CN112843090A - 逆转肿瘤耐药性的羟基磷灰石纳米粒子制备方法和应用 - Google Patents

逆转肿瘤耐药性的羟基磷灰石纳米粒子制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种逆转肿瘤耐药性的羟基磷灰石纳米粒子制备方法和应用。本发明的羟基磷灰石纳米粒子，采用说明书和权利要求书中所述的制备方法制备，用于逆转肿瘤多药耐药性。本发明的羟基磷灰石纳米粒子对乳腺癌耐药细胞等多药耐药性肿瘤细胞表现出细胞毒性。该羟基磷灰石纳米粒子作为药物载体，可高效负载肿瘤化疗药物，有效逆转肿瘤细胞的耐药性，抑制肿瘤细胞生长。

Description

逆转肿瘤耐药性的羟基磷灰石纳米粒子制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种可逆转肿瘤多药耐药性的羟基磷灰石纳米粒子，具体涉及一种羟基磷灰石纳米粒子(HAPNs)制备方法，高效负载肿瘤化疗药物的羟基磷灰石纳米粒子的载药体系，以及其逆转乳腺癌等肿瘤的多药耐药性的应用。
背景技术
癌症是世界范围内威胁人类健康的重要疾病，目前肿瘤治疗的方式仍是以手术、放疗和化疗为主。其中，化疗是利用化学药物来杀死肿瘤细胞，主要是通过抑制肿瘤细胞的生长繁殖来治疗肿瘤。然而，化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时也会将正常细胞杀死，对患者造成严重的毒副作用。同时，化疗药物的使用容易使肿瘤细胞产生多药耐药性(multidrugresistance，MDR)，使肿瘤对多种不同的化疗药物产生耐受，这是影响肿瘤化疗效果的主要原因之一。因此，降低化疗药物的毒副作用和逆转肿瘤的多药耐性已经成为目前癌症治疗领域的研究热点和难点。传统的耐药机制通常都和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的高表达紧密相关，高表达的P-gp能将一些通用的化疗药物泵出胞外，使肿瘤细胞产生多药耐性。
羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2，Hydroxyapatite，HAP)是人体骨骼和牙齿中的主要无机成分，因其具有良好的生物相容性，对多数蛋白或者核酸分子表现出高吸附性，并且具有无免疫抗原性和无致肿瘤性等优点，已被广泛应用于生物医药领域，如生物体植入材料、骨损伤修复、药物载体、免疫传感器以及基因治疗等。同时，近期的研究也发现，羟基磷灰石纳米粒子(Hydroxyapatite nanoparticles，HAPNs)在对正常人体细胞无毒的条件下，对多种肿瘤细胞表现出细胞毒性，如肝癌、肺癌、胃癌以及黑色素瘤等。但HAPNs对于多药耐药性肿瘤细胞是否具有细胞毒性，能否逆转肿瘤的多药耐药，并不清楚。
阿霉素(DOX)是一种较为广泛使用的抗肿瘤药物，通过抑制RNA和DNA合成造成细胞毒性，主要用于急性白血病以及急性淋巴细胞白血病和粒细胞白血病的治疗，对肺癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、甲状腺瘤、绒毛膜上皮癌、肉瘤等多种癌症都有一定疗效，也可与其他抗癌药联合使用。然而，DOX在临床使用时也表现出强烈的细胞毒性，主要的毒副反应有白细胞和血小板减少、心脏毒性、恶心、药物溢出血管引起组织溃疡及坏死等。一旦肿瘤细胞产生耐药性，可将阿霉素等药物泵出细胞，降低治疗效果并可能导致更高的毒副反应。为了逆转肿瘤的耐药性，采用合适的载体负载阿霉素等药物，提高胞内的有效药物浓度，是提高化疗药物疗效并降低药物毒副作用的一种有效手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对多药耐药肿瘤细胞具有毒性的羟基磷灰石纳米粒子，并利用纳米粒子高效负载DOX等化疗药物，通过两者的协同作用，逆转肿瘤细胞的耐药性，提高抗肿瘤活性，并且显著降低药物的毒副作用，为克服肿瘤耐药性提供新的思路。
