KR101069186B1 - 골조직 재생을 위한 중공형 마이크로스피어 및 이의제조방법 - Google Patents

골조직 재생을 위한 중공형 마이크로스피어 및 이의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골조직 재생을 위한 중공형 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 구형의 몸체가 내부에 빈 공간을 형성하고 있고, 어느 일측에 외부와 통하는 하나의 구멍이 형성되어 이루어진 골조직 재생을 위한 중공형 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 중공형 마이크로스피어는 외부와 연결되는 구멍이 형성된 열린 구조를 가져 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공하므로 골 및 치주조직의 재생을 효과적으로 도모할 수 있다.
마이크로스피어, 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리, 골조직, 재생, 골전도

Description

골조직 재생을 위한 중공형 마이크로스피어 및 이의 제조방법{HOLLOW MICROSPHERE FOR BONE REGENERATION AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 골조직 재생을 위한 중공형 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외부와 연결되는 구멍이 형성된 열린 구조를 가져 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공하는 중공형 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 척추동물의 뼈 조직이 외상, 종양, 기형 등에 의해 손상되는 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 된다. 이에 손상된 부위에 골을 채워서 신생골을 생성시키는 치료법이 시행된다.
현재까지 알려진 치료방법으로 자신의 골을 이식하는 자가골 이식술, 다른 사람의 뼈를 이식하는 동종골 이식술, 동물의 뼈를 처리하여 이식하는 이종골 이식술 등이 있다.
상기 자가골 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 뼈조직을 손상된 조직 부위에 이식하는 방법으로, 일부 환자에게서 성공을 거두었다. 그러나 정상 조직을 희생하는 셈이 되므로, 이러한 공여부에 새로운 통증이 생길 수 있는 등의 취약점이 있으며, 수술 후 통증, 골절, 출혈, 반흔을 비롯하여 재활이 더디게 이루어지는 등의 합병증이 발생할 수 있는 단점이 있다. 동종골 이식술은 면역 반응, 간염 등의 질환이 전염될 수 있는 위험이 있다. 한편 이종골 이식술은 면역 반응과 광우병 등의 위험이 있는 단점이 있다. 이에 생체 적합성이 우수한 골이식재로서의 생체 인공재료의 개발이 요구되고 있다.
인공 골이식재의 대표적인 물질로, 수산화아파타이트(hydroxyapatite), 인산삼칼슘(tricalcium phosphate) 등의 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 등이 널리 사용되고 있다. 이중 인산칼슘계 세라믹은 생체 적합성이 우수할 뿐만 아니라 안전성이 우수하여 골 이식재로 활발이 연구되고 있다.
한편, 마이크로스피어(microsphere)는 종래에는 방사선 진단약에 사용되었고, 최근에는 약물운반체로 널리 주목받고 있다. 이러한 마이크로스피어는 일반적으로 약물이 고분자 매트릭스에 용해 상태 또는 미결정 상태로 분산하고 있는 1 내지 2000㎛의 미립자계를 가리킨다.
마이크로스피어와 같은 마이크로입자는 약물, 단백질, 세포의 전달, 약물의 지연방출, 표적부위로의 송달, 유동성을 비롯한 물리적 특성의 개선 등의 다양한 목적으로 개발되고 있다(S. Freiberg, X.X. Zhu, Int. J. Pharm. 282, 1 (2004)). 피막소재로 사용되는 고분자, 무기물 및 이들의 혼합물은 상술한 용도를 위해 개발되었고, 시험관내(in vitro) 가능성 및 임상 성과를 보여주었다(K.J. Pekarek, J.S. Jacob, E. Mathiowitz, Nature 367, 258 (1994); M. Borden, M. Attawia, Y. Khan, C.T. Laurencin, Biomaterials 23, 551 (2002); H.J. Gu, H.H. Lee, H.W. Kim, Tissue Eng. 13, 965 (2007); Q.Q. Qiu, P. Ducheyne, P.S. Ayyaswamy, J. Biomed. Mater. Res. 52, 66 (2000); A.M. Rokstad, S. Holtan, B. Strand, B. Steinkjer, L. Ryan, B.Kulseng, G. Skjak-Braek, T. Espevik, Cell Transplant. 11, 313 (2002); D. Kato, M. Takeuchi, T. Sakurai, S. Furukawa, H. Mizokami, M. Sakata, C. Hirayama, M. Kunitake, Biomaterials 24, 4253 (2003); H. Maeda, T. Kasuga, Acta Biomater. 2, 403 (2006); H.W. Kim, B.H. Yoon, H.E. Kim, J. Mater. Sci. Mater. Med. 16, 1105 (2005); Q.Q. Qiu, P. Ducheyne, P.S. Ayyaswamy, Biomaterials 20, 989 (1999)). 유전자, 세포 또는 조직 수준에서 치료 효과를 이끌어내기 위하여 생체 활성 고분자를 유지하고 방출하는데 있어 마이크로 입자가 효과적임이 많은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 연구 결과 밝혀졌다.
