and the cationic amino group is a functional group (N-hydroxy-succinimidyl (NHS) of the other polymer component. )) And the reactivity decreases.
  • the pH of the first solution is increased (inclined toward the alkaline side)
  • the amino group of the polymer component of the formula (I) is easily transferred from —NH 3+ to —NH 2 , so that the polymer of the formula (II) Increases reactivity with ingredients.
  • the pH of the second solution before mixing is preferably 5 to 6.5.
  • 95 to 99% of the polymer component of the formula (I) is composed of non-cationic amino groups having a binding ability with the polymer component of the formula (II). It is preferably present in a state.
  • the pH of the solution immediately after mixing is preferably 6-8.
  • the pH of the first solution is higher than the pH of the second solution.
  • the pH of the solution can be measured by a known method such as using a commercially available pH meter.
  • Examples of the buffer used include phosphate buffer, citrate buffer, citrate / phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, tartaric acid buffer, Tris buffer, Tris hydrochloride buffer, phosphorus Examples include acid buffered saline or citric acid / phosphate buffered saline.
  • the first buffer solution and the second buffer solution may be the same or different.
  • the first buffer solution and the second buffer solution may be used by mixing two or more kinds of buffer solutions.
  • the concentration of the polymer component of the formula (I) and the formula (II) in the solution is 10 mg / mL to 500 mg / mL. If the concentration of the four-branched polymer is too low, the strength of the gel becomes weak, and if the concentration of the four-branched polymer is too high, the structure of the hydrogel becomes uneven and the strength of the gel becomes weak. Therefore, 20 to 400 mg / mL is preferable, 50 mg / mL to 300 mg / mL is more preferable, and 100 to 200 mg / mL is more preferable.
  • the polymer components of formula (I) and formula (II) have nucleophilic and electrophilic terminal functional groups, respectively, but the molar ratio of nucleophilic functional group to electrophilic functional group is 0.5: 1 to What is necessary is just to mix so that it may become 1.5: 1. Since the functional groups of the polymer component can each react 1: 1 and crosslink, the mixing molar ratio is preferably closer to 1: 1. However, in order to obtain a high-strength hydrogel, 0.8: 1 to 1 .2: 1 is particularly preferred.
  • the hydrophilic polymer and the temperature-responsive polymer each have one terminal functional group (for example, the hydrophilic polymer having a terminal nucleophilic functional group and the terminal having an electrophilic functional group.
  • a two-component system of a temperature-responsive polymer a step of adding and mixing the second solution to the first solution, a step of adding and mixing the first solution to the second solution, There is a step of mixing the first solution and the second solution in equal amounts.
  • the addition speed and mixing speed of the first solution or the second solution are not particularly limited, and those skilled in the art can appropriately adjust them.
  • the terminal functional groups in the hydrophilic polymer and the temperature-responsive polymer are two types (for example, a hydrophilic polymer having a nucleophilic functional group at the terminal, an electrophilic functional group at the terminal)
  • the addition of each solution in the case of a three-component system of a hydrophilic polymer and a temperature-responsive polymer whose terminal is an electrophilic functional group is also a step of sequentially adding, or a nucleophilic functional group and an electrophilic group A step of mixing the solution so that the functional functional group has a desired ratio can be used.
  • the mixing step of the present invention can be performed using, for example, a two-component mixing syringe as disclosed in International Publication WO2007 / 083522.
  • the temperature of the two liquids at the time of mixing is not particularly limited as long as the polymer components are dissolved and each liquid has fluidity. If the temperature is too low, the compound is difficult to dissolve, or the fluidity of the solution is low and it is difficult to mix uniformly. On the other hand, if the temperature is too high, it becomes difficult to control the reactivity of the first four-branched polymer and the second four-branched polymer. Therefore, the temperature of the solution when mixing is 1 to 100 ° C., preferably 5 to 50 ° C., more preferably 10 to 30 ° C. The temperature of the two liquids may be different, but the same temperature is preferable because the two liquids are easily mixed.
  • the mixed solution obtained by the mixing step preferably has a salt concentration of 0 to 1 ⁇ 10 2 mM, and may be 1 ⁇ 10 ⁇ 1 to 1 ⁇ 10 2 . Therefore, the salt concentration of the mixed solution is preferably 100 mM or less, and more preferably 50 mM or less.
  • the hydrogel composition of the present invention can adjust the time until gelation by adjusting the pH of the solution, so that it is easy to make a shape suitable for the introduction part. Therefore, in orthopedic surgery of bone, cartilage, or intervertebral disc that is loaded in the living body, such as knee cartilage surgery or disc surgery, bone, cartilage, or intervertebral disk defect replacement material, or bone, cartilage, or intervertebral disc degeneration It can be suitably used as a part filling material.
  • the hydrogel composition of the present invention may be directly administered to the affected area using the two-component mixing syringe described above, or formed by forming a hydrogel according to the type of the site to be introduced in advance. Later hydrogels may be introduced into the affected area.
  • PEGE polyethylglycidyl ether
  • Tetra-PEGE polyethylglycidyl ether
  • EGE ethyl glycidyl ether
  • methyl which are temperature-responsive four-branched polymer components
  • a four-branched module (Tetra-P (EGE-co-MGE)) made of a copolymer of glycidyl ether (MGE) was synthesized as follows.
  • Tetra-PEGE-OH Tetra-PEG is a tetra-branched polyethylglycidyl ether having a hydroxy group at the end by ring-opening polymerization of EGE using pentaerythritol as a polymerization starting point.
  • Tetra-PEGE-COOH After adding ethyl bromoacetate to Tetra-PEGE-OH, the ester site was deprotected to obtain Tetra-PEGE-COOH having a carboxyl group at the terminal.
  • Tetra-PEGE-OH (4.00 g, 0.182 mmol) was dissolved in THF (120 mL) in a two-necked flask. To the obtained solution, 0.3 M potassium naphthalene (24.32 mL) was slowly added dropwise and stirred. Since the solution was still green after 30 minutes, it was confirmed that the deprotonation of the hydroxy group had completely proceeded. The solution was cooled to 0 ° C.
  • the reaction solution was adjusted to pH 1 with 5N hydrochloric acid, extracted with chloroform, and washed with water and brine.
  • the organic layer was dried over magnesium sulfate and filtered, and then chloroform was distilled off under reduced pressure.
  • the obtained liquid was precipitated in -20 ° C. hexane and decanted. This operation was repeated twice more.
  • the crude product was dried under reduced pressure to obtain yellowish liquid Tetra-PEGE-COOH.
  • Tetra-PEGE-OSu By adding N-hydroxysuccinimide to Tetra-PEGE-COOH using a condensing agent EDC, Tetra-PEGE-OSu having a succinimidyl group at the terminal was obtained.
  • Tetra-PEGE-COOH (1.00 g, 0.0455 mmol) and N-hydroxysuccinimide (0.419 g, 3.64 mmol) were weighed into a two-necked flask, and dichloromethane (30 mL) was added thereto. To the vessel, EDC (0.565 g, 3.64 mmol) dissolved in dichloromethane (20 mL) was slowly added dropwise at 0 ° C.
  • Tetra-PEGE-NH 2 Synthesis Tetra-PEGE-OSu in that an addition of ethylenediamine to obtain Tetra-PEGE-NH 2 having a terminal amino group.
  • Tetra-PEGE-OSu (1 g) was dissolved in dichloromethane (40 mL). Ethylenediamine (1.215 mL, 18.2 mmol) dissolved in dichloromethane (10 mL) was slowly added dropwise to the polymer solution. The mixture was stirred at room temperature for 3 hours and then washed with water and brine. Finally dried over magnesium sulfate, filtrated, by distilling off the dichloromethane under reduced pressure to give pale yellow liquid Tetra-PEGE-NH 2.
  • Tetra-P (EGE-co-MGE) -OH By ring-opening polymerization of EGE and MGE using pentaerythritol as a polymerization starting point, Tetra-P (EGE-co-MGE) -OH, which is a four-branched copolymer of EGE and MGE having a hydroxy group at the end, was synthesized.
  • Tetra-P (EGE-co-MGE) -COOH After adding ethyl bromoacetate to Tetra-P (EGE-co-MGE) -OH, the ester site was deprotected to remove the end. Tetra-P (EGE-co-MGE) -COOH having a carboxyl group was obtained. Tetra-P (EGE-co-MGE) -OH (20 g, 0.889 mmol) was dissolved in THF (600 mL) in a two-necked flask. To the obtained solution, 0.3 M potassium naphthalene (123.2 mL) was slowly added dropwise and stirred.
