-
Technisches
Gebiet
-
Die
Erfindung betrifft neues bei Raumtemperatur durchzuführendes
Verfahren, um Calciumphosphat, insbesondere Hydroxyapatit, zu erhalten,
Mikrokügelchen
und Beschichtungen mit verkapselten Wirkstoffen, Proteinen, Genen,
DNA für
die therapeutische Verwendung. Die Beschichtungen und Mikrokügelchen
sind dazu vorgesehen, eine definierte biologische Funktion in Bezug
auf die Wirkstoffabgabe zu leisten, z. B. Gentherapie durch Abgabe
von Genen. Ein neues Verfahren für
die Verkapselung und nachfolgende kontrollierte Abgabe von therapeutisch aktiven
Mitteln aus diesen biofunktionellen Beschichtungen und Mikrokügelchen
wird offenbart. Solche Beschichtungen und Mikrokügelchen sind nützlich für nebenwirkungsfreie,
langzeitige, gezielte, kontrollierte Freisetzung und Abgabe von
Wirkstoffen, Proteinen, DNA und anderen therapeutischen Mitteln.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Der
schnelle Erfolg bei dem Humangenomprojekt verspricht, dass Krankheiten,
die früher
nicht behandelt werden konnten, in naher Zukunft heilbar sind. Es
gibt die Erwartung, dass die Ära
von Versuch und Fehler, "Trial
and Error", bei
der Bekämpfung
von Krankheiten, indem die Symptome bekämpft werden, zu einem Ende
kommt. Demzufolge wird der Gegenstand der Wirkstoff- und Genfreisetzungskontrolle
zunehmend kritisch. Derzeit müssen
viele Arten von neuen Wirkstoffen oder Genen durch tägliche Injektionen
oder sogar mehrere Male pro Tag verabreicht werden. Ein vollständig neuer
Ansatz zur Wirkstoffabgabe ist daher notwendig, um die Vorteile
neuer Wirkstoffe, die durch das Genomprojekt entstehen, voll ausnutzen
zu können.
Eine langsame aber stetige Freisetzung von Wirkstoffen wird für die Behandlung
vieler Krankheiten, von Krebs und Parkinson-Krankheit bis zu hormoneller
Behandlung von Fettsucht, wo direkt verabreichte Hormone im menschlichen
Körper
nur über
einen kurzen Zeitraum verweilen, erwünscht. In der Vergangenheit
wurden polymere Materialien für
die Wirkstoffabgabekontrolle verwendet und erzielten wesentliche
klinische Erfolge für
bestimmte Wirkstoffsysteme. Der Bedarf für alternative anorganische
Wirk stoffabgabesysteme, die mehr Flexibilität bei der Auswahl des Wirkstoffträgersystems,
der biologischen Resorption und Freisetzungskontrolle, eine Kontrolle
der hydrophoben/hydrophilen Eigenschaften und vernachlässigbare
Nebenwirkungen bieten, ist daher offensichtlich. Eine Hydroxyapatit-(HA)-Matrix
für die
Wirkstoffverkapselung, die bereits die hauptsächliche anorganische Komponente
von Knochen ist, bietet völlig
neue Perspektiven für
Wirkstoffabgabesysteme.
-
Hydroxyapatitkeramiken,
Ca10(PO4)6(OH)2 gehören zu einer
großen
Klasse von auf Calciumphosphat (CaP) basierenden biologisch aktiven
Materialien, die für
eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen verwendet werden, einschließlich Matrizes
zur Wirkstofftreisetzungskontrolle. [M. Itokazu et al., Biomaterials,
19, 817–819,
1998; F. Minguez et al., Drugs Exp. Clin. Res., 16[5], 231–235, 1990;
W. Paul und C. P. Sharma, J. Mater. Sci. Mater. Med., 10, 383–388, 1999].
Andere Mitglieder der CaP-Familie, wie Dicalciumphosphat CaHPO4·2H2O, oder Tricalciumphosphat, Ca3(PO4)2, wurden auch
für ähnliche Zwecke
verwendet. Die CaP-Familie von Materialien ist schon lange anerkannt
als die mit dem höchsten Grad
an biologischer Kompatibilität
mit menschlichem Gewebe.
-
Über Calciumphosphatzemente
(CPC) wurde in einem binären
System berichtet, das Tetracalciumphosphat (TTCP) und Dicalciumphosphatanhydrat
(DCPA) enthält
[L. C. Chow et al., J. Dent. Res., 63, 200, 1984]. Die CPC-Vorteile
der Selbsthärtung und
einer apatitischen Phase, z. B. HA, als Endprodukt führten zu
Anwendungen, wie Knochenersatz und Rekonstruktion und auch Wirkstoffabgabe
[M. Dairra et al., Biomaterials, 19, 1523–1527, 1998; M. Otsuka et al.,
J. of Controlled Release, 43 (1997) 115–122, 1997; Y. Tabata, PSTT,
Bd. 3, Nr. 3, 80–89, 2000;
M. Otsuka et al., J. Pharm. Sci., Bd. 83, Nr. 5, 1994]. CPC wird
typischerweise als Mischung von festen und flüssigen Komponenten in den richtigen Anteilen
formuliert, die unter Bildung von Apatit reagieren. Die physikalischchemischen
Reaktionen, die beim Vermischen der festen und flüssigen Komponenten
auftreten, sind kompliziert, aber Auflösung und Ausfällung sind
die hauptsächlichen
Mechanismen, die für
die Apatitbildung schließlich
verantwortlich sind [C. Hamanish et al., J. Biomed. Mat. Res., Bd.
32, 383–389,
1996; E. Ferandez et al., J. Mater. Sci. Med. 10, 223–230, 1999].
Der Reaktionsweg in den meisten CPC-Systemen führt nicht zu stöchiometrischem
HA, sondern zu calciumdefizientem Ca10–x(HPO4)x(PO4)6–x(OH)2–x, ähnlich dem
in Knochen gefundenen. Die Verfahrensparameter, wie Ca/P-Verhältnis, Verhältnis Pulver/Flüssigkeit,
Kristallkeimkonzentration und -art, Art der Reagenzien, Kontrolle
der endgültigen
Eigenschaften, wie Phasengehalt, Porosität, Festigkeit, Härtungszeit,
Phasenumwandlungskinetik und Mikrostruktur des von CPC abgeleiteten
Hydroxyapatits (CPC-HA)
[Bermudez et al., J. Mat. Sci. Med. 4, 503–508, 1993; ibid 5, 67–71, 1994]
korrelierten mit der Druckfestigkeit von CPC gegenüber dem
Ausgangs-Ca/P-Verhältnis in den
Systemen von Monocalciumphosphatmonohydrat (MCPM) und Calciumoxid.
Es wurde gefunden, dass das optimale Ca/P-Verhältnis in einem Bereich von
1,25 bis 1,45 liegt. Brown et al. [J. Am. Cerm. Soc. 74[5] 934–40, 1991]
fanden, dass die Kinetik der HA-Bildung bei niedrigen Temperaturen
in dem DCP/TTCP-System anfangs durch die Oberfläche der Reaktanten und schließlich durch
Diffusion kontrolliert wird. Diese Prozessvariablen werden in dem vorliegenden
Projekt zur Kontrolle der Kristallinität verwendet und somit zur Resorption
und Wirkstofffreisetzungsrate aus den HA-Mikrokügelchen.
-
Biomimetische
Abscheidung von HA-Filmen bei Raumtemperatur (BM-HA) wurde verwendet
für eine
Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen, einschließlich der
Wirkstoffabgabe [H. B. Wen et al., J. Biomed. Mater. Res. 41, 227–36, 1998;
S. Lin und A. A. Campbell, U.S.-Patent Nr. 5958430, 1999; D. M.
Liu et al., J. Mater. Sci. Mater. Med. 5, 147–153, 1994; K. de Groot et
al., J. Biomed. Mater. Res., 21, 1375–1381, 1987]. Dieser Bildungsmechanismus wird
von der Übersättigung
von Ca2+ und PO4 3– unter einem
geeigneten Lösungs-pH-Wert
angetrieben, wobei HA die stabilste Phase ist. Die apatitischen Kristalle
formen sich durch Kristallkeimbildung und Wachstum und können biologisch
aktive Molekülarten
einbauen, wie Antibiotika, Antikrebswirkstoffe, entzündungshemmende
Mittel etc. Die Abscheidungsraten sind jedoch klein für BM-HA,
im Allgemeinen in einem Bereich von 0,05 bis 0,5 μm/h und eine hoch
dosierte Konzentration von Wirkstoff ist schwierig zu erzielen.