상술한 하이드록시아파타이트로 제조된 작은 사이즈(수십 내지 수백 마이크로미터)의 과립은 치주낭 및 치조 뼈에 있는 결점을 채우고 증강하기 위하여 제조되었다(W. Paul, C.P. Sharma, J. Biomater. Appl. 17, 253 (2003); K.A. Al Ruhaimi, Int. J. Oral. Maxillofac Implants. 16, 105 (2001); P.C. Hobar, M. Pantaloni, H.S. Byrd, Clin. Plast. Surg. 27, 557 (2000); J.M. Schmitt, D.C. Buck, S.P. Joh, S.E. Lynch, J.O. Hollinger, J. Periodontol. 68, 1043 (1997)). 이러한 하이드록시아파타이트 과립은 자연적인 뼈의 무기물과 유사한 화학적 조성 때문에 많은 실험적인 모델에서 우수한 뼈 형성 능력이 보고된 바 있다. 생체내(in vivo) 치료효과와 조직 공학을 위한 생체외(ex vivo) 세포분화를 포함하는 특정한 생물학적 반응을 유도하기 위해, 단백질, 항생제 및 성장 인자와 같은 적절한 생체활성 신호가 하이드록시아파타이트 과립 및 스캐폴드와 함께 도입되었다(B.G. Santoni, G.E. Pluhar, T. Motta, D.L. Wheeler, Biomed. Mater. Eng. 17, 277 (2007); H.W. Kim, J.C. Knowles, H.E. Kim, J. Mater. Sci. Mater. Med. 16, 189 (2005); I. Ono, T. Yamashita, H.Y. Jin, Y. Ito, H. Hamada, Y. Akasaka, M. Nakasu, T. Ogawa, K. Jimbow, Biomaterials 25, 4709 (2004); H.W. Kim, H.E. Kim, J.C. Knowles, Biomaterials 25, 1279 (2004)).
다공성 블록과 비교하여, 마이크로스피어를 포함하는 과립형 하이드록시아파타이트는 복잡한 형상의 결손부위를 충진하기 위한 필러로서 뿐만 아니라 주입가능한 캐리어로 이용될 수 있다(M. Borden, M. Attawia, Y. Khan, C.T. Laurencin, Biomaterials 23, 551 (2002); H.J. Gu, H.H. Lee, H.W. Kim, Tissue Eng. 13, 965 (2007)). 이러한 마이크로스피어는 결손 조직에 직접 이식되었을 때 골원성 또는 줄기 세포의 소집 또는 생체외(ex vivo)에서 설계된 후 특성 세포의 전달에 있어서 유용한 벡터로 인지되고 있다(M. Borden, M. Attawia, Y. Khan, C.T. Laurencin, Biomaterials 23, 551 (2002); H.J. Gu, H.H. Lee, H.W. Kim, Tissue Eng. 13, 965 (2007); Q.Q. Qiu, P. Ducheyne, P.S. Ayyaswamy, J. Biomed. Mater. Res. 52, 66 (2000); A.M. Rokstad, S. Holtan, B. Strand, B. Steinkjer, L. Ryan, B. Kulseng, G. Skjak-Braek, T. Espevik, Cell Transplant. 11, 313 (2002); D. Kato, M. Takeuchi, T. Sakurai, S. Furukawa, H. Mizokami, M. Sakata, C. Hirayama, M. Kunitake, Biomaterials 24, 4253 (2003)). 고분자 마이크로입자를 사용한 세포의 배양 및 전달에 관한 최근 연구는 구형의 물질이 세포의 성장 및 군집에 효과적임을 보여준 바 있다(A.M. Rokstad, S. Holtan, B. Strand, B. Steinkjer, L. Ryan, B. Kulseng, G. Skjak-Braek, T. Espevik, Cell Transplant. 11, 313 (2002); D. Kato, M. Takeuchi, T. Sakurai, S. Furukawa, H. Mizokami, M. Sakata, C. Hirayama, M. Kunitake, Biomaterials 24, 4253 (2003)). 