本发明的第一方面，提供一种羟基磷灰石纳米粒子的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(a)分别提供Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4的水溶液作为前驱体，并提供粒子生长抑制剂聚羧基高分子水溶液，其中用氨水将(NH4)2HPO4溶液pH调节为8～12；
(b)将聚羧基高分子水溶液加入Ca(NO3)2水溶液，搅拌混合2～12h，使其形成稳定羧基/钙离子络合物；
(c)将(NH4)2HPO4溶液和步骤b)中获得的溶液迅速混合，继续用氨水调节pH，使其稳定在8～12，调节反应温度为0～40℃，搅拌反应0.5～2h；
(d)将步骤c)得到的反应混合物进行离心，洗涤并收集磷酸钙初级晶核粒子；
(e)将步骤d)得到的磷酸钙初级晶核粒子加入水溶液再分散，通过搅拌与超声得到均匀悬浊液，接着低温陈化，陈化温度为1～10℃，陈化时间为2～48h；
(f)陈化结束后，将得到的混合物进行离心、洗涤、收集沉淀，冻干后高温煅烧得到所述羟基磷灰石纳米粒子，煅烧温度为400～800℃，煅烧时间为12～24h。
在另一优选例中，步骤a)中所述Ca(NO3)2水溶液的浓度为0.1-0.5M，(NH4)2HPO4的水溶液的浓度为0.1-0.5M。
在另一优选例中，Ca(NO3)2水溶液的浓度为0.2M。
在另一优选例中，(NH4)2HPO4的水溶液的浓度为0.2M。
在另一优选例中，步骤b)中，聚羧基高分子为聚氨基酸、聚丙烯酸、丙烯醚型聚羧酸盐或酰胺-酰亚胺型聚羧酸盐。
在另一优选例中，聚氨基酸为聚谷氨酸或聚天门冬氨酸。
在另一优选例中，聚丙烯酸为聚甲基丙烯酸。
在另一优选例中，聚羧基高分子的分子量为2000Da-100000Da。
在另一优选例中，聚羧基高分子水溶液的浓度为0.33g/L-10g/L。
在另一优选例中，采用两步法合成，先合成磷酸钙初级晶核，再经1～10℃低温陈化得到羟基磷灰石纳米粒子。首先，在步骤b)中加入聚羧基高分子，形成羧基/钙离子络合物，再与(NH4)2HPO4溶液通过步骤c)反应生成磷酸钙初级晶核。然后，经步骤d)洗涤和收集磷酸钙初级晶核，进行步骤e)所述低温陈化。
在另一优选例中，在步骤d)中，用5000～10000rpm的转速离心10～15min后收集沉淀，所得沉淀先用去离子水洗涤2～3遍以去除氨水、未反应离子，再用乙醇洗涤去除水，防止产物磷酸钙初级晶核粒子团聚。
在另一优选例中，步骤f)中，用5000～10000rpm的转速离心10～15min，用去离子水洗涤收集沉淀粒子后，在-20℃预冻，放入冻干机冻干24～48h。
本发明的羟基磷灰石纳米粒子采用两步法制备。第一步中通过选取聚羧基分子与钙离子形成稳定络合产物，抑制磷酸钙粒子过度生长，从而制备初级晶粒；第二步中，利用低温陈化方式，促进羟基磷灰石初级晶粒生长和均化，控制颗粒规整度与均匀度。
本发明的第二方面，提供一种羟基磷灰石纳米粒子，所述羟基磷灰石纳米粒子采用第一方面所述的制备方法制备。
在另一优选例中，所述纳米粒子为短棒状羟基磷灰石纳米粒子(hydroxyapatitenanoparticles，HAPNs)，长度为20～100nm，宽为5～30nm。
在另一优选例中，所述纳米粒子为分布均匀的短棒状羟基磷灰石纳米粒子(HAPNs)。
本发明的羟基磷灰石纳米粒子能高效负载化疗药物，形成载药体系，HAPNs高效地负载药物后，通过和药物协同作用，实现体内外抑制多药耐性肿瘤的生长，极大程度降低所需药物的浓度以及药物本身的毒副作用。
本发明的高效负载抗肿瘤药物的羟基磷灰石纳米粒子，对药物的负载效率达70％～90％，能高效地将药物运送进多药耐性的肿瘤细胞中，在体内外均具有高抗肿瘤活性。
本发明的第三方面，提供第二方面所述的羟基磷灰石纳米粒子的用途，用于抑制肿瘤细胞增殖，逆转肿瘤多药耐药性；
用于体外抑制多药耐性肿瘤细胞生长；
用于负载肿瘤化疗药物；
用于体外逆转肿瘤细胞的耐药性；
用于体内抑制多药耐性肿瘤生长；
用于制备逆转肿瘤细胞耐药性的药物；或