  • Tetra-P (EGE-co-MGE) -OSu By adding N-hydroxysuccinimide to Tetra-P (EGE-co-MGE) -COOH using a condensing agent EDC, succinimidyl at the end Tetra-P (EGE-co-MGE) -OSu having a group was obtained.
  • Tetra-P (EGE-co-MGE) -COOH (17 g, 0.756 mmol) and N-hydroxysuccinimide (6.96 g, 60.48 mmol) are weighed into a two-necked flask, into which dichloromethane (510 mL) is added. It was.
  • Tetra-P (EGE-co-MGE) -NH 2 By adding ethylenediamine to Tetra-P (EGE-co-MGE) -OSu, Tetra-P (EGE-) having an amino group at the terminal is added. co-MGE) -NH 2 was obtained. Tetra-P (EGE-co-MGE) -OSu (10 g, 0.444 mmol) was dissolved in dichloromethane (400 mL). Ethylenediamine (58.86 mL, 889 mmol) dissolved in dichloromethane (100 mL) was slowly added dropwise to the polymer solution.
  • hydrogel composition of the present invention was prepared hydrogel composition of the present invention by the following procedure. 1) Preparation of Tetra-PEG-PEGE gel Tetra-PEG-NH 2 and Tetra-PEG-OSu were dissolved in cyclohexanone to a concentration of 10 mM in separate containers.
  • the mixed solution was quickly transferred to a capillary having a diameter of 640 ⁇ m, and both ends were capped with clay to prevent drying, and allowed to stand at room temperature for 24 hours.
  • the obtained gel was carefully taken out from the capillary and then left to stand in cyclohexanone in an environment of 10 ° C. or lower for 24 hours in order to remove N-hydroxysuccinimide which is a by-product of the gelation reaction.
  • the solvent of the gel was replaced with methanol.
  • Tetra-PEG-NH 2 and Tetra-PEGE-NH 2 having an amino group at the terminal were used.
  • Tetra-PEG-OSu and Tetra-PEGE-OSu having a succinimidyl group at the terminal were used.
  • Tetra-PEG-PEGE hydrogels with different introduction ratios of temperature-responsive polymer components were obtained.
  • the various Tetra-PEG-PEGE hydrogels obtained are shown in Table 1 together with their compositions.
  • Tetra-PEG-P (EGE-co-MGE) gel Using three types of polymer components: Tetra-PEG-OSu, Tetra-PEG-NH 2 , and Tetra-P (EGE-co-MGE) NH 2
  • Tetra-PEG-OSu Tetra-PEG-OSu
  • Tetra-PEG-NH 2 Tetra-P (EGE-co-MGE) NH 2
  • commercially available products having a molecular weight of 20,000 were used for Tetra-PEG-OSu and Tetra-PEG-NH 2 (respectively, SUNBRIGHT PTE-200HS and SUNBRIGHT PTE-200PA, both of which are NOF).
  • Tetra-PEG-OSu and Tetra-PEG-NH 2 are water-soluble regardless of temperature, and Tetra-P (EGE-co-MGE) NH 2 is readily soluble in water in an environment of 10 ° C. or lower (> 135 g / L), hydrogel preparation in water is possible.
  • the gelation time can be controlled and the final gelation reaction rate can be improved.
  • citrate-phosphate buffer (CPB) and citrate-phosphate buffer (PB) were used as reaction fields.
  • the buffer was made PB by mixing 0.2 M sodium dihydrogen phosphate (19.0 mL) and 0.2 M disodium hydrogen phosphate (81.0 mL), and 0.1 M citric acid (19.7 mL). ) And 0.2M disodium hydrogen phosphate were mixed to obtain CPB.
  • the pH was 5.8 and 7.4, respectively.
  • Tetra-PEG-OSu was dissolved in CPB, Tetra-PEG-NH 2 was dissolved in PB, and Tetra-P (EGE-co-MGE) NH 2 was dissolved in PB so that the polymer concentration was 6 mM.
  • the reaction solution was allowed to stand for 24 hours to obtain a Tetra-PEG-P (EGE-co-MGE) gel.
  • the obtained gel was immersed in water for 24 hours to remove N-hydroxysuccinimide, which is a by-product of the gelation reaction.
  • the degree of swelling was measured using the Tetra-PEG-P (EGE-co-MGE) gel obtained in Example 2. Specifically, a cylindrical Tetra-PEG-P (EGE-co-MGE) gel made with a 640 ⁇ m diameter capillary was swollen in water at 3 ° C. for 2 hours to confirm that the gel was in an equilibrium swollen state. Then, while increasing the temperature of the thermostatic bath, the gel diameter was recorded after waiting until the gel reached an equilibrium swelling state at each temperature. Assuming that the gel is isotropically deformed, the diameter at each temperature was converted to volume, and the volume of the gel at each temperature was taken as V, and the volume change at each temperature was obtained. The results are shown in FIG.
  • FIG. 2 is a plot of the volume change ratio depending on the temperature of the gel, where V 0 is the volume during gel preparation and V is the volume at each temperature.
  • V / V 0 1
  • V / V 0 1
  • the gel preparation state is maintained, that is, it is hardly swollen.
  • the Tetra-PEG-P (EGE-co-MGE) gel of the present invention can suppress gel swelling in a living environment. is there. Further, the temperature corresponds to 10 ° C.
  • the Tetra-PEG-P (EGE-co-MGE) gel prepared this time has a high breaking strength exceeding 60 MPa even after standing in water for a long time.
  • the results show that the segment of the Tetra-P (EGE-co-MGE) polymer, which is a temperature-responsive polymer component, is incorporated into the gel, so that the swelling of the gel is suppressed. The fraction can be maintained, and it is considered that high breaking strength was obtained.
  • the breaking strength of human cartilage is about several MPa
  • the Tetra-PEG-P (EGE-co-MGE) gel of the present invention has high mechanical strength that is necessary and sufficient for use in replacing cartilage. It can be said that it has.