더욱이, 콜라겐-아파타이트 마이크로스피어가 쥐-유래 줄기세포의 성장 및 뼈-관련 유전자의 발현을 돕는데 있어 마이크로스피어의 잠재력을 보여준 바 있다(H.J. Gu, H.H. Lee, H.W. Kim, Tissue Eng. 13, 965 (2007)). 그러나, 대부분의 연구가 생체세라믹 입자의 약물 전달 또는 스피어 형성과 관련된 제어에 집중된 반면, 하이드록시아파타이트 마이크로스피어, 특히 세포 전달 및 조직 공학 매트릭스로서의 유용성에 대한 연구가 많이 이루어지지 않은 실정이다(Q.Q. Qiu, P. Ducheyne, P.S. Ayyaswamy, Biomaterials 20, 989 (1999); M.P. Ferraz, A.Y. Mateus, J.C. Sousa, F.J. Monteiro, J. Biomed. Mater. Res. A 81, 994 (2007); S.P. Victor, T.S. Kumar, J. Mater. Sci. Mater. Med. 19, 283 (2008)).
인산칼슘계 세라믹의 조직공학 매트릭스에 관한 연구의 일예로 대한민국 특허등록 제10-0498759호는 인산칼슘계 화합물을 산성 수용액에 용해시키고, 상기 수용액에 염기를 첨가하여 중성 또는 알칼리성으로 조절하고, 온도를 상승시켜, 수산화아파타이트를 재석출하는 수산화아파타이트 과립의 제조방법 제안하고 있다.
또한 대한민국 특허등록 제10-0498759호는 인산삼칼슘 전구체, 기공 전구체, 젤라틴 용액 및 분산매를 이용하여 구형의 다공성 β-인산삼칼슘 구형 과립을 제조 하는 방법을 개시하고 있다.
그러나 상기 언급한 방법에 따라 제조된 인산칼슘계 과립의 경우 모두 닫힌 구조로서, 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공할 수 없는 근본적인 문제점을 가지고 있어, 골이식재 또는 골세포지지체로서 골형성을 촉진하기에 어려운 한계가 있다.
상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 외부와 연결되는 구멍이 형성된 열린 구조를 가져 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공할 수 있는 골 재생을 위한 중공형 마이크로스피어 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
구형의 몸체가 내부에 빈 공간을 형성하고 있고, 어느 일측에 외부와 통하는 하나의 구멍이 형성되어 이루어진 중공형 마이크로스피어를 제공한다.
또한 본 발명은
S1) 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물; 유기용매; 및 결합제를 포함하는 유상을 제조하는 단계;
S2) 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 단계;
S3) 상기 S2)에서 제조된 수상에 상기 S1)에서 제조된 유상을 부가하고 교반하여 O/W형 에멀젼을 제조하는 단계;
S4) 상기 에멀젼 중에 생성된 고형물을 수득하는 단계; 및
S5) 수득된 고형물을 열처리하는 단계
를 포함하는 중공형 마이크로스피어의 제조방법를 제공한다.
본 발명에 따른 중공형 마이크로스피어는 외부와 연결된 구멍이 형성된 열린 구조를 가져 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공한다. 또한 내부에 형성된 빈 공간에도 뼈 조직이 형성될 수 있어 기존의 중실형(solid type) 마이크로스피어와 비교하여 골 형성도가 우수하다. 따라서 본 발명에 따른 중공형 마이크로스피어는 골이식재 또는 골세포 지지체로 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 언급된 중공형 마이크로스피어는 그 내부가 비어 있고, 평균입경 50 내지 1000㎛인 구형의 고형 입자를 의미한다.
본 발명의 중공형 마이크로스피어는 구형의 몸체가 내부에 빈 공간을 형성하고 있고, 어느 일측에 외부와 통하는 하나의 구멍이 형성되어 이루어진다.
이때 마이크로스피어의 재질은 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며, 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않는 생체적합성 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물을 포함하도록 한다.