用于制备治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自：乳腺癌细胞、肝癌细胞、骨肉瘤细胞、肺癌细胞、胃癌细胞以及宫颈癌细胞；
所述肿瘤选自：乳腺癌、肝癌、骨肉瘤、肺癌、胃癌以及宫颈癌。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为多药耐药性肿瘤细胞；
所述肿瘤为多药耐药性肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为多药耐药性肿瘤细胞。在另一优选例中，所述肿瘤细胞为多药耐药性的乳腺癌细胞、肝癌细胞、骨肉瘤细胞、肺癌细胞、胃癌细胞或宫颈癌细胞等。
在另一优选例中，所述肿瘤为多药耐药性肿瘤。在另一优选例中，所述肿瘤为多药耐药性的乳腺癌、肝癌、骨肉瘤、肺癌、胃癌以及宫颈癌等。
在另一优选例中，所述纳米粒子对多药耐药性肿瘤具有毒性。
在另一优选例中，所述羟基磷灰石纳米粒子，用于制备治疗多药耐药性乳腺癌的药物，或用于制备治疗乳腺癌的多药耐药性的药物。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为乳腺癌耐药细胞(MCF-7/ADR)。
在另一优选例中，所述纳米粒子对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR等多药耐药性肿瘤细胞表现出细胞毒性。
本发明的第四方面，提供一种载药体系，包含肿瘤化疗药物和第二方面所述的羟基磷灰石纳米粒子。
在另一优选例中，所述纳米粒子负载肿瘤化疗药物。
在另一优选例中，所述肿瘤化疗药物通过静电吸附负载在所述羟基磷灰石纳米粒子表面。
在另一优选例中，所述肿瘤化疗药物选自：阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、长春花碱、氟尿嘧啶以及铂类化合物。
在另一优选例中，所述纳米粒子与所述肿瘤化疗药物的质量比为4～5：1。
在另一优选例中，所述治疗肿瘤的药物为逆转肿瘤细胞多药耐药性的多药耐药逆转剂。
在另一优选例中，所述治疗肿瘤的药物为一种抗肿瘤药物组合物，含有羟基磷灰石纳米粒子和肿瘤化疗药物以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述治疗肿瘤的药物被制成药学上可接受的剂型。在另一优选例中，所述药学上可接受的剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、纳米制剂等。
本发明的第五方面，提供一种体外抑制肿瘤细胞生长或体外逆转肿瘤细胞的耐药性的方法，向所述肿瘤细胞中添加第二方面所述的羟基磷灰石纳米粒子。
本发明还提供一种逆转肿瘤细胞多药耐药性的方法，包括向所述肿瘤细胞添加羟基磷灰石纳米粒子。
在另一优选例中，所述纳米粒子为短棒状羟基磷灰石纳米粒子，长度为20～100nm，宽为5～30nm。
在另一优选例中，所述纳米粒子为分布均匀的短棒状羟基磷灰石纳米粒子。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自：乳腺癌细胞、肝癌细胞、骨肉瘤细胞、肺癌细胞、胃癌细胞以及宫颈癌细胞。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为多药耐药性肿瘤细胞。在另一优选例中，所述肿瘤细胞为多药耐药性的乳腺癌细胞、肝癌细胞、骨肉瘤细胞、肺癌细胞、胃癌细胞或宫颈癌细胞等。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR。
本发明具有以下优点：
(1)本发明的羟基磷灰石纳米粒子采用两步法制备。第一步中通过选取聚羧基分子与钙离子形成稳定络合产物，抑制磷酸钙粒子过度生长，从而制备初级晶粒；第二步中，利用低温陈化方式，促进羟基磷灰石初级晶粒生长和均化，控制颗粒规整度与均匀度。
(2)本发明针对目前肿瘤药物存在的多药耐性问题，开发出具有良好生物相容性且对多药耐药性肿瘤细胞具有毒性的羟基磷灰石纳米粒子，高效负载抗肿瘤药物并实现药物具有pH响应性的释放。同时，抑制药物外排，使药物在多药耐性肿瘤细胞中积累，体内外抑制肿瘤生长，可以用作逆转肿瘤细胞多药耐性的制剂。