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Abstract

【課題】 水中におけるゲルの膨潤度を制御することによって、生体温度において作製当初の形状を維持し、かつ高い破断強度を有する新規なハイドロゲル組成物を提供することを課題とする。 【解決手段】 ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマー、及び相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーを構成成分として含み、当該ポリマーの末端が共有結合で架橋した網目構造を有する、ハイドロゲル組成物。

Description

温度応答性ポリマーを含む低膨潤度の新規ハイドロゲル
　本発明は、温度応答性ポリマーを含むハイドロゲルであって、溶液中における膨潤を抑え、その形状や力学特性を維持できる新規なハイドロゲルに関する。
　近年、網状構造の親水性ポリマーを含むゲル状の材料であるハイドロゲルが注目されている。ハイドロゲルは、優れた保水能力及び生体適合性等の特性を有することから、シーリング、癒着防止、ドラッグデリバリー、コンタクトレンズなどの医療目的だけでなく、センサーや表面コーティングなどの多様な用途への応用が期待されている材料である（例えば、特許文献１及び２、非特許文献１）。しかしながら、優れた特性の一方で、ハイドロゲルはその体積の大部分が水で占められた開放系の物質であるため、水中ではゲル内部と外部環境の濃度差から生じる浸透圧によって膨潤してしまい、十分な力学的強度が得られないという問題があった。
　特に、軟骨部位等の低侵襲医療への応用において、注射によって患部内で直接ゲルを形成させるインジェクタブルゲルの開発も広く行われつつあるが、ここでも、軟骨等の生体内の環境は閉鎖系ではないため、ゲルは外界との濃度勾配から膨潤してしまう。すなわち、軟骨部位で用いるためには高い破断強度が求められるが、当該部位ではゲルの膨潤によって内圧がかかるだけでなく、時間の経過とともに、ゲル化時の形状は崩れ、さらには力学的強度の低下が生じる。従って、軟骨の置換を指向した際には、インジェクタブルであることに加えて、そのような膨潤による形状変化や力学的強度の低下を生じないハイドロゲルの開発が望まれている。
特開平１１－１８９６２６号公報 特開２００５－６０５７０号公報
Ｓａｋａｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｖｏｌ.４１、Ｎｏ.１４、ｐｐ.５３７９－５３８４、２００８
　本発明は、上記ハイドロゲルにおける強度や持続使用性の問題点を解消するため、水中におけるゲルの膨潤度を制御することによって、生体温度において作製当初の形状を維持し、かつ高い破断強度を有する新規なハイドロゲル組成物を提供することを課題とする。
　本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、ハイドロゲルを形成し得るポリエチレングリコール骨格を有するポリマーと、相転移温度を有する温度応答性ポリマーを組み合わせ、これらを架橋させて網目構造を有するハイドロゲルを作成することによって、溶液中における当該ゲルの膨潤度を制御できることを見出した。これらの知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、一態様において、
（１）　ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマー、及び相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーを構成成分として含み、当該ポリマーの末端が共有結合で架橋した網目構造を有する、ハイドロゲル組成物に関する。
　また、本発明のハイドゲル組成物の好ましい態様は、
（２）　前記温度応答性の四分岐型ポリマーにおける前記相転移温度が、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）である、上記（１）に記載のハイドゲル組成物；
（３）　前記温度応答性の四分岐型ポリマーにおける前記相転移温度が、水中において５～４０℃の範囲である、上記（１）に記載のハイドゲル組成物；
（４）　前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーが、下記式（Ｉ）で表されるポリマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003



（ここで、式（Ｉ）中、
　各ｍは、それぞれ同一又は異なり、２５～２５０の整数であり、
　各Ｘ１は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒａ－、－ＣＯ－Ｒａ－、－Ｒｂ－Ｏ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ－Ｒｃ－、又は－Ｒｂ－ＣＯ－ＮＨ－Ｒｃ－を示し、ここで、ＲａはＣ１－Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１－Ｃ５アルキレン基を示し、及び
　各Ｙ１は、アミノ基、－ＳＨ、及び－ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基；又は、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基である。）
であり、及び、
前記温度応答性の四分岐型ポリマーが、下記式（ＩＩ）で表されるポリマー
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（ここで、式（ＩＩ）中、
　各ｎは、それぞれ同一又は異なり、２５～２５０の整数であり、
　各Ｒ１は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ５アルキル基であり、
　各Ｘ２は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒａ－、－ＣＯ－Ｒａ－、－Ｒｂ－Ｏ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ－Ｒｃ－、又は－Ｒｂ－ＣＯ－ＮＨ－Ｒｃ－を示し、ここで、ＲａはＣ１－Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１－Ｃ５アルキレン基を示し、及び
　各Ｙ２は、アミノ基、－ＳＨ、及び－ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基；又は、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基である。）
である、上記（１）に記載のハイドロゲル組成物；
（５）　前記式（ＩＩ）で表される温度応答性の四分岐型ポリマーが、Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、Ｒ１がエチルであるモノマー成分との組み合わせよりなる共重合体である、上記（４）に記載のハイドロゲル組成物；
（６）　前記Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、前記Ｒ１がエチルであるモノマー成分のモル比が、１：９～４：６である、上記（５）に記載のハイドロゲル組成物；
（７）　各Ｙ１が、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基であり、及び、
　各Ｙ２が、アミノ基、－ＳＨ、及び－ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基である、
上記（４）乃至（６）のいずれか１に記載のハイドロゲル組成物；
（８）　Ｙ１がＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基であり、Ｙ２がアミノ基である、上記（７）に記載のハイドロゲル組成物；
（９）　水溶液中、３０～４０℃の範囲における前記ハイドロゲル組成物の体積が、ゲル作成時の体積に対して０．８～１．５の体積変化の範囲の膨潤度である、上記（１）乃至（８）のいずれか１に記載のハイドロゲル組成物；
（１０）　６０ＭＰａ以上の圧縮破断強度を有する、上記（１）乃至（９）のいずれか１に記載のハイドロゲル組成物；
（１１）　前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーと、前記温度応答性の四分岐型ポリマーのモル比が、１０：９０～９０：１０である、上記（１）乃至（１０）のいずれか１に記載のハイドロゲル組成物
に関する。
　本発明によれば、ハイドロゲルの膨潤度を制御することによって従来のハイドロゲルにおける強度や持続使用性の問題点を解消することができ、生体条件・体液浸漬環境下に導入した場合であっても、生体温度において作製当初の形状を維持しつつ、人間の軟骨に匹敵する高い破断強度を有する新規なハイドロゲル組成物を提供することができる。
　具体的には、本発明のハイドロゲル組成物では、ゲルの構成セグメントとして、相転移温度を有する温度応答性ポリマーを導入することによって、一定温度以上において、当該温度応答性ポリマーが収縮してゲルの膨張を妨げ、かつ、他の親水性ポリマーセグメントのにおける膨潤も抑え、ゲル全体の膨潤を抑制できるという効果を奏する。また、導入する温度応答性ポリマーの比率を適宜変更することによって、或いは相転移温度が異なる温度応答性ポリマーを用いること等によって、所望の用途に応じて、ハイドロゲル全体の膨潤度・収縮率を制御することが可能となる。
　上述のように、生体内の、特に軟骨等のような過重部においてゲルを応用する場合には、高い力学特性及び形態維持能が必要となるが、本発明は従来にはない発想で当該課題を解決するものであり、高分子ゲルの実用化において極めて有益である。
図１は、ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型の親水性ポリマーと温度応答性の四分岐型ポリマーよりなる本発明のハイドロゲル組成物の構造、及びゲル中の温度応答性ポリマー成分が温度に応じて収縮することによる膨潤抑制の機構を示す模式図である。 図２は、本発明のハイドロゲル組成物における体積変化（膨張度）の温度依存性を比率をプロットしたグラフである。 図３は、本発明のハイドロゲル組成物における応力―ひずみ曲線の測定結果を示すグラフである。
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　本発明のハイドロゲル組成物は、ａ）ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型の親水性ポリマー、及び、ｂ）相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーを構成成分として含み、当該ポリマーの末端が共有結合で架橋した網目構造を有するものである。
（１）ポリエチレングリコール骨格を有する親水性ポリマー成分
　本発明のハイドロゲル組成物において用いられる親水性ポリマー成分は、ポリエチレングリコール骨格を有し、その末端において当該親水性ポリマーどうし、及び／又は後述の温度応答性ポリマーと架橋することによって網目構造を有するものである。好ましくは、水を含むことによって、ハイドロゲルを形成し得る親水性ポリマーである。ここで、「ハイドロゲル」とは、多量の水を含んだ親水性の高分子を含むゲル状の物質であり、「ゲル」とは、一般に、高粘度で流動性を失った分散系をいう。