이러한 인산칼슘계 세라믹 또는 생체활성유리는 본 발명에서 한정하지 않으며, 이 분야에서 공지된 것을 사용한다. 대표적으로 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6OH2), 옥시 아파타이트(Ca10(PO4)6O), 인산일칼슘( Ca(H2PO4)2), 인산이칼슘(CaHPO4·2H2O), 인산삼칼슘(Ca3(PO4)2), 인산사칼슘(Ca4(PO4)2O), 칼슘메타 포스페이트(Ca(PO3)2) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 인산칼슘계 세라믹; 실리카(SiO2), 산화나트륨(Na2O), 산화칼슘(CaO), 오산화인(P2O5) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 생체활성유리; 또는 이들의 혼합물 등이 가능하다.
이때 마이크로스피어는 기계적 물성 및 조직공학적 용도를 고려하여 평균입경이 바람직하게는 250 내지 450 ㎛, 더욱 바람직하게는 300 내지 400 ㎛이다.
상기 중공형 마이크로스피어는 몸체 어느 일측에 외부와 통하는 하나의 구멍이 형성되어 있다. 이러한 구멍은 본 발명의 마이크로스피어가 외부와 연결된 열린 구조를 갖게 하여 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공할 수 있게 한다. 이때 구멍의 직경은 부착된 골세포의 골전도 및 골재생을 위한 표면적 및 공간 제공을 고려하여 마이크로스피어 평균입경의 1/4 내지 1/2의 범위인 것이 바람직하다.
이러한 본 발명의 마이크로스피어는 그 표면에 1.5 ㎛ 이하, 바람직하게는 1 ㎛ 내외의 미세한 인산칼슘계 세라믹 또는 생체활성유리 입자가 형성된 미세-조면화(micro-roughened) 표면을 갖는다. 이와 같은 마이크로스피어의 표면은 이식시 생체 내 존재하는 활성물질 및 세포가 쉽게 반응하여 부착될 수 있도록 한다.
본 발명의 중공형 마이크로스피어는 세포가 부착되어 성장할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공할 수 있는 열린 구조를 갖고, 이러한 구조로 인하여 내부 공 간까지 뼈 조직이 형성될 수 있어 기존의 중실형(solid type) 마이크로스피어와 비교하여 골형성도가 우수하다. 따라서 골이식재 또는 골세포지지체로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 골조직 재생을 위한 중공형 마이크로스피어의 제조단계를 보여주는 순서도이다.
도 1을 참조하면, 전술한 바의 골조직 재생을 위한 중공형 마이크로스피어는
S1) 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물; 유기용매; 및 결합제를 포함하는 유상을 제조하는 단계;
S2) 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 단계;
S3) 상기 S2)에서 제조된 수상에 상기 S1)에서 제조된 유상을 부가하고 교반하여 O/W형 에멀젼을 제조하는 단계;
S4) 상기 에멀젼 중에 생성된 고형물을 수득하는 단계; 및
S5) 수득된 고형물을 열처리하는 단계
를 거쳐 제조한다.
먼저, 단계 S1)에서 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물; 유기용매; 및 결합제를 포함하는 유상을 제조한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 인산칼슘계 세라믹과 생체활성유리는 생체적합성을 갖는 것이라면 어떠한 것이든 가능하다. 대표적으로 하이드록시아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산일칼슘, 인산이칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 칼슘메타 포 스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 인산칼슘계 세라믹; 실리카, 산화나트륨, 산화칼슘, 오산화인 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 생체활성유리; 또는 이들의 혼합물이 가능하다. 이때 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물의 함량은 중공형 마이크로스피어가 용이하게 형성될 수 있도록 유상 중 1 내지 30 중량%인 것이 바람직하다.
상기 유기 용매는 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물; 및 결합제를 균일하게 용해시킬 수 있는 것이면 본 발명에서 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 유기 용매로 소수성 및 휘발성이 강한 것을 사용할 수 있다. 일예로 디클로로메탄, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 아세트산, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합용매가 가능하다.
상기 유상에는 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물; 및 유기용매 이외에 결합제가 첨가된다. 상기 결합제는 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물 분말의 결합을 위해 첨가되는 것으로, 바람직하게는 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티레이트 및 이들의 혼합물을 사용한다. 이때 결합제의 함량은 유상 중 1 내지 10 중량%인 것이 바람직하다.
다음으로, 단계 S2)에서는 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조한다.