(3)本发明针对目前肿瘤化疗药物存在严重毒副作用，开发出负载抗肿瘤药物的羟基磷灰石纳米药物体系，且在体内动物实验的结果中，未对动物体重以及心脏等器官显示出任何影响。然而，抗肿瘤药物单独给药后，导致动物体重明显下降且具有明显的心脏毒性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为结构表征结果，其中A为HAPNs、DOX以及DHAPNs(负载DOX的HAPNs)的FTIR谱图；B为HAPNs和DHAPNs的Zeta电位图；C为HAPNs和DHAPNs的TEM图。
图2为DHAPNs在不同pH环境下的胞外药物释放。
图3为体外抗肿瘤活性结果，其中A为不同浓度的HAPNs对多药耐性肿瘤细胞的毒性；B为HAPNs对MCF-7细胞活性的影响；C为DOX和DHAPNs对多药耐性肿瘤细胞毒性的对比图；D为DOX和DHAPNs对多药耐性肿瘤细胞的IC50值。
图4对比例粒子的表征和体外抗肿瘤活性，其中A为对比粒子的TEM图；B为对比粒子对多药耐性肿瘤细胞的毒性。
图5为流式细胞仪检测多药耐性肿瘤细胞对DOX和DHAPNs的胞内摄取对比图。
图6为HAPNs、DOX以及DHAPNs对多药耐性肿瘤细胞的P-gp泵活性影响的对比图(*,p<0.05)。
图7为体内抗肿瘤活性评价结果，其中A为荷瘤鼠在进行DOX以及DHAPNs给药后，多药耐性肿瘤体积变化的对比图；B为荷瘤鼠在进行DOX以及DHAPNs给药后，体重变化的对比图。(*,P<0.05)
图8为体内心脏毒性评价结果，其中A为荷瘤鼠在进行DOX以及DHAPNs给药后，心脏重量占总体重的百分比的对比图；B为荷瘤鼠在进行DOX以及DHAPNs给药后，体内乳酸脱氢酶含量变化的对比图。(*,p<0.1；**,p<0.05)
具体实施方式
目前解决肿瘤细胞对药物产生多药耐药性的问题仍然是癌症治疗的难点。为此，本发明人经过广泛而深入的研究，研发出液相沉淀法可控制备羟基磷灰石纳米粒子，可抑制多药耐药性肿瘤细胞生长，并可高效负载化疗药物，两者协同作用逆转肿瘤细胞多药耐药性。具体地，制备出羟基磷灰石纳米粒子，将其用于抑制多药耐药性肿瘤生长，并利用对多药耐性肿瘤细胞具有抗性的HAPNs负载化疗药物，进一步开发载药纳米粒子，用纳米材料将化疗药物递送到耐药肿瘤细胞中的同时，使药物与纳米粒子协同作用，逆转多药耐药性，提高治疗效果并且降低药物的毒副作用，开发能用于多药耐药性肿瘤治疗的新型抗肿瘤药物。在此基础上，完成了本发明。
制备方法
本发明公开了一种可逆转肿瘤细胞耐药性的羟基磷灰石纳米粒子(HAPNs)及其载药系统。该羟基磷灰石纳米粒子为短棒状，尺寸为20～100nm。以Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4为原料，采用液相沉淀法在0～40℃合成。
本发明的羟基磷灰石纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(i)混合聚羧基分子水溶液和Ca(NO3)2溶液，形成稳定羧基/钙离子络合体系，混合时间为2～12h；
(ii)将(NH4)2HPO4水溶液(pH为8～12)和(i)中获得的溶液迅速混合，继续用氨水调节pH，使其稳定在8～12，调节反应温度为0～40℃，搅拌反应0.5～2h；
(iii)将步骤ii)得到的反应混合物进行离心、洗涤并收集沉淀产物磷酸钙初级晶核粒子；
(iv)将iii)中得到的粒子加入水溶液分散，通过搅拌与超声得到均匀悬浊液，后续低温陈化，陈化温度为1～10℃，陈化时间为2～48h；
(v)陈化步骤结束后，将得到的反应混合物进行离心，依次以去离子水和乙醇洗涤，收集沉淀物；
(vi)将沉淀物进行冷冻干燥后，放入马弗炉中高温煅烧12～24h，得到所述羟基磷灰石纳米粒子。
在另一优选例中，Ca(NO3)2水溶液的浓度为0.1-0.5M，较佳为0.2M。
在另一优选例中，(NH4)2HPO4水溶液的浓度为0.1-0.5M，较佳为0.2M。