Daher ist allein stehendes BM-HA nicht geeignet, wenn das Ziel darin
besteht, Filme von mehr als 1 μm
zu bilden, kann aber geeignet sein als zusätzlicher Verkapselungsfilm
oben auf der porösen
HA-Struktur, die
mit dem Wirkstoffmaterial gesättigt
ist. Dies ist besonders kritisch für Orthopäden, wo eine hohe Konzentration
an Antibiotika an der Knochen-HA-Grenzfläche erforderlich
ist, um eine akute Entzündung
kurz nach der Operation zu vermeiden. Weiterhin basieren die physiologischen
Lösungen
für BM-HA- Bildung natürlicherweise
auf Wasser, was es unmöglich
macht, hydrophobe biologisch aktive Mittel in BM-HA-Beschichtungen
zu verkapseln.
-
Sol-Gel-Abscheidung
von HA-(SG-HA)-Filmen bei erhöhten
Temperaturen (375 bis 500°C)
wurden bereits von D. Liu und T. Troczynski in der U.S.-Patentanmeldung Serial
Nr. 09/563,231, eingereicht am 2. Mai 2000, offenbart. Sol-Gel-(SG)-Verarbeitung
von HA lässt
ein Vermischen der Calcium- und Phosphorvorläufer auf Molekülebene zu,
was die chemische Homogenität
des entstehenden Calciumphosphats verbessert. Die Vielseitigkeit
der SG-Methode öffnet
eine Möglichkeit,
um dünne
Filmbeschichtungen in einem einfachen, milden, bei relativ geringer
Temperatur durchführbaren
Verfahren zu bilden. Die Kristallinität der Calciumphosphatphase, die
durch das neue erfinderische Verfahren von D. Liu und T. Troczynski
erhalten wird, kann durch geeignete Verwendung einer Wasserbehandlung
während
des Verarbeitens verbessert werden. Die Variation des Ca/P-Verhältnisses.
in der Sol-Gel-Vorläufermischung
lässt es
zu, andere Phasen als Calciumphosphatphasen zu erhalten, z. B. Hydroxyapatit,
Dicalciumphosphat, Tricalciumphosphat oder Tetracalciumphosphat.
Die Verwendung von dünnen
(< 1 μm) dichten
hoch kristallinen Filmen aus SG-HA, um als Kern zu dienen und zu
dicken (> 10 μm) porösen gering
kristallinen (amorphen) Filmen aus CPC-HA für die Wirkstoffverkapselung
und Freisetzung zu wachsen, wird hier offenbart.
-
Probleme
mit Wirkstoffabgabe in vivo sind verbunden mit der Toxizität des Trägermittels,
der allgemein niedrigen Beladungskapazität für Wirkstoffe ebenso wie dem
Ziel, die Wirkstoffabgabe zu kontrollieren, was zu einer selbst
regulierten zeitweisen Freisetzung führt. Mit Ausnahme von kolloidalen
Trägersystemen,
die eine relativ hohe Beladungskapazität für Wirkstoffe unterstützen, geben
die meisten Systeme biologisch aktive Arzneistoffe in nicht ausreichendem
Ausmaß ab.
In Bezug auf die Genabgabe ist bis heute die effizienteste obwohl
am wenigsten sicherste Methode der Abgabe der über Viren vermittelte Gentransfer.
Es ist eine äußerst ineffiziente
Methode und liefert noch größere Probleme
als die Abgabe von Wirkstoffen aufgrund der hydrophilen und labilen
Natur der DNA-Oligos.
Die Probleme mit der Abgabe von Genen oder Antisense-Oligos entsteht
durch die schnelle Clearance von Plasmid-DNA oder Oligos durch Leber-
und Nierenaufnahme ebenso wie den Abbau von DNA durch Serumnucleasen [Y. Takura
et al., Eur. J. Pharm. Sci. 13 (2001), 71–76]. Diese Wirkungen wurden
sowohl in situ als auch bei intravenöser Abgabe beobachtet. Es wird
z. B. geschätzt,
dass mehr als die Hälfte
der intravenös oder
in situ abgegebenen nackten Plasmid-DNA von der Tumorstelle innerhalb
der ersten zwei Stunden nach Intratumoralinjektion verstoffwechselt
wurde [K. Ohkouchi et al., Cancer Res. 50 (1996), 1640–1644 und
H. Imoto et al., Cancer Res. 52 (1992), 4396–4401]. Sogar nach der Clearance
macht nur ein geringer Prozentsatz der verbleibenden DNA oder der
verbleibenden Oligos ihren Weg in das Cytoplasma oder den Kern der
Zielzelle. Die Membrandurchlässigkeit
für nackte
DNA und insbesondere Oligos ist praktisch nicht vorhanden aufgrund
ihrer polyanionischen Natur. Aus diesem Grund ist ihre Aufnahme über das
endosomale Kompartiment mit einem starken Abfall des pH-Werts und
einem Abbau verbunden. Schließlich
müssen
viele der abgegebenen Gene für
eine stabile Expression transportiert und manchmal in das Genom
der Zielzelle eingebaut werden. Dies macht den Gentransfer in vivo
sehr schwierig. Zusätzlich
ist eine erfolgreiche kontrollierte Freisetzung immer noch problematisch
für die meisten
Anwendungen (mit Ausnahme der nackten DNA-Impfstoffe) und es ist
wünschenswert,
eine längere
Expression des interessierenden Gens zu haben, um den speziellen
medizinischen Zustand zu verbessern. Bei den meisten Anwendungen
ist für
die Expression eines bestimmten Genprodukts ein Zeitraum von wenigen
Wochen bis mehreren Monaten erwünscht.
-
Wirkstoffverkapselung
in HA wurde in der Vergangenheit erreicht durch einfache Nachimprägnierung
einer gesinterten porösen
HA-Keramik [K. Yamamura et al., J. Biomed. Mater. Res. 26, 1053–64, 1992].
Bei diesem Verfahren werden die Wirkstoffmoleküle einfach an der Oberfläche der
porösen
Keramik adsorbiert. Die Wirkstofffreisetzung wird durch Desorption
und Auslaugen des Wirkstoffs in das umgebende Gewebe nach Kontakt
mit physiologischer Flüssigkeit
erreicht. Unglücklicherweise werden
die meisten adsorbierten Wirkstoffmoleküle aus solchen Systemen in
einem relativ kurzen Zeitraum freigesetzt. Die Imprägnierung
von porösen
gesinterten Calciumphosphatmikrokügelchen mit Wirkstoffmaterial
wurde in der Patentliteratur berichtet. Poröse Körnchen mit "langsamer Freisetzung" werden in U.S.-Patent
Nr. 5 055 307 [S. Tsuru et al., 1991] beansprucht, wobei die Körnchen bei
200 bis 1400°C
gesintert werden und die Poren mit der Wirkstoffkomponente imprägniert werden. "Calcium phosphate
microcarriers and mic rospheres" (Calciumphosphatmikroträger und
Mikrokügelchen)
werden in WO 98/43558 von B. Starling et al. [1998] beansprucht,
wobei hohle Mikrokügelchen
gesintert und mit Wirkstoffen für
langsame Freisetzung imprägniert werden.
D. Lee et al. beanspruchen kaum kristallinen Apatit [WO 98/16268],
wobei Makroformen härten und
gleichzeitig Wirkstoffmaterial verkapseln für eine langsame Freisetzung.
Es wurde vorgeschlagen, poröses
zusammengesetztes HA als Träger
für Gentamicinsulfat
(GS), ein Aminoglycosidantibiotikum, zu verwenden, um bakterielle
Infektionen an infizierten Knochenstellen zu behandeln [J. M. Rogers-Foy et al., J. Inv.
Surgery 12 (1997) 263–275].
Die Gegenwart von Proteinen in HA-Beschichtungen beeinflusste die
Auflösungseigenschaften
weder von Calcium- noch Phosphorionen und war nur abhängig von den
Medien [S. A. Bender et al., Biomaterials 21 (2000) 299–305].
-
Die
Gruppe der Kobe-Universität,
die von Prof. M. Otsuka geführt
wird, führte
eine Reihe von Untersuchungen zur Wirkstoffverkapselung in selbsthärtenden
Calciumphosphatzementen durch, die von Tetracalciumphosphat und
Dicalciumphosphat abgeleitet sind [J. Contr. Rel. 43, 115–122, 1997;
ibid 52, 281–289,
1998; J. Pharm. Sci. 83, 611–615, 259–263, 255–258, 1994].
Der Zement wurde durch in-situ-Wirkstoffverkapselung in Makropellets
mit 15 mm Durchmesser geformt und die Wirkstoff-(Indomethacin)-Freisetzung
bis zu 3 Wochen überwacht.
Es wurde geschlossen, dass das Zement-Wirkstoffabgabesystem, das
in situ in umgebendes Knochengewebe geformt wird, ein exzellenter
Weg sein könnte, um
lokalisierte Knocheninfektionen mit hoher therapeutischer Wirksamkeit
zu behandeln. Der Vorteil von HA für die Wirkstoffabgabe ist es,
dass Nebenwirkungen nie für
Hydroxyapatitmaterialien befürchtet
wurden [Y. Shinto et al., J. Bone Jt. Surg., 74B4, 600-4, 1992].