상기 친수성 용매는 바람직하게는 증류수를 사용한다.
본 발명의 수상은 제조되는 에멀젼의 안정성 확보를 위해 계면활성제를 포함 할 수 있다. 이때 계면활성제는 O/W형 에멀젼 제조에 이용될 수 있는 HLB(hydrophilic-lipophilic balance) 값이 10 이상인 것이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 일예로 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티레이트, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르 및 이들의 혼합물 등이 가능하다. 계면활성제의 사용량은 안정한 에멀젼의 제조와 제조되는 중공형 마이크로스피어의 입경을 고려하여 수상 중 0.1 내지 10 중량%가 바람직하다.
이어서, 단계 S3)에서는 상기 S2)에서 제조된 수상에 상기 S1)에서 제조된 유상을 부가하고 교반하여 O/W형 에멀젼을 제조한다.
수상에 유상을 부가하여 교반하여 유화함으로써 O/W형 에멀젼이 제조된다. 이때 구형의 입자가 형성되고 고상화(soldificiation)가 진행되는 동안 휘발성이 강한 유기용매는 교반에 의해 휘발하게 되며, 이와 동시에 구형의 입자 내부에 빈 공간이 형성되고 몸체 외부에는 하나의 구멍이 형성된다. 형성된 구멍은 무너지지 않고 구형 입자가 고상화 되면서 안정적으로 형상을 유지하게 된다.
이러한 유기용매 증발과정에서 중공형 마이크로스피어의 몸체에 구멍이 크게 형성되어 열린 구조를 갖게 되는데, 이를 조절하는 것이 매우 중요하다. 이러한 구멍의 형성시 구멍의 직경은 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공하기 위하여 마이크로스피어의 평균 입경의 1/4 내지 1/2의 범위로 형성되도록 해주는 것이 중요하다. 이렇게 마이크로스피어의 몸체에 형성된 구멍은 후술할 열처리 공정을 거쳐 더욱더 안정적인 구조를 갖게 된다.
상기 에멀젼 제조방법으로는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절 히 선정될 수 있는 유중수형 에멀젼의 제조방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 경우 호모믹서(homogenizer) 또는 교반기 등을 사용할 수 있다.
이때, 수상의 부피는 유상의 부피에 대해서 10 내지 1000배가 되도록 한다. 이는 수상의 부피가 10 배 미만이면 같은 교반 조건하에서 에멀젼 형성시 응집이 발생하는 문제점이 있고, 이와 반대로 1000 배를 초과하는 경우 수율 및 생산성이 저하되기 때문이다.
이때 에멀젼은 열린 구조를 갖는 중공형 마이크로스피어의 제조를 위해 100 내지 2,000 rpm의 교반속도로 10 분 내지 24 시간 충분히 교반하여 제조한다. 만약 교반 속도가 너무 빨라 지면 입자 및 구멍의 형성이 어렵고, 깨지는 문제점이 있으며, 이와 반대로 교반 속도가 너무 느리면 입자들의 초기 형성시 응집에 의한 마이크로스피어의 입경이 커지는 문제점이 있기 때문이다. 교반시간은 유기용매가 충분히 증발하고 마이크로스피어가 고상화하는데 필요한 시간으로서 마이크로스피어의 재질, 교반속도, 유기용매의 종류에 따라 상기 범위 내에 변경될 수 있다.
다음으로 단계 S4)에서는 상기 에멀젼 중에 생성된 고형물을 수득한다.
유기용매 증발 후 고상화가 완전히 이루어져 경화된 중공형 마이크로스피어를 포함하는 고형물을 수득한다. 이때 여과공정, 세척공정, 건조공정 등의 통상적으로 알려진 방법이 수행된다.
마지막으로 단계 S5)에서는 수득된 고형물을 열처리한다.
이러한 열처리 단계를 통해 표면에 잔류하고 있는 결합제, 계면활성제, 미반응 물질 등이 제거되며, 인산칼슘계 세라믹 또는 생체활성유리 입자 등이 치밀화되 어 결정화됨으로써 안정적 구조를 갖게 된다.
이때 열처리는 1) 300 내지 1000 ℃에서 1 시간 내지 10 시간 동안 수행하는 1단계; 및 2) 600 내지 1500 ℃에서 10 분 내지 5 시간 동안 수행하는 2단계를 포함하는 것이 바람직하다.