在另一优选例中，聚羧基高分子选用聚丙烯酸，分子量2000Da-30000Da，浓度为0.33g/L-10g/L。分子量为10000Da，浓度为1.67g/L时效果最佳。
在另一优选例中，(NH4)2HPO4水溶液的pH为8～12。
在另一优选例中，高温煅烧温度为400～800℃。
在另一优选例中，所述制备方法包括以下步骤：
(a)首先配制浓度为0.2M的Ca(NO3)2水溶液，浓度为1.67g/L的聚丙烯酸水溶液。配制浓度为0.2M的(NH4)2HPO4的水溶液，并用氨水调节pH为8～12；
(b)将Ca(NO3)2水溶液与聚丙烯酸水溶液混合，室温下搅拌12h；
(c)将上述(NH4)2HPO4溶液和步骤(b)所得溶液迅速混合，继续用氨水调节pH，使其稳定在8～12，调节反应温度为0～40℃，搅拌反应0.5～2h；
(d)反应结束后，用5000～10000rpm的转速离心10～15min后收集白色沉淀；
(e)将产物依次用去离子水和乙醇洗涤，收集粒子沉淀；
(f)将(e)中得到的粒子加入水溶液分散，通过搅拌与超声得到均匀悬浊液，后续低温陈化，陈化温度为1～10℃，陈化时间为2～48h；
(g)陈化步骤结束后，得到的反应混合物进行离心，收集沉淀物，依次以去离子水和乙醇洗涤，收集沉淀物，并于-20℃冰箱内预冻；
(h)将预冻后的产物，放入冻干机冻干24～48h；
(i)将冻干后的样品放入马弗炉中高温煅烧12～24h，得到的产物即为羟基磷灰石纳米粒子。
本发明的负载肿瘤化疗药物的载药体系的制备方法，包括如下步骤：
(i')提供羟基磷灰石纳米粒子，置入肿瘤化疗药物溶液中进行超声；
(ii')搅拌超声后获得的混合物，离心收集上清，用PBS清洗沉淀后再去除上清；
(v')将获得的沉淀冻干得到所述载药体系。
在另一优选例中，所述载药体系的制备方法，包括如下步骤：
(a)称取一定量的HAPNs，加入到含有肿瘤化疗药物的中性PBS溶液中，超声10min；
(b)超声后转移到搅拌器上，常温搅拌反应72h；
(c)反应结束后，离心收集上清，并用PBS清洗沉淀后再收集上清，载药量可通过测定两次上清中的药物含量来计算；
(d)将获得的沉淀冻干24h，即得到载药体系：负载肿瘤化疗药物的HAPNs。
在另一优选例中，高温煅烧温度为400～800℃。
在另一优选例中，所述肿瘤化疗药物选自：阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、长春花碱、氟尿嘧啶以及铂类化合物。
在另一优选例中，所述纳米粒子与所述肿瘤化疗药物的质量比为4～5：1。
在另一优选例中，所述肿瘤化疗药物溶液的浓度为200～1000μg/mL。
该羟基磷灰石纳米粒子对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR等多药耐药性肿瘤细胞表现出细胞毒性。利用该羟基磷灰石纳米粒子可高效负载肿瘤化疗药物，所制备的载阿霉素(DOX)纳米粒子(DHAPNs)具有响应低pH值的药物释放性能，在酸性pH环境中可快速释放药物。
在体外细胞培养实验中，与单独使用化疗药物相比显著提高药物的利用率，以MCF-7/ADR为模型，按DOX的剂量进行衡算，DHAPNs的半致死剂量比DOX降低150倍，可有效逆转肿瘤细胞的耐药性，抑制肿瘤细胞生长。
在动物肿瘤模型的体内实验中，DHAPNs能完全抑制耐药性乳腺癌肿瘤的生长，降低甚至是消除DOX的毒副作用。HAPNs和化疗药物协同作用，为多药耐药性肿瘤提供了一种高效低毒的纳米治疗方式。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
羟基磷灰石纳米粒子(HAPNs)的制备
(a)首先配制浓度为0.1M的Ca(NO3)2水溶液，配置浓度为1.67g/L、分子量为10000Da的聚丙烯酸水溶液；同时，配制浓度为0.1M的(NH4)2HPO4的水溶液，并用氨水调节pH为10；
(b)将聚丙烯酸水溶液加入Ca(NO3)2水溶液，搅拌混合2h，然后将(NH4)2HPO4溶液和上述得到的溶液迅速混合，继续用氨水调节pH，使其稳定在11，调节反应温度为40℃，搅拌反应2h；