　そのようなハイドロゲルを形成し得るポリマーとして、４つのポリエチレングリコール分岐を有するポリマー成分が、互いに架橋して均一な網目構造ネットワークを形成するものが挙げられる。かかる四分岐型のポリエチレングリコール骨格よりなるゲルは、一般に、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧゲルとして知られており、それぞれ末端に活性エステル構造等の求電子性の官能基とアミノ基等の求核性の官能基を有する二種の四分岐高分子間のＡＢ型クロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークが構築される。Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧゲルは、これまでの研究から、２００ｎｍ以下のサイズ領域で高分子網目に不均一性がなく、理想的な均一網目構造を有することが報告されている（Ｍａｔｓｕｎａｇａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｖｏｌ.４２、Ｎｏ.４、ｐｐ.１３４４－１３５１、２００９）。また、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧゲルは各高分子溶液の単純な二液混合で簡便にその場で作製可能であり、ゲル調製時のｐＨやイオン強度を調節することでゲル化時間を制御することも可能である。そして、このゲルはＰＥＧを主成分としているため、生体適合性にも優れている。
　本発明のハイドロゲル組成物において用いられるポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型の親水性ポリマーは、一態様において、以下の一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記式（Ｉ）中、各ｍは、それぞれ同一でも又は異なってもよい。各ｍの値が近いほど、均一な立体構造をとることができ、高強度となる。このため、高強度のゲルを得るためには、同一であることが好ましい。各ｍの値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、各ｍの値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、各ｍは、２５～２５０の整数値があげられ、３５～１８０が好ましく、５０～１１５がさらに好ましく、５０～６０が特に好ましい。そして、その分子量としては、５×１０３～５×１０４Ｄａがあげられ、７．５×１０３～３×１０４Ｄａが好ましく、１×１０４～２×１０４Ｄａがより好ましい。
　上記式（Ｉ）中、各Ｘ１は、官能基とコア部分をつなぐリンカー部位である。各Ｘ１は、それぞれ同一でも異なってもよいが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。各Ｘ１は、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒａ－、－ＣＯ－Ｒａ－、－Ｒｂ－Ｏ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ－Ｒｃ－、又は－Ｒｂ－ＣＯ－ＮＨ－Ｒｃ－を示す。ここで、ＲａはＣ１－Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１－Ｃ５アルキレン基を示す。
　ここで、「Ｃ１－Ｃ７アルキレン基」とは、分岐を有してもよい炭素数が１以上７以下のアルキレン基を意味し、直鎖Ｃ１－Ｃ７アルキレン基又は１つ又は２つ以上の分岐を有するＣ２－Ｃ７アルキレン基（分岐を含めた炭素数が２以上７以下）を意味する。Ｃ１－Ｃ７アルキレン基の例は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基である。Ｃ１－Ｃ７アルキレン基の例は、－ＣＨ2－、－(ＣＨ2)2－、－(ＣＨ2)3－、－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)3－、－(ＣＨ(ＣＨ3))2－、－(ＣＨ2)2－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)3－ＣＨ(ＣＨ3)－、－(ＣＨ2)2－ＣＨ(Ｃ2Ｈ5)－、－(ＣＨ2)6－、－(ＣＨ2)2－Ｃ(Ｃ2Ｈ5)2－、及び－(ＣＨ2)3Ｃ(ＣＨ3)2ＣＨ2－などが挙げられる。
　「Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基」とは、鎖中に１個若しくは２個以上の二重結合を有する状又は分枝鎖状の炭素原子数２～７個のアルケニレン基であり、例えば、前記アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の２～５個を除いてできる二重結合を有する２価基が挙げられる。
　本明細書において、アルキレン基及びアルケニレン基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、アシル基、又はアリール基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
　また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。
　各Ｙ２は、上述のように、共有結合による架橋反応であるＡＢ型クロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークを形成させるためのものであり、求核性官能基又は求電子性官能基から選択される。典型的には、ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型の親水性ポリマーは末端に求電子性官能基を有し、その場合、後述の温度応答性の四分岐型ポリマーのＹ２は求核性官能基である。例えば、親水性ポリマーの末端がアミノ基であり、温度応答性ポリマーの末端がＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）を含むエステル構造である場合には、各ポリマーの末端は、アミド結合によって架橋してゲルを形成する。しかしながら、合成の容易さ等の観点から、逆の組み合わせであることも可能である。さらに、親水性ポリマーと温度応答性ポリマーを等量以外で含む態様においては、末端が求核性官能基である親水性ポリマーと求電子性官能基である親水性ポリマーを混在して用いることもでき、これによって、ハイドロゲル組成物中における親水性ポリマー成分と温度応答性ポリマー成分の比率を適宜変更することができる。
　当該親水性ポリマーの末端が求核性官能基である場合には、アミノ基が好ましい。しかし、高強度な立体構造になる架橋を得られれば、当該官能基は、アミノ基以外の求核性官能基を用いることもできる。このような求核性官能基として、－ＳＨ、又は－ＣＯ２ＰｈＮＯ２(Ｐｈは、ｏ－、ｍ－、又はｐ－フェニレン基を示す)などがあげられ、当業者であれば公知の求核性官能基を適宜用いることができる。当該官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋反応の対象となる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有する高強度のゲルを得やすくなる。
　また、当該親水性ポリマーの末端が求電子性官能基である場合には、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基が好ましい。しかし、求電子性を有する他の活性エステル基を用いてもよい。このような活性エステル基としては、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、又はニトロフェニル基などがあげられ、当業者であれば公知の活性エステル基を適宜用いることができる。当該官能基は、それぞれ同一であっても、異なってもよいが、同一である方が好ましい。官能基が同一であることによって、架橋反応の対象となる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有する高強度のゲルを得やすくなる。
（２）温度応答性ポリマー成分
　本発明のハイドロゲル組成物において用いられる温度応答性ポリマー成分は、溶液中で相転移温度を有するポリマーであって、上記親水性ポリマー成分と架橋することによってハイドロゲルを形成することができるポリマーである。
　そのような相転移温度を有するポリマーとしては、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）又は上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有する高分子（天然物及び合成高分子のいずれをも含み得る）であることが好ましい。ここで、「下限臨界溶液温度を有する高分子」は、ある温度以下では水等の溶媒にに可溶化するが、ある温度以上では、可逆的に分子内で収縮して或いは分子間で凝集して当該溶媒に不溶化し、相分離を示す性質を有するものである。これとは逆に、「上限臨界溶液温度を有する高分子」は、ある温度以上では水等の溶媒にに可溶化するが、ある温度以下では、可逆的に分子内で収縮して或いは分子間で凝集して当該溶媒に不溶化し、相分離を示す性質を有するものである。
　温度応答性ポリマー成分における相転移温度は、水中において５～４０℃、好ましくは、１０～３５℃である。特に、相転移温度が下限臨界溶液温度である場合、当該温度は、１０～３５℃、より好ましくは、２５～３５℃である。ハイドロゲル組成物の膨張を抑制するという観点からは、当該温度は、ハイドロゲルを使用する温度において、当該ゲル中における温度応答性ポリマー成分が収縮する状態となることが好ましい。
　上記親水性ポリマー成分が式（Ｉ）で表されるような四分岐型のポリマーである場合には、温度応答性ポリマー成分もまた四分岐型のポリマーであることが、均一な網目構造ネットワークのハイドロゲルを構成するために好ましい。
　本発明のハイドロゲル組成物において用いられる相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーは、一態様において、以下の一般式（ＩＩ）で表されるポリアルキルグリシジルエーテル骨格の構造を有する化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記式（ＩＩ）中、各Ｒ１は、それぞれ同一又は異なっていてもよい、Ｃ１－Ｃ５アルキル基であり、好ましくはメチル又はエチルである。より好ましくは、式（ＩＩ）表される温度応答性の四分岐型ポリマーが、Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、Ｒ１がエチルであるモノマー成分との組み合わせよりなる共重合体である。かかる共重合体におけるＲ１の比率を調節ことによって、温度応答性ポリマー全体の相転移温度を所望のものに変更することが可能となる。ここで、Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、Ｒ１がエチルであるモノマー成のモル比は、好ましくは、１：９～３：７であり、好ましくは２：８である。
　上記式（ＩＩ）中、ｎ、Ｘ２、及びＹ２の定義は、上記式（Ｉ）におけるｍ、Ｘ１、及びＹ１の定義とそれぞれ同様である。
（３）本発明のハイドロゲル組成物
　上述のように、本発明では、ハイドロゲルを形成し得る親水性ポリマー成分とともに、温度応答性ポリマー成分を用いてゲルを形成させることで、最終的なハイドロゲル組成物における膨潤度を制御することができる。例えば、親水性ポリマー成分として式（Ｉ）のＴｅｔｒａ－ＰＥＧゲルを用い、その一部を式（ＩＩ）の温度応答性ポリマー成分で置換することで、従来のＴｅｔｒａ－ＰＥＧゲルが有する均一な網目構造を維持したまま、ゲルに温度応答能を付与することができる。
図１に示すように、ゲル中の温度応答性ポリマー成分が温度に応じて収縮することで、ゲル全体としての体積相転移が生じ、これによって、ゲル全体の膨潤を抑制することができ、当該膨張による形状変化及び力学的強度の低下を回避することが可能となる。ここで重要なのは、網目構造に親水性ＰＥＧ相が均一に分散して存在すること、すなわち、両親媒性の温度応答性ポリマー成分のセグメントは、常に親水性ポリマー成分のセグメントで囲まれることである。そのため、ゲルの収縮の際には、収縮が進行している相の周囲に、常に水の透過経路が確保されることになり、従来のゲルで生じていたような、ゲルの表面において水を透過できない脱水和層であるスキン層の形成を抑制することができる。従って、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧゲルへの温度応答性ポリマー成分の導入量を調節し、或いは適切な相転移温度の温度応答性ポリマー成分を用いることで、収縮状態のゲルの膨潤度の調節が可能となるのである。