이러한 열처리 1단계는 0.1 내지 5 ℃/min의 승온 속도로 수행하고, 2단계는 1 내지 50 ℃/min의 승온 속도로 수행하는 것이 바람직하다.
이때 열처리 온도 및 시간이 상기 범위 미만이면 인산칼슘계 세라믹 또는 생체활성유리의 충분한 결정화가 이루어지지 않고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하여 수행하면 마이크로스피어와 이에 형성된 구멍의 크기가 감소되므로 상기 범위내에서 적절히 수행되어야 한다.
상술한 1단계 열처리를 거치면서 결합제, 미반응 물질 등의 소멸에 의한 중량 감소가 이루어지고, 2단계 열처리를 거치면서 출발물질인 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 분말이 소결되어 마이크로스피어의 크기가 감소하게 된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 하이드록시아파타이트 중공형 마이크로스피어 제조
1.1 하이드록시아파타이트 분말의 제조
전구체인 Ca(NO3)2·4H2O와 (NH4)2HPO4를 수용액으로 하는 습식반응에 의해 하이드록시아파타이트 분말을 제조하였다. 각각의 화합물은 증류수에 용해하였고, 화학양론적으로 Ca/P의 몰비가 1.67이 되도록 혼합하였다. 반응은 37 ℃에서 24시간 공기중에서 진행되었고, pH는 Tris-HCl 버퍼를 사용하여 9.0으로 조정하였다. 반응후 침전을 여과하고, 세척한 후 건조하였다. 건조된 분말은 700 ℃에서 3시간 동안 하소(calcine)하여 하이드록시아파타이트 분말을 얻었다.
1.2 중공형 마이크로스피어의 제조
얻은 하이드록시아파타이트 분말 20 중량%를 5 중량%의 폴리비닐부티레이트(PVB)를 포함하는 디클로로메탄(DCM)에 분산시켜 유상을 제조하였다. 강하게 유상을 교반한 후 계면활성제로 2 중량%의 폴리비닐알코올(PVA)을 포함하는 수욕에 350 rpm 교반하면서 부가하였다. 이때 유상 대 수상의 부피비는 1: 30이었다. 교반 동안 유상 중의 디클로로메탄은 증발하였고, 마이크로스피어 입자들이 경화되었다. 30분 동안 교반 후 마이크로스피어를 여과지로 여과한 다음 증류수로 세척하였다. 얻은 마이크로스피어를 50 ℃에서 건조하였고, 이어서 로(furnace)에서 열처리하였다. 이때 열처리는 600 ℃까지 2.5 ℃/분의 승온속도로 가열하여 4시간 동안 1차 열처리하고, 1,200 ℃까지 10 ℃/분의 승온속도로 가열하여 2시간 동안 2차 열처리하였다. 그리고 상온에서 냉각시켰다.
실험예 1: XRD 분석
본 발명의 제조방법이 출발물질인 인산칼슘계 세라믹의 결정화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 출발물질로 사용한 하이드록시아파타이트 분말과 실시예 1에서 제조된 중공형 마이크로스피어를 X-선 회절분석기(X-Ray Diffraction, XRD)를 이용하여 측정하였으며, 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 (a)는 출발물질인 하이드록시아파타이트 분말의 X-Ray 회절 분석 스펙트럼이고, (b)는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 하이드록시아파타이트 중공형 마이크로스피어의 X-Ray 회절 분석 스펙트럼이다.
도 2를 참조하면, 출발물질인 하이드록시아파타이트 분말과 달리 중공형 마이크로스피어의 경우 특징적인 하이드록시아파타이트 결정의 피크가 관찰되어, 본 발명의 제조방법을 통해 출발물질인 하이드록시아파타이트가 결정화 되었음을 확인할 수 있다.
실험예 2: 주사전자현미경 분석
상기 실시예 1에서 제조한 중공형 마이크로스피어의 표면 형상 및 미세 구조를 알아보기 위해 주사전자현미경(Scanning electron microscopy)으로 분석하였고, 얻어진 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3은 실시예 1에서 열처리 전 마이크로스피어의 표면을 확대한 주사전자현미경 사진이다.
도 3을 참조하면, O/W 에멀젼 제조방법에 의해 몸체에 구멍(도 3의 화살표 참조)이 형성된 중공형 마이크로스피어가 제조되었음을 확인할 수 있다.