(c)反应结束后，用10000rpm的转速离心15min后收集白色沉淀；
(d)将产物依次用去离子水和乙醇洗涤，收集粒子沉淀；
(e)将(d)中得到的粒子加入水溶液分散，通过搅拌与超声得到均匀悬浊液，设置后续低温陈化温度为10℃，陈化时间为12h；；
(f)陈化步骤结束后，得到的反应混合物进行离心，收集沉淀物，依次以去离子水和乙醇洗涤，得到的产物于-20℃冰箱内预冻；
(g)将预冻后的产物，放入冻干机冻干24h；
(h)将冻干后的样品放入马弗炉中600℃煅烧12h，得到的产物即为羟基磷灰石纳米粒子。
实施例2
羟基磷灰石纳米粒子(HAPNs)的制备
(a)首先配制浓度为0.2M的Ca(NO3)2水溶液，配置浓度为5g/L，分子量为100000Da的聚谷氨酸水溶液；同时，配制浓度为0.2M的(NH4)2HPO4的水溶液，并用氨水调节pH为10；
(b)将上述(NH4)2HPO4溶液和Ca(NO3)2溶液迅速混合，继续用氨水调节pH，使其稳定在11，调节反应温度为8℃，搅拌反应2h；
(c)反应结束后，用10000rpm的转速离心15min后收集白色沉淀；
(d)将产物依次用去离子水和乙醇洗涤，收集粒子沉淀后；
(e)将(d)中得到的粒子加入水溶液分散，通过搅拌与超声得到均匀悬浊液，设置后续低温陈化温度为10℃，陈化时间为24h；
(f)陈化步骤结束后，得到的反应混合物进行离心，收集沉淀物，依次以去离子水和乙醇洗涤，得到产物羟基磷灰石纳米粒子，并于-20℃冰箱内预冻
(g)将预冻后的产物，放入冻干机冻干24h；
(h)将冻干后的样品放入马弗炉中高温煅烧12h，得到的产物即为羟基磷灰石纳米粒子。
实施例3
载药体系的制备
(a)称取质量(M0)为10mg的HAPNs，加入到体积(V)为5mL，抗肿瘤药物阿霉素(doxorubicin，DOX)的浓度(P0)为600μg/mL的溶液中，搅拌72h；
(b)反应结束后，离心收集上清，并用PBS清洗沉淀两次，收集得到的沉淀物冻干后，得到负载DOX的HAPNs(DHAPNs)；
(c)测定两次清洗后的上清的OD480值，根据相应的标准曲线计算两次上清中DOX的浓度，记为P1和P2；
(d)HAPNs的载药量(μg DOX/mg HAPNs)＝(P0-P1-P2)×V/M；
(e)HAPNs的载药效率(％)＝((P0-P1-P2)/P0)×100％。
在DOX浓度为600μg/mL时，10mg的HAPNs对DOX的吸附效率为75.68±1.37％，载药量为220.95±7.37μg DOX/mg HAPNs。
所得的HAPNs和DHAPNs采用傅立叶变换红外光谱测试、透射电子显微镜和纳米粒度仪等测定微观结构和形貌。具体如下：
(a)称取适量HAPNs、DOX和DHAPNs粉末，采用傅立叶红外光谱仪(Nicolet 5700智能型傅立叶红外光谱仪)检测其特征化学键或官能团；
(b)用PBS制备粒子浓度为100μg/mL的HAPNs和DHAPNs悬液，装入离心管中，超声分散10min。用纳米粒度分析仪(Nano-ZS，Malvern)检测纳米粒子的Zeta电位；
(c)称取适量HAPNs和DHAPNs粉末，加入无水乙醇中超声分散，取少量粒子悬液滴于铜网上，待样品干燥后采用透射电子显微镜(JEM-2100)观察粒子的形貌和大小。
结果如图1所示。
由图1中A红外光谱图可以看出，DHAPNs在525cm-1和1030cm-1波长处出现的吸收峰为PO4 3-，在3430cm-1波长处的吸收峰为OH-1，均为HAPNs的特征官能团，与HAPNs的红外图谱一致；DHAPNs在1619cm-1和1414cm-1波长处出现的吸收峰代表N-H伸缩振动和C-OH弯曲，均为DOX的特征结构，与DOX的红外图谱一致。
由图1中B所示HAPNs以及DHAPNs的Zeta电位结果中可以看出，HAPNs在PBS中的Zeta电位约在-17mV左右，因为DOX带正电，在合成DHAPNs的载药体系后，Zeta电位由负转正，为+5mV左右。