　このような温度応答性ポリマー成分の収縮によってゲル全体の膨張が抑制されることによって、好ましくは、水溶液中、３０～４０℃の範囲における前記ハイドロゲル組成物の体積が、ゲル作成時の体積に対して０．８５～１．５の体積変化の範囲の膨潤度となる。より好ましくは、０．９～１．２の膨潤度である。これによって、生体条件・体液浸漬環境下に導入した場合であっても、膨潤による形状変化や強度の低下を回避し、生体温度において作製当初の形状及び強度を維持可能なハイドロゲル組成物を得ることができる。
　温度応答性ポリマー成分の導入量については、所望の膨潤度に応じて適宜調整することができるが、好ましくは、前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーと、前記温度応答性の四分岐型ポリマーのモル比が、１０：９０～９０：１０、より好ましくは３０：７０～７０：３０である。かかるモル比の範囲は、上述のように、親水性ポリマーと温度応答性ポリマーにおける末端の官能基を調整することで適宜変更することができる。例えば、（末端が求核性官能基である親水性ポリマー）：（末端が求電子性官能基である親水性ポリマー）：（末端が求電子性官能基である温度応答性ポリマー）を５０：１０：４０とすることによって、親水性ポリマー成分と温度応答性ポリマー成分を６０：４０とするハイドロゲル組成物を得ることができる。
　本発明のハイドロゲル組成物は、１０～１００ＭＰａ、好ましくは、生体軟骨を超える１０ＭＰａ以上、より好ましくは６０ＭＰａ以上の圧縮破断強度を有することが好ましい。このような圧縮破断強度を有するハイドロゲルを用いることで、高い負荷がかかる骨欠損分や骨変形部において好適に用いることができる。圧縮破断強度は、公知の測定機器を用いて、公知の方法で調べることができる。圧縮破断強度測定機器としては、たとえば、Ｓｕｎ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の圧縮試験機（Ｒｈｅｏ　Ｍｅｔｅｒ:ＣＲ－５００ＤＸ－ＳＩＩ）があげられる。圧縮破断強度とは、ゲル試料に圧縮荷重を加えた時に、ゲル試料が破断する最大応力のことをさす。圧縮破断強度は、円柱状のゲル試料に対して、１軸荷重をかけた時の圧縮力をその軸に垂直な断面積で割った値で表わすことができる。
　本発明のハイドロゲル組成物は、上述のポリマーを用いて、当該技術分野において公知の方法により作製することができる。
　上記式（Ｉ）の親水性ポリマー成分及び式（ＩＩ）の温度応答性ポリマー成分からハイドロゲルを得る方法としては、式（Ｉ）のポリマー成分と適切な緩衝液（「第１の緩衝液」）を含む溶液（「第１の溶液」）と、式（ＩＩ）のポリマー成分と適切な緩衝液（「第２の緩衝液」）を含む溶液（「第２の溶液」）とを混合する方法が好ましい。この場合、第１の緩衝液のｐＨが５～９、及び濃度が２０～２００ｍＭであり、第２の緩衝液のｐＨが５～９、及び第２の緩衝液の濃度が２０～２００ｍＭである。ここで、末端がアミノ基であるポリマーを含む溶液のｐＨは、末端が求電子性官能基である他の溶液のｐＨよりも高くする必要がある。これにより、式（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリマー成分の間でアミド結合の形成反応が起こり、均一な網目構造を有するハイドロゲルを製造することができる。以下、式（Ｉ）の親水性ポリマー成分の末端がアミノ基であり、式（ＩＩ）の温度応答性ポリマー成分の末端がＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）である場合を例として、述べる。
　酸性溶液中では、第１の溶液のアミノ基がカチオンの状態となりやすく、互いに反発しやすくなり、そして、カチオン状態のアミノ基は、もう一方のポリマー成分の官能基（Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ））との反応性が低下する。一方、第１の溶液のｐＨが高くなる（アルカリ性側に傾く）と、式（Ｉ）のポリマー成分のアミノ基が－ＮＨ３＋から－ＮＨ２へと移りやすくなるので、式（ＩＩ）のポリマー成分との反応性が高くなる。しかし、式（ＩＩ）のポリマー成分は、溶液のｐＨが７以上になると、エステル結合が分解されやすくなり、式（Ｉ）のポリマー成分との反応性が低下してくる。そのため、ゲル強度が弱くなってしまう。従って、第１及び第２の緩衝液のｐＨを調節する必要がある。
　混合前の第２の溶液のｐＨは５～６.５であることが好ましい。また、混合後の溶液においては、不均一な混合を防ぐために、式（Ｉ）のポリマー成分の９５～９９％は式（ＩＩ）のポリマー成分との結合能を有する非カチオン性のアミノ基の状態で存在することが好ましい。このような工程を経るためには、混合直後の溶液のｐＨは６～８であることが望ましい。このため、第１の溶液のｐＨは、第２の溶液のｐＨよりも高い方が好ましい。溶液のｐＨは、市販のｐＨメーターを用いるなど公知の方法で測定することができる。このように、混合後のｐＨを６～８に保ち、ＮＨＳと反応可能な非カチオン性のアミノ基を５％以下に保つことにより、均一で強固なハイドロゲルを製造することが可能になる。
　また、緩衝液濃度が低すぎると、溶液中のｐＨ緩衝能が低下し、高強度のハイドロゲルを製造することができず、逆に、緩衝液濃度が高すぎても、式（Ｉ）のポリマー成分と式（ＩＩ）のポリマー成分の混合を阻害するために、高強度のハイドロゲルを製造することができない。よって、上記のように、緩衝液の濃度を２０ｍＭ～２００ｍＭとすることで、均一構造を有する高強度なハイドロゲルを製造することができる。
　用いられる緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸・リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、又はクエン酸・リン酸緩衝生理食塩水があげられる。第１の緩衝液と第２の緩衝液は、同じでも異なってもよい。また、第１の緩衝液及び第２の緩衝液は、それぞれ２種以上の緩衝液を混合して用いてもよい。
　式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリマー成分の溶液中濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍＬがあげられる。四分岐型ポリマーの濃度が、低すぎるとゲルの強度が弱くなり、四分岐型ポリマーの濃度が高すぎるとハイドロゲルの構造が不均一になりゲルの強度が弱くなる。そのため、２０～４００ｍｇ／ｍＬが好ましく、５０ｍｇ／ｍＬ～３００ｍｇ／ｍＬがより好ましく、１００～２００ｍｇ／ｍＬがさらに好ましい。
　式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリマー成分は各々求核性、求電子性の末端官能基を有するが、求核性官能基と求電子性官能基のモル比が０．５：１～１．５：１となるように混合すればよい。当該ポリマー成分の官能基はそれぞれ１：１で反応して架橋し得るので、混合モル比は１：１に近いほど好ましいが、高い強度のハイドロゲルを得るためには０．８：１～１．２：１が特に好ましい。
　上記の混合工程としては、親水性ポリマーと温度応答性ポリマーにおける末端の官能基が各々１種類の場合（例えば、末端が求核性官能基である親水性ポリマーと末端が求電子性官能基である温度応答性ポリマーの２成分系である場合）には、第１の溶液に第２の溶液を添加して混合する工程、第２の溶液に第１の溶液を添加して混合する工程、第１の溶液と第２の溶液とを等量ずつ混合する工程があげられる。第１の溶液又は第２の溶液の添加速度、混合速度は特に限定されず、当業者であれば適宜調整することができる。また、親水性ポリマーと温度応答性ポリマーにおける末端の官能基のいずれか又は両方が２種類である場合（例えば、末端が求核性官能基である親水性ポリマー、末端が求電子性官能基である親水性ポリマー、及び末端が求電子性官能基である温度応答性ポリマーの３成分系である場合）における各溶液の添加も同様に、順次添加する工程、又は求核性官能基と求電子性官能基が所望の比率となるように溶液を混合する工程を用いることができる。
　本発明の混合工程は、たとえば国際公開ＷＯ２００７／０８３５２２号パンフレットに開示されたような二液混合シリンジを用いて行うことができる。混合時の二液の温度は、特に限定されず、ポリマー成分がそれぞれ溶解され、それぞれの液が流動性を有する状態の温度であればよい。温度が低すぎると化合物が溶解されにくく、または溶液の流動性が低くなり、均一に混ざり難くなる。一方、温度が高すぎると第１の四分岐型ポリマーと第２の四分岐型ポリマーのの反応性を制御し難くなる。そのため、混合するときの溶液の温度としては、１℃～１００℃が挙げられ、５℃～５０℃が好ましく、１０℃～３０℃がより好ましい。二液の温度は異なってもよいが、温度が同じである方が、二液が混合されやすいので好ましい。
　当該混合工程によって得られる混合溶液は、塩濃度が０～１×１０２ｍＭであることが好ましく、１×１０－１～１×１０２であってもよい。そのため、混合溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下であることが好ましく、５０ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
　また、本発明のハイドロゲル組成物は、溶液のｐＨを調整することで、ゲル化までの時間を調節することができるので、導入部に適合した形状を作りやすい。そのため、膝軟骨手術や椎間板手術など、生体において荷重負荷がかかる骨、軟骨、又は椎間板の整形外科的手術において、骨、軟骨、若しくは椎間板の欠損部補填物質、又は骨、軟骨、若しくは椎間板の変性部補填物質として好適に用いることができる。整形外科手術において、本発明のハイドロゲル組成物は、上記した二液混合シリンジを用いて、患部に直接投与してもよいし、あらかじめ導入する部位の型に合わせてハイドロゲルを形成して形成後のハイドロゲルを患部に導入してもよい。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
温度応答性の四分岐型ポリマー成分の合成
　温度応答性の四分岐型ポリマー成分である、ポリエチルグリシジルエーテル（ＰＥＧＥ）の四分岐モジュール（Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ）、及び、エチルグリシジルエーテル（ＥＧＥ）とメチルグリシジルエーテル（ＭＧＥ）の共重合体よりなる四分岐モジュール（Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ））を以下のとおり合成した。
　以下の実験では、１Ｈ　ＮＭＲスペクトルは、日本電子のＪＮＭ－ＥＣＳ４００(４００ＭＨｚ)を用いて解析した。重水素化クロロホルムを溶媒として用い、テトラメチルシランを内部標準とした。分子量はブルカーダルトニクスの質量分析計Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ　ＩＩＩのリニアポジティブイオンモードを用いて決定した。
１）　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥモジュールの合成
１－１　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＨの合成