Mischungen aus Calciumphosphat-biologisch abbaubaren Polymeren wurden
auch als mögliche
Träger
für die
Wirkstoffabgabe untersucht [I. Soriano und C. Evora, J. Contr. Rel.
68, 121–134, 2000].
Verlängerte
Wirkstofffreisetzung (bis zu 10 Wochen) wurde für die Verbundstoffe, die mit
hydrophoben Polymerbeschichtungen beschichtet waren, erhalten. Eine
Gruppe von der Universität
von Pennsylvania [Q. Qiu et al., J. Biomed. Mat. Res. 52, 66–76, 2000]
verarbeitete kürzlich
Mikrokügelchen aus
einem Verbund von Polymerbiologisch aktivem Glas-Keramik für die Wirkstoffabgabe.
Poröse
Calciumphosphatkeramiken wurden mit Knochenmarkszellen imprägniert [E.
Kon et al., J. Biomed. Mat. Res. 49, 328–337, 2000] und mit humanem
knochenmorphogenetischen Protein [I. Alam et al., J. Biomed. Mat.
Res. 52, 2000].
-
S.
Takenori et al. offenbarten in U.S.-Patent Nr. 5 993 535 (und der
entsprechenden
EP 0899247 ) einen
Calciumphosphatzement, der Tetracalciumphosphat und Calciumhydrogenphosphatpolysaccharid
als Hauptkomponenten enthält.
Er benötigte 24
Stunden Inkubation bei 37°C
für die
Umwandlung in Hydroxyapatit. T. Sumiaki et al. offenbarten in U.S.-Patent
Nr. 5 055 307 langsam freisetzende Wirkstoffabgabekügelchen
mit porösen
Kügelchen aus
Calciumphosphatverbindung mit einem Verhältnis von Ca zu P von 1,3 bis
1,8, einer Porosität
von 0,1 bis 70%, einer spezifischen Oberfläche von 0,1 bis 50 m
2/g und einer Porengröße von 1 nm bis 10 μm, wobei
die Körnchen
bei einer Temperatur von 200 bis 1400°C gebrannt wurden und eine Wirkstoffkomponente
in die Poren der Körnchen
imprägniert wurde,
und ein Verfahren zur Herstellung davon. S. Gogolewski offenbarte
in WO 00/23123 den härtbaren
keramischen hydraulischen Zement mit einem Wirkstoff, der an einem
menschlichen oder tierischen Körper
abgegeben wird bei Abbau oder Auflösung des gehärteten Zements.
Die Umwandlung von CPC, um HA zu erzielen, erforderte jedoch 40
Stunden. L. Chow et al. offenbarten in U.S.-Patent Nr. 5 525 148 Calciumphosphatzemente,
die im Wesentlichen bei Umgebungstemperatur zu Hydroxyapatit selbsthärten, wenn
sie in Kontakt mit einem wässrigen
Medium sind. Genauer enthalten die Zemente eine Kombination von
Calciumphosphaten außer
Tetracalciumphosphat mit einer wässrigen
Lösung,
die mit einer Base eingestellt wird, damit ein pH-Wert von etwa 12,5
oder darüber
aufrechterhalten wird und die ausreichend gelöstes Phosphatsalz aufweist,
um eine Lösungsmischung
mit einer Phosphatkonzentration, die gleich oder größer als
etwa 0,2 Mol/l ist, zu liefern. Die Hauptnachteile der Verarbeitung
sind jedoch ein hoher pH-Wert (> 12,5),
der die meisten Wirkstoffe, Proteine und DNA denaturieren könnte, so
dass das Verfahren für
Wirkstoffverkapselungsträger
nicht geeignet ist. C. Rey et al. offenbarten in WO 98/16209 ein
synthetisches, kaum kristallines Apatitcalciumphosphat, das ein
biologisch aktives Mittel und/oder Zellen enthält, bevorzugt Gewebe bildende
oder Gewebe abbauende Zellen, das geeignet ist für eine Vielzahl von in-vivo- und in-vitro-Anwendungen,
einschließlich
der Wirkstoffabgabe, des Gewebewachstums und der Knochenvermehrung.
Das Verhältnis von
Ca/P war jedoch auf weniger als 1,5 beschränkt und die Autoren offenbarten
nicht, wie Mikrokügelchen
und Beschichtungen herzustellen sind.
-
Die
physikalischen Eigenschaften, d. h. die Form der Hydroxyapatitkeramik
haben auch einen wesentlichen Einfluss auf die Gewebereaktion. Von verschiedenen
möglichen
Formen erleichtern Hydroxyapatitkörnchen nicht nur chirurgische
Operationen, sondern nützen
auch dem Gewebewachstum nach Implantation, indem sie relativ große intergranuläre Poren
erzeugen, die die Invasion des Wirtsgewebes zulassen. Auf dieser
Basis hat die Verwendung von wirkstoffhaltigen HA-Körnchen eine verbesserte therapeutische
Wirkung bei praktischen klinischen/biomedizinischen Anwendungen.
-
Während die
obigen Studien die Auflösung von
porösem
HA beschreiben, um einen löslichen
extrazellulär
wirkenden biologisch aktiven Inhaltsstoff durch Desorption und Auslaugen
freizusetzen, hat diese Offenbarung das Ziel, auch intrazellulär Gene, Wirkstoffe
oder Proteine abzugeben unter Verwendung von resorbierenden HA-Mikroträgern. Die Hauptbeobachtung
ist es, dass HA-Teilchen innerhalb von Makrophagen an der Grenzfläche von HA-beschichteten
Hüftimplantaten
gefunden wurden [T. W. Bauer et al., J. Bone Joint Surg. Am. 73-A (1991),
1439–1452].
Demzufolge wurde vorgeschlagen, dass Phagozyten HA-Teilchen aufnehmen
und solubilisieren [R. W. Evans et al., Calcif. Tissue. Int. 36
(1984), 645–650].
Dies kann daher einer der Hauptmechanismen der intrazellulären Abgabe
von Genen durch Verwendung von HA-Beschichtungen und Mikrokügelchen
sein, ohne die Notwendigkeit, einen durch Viren vermittelten Gentransfer
zu verwenden.
-
WO
97/17285 offenbart einen wenig kristallinen Calciumphosphatapatit,
der hergestellt wird, indem ein wenig kristallines Calciumphosphat
aus einer wässrigen
Lösung,
die Calcium- und Phosphationen enthält, ausgefällt wird und das wenig kristalline Calciumphosphat
aus der Lösung
gesammelt wird und in vorbestimmter relativer Feuchtigkeit und Temperatur
dehydratisiert wird.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Es
wird hier ein Verfahren offenbart, mit dem Hydroxyapatit so verarbeitet
werden kann, dass er als wirksamer Träger für die Wirkstoffabgabe aus Beschichtungen
oder selbsttragenden Mikrokügelchen dient.
Das Verfahren betrifft Calciumphosphat-(CaP), insbesondere Hydroxyapatit-(HA)-Mikrokügelchen und
-Beschichtungen, die jede Art von Wirkstoff oder Protein, der/das
in organischen Flüssigkeiten
oder Wasser dispergiert werden kann, verkapseln kann. Das Verfahren
beginnt mit einer Calciumphosphatzement-(CPC)-Aufschlämmung gefolgt
von einer Inkubation, um die HA-Phase innerhalb der Mikrokügelchen
oder innerhalb der Beschichtung auszufällen. Durch Zugabe von Wirkstoffen
und Proteinen in die kolloidale Suspension (CPC-Aufschlämmung) der Mikrokügelchen- oder Beschichtungsvorläufer wird eine
direkte, in-situ-Verkapselung und anschließende kontrollierte Freisetzung
der therapeutisch aktiven Mittel aus den Apatitmikrokügelchen
erreicht. Der variierende Kristallinitätsgrad der Mikrokügelchen
wird verwendet, um den Resorptionsprozess in Körperflüssigkeiten und damit die Rate
der Wirkstofffreisetzung zu kontrollieren und auszunutzen.
-
Trotz
der Tatsache, dass verschiedene Techniken in der Vergangenheit untersucht
wurden bei der Verwendung von statischen Makrokomponenten von CaP
für die
Wirkstoffabgabe, lässt
keine davon die Verarbeitung von schnell härtenden funktionellen Zementmikrokügelchen
und Beschichtungen mit in-situ-Wirkstoffverkapselung
zu. Demzufolge wird hier ein neuer, sicherer und billiger Weg zur
Abgabe von Wirkstoffen, Proteinen, Genen und Antisense-Oligos in
vivo offenbart. Bei diesem Verfahren werden Calciumphosphatbeschichtungen
und Mikrokügelchen durch
Auflösungs-Ausfällungsmechanismen
erhalten, ähnlich
dem Härten
von Calciumphosphatzementen (CPC). Dieses Verfahren wird zur Abscheidung
von adhäsiven,
dicken (typischerweise 10 bis 1000 μm Dicke) HA-Filmen und zur Herstellung von HA-Mikrokügelchen
(typischerweise Durchmesser 10 bis 1000 μm) verwendet.