在图1中C的TEM图片中，HAPNs为短棒状，由Image J软件分析棒状粒子(n＝100)的长度约为20～100nm，宽度约为5～30nm。HAPNs负载DOX后，粒子形貌虽没有发生明显变化，但粒子四周被一层物质包裹，使粒子的宽度略有增大。以上结果均证实了DOX通过静电吸附成功负载在HAPNs表面，形成DHAPNs药物体系。
实施例4
DHAPNs的pH响应性评价
选用与人体血液以及细胞器(如溶酶体和线粒体)的pH相对应的PBS溶液，pH分别为7.4和5.0，来模拟DHAPNs在血液以及肿瘤细胞中DOX的释放情况。具体如下：
(a)将载药粒子DHAPNs(DOX浓度为20μg/mL)放入预先准备好的透析袋中，袋子中分别装入1mL的pH为5.0和7.4的PBS溶液，留有1/3的空隙，密封；
(b)将透析袋分别放入装有上述9mL的PBS的离心管中，放在转速为80rpm、温度为37℃的摇床中避光震荡，记透析体积为V0，离心管中理论DOX浓度为C0；
(c)分别在不同的时间点从离心管中取出V＝9mL的液体，加入到透明的96孔板中，每孔200μL，设置三个平行，用酶标仪测定DOX的荧光值，激发波长为485nm，发射波长为590nm，同时将等量的PBS补加入到离心管中。通过读出的荧光值，根据相应的标准曲线求出溶液中DOX浓度(μg/mL)，分别记C1、C2……Cn，求出药物累积释放量R(％)对时间的曲线；
(d)R(％)＝((Cn×V0+(Cn-1+Cn-2+……+C1)×V)/(C0×V0))×100。
结果如图2所示。
DHAPNs在pH为7.4和5.0的PBS溶液中的起始释放速率均比较快，在12h后，释放速率趋于缓慢。但在pH为7.4的PBS溶液中，48h后DHAPNs中仅有28.5％的DOX进入溶液中。而相比之下，在pH为5.0的PBS溶液中，DHAPNs中DOX的释放速率和累积释放量均高于中性环境，48h后有51.3％的DOX从纳米粒子上释放进入溶液，释放量约为pH为7.4的PBS溶液中的1.8倍。结果表明，DOX在HAPNs上的释放具有pH响应性，在DHAPNs通过血液运输的过程中，大部分DOX仍然会吸附在HAPNs表面，在HAPNs将药物递送到肿瘤细胞以及酸性细胞器后，DOX能够更加快速高效地释放，提高治疗效果。
实施例5
体外抗肿瘤活性评价
采用MTT法检测评价药物体外抗肿瘤活性。
(a)以多药耐性乳腺癌细胞MCF-7/ADR和乳腺癌细胞MCF-7为模型，将MCF-7/ADR细胞接种于96孔培养板里，每孔细胞数为3000～5000个，在37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜；
(b)将HAPNs和DHAPNs置于高温高压灭菌锅，121℃下高压灭菌30min，以保证完全无菌；
(c)待细胞完全贴壁后，将每孔的培养液置换含有不同浓度的HAPNs、DOX和DHAPNs的新培养基，在37℃恒温、5％CO2的培养箱中培养72h；
(d)培养结束后，每孔加入30μL MTT试剂，在37℃继续孵育4h；
(e)将上层的液体除去，每孔加入200μL DMSO，37℃震荡10min，使紫色结晶甲瓒充分溶解后，每孔取出150μL放入新的96孔酶标板中在570nm波长处检测每孔的吸光度值，以去除底部沉积的细胞和粒子对吸光值的影响，HAPNs、DOX和DHAPNs组的数据与对照组数据的比值作为其在该作用条件下对细胞的毒性。
结果如图3所示。
如图3中A所示，不同浓度的HAPNs和MCF-7/ADR细胞孵育72h后，MTT法检测细胞活性。HAPNs在浓度为62.5μg/mL的时候，MCF-7/ADR细胞的活性为90％，当浓度达到500μg/mL时，细胞活性降低为68％，说明HAPNs对多药耐性乳腺癌细胞具有细胞毒性。
在图3中B所示的MCF-7细胞活性结果中，500μg/mL的HAPNs作用于MCF-7细胞72h后，MCF-7细胞的活性降低为63％。HAPNs对敏感乳腺癌细胞株具有一定的生长抑制作用。