　ペンタエリトリトールを重合起点として、ＥＧＥを開環重合させることで、末端にヒドロキシ基を有する四分岐ポリエチルグリシジルエーテルであるＴｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＨを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　ペンタエリトリトール（０．２０８ｇ，１．５２ｍｍｏｌ）が溶解している９０ｍＬのＤＭＳＯとＴＨＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝３／２）に、０．３Ｍのカリウムナフタレン（３．５６ｍＬ）をゆっくりと添加した。アルコキシドが形成されると共に、カリウムナフタレンの緑色が黄色に変化した。ＥＧＥの添加によって重合を開始させ、その後６０℃で攪拌した。質量分析計で高分子の成長を観察しながら、目的の分子量に達するまでＥＧＥの添加を続けた。添加したＥＧＥ（４４．１ｍＬ，４１０ｍｍｏｌ）が完全に消費されたことを確認した後、５Ｎの塩酸を用いて重合を停止させた。ＴＨＦをロータリーエバポレータで減圧留去した後、残渣を過剰量のジエチルエーテルに溶解させ、ＤＭＳＯを取り除くために食塩水で洗浄した。さらに、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に濃縮した。ナフタレンを除去するため、得られた液体を－２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗精製物を減圧乾燥することで、黄色の液体Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＨ（３９．４ｇ，９４％）を得た。
質量分析:　Ｍｎ＝２２，０００。ゲル濾過クロマトグラフィー：Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０２。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３－３．７５（ｍ，１５０６Ｈ，－Ｃ－ＣＨ２－Ｏ－およびＥＧＥ),δ１．１７（ｔ，６４２Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３）。
１－２　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＣＯＯＨの合成
　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＨに対してブロモ酢酸エチルを付加した後、エステル部位を脱保護することで末端にカルボキシル基を有するＴｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＣＯＯＨを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　二口フラスコ中でＴｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＨ（４．００ｇ，０．１８２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１２０ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液に、０．３Ｍのカリウムナフタレン（２４．３２ｍＬ）をゆっくりと滴下し、攪拌した。３０分後も溶液が緑色であったことから、ヒドロキシ基の脱プロトン化が完全に進行したことを確認した。溶液を０℃に冷却し、ブロモ酢酸エチル（１．６１ｍＬ，１４．６ｍｍｏｌ）をシリンジで添加したところ、溶液の色が黄色に変化した。その後、反応系を室温に戻し、２４時間攪拌した。白色の沈殿物が見られる反応液を濾過した後、ロータリーエバポレーターを用いてＴＨＦと過剰のブロモ酢酸エチルを除去した。ナフタレンを除去するため、得られた液体を－２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗精製物を１Ｎの水酸化ナトリウムと１，４－ジオキサンの混合溶液（ｖ／ｖ＝１／１）の中で生成物を８０℃で２４時間攪拌することでエステルの脱保護を行った。５Ｎの塩酸を用いて反応液のｐＨを１にした上で、クロロホルムで抽出し、水と食塩水で洗浄を行った。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後、クロロホルムを減圧留去した。ナフタレンを除去するため、得られた液体を－２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗精製物を減圧下で乾燥させることで、黄色がかった液体Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＣＯＯＨを得た。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．２７（ｓ，８Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ），δ３．３－３．７５（ｍ，１５０６Ｈ，－Ｃ－ＣＨ２－Ｏ－およびＥＧＥ），δ１．１７（ｔ，６４２Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３）。
１－３　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＳｕの合成
　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＣＯＯＨに、縮合剤ＥＤＣを用いてＮ－ヒドロキシスクシンイミドを付加させることで、末端にスクシンイミジル基を有するＴｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＳｕを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＣＯＯＨ（１．００ｇ，０．０４５５ｍｍｏｌ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（０．４１９ｇ，３．６４ｍｍｏｌ）を二口フラスコに量りとり、その中にジクロロメタン（３０ｍＬ）を加えた。その容器へ、ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶かしたＥＤＣ（０．５６５ｇ，３．６４ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくりと滴下した。室温で２４時間攪拌した後、ロータリーエバポレータで溶媒を留去した。得られた液体を酢酸エチルに溶解させ、濾過した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、減圧乾燥することで、粘性がある液体Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＳｕを得た。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３－３．７５（ｍ，１５０６Ｈ，－Ｃ－ＣＨ２－Ｏ－ａｎｄＥＧＥ），δ２．８４（ｍ，１６Ｈ＊，－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯＯＳｕ),δ１．１７(ｔ，６４２Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３)。
なお、得られた１ＨＮＭＲスペクトルを元に、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＳｕの末端スクシンイミジル化率はおおよそ１００％であると見積もった。
１－４　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＮＨ２の合成
　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＳｕにエチレンジアミンを付加させることで、末端にアミノ基を有するＴｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＮＨ２を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＳｕ（１ｇ）をジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解させた。高分子溶液に対してジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させたエチレンジアミン（１．２１５ｍＬ，１８．２ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。混合液を室温で３時間攪拌した後、水と食塩水で洗浄した。最後に硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、ジクロロメタンを減圧下で留去することで、薄い黄色の液体Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＮＨ２を得た。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．１４（ｓ，６．５Ｈ＊，－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－），δ３．３－３．７５（ｍ，１５０６Ｈ，－Ｃ－ＣＨ２－Ｏ－，－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－およびＥＧＥ），δ２．８２（ｔ，７Ｈ＊，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ２），δ１．１７（ｔ，６４２Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３）。なお、得られた１ＨＮＭＲスペクトルを元に、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＮＨ２の末端アミノ化率は８１～８８％程度であると見積もった。
２）　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）モジュールの合成
２－１　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＨの合成
　ペンタエリトリトールを重合起点として、ＥＧＥとＭＧＥを開環重合させることで、末端にヒドロキシ基を有するＥＧＥとＭＧＥの四分岐コポリマーであるＴｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＨを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ペンタエリトリトール（０．２０８ｇ，１．５３ｍｍｏｌ）が溶解している９０ｍＬのＤＭＳＯとＴＨＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝３／２）に、０．３Ｍのカリウムナフタレン（４．０５ｍＬ）をゆっくりと添加した。アルコキシドが形成されると共に、カリウムナフタレンの緑色が黄色に変化した。ＥＧＥとＭＧＥの混合液（ＥＧＥ／ＭＧＥ＝０．８／０．２）を添加することで重合を開始させ、その後６０℃で攪拌した。質量分析計で高分子の成長を観察しながら、目的の分子量に達するまでモノマーの添加を続けた。添加したＥＧＥ（４１．６ｍＬ，３８７ｍｍｏｌ）とＭＧＥ（８．６１ｍＬ，９６．８ｍｍｏｌ）が完全に消費されたことを確認した後、５Ｎの塩酸を用いて重合を停止させた。ＴＨＦをロータリーエバポレータで減圧留去した後、残渣を過剰量のジエチルエーテルに溶解させ、ＤＭＳＯを取り除くために食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に濃縮した。ナフタレンを除去するため、得られた液体を－２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗生成物を減圧乾燥することで、黄色の液体Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＨ（４１．６８ｇ）を得た。
質量分析:Ｍｎ＝２２，５００。ゲル濾過クロマトグラフィー：Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０２。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３－３．７５（ｍ，１５９５Ｈ，－Ｃ－ＣＨ２－Ｏ－，ＥＧＥおよびＭＧＥ），δ１．１７（ｔ，５４６Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３)。