-
Calciumphosphatzemente
geben wie die meisten anderen Zemente (z. B. Portland-Zement) Hydratisierungswärme ab,
wenn sie hydratisieren und härten
bzw. abbinden. Bei einer schnellen Härtung (die ein wichtiges Erfordernis
bei bestimmten Anwendungen ist) kann diese Wärme nicht schnell genug abgeleitet werden
und die Temperatur des zementierten Bereichs nimmt zu, manchmal
in einem Ausmaß,
das hoch genug ist, um den Zement zu schädigen, z. B. zu brechen. Wichtiger
ist, dass dann, wenn der Zement in den menschlichen Körper gebracht
wird, z. B. als Teil eines Implantats, dieser Temperaturanstieg
die umgebenden biologischen Bestandteile, wie Zellen, Proteine und
Enzyme schädigen
kann, wenn die Wärme
schnell beim Härten
abgeführt
wird. Das neue hier offenbarte Zementsystem weist einen relativ
milden Temperaturanstieg während
des Härtens
auf, d. h. von Raumtemperatur, ~20°C, auf eine maximale Temperatur
in der Nähe der
Körpertemperatur,
~37°C. Dieser
Zement weist auch exzellente mechanische Eigenschaften auf. Z. B.
ist seine Druckfestigkeit im Allgemeinen größer als 10 MPa und in bestimmten
Zusammensetzungen > 30
MPa.
-
Diese
CPC-Aufschlämmung
ist eine Mischung aus sauren Calciumphosphaten, wie Monocalciumphosphat-(MCP)-Anhydrat
oder -Dihydrat und basischem Calciumhydroxid, zusammen mit einer
geringen Menge anderer anorganischer Inhaltsstoffe, wie Apatitkeime.
Diese Mischung wird sorgfältig
gemischt, z. B. unter Verwendung einer Kugelmühle. Die Mischung, die in einem
inerten flüssigen Medium
(z. B. Alkoholen) oder einer flüssigen
Mischung des inerten Mediums und einer kleinen Menge einer phosphatisierenden
Flüssigkeit
suspendiert ist, hat ein Ausgangs-Ca/P-Verhältnis im Bereich von 1,2 bis
1,67 und eine Feststoffkonzentration von 30 bis 70 Vol.-%, bevor
das Formungsverfahren ausgeführt
wird (d. h. Füllen
der Höhle
mit Zement oder Formen eines wirkstoffimprägnierten Mikrokügelchens).
Das Formungsverfahren kann optimiert werden, indem die Abbindezeit
innerhalb von 2 bis 40 Minuten kontrolliert wird.
-
Der
entstehende Zement weist eine apatitische Phase (HA) auf, entweder
mit einer nadelförmigen
Körnchen-
oder plattenartigen Körnchenmorphologie,
abhängig
von den Verfahrensparametern. Ein nanostrukturierter Zement kann
auch synthetisiert werden und wird insbesondere zur Verkapselung
von Wirkstoffen, Antibiotika, Proteinen und Enzymen verwendet. Die
Apatitphase entwickelt sich innerhalb von 1 bis 6 Stunden Inkubation
in dem CPC-System, wie es offenbart ist. Eine schnelle Bildung der
Apatitphase ist vorteilhaft für
eine frühe
biologische Reaktion des umgebenden Wirtsgewebes. Eine schnelle Abbindung
(2 bis 40 Minuten) und Härtungszeit
(weniger als 6 Stunden) nützt
klinischen Anwendungen des Zements enorm. Eine kontrollierbare Kristallinität, von amorph
(leicht resorbierbar) bis hoch kristallin (d. h. stabil in physiologischer
Umgebung) der fertigen Apatitstruktur lässt eine anwendungsorientierte Verwendung
des Zements zu. Feine (Nano- bis Submikrometer) Ausgangsinhaltsstoffe
lassen es zu, die fertige Mikrostruktur zu kontrollieren, was eine
hohe Festigkeit des fertigen Körpers
zulässt.
Die Nanostruktur des neuen CPC bietet einen großen Vorteil bei der Verkapselung
von Wirkstoffen ebenso wie für
deren kontrollierte Freisetzung. Apatitmikrokügelchen können leicht hergestellt werden
unter Verwendung der neuen CPC-Formulierung mit einer Größe im Bereich
von 10 bis 1000 μm
unter Verwendung einer einfachen Sprühtrocknungseinrichtung. Die
Kontrolle des Abbinde- und Härtungsverfahrens
der Zementmikrokügelchen
lässt eine
Vielzahl von biomedizinischen oder klinischen Anwendungen zu, z.
B. Injektionsverpackung und in-situ-Härtung für die Reparatur, Wiederherstellung,
Vermehrung von defekten Geweben, und viele andere.
-
Das
offenbarte Verfahren kann verwendet werden, um HA-Keramiken verschiedener
physikalischer Formen bei Raumtemperatur zu synthetisieren. Die
folgenden Anwendungen sind vorgesehen: Körnchen oder Masseformen für künstliche
Knochenfüllstoffe/Knochenrekonstruktion;
bei Raumtemperatur verarbeitete Beschichtungen (auf Ti und anderen
Legierungen), mit Wirkstoffeinbau; organisch/anorganische Verbundmaterialien,
einschließlich
HA in Kombination mit anderen Materialien, wie Biopolymeren und
Keramiken und Proteinen, um Nano- und
Bioverbundmaterialien mit kontrollierter Wirkstofffreisetzungsfunktion
und/oder Knochenwachstumskontrollfunktionen zu liefern.
-
Es
wird hier ein neuer Ansatz offenbart, um mehrschichtige HA-Beschichtungen
oder Mikrokügelchen
mit funktionellem Gradienten zu schaffen. Das bedeutet, dass mehrere
Schichten von HA-Beschichtungen abgeschieden werden unter Verwendung
verschiedener Techniken, mit verschiedenen Funktionen, die jeder
speziellen Schicht zugeordnet werden. Insbesondere wird eine in-situ-Wirkstoffverkapselung
innerhalb der HA-Beschichtungen mit funktionellem Gradienten beschrieben,
indem eine Sol-Gel-Verarbeitung bei erhöhter Temperatur mit einer Ausfällungsverarbeitung
bei Raumtemperatur kombiniert wird. Als Ergebnis dieses Protokolls
wird eine 10 bis 30 μm
dicke HA-Matrix mit Poren im Nano- bis Submikrometerbereich, die
fest an ein metallisches Substrat über einen 0,6 bis 0,8 μm dünnen Zwischen-HA-Film
gebunden ist, erzielt. Der dünne Sol-Gel-HA-Film
(SG-HA) entwickelt eine gute Bindung mit dem darunter liegenden
Substrat bei der Verarbeitungstemperatur von 400°C und dient als Zwischenkernbildungs/-bindungsschicht
zwischen dem darunter liegenden Substrat und der dicken HA-Filmmatrix.
Die dicke CPC-HA-Filmmatrix wird bei Raumtemperatur auf dem dünnen SG-HA-Film abgeschieden
durch Tauchbeschichtung in nicht wässriger Suspension von Monocalciumphosphat- und
Calciumhydroxidvorläuferpulvern.
Das Wirkstoffmaterial wird in der Suspension dispergiert und anfangs
in die Poren des Vorläuferpulverfilms
abgeschieden. Anschließend
wird ein poröser
dicker Apatitfilm in physiologischer Umgebung gebildet, durch Auflösungs-Ausfällungsverfahren.
Der dünne SG-HA-Film
dient als Keimbildungsmatrize und lässt eine Keimbildung und Wachstum
der dicken Filmapatitkristalle zu und vermittelt dadurch der HA-Matrix eine
ausreichende Grenzflächenfestigkeit.
Dieses Raumtemperaturbeschichtungsverfahren verbunden mit einer
in-situ-Verkapselung
von Wirkstoffen kann für
eine Vielzahl von metallischen oder nichtmetallischen Substraten
angewendet werden, was potenzielle Vorteile für verschiedene biomedizinische/biochemische
Anwendungen liefert.
-
Die
Mikrokügelchen
sind selbsttragende Körnchen,
die durch Sprühtrocknungs- und Inkubationsverfahren
von CPC-HA-Vorläuferaufschlämmung erzeugt
wurden unter Verwendung von Synthesewegen und einer Chemie, wie
für die
Beschichtungen. Weitere Details der Erfindung sind unten angegeben.
-
Ein
Verfahren zur Abscheidung von adhäsiven, dicken Hydroxyapatitfilmen
auf metallischen Substraten bei Raumtemperatur durch einen Auflösungs/Ausfällungsmechanismus ähnlich dem
Abbinden bzw. Härten
der Calciumphosphatzemente (CPC) wird offenbart. Ein solcher nanoporöser, semiamorpher
10 bis 1000 μm
dicker Film wird schnell auf dem darunter liegenden kristallinen
dünnen
Film aus Hydroxyapatit, der durch Sol-Gel-Verfahren abgeschieden
wurde, gezüchtet.