도 4의 (a)는 실시예 1에서 제조된 마이크로스피어에 형성된 구멍을 확대한 주사전자현미경 사진, (b)는 마이크로스피어의 단면을 확대한 주사전자현미경 사진, (c)는 마이크로스피어의 표면을 확대한 주사전자현미경 사진이다.
도 4를 참조하면, 2단계에 걸친 열처리에 의해 구형의 형상 및 몸체에 형성된 구멍이 안정적으로 유지됨을 확인할 수 있다.
도 4의 (a)를 참조하면, 마이크로스피어의 어느 일측에 100㎛ 이상의 직경을 갖는 구멍이 형성됨을 알 수 있고, (b)를 참조하면, 이러한 구멍이 마이크로스피어 몸체에 형성됨으로써 마이크로스피어는 외부와 연결된 열린 구조의 얇은 벽으로 이루어진 중공형의 형상을 갖고, 벽의 두께는 수십 ㎛임을 확인할 수 있다. 또한 (c)를 참조하면, 실시예 1에서 제조된 중공형 마이크로스피어는 많은 하이드록시아파타이트 입자로 이루어진 미세-조면화(micro-roughened)된 표면을 갖는다.
실험예3 : 중공형 마이크로스피어의 평균 입경 분석
상기 실시예 1에서 제조한 중공형 마이크로스피어의 사이즈 분포를 알아보기 위해, 입경을 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, 중공형 마이크로스피어는 수십 내지 수백 ㎛ 입경을 갖는 크기로, 평균 입경이 363 ㎛임을 알 수 있다. 이러한 평균 입경은 세포 전달 및 조직 공학적 적용에 적절한 크기로 판단된다.
실험예4 : 전조골세포 배양 실험
상기 실시예 1에서 제조한 중공형 마이크로스피어의 생체활성도를 알아보기 위해 전조골세포(preosteoblast)인 쥐-유래 MC3T3-E1 세포를 배양하여 마이크로스피어 표면 및 내부에서 자란 세포의 형상을 관찰하였으며, MTS (CellTiter 96 AQueous One solution cell proliferation assay : promega) 분석을 이용하여 세포 증식률을 측정하였다.
세포는 10% FBS 및 성장 배지(α-MEM, 2mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신)가 담긴 배양 플라스크에 유지하였다. 세포 실험을 위해 체질(seiving)을 통해 200 내지 600 ㎛의 사이즈를 갖는 마이크로스피어를 분리한 다음, 30분 동안 70 % 에탄올로 소독한 후 층류(laminar flow)로 건조하였다. 이어서 마이크로스피어를 혈청 없는 배지(serum free medium)로 두 번 세척하였고, 시료 10 mg을 96 웰 플레이트 각각의 플레이트에 첨가하였다. 웰 표면을 덥도록 마이크로스피어의 농도를 조절하였다. 대조군으로 마이크로스피어가 없는 빈 웰 플레이트를 사용하였다. 50 ㎕ 세포 부유액(cell suspension, 세포농도 4×105 cells/mL)을 각각의 웰에 씨딩하였다. 골 분화(osteoblastic differentiation)를 유도하기 위해 배지에 50 ㎍/ml 아스크로브산, 10 mM β-글리세롤 및 10 nM 덱사메타손을 첨가하였다. 6 시간 배양 후 150 ㎕ 배지를 각각의 웰에 추가하였고, 그 다음 3, 7, 10일 동안 배양하였다.
마이크로스피어 표면 및 내부에서 자란 세포 형상은 시료를 글루타르알데히드로 고정하고, 에탄올로 탈수화한 다음 헥사메틸 디실라잔으로 처리하여 주사전자 현미경(Scanning electron microscopy)으로 분석하였고, 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다.
세포 증식률은 MTS (CellTiter 96 AQueous One solution cell proliferation assay : promega) 분석에 의해 정량되었고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 6은 실시예 1에서 제조된 중공형 마이크로스피어를 이용하여 골형성세포인 MC3T3-E1을 7일 동안 배양한 후 (a) 표면 및 (b) 내부를 확대한 주사전자현미경 사진이다.