２－２　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＣＯＯＨの合成
　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＨに対してブロモ酢酸エチルを付加した後、エステル部位を脱保護することで末端にカルボキシル基を有するＴｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＣＯＯＨを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　二口フラスコ中でＴｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＨ（２０ｇ，０．８８９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６００ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液に、０．３Ｍのカリウムナフタレン（１２３．２ｍＬ）をゆっくりと滴下し、攪拌した。３０分後も溶液が緑色であったことから、ヒドロキシ基の脱プロトン化が完全に進行したことを確認した。溶液を０℃に冷却し、ブロモ酢酸エチル（７．６３５ｍＬ，７３．７０ｍｍｏｌ）をシリンジで添加したところ、溶液の色が黄色に変化した。その後、反応系を室温に戻し、２４時間攪拌した。ロータリーエバポレーターを用いてＴＨＦと過剰のブロモ酢酸エチルを除去し、残渣を過剰のジエチルエーテルに溶解させた後、白色の沈殿物を濾過して取り除いた。ナフタレンを除去するため、ジエチルエーテルを減圧留去し、得られた液体を－２０℃のヘキサン中に沈殿させ、デカンテーションを行った。この操作を更に二回繰り返した。粗精製物を１Ｎの水酸化ナトリウムと１，４－ジオキサンの混合溶液（ｖ／ｖ＝１／１）の中で生成物を８０℃で２４時間攪拌することでエステルの脱保護を行った。５Ｎの塩酸を用いて反応液のｐＨを１にした上で、クロロホルムで抽出し、水と食塩水で洗浄を行った。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後、減圧下で乾燥させることで、黄色がかった液体Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＣＯＯＨを得た。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．２７（ｓ，８Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ），δ３．３－３．７５(ｍ、１５９５Ｈ，－Ｃ－ＣＨ２－Ｏ－，ＥＧＥおよびＭＧＥ），δ１．１７（ｔ，５４６Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３）。
２－３　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＳｕの合成
　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＣＯＯＨに、縮合剤EDCを用いてN-ヒドロキシスクシンイミドを付加させることで、末端にスクシンイミジル基を有するＴｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＳｕを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＣＯＯＨ（１７ｇ，０．７５６ｍｍｏｌ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（６．９６ｇ，６０．４８ｍｍｏｌ）を二口フラスコに量りとり、その中にジクロロメタン（５１０ｍＬ）を加えた。その容器へ、ジクロロメタン（３４０ｍＬ）に溶かしたＥＤＣ（９．３９ｇ，６０．４８ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくりと滴下した。室温で２４時間攪拌した後、ロータリーエバポレータで溶媒を留去した。得られた液体を酢酸エチルに溶解させ、濾過した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で二回、食塩水で一回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、減圧乾燥することで、粘性がある液体Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ－ＯＳｕを得た。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．３－３．７５（ｍ，１５９５Ｈ，－Ｃ－ＣＨ２－Ｏ－，ＥＧＥおよびＭＧＥ）,δ２．８４（ｍ，１６Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯＯＳｕ），δ１．１７（ｔ，５４６Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３）。
２－４　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＮＨ２の合成
　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＳｕにエチレンジアミンを付加させることで、末端にアミノ基を有するＴｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＮＨ２を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＯＳｕ（１０ｇ，０．４４４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４００ｍＬ）に溶解させた。高分子溶液に対してジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させたエチレンジアミン（５８．８６ｍＬ，８８９ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。混合液を室温で３時間攪拌した後、ロータリーエバポレータでジクロロメタンを減圧留去した。残渣をメタノールに溶解させ、濾過した後、メタノールを外液に透析を行った。透析で精製された溶液を減圧乾燥することで、薄い黄色の液体Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＮＨ２を得た。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３)：δ４．１４（ｓ，７．５Ｈ＊，－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－），δ３．３－３．７５（ｍ，1595Ｈ,－Ｃ－ＣＨ２－Ｏ－，－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－およびＥＧＥ），δ２．８２（ｔ，７Ｈ＊，－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ２），δ１．１７（ｔ，５４６Ｈ，－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３）。
なお、得られた１ＨＮＭＲスペクトルを元に、Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）－ＮＨ２の末端アミノ化率は８８～９４%程度であると見積もった。
ハイドロゲル組成物の作成
　上記で得た温度応答性ポリマー成分及び親水性ポリマー成分を用いて、以下の手順で本発明のハイドロゲル組成物を調製した。
１）　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＰＥＧＥゲルの調製
　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＮＨ２およびＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＯＳｕを、それぞれ別の容器に１０ｍＭの濃度になるよう、シクロヘキサノン中に溶解させた。ここで、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＮＨ２は、市販のものをそのまま用いた（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＰＴＥ－１００ＰＡ、Ｍｎ＝１０，０００，日油）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　得られた二液を同量ずつ取り、別の容器で混合させ、さらにボルテックスミキサーを用いて良く攪拌した。ゲル化が始まる前に、混合液を素早く直径６４０μｍのキャピラリーに移し取り、乾燥を防ぐために両端を粘土でキャップした上で、室温で２４時間静置した。得られたゲルをキャピラリーから丁寧に取り出した後、ゲル化反応の副生成物であるＮ－ヒドロキシスクシンイミドを取り除くため、シクロヘキサノン中で１０℃以下の環境で２４時間静置した。次に、ゲルをシクロヘキサノンとメタノールの混合液（シクロヘキサノン／メタノール＝０．７５／０．２５）に浸し、さらにメタノールの比率を０．５、０．７５、１．０と増加させていくことで、ゲルの溶媒をメタノールへと置換した。同様の手順で、さらにゲルをメタノールと水の混合液（メタノール／水＝０．７５／０．２５）に漬け、水の混合比を０．５、０．７５、１．０と増加させていき、最終的に水で膨潤したＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＰＥＧＥハイドロゲルを得た。
　同様の手順を用いて、末端にアミノ基を有するＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＮＨ２とＴｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＮＨ２および末端にスクシンイミジル基を有するＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＯＳｕ、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧＥ－ＯＳｕの４種類のポリマーを異なる比率で混合させることで、温度応答性ポリマー成分の導入比が異なるＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＰＥＧＥハイドロゲルを得た。ここで、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＯＳｕは、市販のものをそのまま用いた（ＢＲＩＧＨＴ　ＰＴＥ－１００ＨＳ、Ｍｎ＝１０，０００，日油）。得られた各種Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＰＥＧＥハイドロゲルをその組成とともに、表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
２）　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ゲルの調製