Eine direkte in-situ-Verkapselung und anschließende kontrollierte Freisetzung
von therapeutisch aktiven Mitteln aus den Apatitbeschichtungen wurde
erreicht. Eine leichte Modifikation eines ähnlichen Verfahrens führt zur
Bildung von mit Arzneimittel beladenen HA-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser
von 10 bis 1000 μm.
Sowohl die Beschichtungen als auch die Mikrokügelchen sind für eine von
Nebenwirkungen freie, langzeitige, gezielte kontrollierte Freisetzung
und Abgabe von Wirkstoffen, Proteinen, DNA und anderen ausgebildet.
-
Die
Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung einer Calciumphosphatphase
gerichtet, das beinhaltet: (a) dass ein Homogenisat von Monocalciumphosphat(Ca(H2PO4)2)
und Calciumhydroxid-(Ca(OH)2)-Vorläufern in
einem im Wesentlichen wasserfreien Medium dispergiert wird, um eine
Paste oder eine viskose Aufschlämmung
der Vorläufer
zu bilden; (b) die Vorläuferaufschlämmung getrocknet wird;
(c) eine auf Wasser basierende Lösung
von Phosphationen der Aufschlämmung
zugemischt wird, um eine Mischung herzustellen und (d) die entstehende
Mischung in feuchter Umgebung bei einer Temperatur von 20 bis 50°C inkubiert
wird, um die Vorläufer
zu lösen
und eine Calciumphosphatphase auszufällen.
-
Die
Calciumphosphatphase kann Hydroxyapatit sein. Das Ca/P-Atomverhältnis in
der Vorläufermischung
kann in einem Bereich von 1,2 bis 1,67 liegen und die Mischung kann
eine Feststoffkonzentration von 30 bis 70 Vol.-% haben. Das im Wesentlichen
wasserfreie Medium kann ein Alkohol sein. Der Alkohol kann Ethylalkohol,
Methylalkohol oder Propylalkohol sein. Die auf Wasser basierende
Lösung
von Phosphationen kann Natriumphosphat sein und die feuchte Umgebung
kann eine relative Feuchtigkeit von 50 bis 100% sein.
-
Die
Vorläuferaufschlämmung kann
zu einer vorbestimmten Form getrocknet werden. Die Form kann ein
Pellet, eine Beschichtung, ein Mikrokügelchen oder eine Dentalhöhle oder
Knochenhöhlenfüllung sein.
Ein kristallines Hydroxyapatitpulver kann der Vorläuferaufschlämmung zugegeben
werden, um die Kristallisation der Hydroxyapatitcalciumphosphatphase
während
des Inkubationszeitraums zu fördern. Ein
therapeutisch aktives Material kann der Vorläuferaufschlämmung zur Verkapselung während der Kristallisation
der Hydroxyapatitcalciumphosphatphase während des Inkubationszeitraums
zugegeben werden. Das therapeutisch aktive Material kann ein Wirkstoff,
ein Protein, ein Gen oder DNA sein.
-
Die
Aufschlämmung
der Vorläufer
kann auf der Oberfläche
eines Calciumphosphatsubstrats abgeschieden werden und getrocknet
werden. Das Calciumphosphatsubstrat kann ein dünner Film aus Hydroxyapatitbeschichtung
sein, der auf einem metallischen Substrat abgeschieden wurde unter
Verwendung des Sol-Gel-Verfahrens.
Die ausgefällte
Calciumphosphatphase kann einer Lösung, die mit Ca2+- und
PO4 3–-Ionen übersättigt ist,
ausgesetzt werden, was eine Beschichtung eines biomimetischen Hydroxyapatitfilms
auf der ausgefällten
Calciumphosphatphase liefert.
-
Die
Aufschlämmung
der Vorläufer
kann zerstäubt
und sprühgetrocknet
werden, um Mikrokügelchen
der Vorläufer
zu erhalten. Die Mikrokügelchen der
Vorläufer
können
einer auf Wasser basierenden Lösung
von Phosphationen ausgesetzt werden und in feuchter Umgebung bei
einer Temperatur von 20 bis 50°C
inkubiert werden, um die Auflösung
der Vorläufer
und die Ausfällung
der Calciumphosphatphase zu fördern.
Die Mikrokügelchen
enthaltende ausgefällte
Calciumphosphatphase kann einer Lösung, die mit mit Ca2+- und PO4 3–-Ionen übersättigt ist,
ausgesetzt werden, was eine Beschichtung aus einem biomimetischen
Hydroxyapatitfilm auf der ausgefällten Calciumphosphatphase
liefert. Die ausgefällte
Calciumphosphatphase kann einer Polymerlösung ausgesetzt werden, um
einen Polymerfilm auf der Mikrokügelchenoberfläche zu bilden.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
In
den Zeichnungen, die spezifische Ausführungsformen der Erfindung
darstellen, aber nicht als den Sinn oder Schutzbereich der Erfindung
in irgendeiner Weise beschränkend
angesehen werden sollten, zeigt:
-
1(a) eine CPC-HA-Beschichtung auf einem
metallischen Substrat ohne SG-HA-Zwischenschicht.
-
1(b) eine CPC-HA-Beschichtung auf einem
metallischen Substrat mit SG-HA-Schicht.
-
2(a) einen Querschnitt des CPC-HA/SG-HA-Beschichtungssystems.
-
2(b) ein FTIR-Spektrum des CPC-HA/SG-HA-Beschichtungssystems.
-
3(a) eine schematische Darstellung eines
Sprühtrocknungssystems
für CPC-Mikrokügelchen
zur Wirkstoffverkapselung.
-
3 die vier Stufen der CPC-HA-Mikrokügelchenverarbeitung.
-
4(a) CPC-HA-Mikrokügelchen, ungefähr 20 μm groß.
-
4(b) CPC-HA-Mikrokügelchen, ungefähr 300 μm groß.
-
5(a) und 5(b) zeigen
die jeweilige CPC-HA-Mikrostruktur: kristallin (a) und amorph (b).
-
6(a) und 6(b) zeigen
biomimetische Hydroxyapatit-(BM-HA)-Filmabscheidungen, die CPL genannt werden,
für Calciumphosphatschicht,
auf SG-HA-Substrat geringer Kristallinität (a) und hoher Kristallinität (b).
-
7 zeigt
ein Diagramm, in dem % Freisetzung gegen Freisetzungszeit (Stunden)
für die HA-CPC-Beschichtung
mit 5% eingekapseltem Amethopterin als Wirkstoff gezeigt ist.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Um
dicke HA-Filme für
die Wirkstoffverkapselung zu erzeugen, wird zuerst die Oberfläche des darunter
liegenden Substrats (typischerweise rostfreier Stahl oder Titan)
mit einem dünnen
Film aus Sol-Gel-HA im Submikrometerbereich beschichtet, wie bereits
in U.S.-Patentanmeldung Serial Nr. 09/563 231, eingereicht am 2.
Mai 2000, offenbart. Der dünne
Sol-Gel-HA-Film (SG-HA) entwickelt eine gute Bindung mit dem darunter
liegenden Substrat bei 400°C
Verarbeitungstemperatur und dient für die zwischenzeitliche Kernbildung
und Verbindungsschicht zwischen dem darunter liegenden Substrat und
der dicken CPC-HA-Filmmatrix. Die dicke CPC-HA-Filmmatrix wird bei
Raumtemperatur auf dem dünnen
SG-HA-Film abgeschieden
durch Tauchbeschichtung in einer nicht wässrigen Suspension von Monocalciumphosphat
und Calciumhydroxidvorläuferpulvern.
Das Wirkstoffmaterial wird in der Suspension dispergiert und anfangs
in die Poren des Vorläuferpulverfilms
abgeschieden. Anschließend wird
der Vorläuferpulverfilm, der
Wirkstoffmaterial enthält,
einer auf Wasser basierenden Lösung
von Natriumphosphat ausgesetzt und bis zu 24 Stunden in einen Inkubator
bei 37°C,
100% relativer Feuchtigkeit gestellt. Während dieses Zeitraums bildet
sich ein poröser
dicker HA-Film aufgrund der Auflösung der
Vorläuferpulver
und der Wiederausfällung
der das Wirkstoffmaterial einkapselnden Apatitphase. Der dünne SG-HA-Film
dient als Keimmatrize oder Impfkristall, der Keimbildung und Wachstum
der Apatitkristalle des dicken Films zulässt und daher der HA-Matrix
eine ausreichende Grenzflächenfestigkeit vermittelt.