도 6을 참조하면, 골형성 세포가 미세-조면화된 표면 위에 활발한 세포골격 확장(cytoskeletal extension)을 함을 알 수 있다. 또한 마이크로스피어 외부 표면 뿐만 아니라 내부 표면에서도 골형성 세포가 자라고 있어, 내부 공간이 세포의 성장 및 증식을 위한 공간으로 작용하였음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 중공형 마이크로스피어는 세포 전달 및 조직공학을 위한 지지체로도 유용하게 사용할 수 있다.
도 7은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 중공형 마이크로스피어 표면에서 골형성 세포의 증식률을 MTS 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7을 참조하면, 배양 시간이 길어짐에 따라 세포의 양이 지속적으로 증가하였음을 보여주고, 이는 본 발명의 마이크로스피어가 세포가 부착하여 증식하기에 바람직한 지지체라는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 중공형 마이크로스피어는 세포친화성 및 골전도성이 우수하 여 골 및 치주 조직의 재생을 위한 조직공학용 지지체로 이용되어 치과 및 정형외과 분야에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 마이크로스피어의 제조단계를 보여주는 순서도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 출발물질로 사용한 하이드록시아파타이트 분말과 실시예 1에서 제조된 하이드록시아파타이트 중공형 마이크로스피어의 X-Ray 회절 분석 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 열처리 전 마이크로스피어의 표면을 확대한 주사전자현미경 사진이다(스케일바=1mm).
도 4의 (a)는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 마이크로스피어에 형성된 구멍을 확대한 주사전자현미경 사진(스케일바=300㎛), (b)는 마이크로스피어의 단면을 확대한 주사전자현미경 사진(스케일바=100㎛), (c)는 마이크로스피어의 표면을 확대한 주사전자현미경 사진(스케일바=10㎛)이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 중공형 마이크로스피어의 사이즈 분포도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 중공형 마이크로스피어를 이용하여 골형성세포인 MC3T3-E1을 7일 동안 배양한 후 (a) 표면 및 (b) 내부를 확대한 주사전자현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 중공형 마이크로스피어 표면에서 골형성 세포의 증식률을 MTS 방법으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims (14)

  1. 내부에 빈 공간을 형성하고 있는 구형의 몸체 일측에 외부와 통하는 1개의 열린 구멍이 형성되어 있으며, 구멍의 직경은 몸체 평균 입경의 1/4 내지 1/2의 범위이며, 하이드록시아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산일칼슘, 인산이칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 인산칼슘계 세라믹; 실리카, 산화나트륨, 산화칼슘, 오산화인 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 생체활성유리; 또는 이들의 혼합물을 포함하는 중공형 마이크로스피어.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 마이크로스피어의 평균입경은
    250 내지 450 ㎛인 것인 중공형 마이크로스피어.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 마이크로스피어의 표면에
    인산칼슘계 세라믹 또는 생체활성유리 입자가 형성된 것인 중공형 마이크로 스피어.
  6. 제5항에 있어서, 상기 입자의 직경은
    1.5 ㎛ 이하인 것인 중공형 마이크로스피어.
  7. S1) 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물; 유기용매; 및 결합제를 포함하는 유상을 제조하는 단계;
    S2) 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 단계;
    S3) 상기 S2)에서 제조된 수상에 상기 S1)에서 제조된 유상을 부가하고 교반하여 O/W형 에멀젼을 제조하는 단계;
    S4) 상기 에멀젼 중에 생성된 고형물을 수득하는 단계; 및
    S5) 수득된 고형물을 열처리하는 단계
    를 포함하는 제1항의 중공형 마이크로스피어의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인산칼슘계 세라믹은 하이드록시아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산일칼슘, 인산이칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종이고,
    상기 생체활성유리는 실리카, 산화나트륨, 산화칼슘, 오산화인 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것인 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 유기용매는
    디클로로메탄, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 아세트산, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것인 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 결합제는
    폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티레이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것인 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 계면활성제는
    폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것인 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 유상:수상의 부피비는
    1:10 내지 1:1000인 것인 제조방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 열처리는
    1) 300 내지 1000 ℃에서 1 시간 내지 10 시간 동안 수행하는 1단계; 및
    2) 600 내지 1500 ℃에서 10 분 내지 5 시간 동안 수행하는 2단계
    를 포함하는 것인 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 1단계는 0.1 내지 5 ℃/min의 승온 속도로 수행하고,
    상기 2단계는 1 내지 50 ℃/min의 승온 속도로 수행하는 것인 제조방법.
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