　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＯＳｕ、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＮＨ２、Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ＮＨ２の３種類のポリマー成分を用いて、ＥＧＥ＝ＭＧＥ共重合体の温度応答性ポリマー成分を含むハイドロゲルを調製した。ここで、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＯＳｕ及びＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＮＨ２は、分子量２０，０００の市販品を用いた（それぞれ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＰＴＥ－２００ＨＳ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ　ＰＴＥ－２００ＰＡ、いずれも日油）。Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＯＳｕおよびＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＮＨ２は温度に寄らず水溶性であり、Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ＮＨ２は10℃以下の環境で水に易溶であるため（＞１３５ｇ／Ｌ）、水中でのハイドロゲル調製が可能である。ここで、上記のように、四分岐型ポリマー間のスクシンイミジル基とアミノ基の反応速度を制御することで、ゲル化時間を制御すると共に最終ゲル化反応率を向上させることが出来るため、ここでも反応場として、クエン酸―リン酸緩衝液(ＣＰＢ)およびクエン酸―リン酸緩衝液(ＰＢ)を用いた。緩衝液は０．２Ｍのリン酸二水素ナトリウム（１９．０ｍＬ）と０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウム（８１．０ｍＬ）を混合することでＰＢとし、０．１Ｍのクエン酸（１９．７ｍＬ）と０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウムを混合することで、ＣＰＢとした。ｐＨは、それぞれ５．８及び７．４であった。ここでは調製段階の高分子溶液の相分離を防ぐために、以下の作業は全て１０℃以下の環境で行った。
　Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＯＳｕをＣＰＢ、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＮＨ２をＰＢ、及び、Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ＮＨ２をＰＢに、それぞれ高分子濃度が６ｍＭになるように溶解させた。調製した三液を最終モル比がＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＯＳｕ:Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－ＮＨ２:Ｔｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ＮＨ２＝１０：２：８になるように混合し、ボルテックスミキサーを用いてよく攪拌した後、キャピラリーおよび円筒型ゲル枠にそれぞれ流し込み成形を行った。反応液を２４時間静置することで、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ゲルを得た。得られたゲルを水中に２４時間漬けておくことで、ゲル化反応の副生成物であるN-ヒドロキシスクシンイミドを取り除いた。
本発明のハイドロゲルにおける膨潤度の測定
　実施例２で得たＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ゲルを用いて、膨潤度を測定した。具体的には、直径６４０μmのキャピラリーで作製した円筒状のＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ゲルを、水中で３℃で２時間膨潤させ、ゲルが平衡膨潤状態にあることを確認した上で、恒温槽の温度を上昇させながら、各温度でゲルが平衡膨潤状態になるまで待機した後にゲルの直径を記録した。ゲルが等方的に変形すると仮定して、各温度での直径を体積に換算し、各温度でのゲルの体積をＶとして、各温度における体積変化を得た。結果を図２に示す。
　図２は、ゲル作製時の体積をＶ０とし、各温度での体積をＶとしたとき、このゲルの温度に依存する体積変化の比率をプロットしたものである。Ｖ／Ｖ０が１の場合には、ゲル作製状態を維持し、すなわちほとんど膨潤していないことを意味している。図の結果から、おおよそ３５～４０℃の領域では、水中でもゲル作製時の状態を保持していることが分かる。人間の体温の平均が３６．５℃であるから、この結果は、本発明のＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ゲルでは、生体環境においてゲルの膨潤を抑制できることを実証するものである。また、当該温度は、水中におけるＴｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ポリマーの相転移温度である１０℃に対応するものであり、ここで得られたゲルの膨潤抑制の効果は、ゲル中の網目構造におけるＴｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ポリマーのセグメントが当該相転移温度以上で収縮するという構造変化に起因するものといえる。
本発明のハイドロゲルにおける破断強度の測定
　次に、Ｔｅｔｒａ－ＰＥＧ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ゲルの破断強度の評価を行った。ゲルの圧縮試験には、３３６５卓上型万能試験機(インストロン)を用いた。高さ７．５ｍｍで直径９．０ｍｍの円筒型の鋳型で作製したゲルを３７℃の水中に２時間浸漬し、そのサイズを測定したところ、ゲル作製時のものから変化が無いことを確認した。その後、水中からゲルを取り出し、１０ｍｍ／分の速度で圧縮試験を行い、応力―ひずみ曲線を得た。得られた結果を図３に示す。
　図３の結果より、今回調整されたＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ゲルは、長時間水中で静置された後でも６０ＭＰａを超える高い破断強度を有することが明らかになった。当該結果は、温度応答性ポリマー成分であるＴｅｔｒａ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ポリマーのセグメントがゲル中に組み込まれたことで、ゲルの膨潤が抑制され、それによってゲル作製時の高分子体積分率を維持することができ、高い破断強度が得られたものと考えられる。人間の軟骨の破断強度は数ＭＰａ程度であることを考慮すると、本発明のＴｅｔｒａ－ＰＥＧ－Ｐ（ＥＧＥ－ｃｏ－ＭＧＥ）ゲルは、軟骨を置換する用途においても必要十分な高い力学的強度を有しているといえる。

Claims (11)

  1. 　ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマー、及び相転移温度を有する温度応答性の四分岐型ポリマーを構成成分として含み、当該ポリマーの末端が共有結合で架橋した網目構造を有する、ハイドロゲル組成物。
  2. 　前記温度応答性の四分岐型ポリマーにおける前記相転移温度が、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）である、請求項１に記載のハイドゲル組成物。
  3. 　前記温度応答性の四分岐型ポリマーにおける前記相転移温度が、水中において５～４０℃の範囲である、請求項１に記載のハイドゲル組成物。
  4. 　前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーが、下記式（Ｉ）で表されるポリマー
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （ここで、式（Ｉ）中、
    　各ｍは、それぞれ同一又は異なり、２５～２５０の整数であり、
    　各Ｘ１は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒａ－、－ＣＯ－Ｒａ－、－Ｒｂ－Ｏ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ－Ｒｃ－、又は－Ｒｂ－ＣＯ－ＮＨ－Ｒｃ－を示し、ここで、ＲａはＣ１－Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１－Ｃ５アルキレン基を示し、及び
    　各Ｙ１は、アミノ基、－ＳＨ、及び－ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基；又は、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基である。）
    であり、及び、
    前記温度応答性の四分岐型ポリマーが、下記式（ＩＩ）で表されるポリマー
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （ここで、式（ＩＩ）中、
    　各ｎは、それぞれ同一又は異なり、２５～２５０の整数であり、
    　各Ｒ１は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ５アルキル基であり、
    　各Ｘ２は、それぞれ同一又は異なり、Ｃ１－Ｃ７アルキレン基、Ｃ２－Ｃ７アルケニレン基、－ＮＨ－Ｒａ－、－ＣＯ－Ｒａ－、－Ｒｂ－Ｏ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ２－ＮＨ－Ｒｃ－、－Ｒｂ－ＣＯ－Ｒｃ－、又は－Ｒｂ－ＣＯ－ＮＨ－Ｒｃ－を示し、ここで、ＲａはＣ１－Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１－Ｃ５アルキレン基を示し、及び
    　各Ｙ２は、アミノ基、－ＳＨ、及び－ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基；又は、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基である。）
    である、請求項１に記載のハイドロゲル組成物。
  5. 　前記式（ＩＩ）で表される温度応答性の四分岐型ポリマーが、Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、Ｒ１がエチルであるモノマー成分との組み合わせよりなる共重合体である、請求項４に記載のハイドロゲル組成物。
  6. 　前記Ｒ１がメチルであるモノマー成分と、前記Ｒ１がエチルであるモノマー成分のモル比が、１：９～５：５である、請求項５に記載のハイドロゲル組成物。
  7. 　各Ｙ１が、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基、スルホスクシンイミジル基、マレイミジル基、フタルイミジル基、イミダゾーイル基、及びニトロフェニル基よりなる群から選択される求電子性官能基であり、及び、
    　各Ｙ２が、アミノ基、－ＳＨ、及び－ＣＯ２ＰｈＮＯ２よりなる群から選択される求核性官能基である、
    請求項４乃至６のいずれか１項に記載のハイドロゲル組成物。
  8. 　Ｙ１がＮ－ヒドロキシ－スクシンイミジル（ＮＨＳ）基であり、Ｙ２がアミノ基である、請求項７に記載のハイドロゲル組成物。
  9. 　水溶液中、３０～４０℃の範囲における前記ハイドロゲル組成物の体積が、ゲル作成時の体積に対して０．８～１．５の体積変化の範囲の膨潤度である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のハイドロゲル組成物。
  10. 　６０ＭＰａ以上の圧縮破断強度を有する、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のハイドロゲル組成物。
  11. 　前記ポリエチレングリコール骨格を有する四分岐型ポリマーと、前記温度応答性の四分岐型ポリマーのモル比が、１０：９０～９０：１０である、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のハイドロゲル組成物。
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