Als Ergebnis dieses Vorgehens wird eine 10 bis 1000 μm dicke poröse CPC-HA-Matrix,
die das Wirkstοffmaterial
verkapselt, im Nano- bis Submikrometerbereich, die fest an ein Substrat über einen
0,6 bis 0,8 μm
dünnen
Zwischen-SG-HA-Film gebunden ist, erzielt. 1 zeigt
die CPC-HA-Beschichtung auf metallischen Substraten (a) ohne SG-HA-Zwischenschicht und
(b) mit SG-HA-Beschichtung. Die Abwesenheit der SG-HA-Zwischenschicht verursacht
eine spontane Trennung von CPC-HA-Beschichtung von dem Substrat. 2 zeigt den Querschnitt des CPC-HA/SG-HA-Beschichtungssystems
(a) und das FTIR-Spektrum (b) verglichen mit handelsüblichem kristallinen
Hydroxyapatit. Eine ausgezeichnete innige Grenzfläche zwischen
den zwei Filmen des CPC-HA/SG-HA-Beschichtungssystems bestätigt, dass
SG-HA als Keimbildungsstelle für
CPC-HA dient.
-
Um
die HA-Mikrokügelchen
für die
Wirkstoffverkapselung herzustellen, wird die nicht wässrige Suspension
von CPC-Vorläuferpulvern
(Monocalciumphosphat und Calciumhydroxid) zusammen mit feinen kristallinen
HA-Additivimpfkristallen zerstäubt und
sprühgetrocknet,
um 10 bis 1000 μm
große
in etwa kugelförmige
Teilchen zu erzeugen (3a und Stufe 1 in der schematischen 3). Das Wirkstoffmaterial wird in der
Suspension dispergiert und anfangs in die Poren der Vorläuferpulvermikrokügelchen
abgeschieden. Anschließend
werden die Vorläuferpulvermikrokügelchen,
die Wirkstoffmaterial enthalten, der auf Wasser basierenden Lösung von Natriumphosphat
ausgesetzt und 24 Stunden lang in einen Inkubator mit 37°C, 100% relativer
Feuchtigkeit gestellt (Stufe 2). Während dieses Zeitraums bildet sich
ein poröses
HA-Mikrokügelchen
aufgrund der Auflösung
der Vorläuferpulver
und der Wiederausfällung
der Apatitphase, die das Wirkstoffmaterial verkapselt, Stufe 3.
Die feinen kristallinen HA-Additivteilchen dienen als Impfkeime,
die die Keimbildung und das Wachstum der Apatitkristalle zulassen.
Als Ergebnis dieses Vorgehens wird eine 10 bis 1000 μm große poröse CPC-HA-Mikrokügelchenmatrix
im Nano- bis Submikrometerbereich, die das Wirkstoffmaterial verkapselt,
erzielt. In der letzten Stufe 4 des Verfahrens (3)
kann ein dünner
Film aus BM-HA auf der Mikrokügelchenoberfläche für weitere
Verkapselung abgeschieden werden. 4 ist
ein SEM-Mikrograph von zwei CPC-HA-Mikrokügelchen, ~20 μm groß (a) und
~300 μm
groß (b),
die mit dem obigen Verfahren erzeugt wurden (BM-HA ist auf diesen
Mikrokügelchen
nicht vorhanden). Indem der Gehalt an HA-Impfkeimen in den Mikrokügelchen
verändert
wird, kann die Kristallinität
(und damit die Resorptionsrate in physiologischer Umgebung) des
entstehenden CPA-HA variiert werden. Dies wird in 5 dargestellt,
die die mikrokristalline (a) und amorphe (b) Struktur von CPC-HA
zeigt (diese werden mit XRD und FTIR-Daten bestätigt).
-
Die
Beschichtungen und Mikrokügelchen werden
so prozessiert, dass sie sekundäre
Materialien in den offenen und geschlossenen Poren von HA einkapseln,
wobei das sekundäre
Material bevorzugt der therapeutischen Verwendung dient, wie Wirkstoffe,
Proteine, Gene, DNA und dgl. Es wurde gezeigt, dass eine direkte
in-situ-Verkapselung und anschließende kontrollierte Freisetzung
von therapeutisch aktiven Mitteln aus solchen Apatitbeschichtungen und
Mikrokügelchen
erreicht werden kann. Sowohl die Beschichtungen als auch die Mikrokügelchen sind
für eine
nebenwirkungsfreie, langzeitige, gezielte, kontrollierte Freisetzung
und Abgabe von Wirkstoffen, Proteinen, DNA und anderen ausgebildet. Das
offenbarte Verfahren befasst sich mit einer Wirkstoffabgabe über Verkapselung
(Einschluss innerhalb der Struktur) statt einer Imprägnierung
von Wirkstoffen in die HA-Matrix. Somit ist die Wirkstofffreisetzung
mit der Resorption der HA-Matrix verknüpft, statt mit einem Auslaugen
aus der Matrix. Eine Materialverfahrensuntersuchung wurde entwickelt,
um die Struktur von HA bei der Wirkstoffverkapselung zu kontrollieren
und daher die HA-Resorption und das Wirkstoff- oder Genabgabeverfahren
zu kontrollieren. Das biologisch resorbierbare HA für Wirkstoffverkapselung
ist so aufgebaut und wird so verarbeitet, dass der Wirkstoff als
Ergebnis einer graduellen Resorption der Matrix freigesetzt wird,
statt durch Auslaugen des Wirkstoffs aus offenen Poren der Matrix.
Der zusätzliche
BM-HA-Verkapselungsfilm,
der auf SG-HA-beschichtetem Substrat wächst, ist in den SEM-Mikrographien
in 6 gezeigt. Die biomimetischen Hydroxyapatit-(BM-HA)-Filmabscheidungen, als
CPL bezeichnet wegen der Calciumphosphat schicht, sind auf SG-HA-Substrat
geringer Kristallinität
(a) und hoher Kristallinität
(b) gezeigt.
-
Es
versteht sich, dass in der Beschreibung und den Ansprüchen der
Ausdruck "Calciumphosphat" (CaP) allgemein
verwendet wird und Mineralien einschließt, wie Hydroxyapatit, Dicalciumphosphat, Tricalciumphosphat
und Tetracalciumphosphat.
-
Es
wird mehrschichtiges biokompatibles/bioaktives funktionell eingestuftes
Calciumphosphat in zwei Formen offenbart: (i) Beschichtungen auf
einer Vielzahl von Substraten, typischerweise rostfreiem Stahl oder
Titan und (ii) selbsttragende Mikrokügelchen. Zwei Arten von Beschichtungen
werden abgeschieden. Die erste Beschichtung direkt auf der Metalloberfläche ist
ein dünner
Film (0,2 bis 0,5 μm)
aus dichtem hoch kristallinen HA, der durch Sol-Gel-Technik bei
erhöhten
Temperaturen, etwa 400°C,
erzeugt wird. Diese Beschichtung dient verschiedenen Zwecken: (i)
um die Metalloberfläche
von dem umgebenden Gewebe abzuschirmen; (ii) um eine Oberfläche mit
hoher Haftung und Keimbildungsfläche
für die
zweite CPC-HA-Beschichtung bereitzustellen. Die zweite Beschichtung
ist ein dickerer, poröser
Film (10 bis 1000 μ)
aus HA, der bei Raumtemperatur verarbeitet wird. Das Ziel ist es, eine
schnelle Bildung einer adhäsiven
Apatitschicht durch einen Auflösungs-Ausfällungsmechanismus
zu erreichen ähnlich
dem Härten
von Calciumphosphatzementen (CPC). Indem Wirkstoffe mit verschiedenen
Konzentrationen in die CPC-kolloidale Suspension gegeben werden,
wird eine direkte in-situ-Verkapselung und anschließende kontrollierte
Freisetzung von therapeutisch aktiven Mitteln aus den Apatitbeschichtungen
erreicht. Variierende Kristallinitätsgrade der Beschichtung und
mehrstufige Beschichtungs/Imprägnierungstechniken
werden verwendet, um das CPA-HA-Resorptionsverfahren
zu kontrollieren und anzupassen und damit die Wirkstofffreisetzungsrate
aus der CPC-Matrix. Eine Untersuchung der Grenzflächen (2a)
zeigt, dass die CPC-HA-Beschichtung in innigem Kontakt mit der darunter
liegenden dünnen
SG-HA-Schicht ist. Das Schlüsselmerkmal
der vorliegenden Erfindung ist daher, dass der vorbeschichtete dünne SG-HA-Film
als Matrize für
die Keimbildung und das Wachstum von bei Raumtemperatur ausgefälltem Apatit
in der CPC-HA-Beschichtung dient. Ein solcher Mechanismus lässt eine
beträcht liche
Grenzflächenbindung zu,
die sich zwischen dünnem
SG-HA und dickem CPC-HA entwickelt, wie beobachtet.
-
FTIR-Spektren
des entstehenden CPC-HA, 2b, deuten
auf eine Unordnung der Kristallstruktur, die zur schlechten Symmetrie
von PO4-Tetraedren beiträgt. Tatsächlich ist das entstehende
CPC-HA ein amorpher oder sehr feiner, kaum kristalliner, nicht stöchiometrischer,
leicht resorbierbarer Apatit, ähnlich
dem, der sich in Knochenmineral findet, d. h. Ca9(PO4)5–x–y(CO3)y(HPO4)x(OH)1–y/3.
Dieses CPC-HA hat eine Porosität
von etwa 45% und eine durchschnittliche Porengröße von etwa 16 nm. Die Nanoporen
in dem CPC-HA immobilisieren verkapselte Biomoleküle gleicher
Dimension physikalisch, so dass die Auflösung der CPC-HA-Matrix für die Freisetzungskinetik
verantwortlich ist (statt einer einfachen Desorption und einem Auslaugen,
wie im Stand der Technik offenbart). Dies bietet eine zusätzliche
Art der Wirkstoff/Genfreisetzungskontrolle, d. h. durch Einstellung
der Resorptionsrate (d. h. Einstellung der Kristallinität) der CPC-HA-Mikrokügelchen
oder Beschichtungen.
-
Es
wird hier auch ein neu aufgefundener Ansatz offenbart, um aktive
CaP-Mikrokügelchen
zu erzielen, die jede Art von Wirkstoff oder biologischem Molekül verkapseln
können,
der/das in organischen Flüssigkeiten
oder Wasser dispergiert werden kann. Der Ansatz kombiniert eine
Sphäroidisierung
einer Calciumphosphatzement-(CPC)-Aufschlämmung mit anschließender Inkubation,
um die HA-Phase auszufällen, 3, 4. Die
CPC-HA-Mikrokügelchen
haben eine kaum kristalline calciumdefiziente Apatitstruktur ähnlich der
von natürlichem
(Knochen)-Apatit
und identisch mit der, die für
die dicken CPC-HA-Beschichtungen bestimmt wurde, die auf SG-HA-Substraten
wachsen. Die Mikrostruktur (d. h. insbesondere Kristallinität und Nanoporosität) der Apatitkügelchen kann
zugeschnitten werden, indem die Konzentration des Impf-HA-Sintersubmikrometerpulvers
eingestellt wird. Je größer die
Menge an Impfkeimen, desto feiner die entstehende Mikrostruktur
der Matrixphase. Die Beispiele der Mikrostrukturen von kristallinem
(a) und amorphem (b) CPC-HA, das in unserem Labor erzeugt wurde
durch Veränderung
der Impf- und Verfahrensparameter sind in 5 gezeigt.
Das Schlüsselmerkmal
der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Mikrokügelchen
bei Raumtemperatur geformt werden und mit CPC-HA geimpft werden
und bei Raumtemperatur gezüchtet
werden, die das vorgesehene organische Material, z. B. Wirkstoff
oder Protein, verkapseln.
-
Um
eine bessere Kontrolle der Wirkstofffreisetzung zu erzielen, wird
ein zusätzlicher
Film aus BM-HA auf der Oberfläche
der Mikrokügelchen
abgeschieden, wie in 3 gezeigt (Stufe
4) und auch in 6. Es wurde vorher
gezeigt, dass BM-HA
mit ausgezeichneter Qualität
durch Lösung-Ausfällung auf
Hydroxyapatitfilmen gezüchtet
werden kann. BM-HA kann auf der Oberfläche von CPA-HA-Mikrokügelchen
für eine
letzte langzeitige Verkapselung gezüchtet werden.
-
Beispiele
-
Beispiel 1: CPC-HA/SG-HA-Beschichtungen
auf rostfreiem Stahl
-
Metallische
Substrate aus rostfreiem Stahl (316L) wurden mit einer 0,6 bis 0,8 μm dünnen Schicht
aus Apatit (SG-HA) unter Verwendung der kürzlich entwickelten Sol-Gel-Technik
beschichtet. Insbesondere beinhaltet das Sol-Gel-Verfahren zur Herstellung
eines kristallisierten Hydroxyapatits: (a) dass ein Phosphorvorläufer (Phosphit)
in einem auf Wasser basierenden Medium hydrolysiert wird; (b) ein
Calciumsalzvorläufer
dem Medium zugegeben wird, nachdem der Phosphit hydrolysiert worden
ist, um ein Calciumphosphatgel zu erhalten, wie ein Hydroxyapatitgel;
(c) das Gel auf dem Substrat durch Tauchbeschichtung abgeschieden
wird und (d) der Film bei 400°C
20 Minuten lang calciniert wird, um kristallisierten Hydroxyapatit
zu erhalten. Eine anorganische kolloidale Aufschlämmung, die
Calciumphosphatvorläufer
Ca(OH)2 und als Calciumphosphatsalz Monocalciumphosphatanhydart
enthielt, wurde in Ethanol in der Kugelmühle vermahlen. Die zwei anorganischen
Ausgangsstoffe hatten Teilchengrößen von
0,3 bis 2 μm
bzw. 0,5 bis 4 μm.
Das Anfangs-Ca/P-Verhältnis
in der Aufschlämmung
wurde auf 1,5 gehalten. Da Auflösung
und Ausfällung
die Hauptmechanismen für
die Apatitentwicklung in einem solchen System sind, wurde 5 Gew.-%
kristallines Hydroxyapatitpulver im Submikrometerbereich als Impfkeim
für die
heterogene Keimbildung von CPC-HA verwendet. Die mit einem dünnen SG-HA-Film
auf der Oberfläche
modifizierte Probe wurde in die Ethanolsuspension der Vorläufer getaucht.
Nach einer einzigen Tauchbeschichtung entwickelte sich eine 30 μm dicke Schicht
aus einer porösen
Vorläuferpulvermischung
auf dem Substrat auf grund der schnellen Verdampfung von Ethanol. Aufgrund
der kolloidalen Natur der Vorläuferaufschlämmung entwickelt
der dicke Film eine ausreichende strukturelle Integrität (d. h.
Festigkeit und Härte),
um die nächste
Verfahrensstufe auszuhalten. In dieser Stufe wird der Film einer
auf Wasser basierenden Natriumphosphatlösung (0,25 M) ausgesetzt, damit
sie in die offenen Poren des Films aufgenommen werden kann und dann
24 Stunden lang in einen Inkubator mit 37°C, 100% relative Feuchtigkeit
gestellt. Während
der Inkubation reagieren die kolloidalen Vorläufer mit dem flüssigen Phosphat
und dem ausgefällten
HA. Die Mikrostruktur des entstehenden dicken CPC-HA-Films ist in 5a gezeigt.
Ein Zugadhäsionstest,
der an den Beschichtungen durchgeführt wurde gemäß ASTM C-633-Standard
zeigte eine Adhäsionsfestigkeit
des dicken CPC-HA-Films an dem dünnen
SG-HA-Film von 6,1 ± 1,2
MPa (Test an 6 Proben mit ~20 μm
dicker Beschichtung). Diese Bindefestigkeit ist größer als
die Zugfestigkeit von Massen-CPC-HA, die in der Literatur berichtet
wird, die allgemein < 2
MPa ist. Der Bruch erfolgte hauptsächlich an der SG-HA/CPC-HA-Grenzfläche, was darauf
hindeutet, dass die Grenzfläche
der schwächste
Verbindungsbereich ist. Dieses CPC-HA hatte eine Porosität von etwa
45% und eine durchschnittliche Porengröße von etwa 16 nm. Eine Makrografie
der beschichteten Probe ist in 1b gezeigt.
Die Mikrografie der Beschichtungsgrenzfläche ist in 2a gezeigt
und das FTIR-Spektrum in 2b.
-
Beispiel 2: CPC-HA-Beschichtungen
auf rostfreiem Stahl
-
Metallische
Substrate aus rostfreiem Stahl (316L), die frei von einem SG-HA-Zwischenfilm waren,
wurden mit CPC-HA beschichtet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Während des
HA-Inkubationszeitraumes trennte sich die Beschichtung spontan von
dem Substrat, wie in 1a dargestellt. Offensichtlich verband
sich die CPC-HA-Beschichtung nicht mit dem metallischen Substrat,
d. h. die Bindungsfestigkeit war 0 MPa. Andere Eigenschaften der
Beschichtung, d. h. Phasengehalt und Porosität waren ähnlich, wie in Beispiel 1 erhalten.
-
Beispiel 3: BM-HA/SG-HA-Beschichtungen
auf rostfreiem Stahl
-
Metallische
Substrate aus rostfreiem Stahl (316L) wurden mit einer 0,6 bis 0,8 μm dünnen Schicht
aus Apatit (SG-HA) beschichtet, wie in Beispiel 1 beschrie ben. Eine
Gruppe von Proben wurde 20 Minuten lang bei 400°C gebrannt, um einen kristallinen
SG-HA(C)-Film zu erhalten und eine weitere Gruppe wurde 60 Minuten
bei 375°C
gebrannt, um einen amorphen SG-HA(A)-Film zu erreichen. Diese Filme
wurden als Keimbildungsstelle für
die Ausfällung
des BM-HA-Films verwendet. Die mit SG-HA beschichteten Proben wurden
in "simulierte Körperflüssigkeit" (SBF) eingetaucht
mit einer ionischen Zusammensetzung (in Einheiten an mmol/l) von 142Na+, 5,0K+, 2,5Ca2+, 1,5Mg2+, 103Cl–,
25HCO3 –, 1,4HPO4 2– und
0,5SO4 2–.
Die SBF wurde auf pH 7,4 mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan und
HCl gepuffert. Diese statische in-vitro-Abscheidung (d. h. das SBF
wurde während
des Abscheidungszeitraums nicht erneuert) bei ~24°C erzeugte
dichte 3 bis 5 μm dicke
BM-HA-Filmabscheidungen guter Qualität auf flachen SG-HA-Substraten,
wie in 6 gezeigt. Der kristalline
SG-HA(C)-Film, 6b, war mit dichtem BM-HA beschichtet,
wohingegen der amorphe SG-HA(A)-Film, 6a,
mit porösem
BM-HA beschichtet war. Die Eigenschaften des darunter liegenden
SG-HA-Oberflächenmodifikationsfilms
können verwendet
werden, um die Eigenschaften zu variieren, z. B. die Porosität des Kristallisationskeim
bildenden und abgeschiedenen oberen BM-HA-Films.
-
Beispiel 4: CPC-HA/SG-HA-Beschichtungen
mit verkapseltem Wirkstoff
-
Metallische
Substrate aus rostfreiem Stahl (316L) wurden mit CPC-HA/SG-HA-Beschichtungen beschichtet,
wie in Beispiel 1 beschrieben. Um die Möglichkeit festzustellen, CPC-HA
für eine
kontrollierte Wirkstofffreisetzung zu verwenden, wurde Amethopterin
(Sigma Chemicals, USA) als Modellwirkstoff angewendet in einer Menge
von 5% bezogen auf den Festphasengehalt der CPC-HA-Vorläufer. Der
Wirkstoff wurde mit der kolloidalen Suspension der Vorläufer vermischt,
bevor die Tauchbeschichtung durchgeführt wurde. Alle anderen Prozeduren, z.
B. Inkubation, wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Während des Inkubationszeitraums
fiel eine 20 μm
dicke CPC-HA-Beschichtung aus, die die Wirkstoffmoleküle innerhalb
der Nanoporen des kristallisierten HA verkapselte. Nach der Verkapselung
wurde eine Wirkstofffreisetzungsuntersuchung durchgeführt, indem
die Substrate in 20 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS,
pH = 7,4) mit einem konstanten Verhältnis von (CPC-Beschichtungsgewicht)/(Volumen
an PBS) von 1 mg/ml getaucht wurden. Eine Referenzprobe, die mit
einem Hydrogelfilm beschichtet war, wurde auch bezüglich der
Wirkstofffreisetzungskinetik getestet.
-
Der
Hydrogelfilm wurde hergestellt, indem die CPC-HA-Schicht, die den
Wirkstoff enthielt, in eine Polymerlösung getaucht wurde, die 3%
Polyvinylalkohol enthielt. Nach dem Trocknen war die Gewichtszunahme
der ~20 mg CPC-HA-Schicht aufgrund der zusätzlichen Hydrogelbeschichtung
~0,5 mg, entsprechend dem Gehalt des Polymerfilms in der CPC-HA-Matrix
von etwa 2,5%. Es wurden periodisch Proben von PBS-Flüssigkeit
mit freigesetztem Wirkstoff entnommen (d. h. die Gesamtflüssigkeit wurde
geleert) und mit der gleichen Menge von 20 ml PBS wieder aufgefüllt. Die
Wirkstoffkonzentration im Überstand
wurde über
Spektroskopie mit UV/sichtbarem Licht bestimmt. 7 zeigt
die Wirkstofffreisetzungskinetik für den Zeitraum von 3 Tagen,
für beide Arten
von wirkstoffbeladenem CPC-HA. Obwohl ein Burst-Effekt für beide
Beschichtungen während
des Anfangszeitraums von etwa 8 Stunden nachgewiesen wurde, ist
eine langsamere Freisetzung für
die Probe, die mit Hydrogel nachbeschichtet wurde, evident. Eine
lineare Beziehung wurde erreicht zwischen der Menge an freigesetztem
Wirkstoff und (Zeit)1/2 für die Freisetzungszeit
von mehr als 8 Stunden. Der Dauerfreisetzungszeitraum von 8 bis
60 Stunden wird durch das Diffusionsgesetz von Fick gut beschrieben.
Die Freisetzungskinetik wird modifiziert aufgrund der Gegenwart
des nachbeschichteten dünnen
Hydrogelfilms, was auf eine verminderte Diffusionsfähigkeit
der Wirkstoffmoleküle
hindeutet. Die Burst-Wirkung kann jedoch einen Vorteil in einem
frühen
Zeitraum nach einer orthopädischen/dentalen Chirurgie
bieten, wenn entzündungshemmende
Mittel in Implantatvorrichtungen eingearbeitet wurden, um eine akute
oder schwere entzündliche
Antwort zu vermeiden.
-
Beispiel 5: CPC-HA-Mikrokügelchen
-
Eine
anorganische kolloidale Aufschlämmung,
die Ca(OH)2 und Monocalciumphosphatanhydrat
enthält,
wird in Ethanol in einer Kugelmühle
vermahlen mit einem Ca/P-Verhältnis
= 1,5 (diese Stufe des Verfahrens ist gleich dem CPC-HA-Beschichtungsverfahren,
das in Beispiel 1 beschrieben wurde). Da Auflösung und Ausfällung die
Hauptmechanismen für
die Apatitentwicklung in einem solchen System sind, wird eine geringe
Menge (2 Gew.-%) kristallines HA-Pulver der Aufschlämmung zugegeben
als Kristallkeime für
die heterogene Keimbildung von HA. Die Mikrostruktur, insbesondere
Nanoporosität,
der Apatitkügelchen
wird zugeschnitten, indem die Konzentration von gesintertem Submikrometerpulver von
Kristallkeim-HA im Bereich von 1 bis 10% eingestellt wird. Je größer die
Menge der Kristallkeime, desto feiner die entstehende Mikrostruktur
der CPC-HA-Matrixphase.
Die Aufschlämmung
wird zerstäubt
und sprühgetrocknet,
um Kügelchen
zu erzeugen aufgrund der schnellen Verdampfung von Ethanol, wie
in 3a dargestellt. Eine enge Verteilung der Mikrokügelchengröße kann
erreicht werden, indem die Sprühparameter
(wie Sprühdruck,
Viskosität der
Aufschlämmung
und Konzentration) variiert werden, wobei eine durchschnittliche
Körnchengröße im Bereich
von 10 bis 1000 μm
Durchmesser erreichbar ist. Jedes sekundäre Dotierungsmittel, z. B.
Wirkstoffmaterial, wird in den Poren der Kugeln auf dieser Verfahrensstufe
eingeschlossen, wie in Beispiel 4, und auch schematisch in 3b dargestellt.
Die kolloidale Natur des Vorläufer-Sols
lässt es
zu, dass sich eine relativ starke Bindung innerhalb der blitzgetrockneten
Vorläufermikrokügelchen
entwickelt. Stufe 1, 3b. Anschließend wurden die Mikrokügelchen einer
auf Wasser basierenden Natriumphosphatlösung (0,25 M) ausgesetzt und
24 Stunden lang in einen Inkubator mit 37°C, 100% relativer Feuchtigkeit gestellt,
Stufe 2. Eine kaum kristalline, calciumdefiziente Apatitstruktur
entwickelt sich innerhalb der Mikrokügelchen bei diesem Verfahren, ähnlich dem
natürlich
vorkommenden Apatit, wie oben für
die Beschichtungen beschrieben, Stufe 3. Eine kaum kristalline,
calciumdefiziente Apatitstruktur entwickelt sich innerhalb der Mikrokügelchen
bei diesem Verfahren, ähnlich
der von natürlich
vorkommendem (d. h. Knochen)-Apatit. Das Mineralisierungsverfahren
in Stufe 3 kann als Ergebnis der Wechselwirkung zwischen Ca(OH)2 und Ca(HPO4)2 in dem Film, der der Natriumphosphatlösung ausgesetzt
war, ausgedrückt
werden: 3Ca(HPO4)2 + 6Ca(OH)2 → Ca9(PO4)5(HPO4)(OH).
-
Die
Mikrostruktur der entstehenden kleinen (~20 μm) und großen (~300 μm) Mikrokügelchen ist in 5 dargestellt.
In der letzten Stufe 4 des in 3b gezeigten
Verfahrens, kann ein dünner
dichter Film von BM-HA auf der Oberfläche der porösen HA-Makrokügelchen
abgeschieden werden für
eine langzeitige Verkapselungsfunktion. Um dies zu erreichen, werden
HA-CPC-Kügelchen
mit in den Nanoporen verkapseltem Wirkstoff in eine simulierte Körperflüssigkeit,
wie in Beispiel 3 beschrieben, eingetaucht.