从图3中C中DOX以及DHAPNs作用72h后，MCF-7/ADR细胞的活性变化结果可以看出，随着药物浓度的提高，MCF-7/ADR细胞的活性均逐渐降低。当DOX浓度达到10μg/mL时，DHAPNs以及DOX作用MCF-7/ADR细胞72h后，细胞活性分别为25％以及83％，DHAPNs对多药耐性乳腺癌细胞的生长抑制效果远优于DOX单独作用。
图3中D为计算得到的DHAPNs和DOX对MCF-7/ADR细胞作用72h后的IC50值，分别为2.4μg/mL以及367.8μg/mL，DHAPNs的IC50值相比于DOX降低了153倍。细胞活性的结果说明DHAPNs能有效逆转乳腺癌细胞的多药耐性，并且DHAPNs对MCF-7/ADR的细胞毒性具有浓度效应。
对比例1
(a)首先配制浓度为0.1M的Ca(NO3)2水溶液；同时，配制浓度为0.1M的(NH4)2HPO4的水溶液，并用氨水调节pH为11；
(b)将上述(NH4)2HPO4溶液和Ca(NO3)2溶液迅速混合，继续用氨水调节pH，使其稳定在11，调节反应温度为40℃，搅拌反应2h；
(c)反应结束后，用10000rpm的转速离心15min后收集白色沉淀；
(d)将产物依次用去离子水和乙醇洗涤，收集粒子沉淀后；
(e)将(d)中得到的粒子加入水溶液分散，通过搅拌与超声得到均匀悬浊液，设置后续低温陈化温度为10℃，陈化时间为12h；
(f)陈化步骤结束后，得到的反应混合物进行离心，收集沉淀物，依次以去离子水和乙醇洗涤，得到产物羟基磷灰石纳米粒子，并于-20℃冰箱内预冻
(g)将预冻后的产物，放入冻干机冻干24h；
(h)将冻干后的样品放入马弗炉中高温煅烧12h，得到的产物即为对比粒子。
在图4中A所示的TEM图片中，对比粒子为短棒状，尺寸与羟基磷灰石纳米粒子一致，但粒子团聚程度较高。另外，采用MTT法检测对比粒子对MCF-7/ADR细胞的毒性，500μg/mL对比粒子与多药耐性肿瘤细胞作用72h后，细胞活性高于90％，结果表明本对比例获得的纳米粒子无明显毒性(图4中B)。
实施例6
药物胞内的摄取
收集对数生长期的细胞MCF-7/ADR，将细胞悬液接入6孔板中，每孔约为2×105个细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
待细胞贴壁后，吸去上层的培养基，加入等体积的DOX和DHAPNs溶液，单独的DOX和DHAPNs中载药的DOX浓度一致均为5μg/mL，并设置不加药物的对照组，置于培养箱中培养1、12和24h。
孵育结束后吸去上层液体，用PBS清洗3次后，用台盼蓝孵育10min，再用PBS清洗3次，加入胰酶消化细胞，用培养基重悬后收集于1.5mL的离心管中。1400rpm在4℃离心5min，用预冷的PBS洗涤两次，用流式细胞仪检测胞内DOX的荧光强度。
从流式细胞仪的摄取结果(图5)来看，MCF-7/ADR细胞对DOX的摄取能力较弱，随着孵育时间由1h增加到24h，胞内荧光强度仅从6.4％升高到10.6％。在DHAPNs的作用下，MCF-7/ADR细胞内快速积累DOX，1h后胞内荧光强度为48.4％，12h后胞内荧光强度上升至80.4％，在24h胞内DOX含量达到最高。摄取的结果说明DHAPNs可极大地提高MCF-7/ADR细胞内DOX的含量。
实施例7
药物对P-gp泵活力的影响
接种对数生长期的MCF-7/ADR细胞至6孔板，每孔2×105个细胞，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。弃去原有培养液，加入250μg/mL的HAPNs，同样量的2.5μg/mL的DOX、15μg/mL的HAPNs以及相应浓度的DHAPNs悬液，孵育48h。弃去原有培养液，用PBS清洗3次，每孔加2mL浓度为5μg/mL的罗丹明123(RH123)，孵育3h。弃去RH123染色液，用PBS清洗3次，用不含EDTA的胰酶消化后用培养基重悬离心，PBS清洗后，每管加入500μL的PBS重悬。用流式细胞仪检测胞内荧光，RH123的最大激发波长为507nm，最大发射波长为529nm。
罗丹明123(RH123)作为一种荧光染料，可以被细胞膜上的P-gp泵出细胞外，因此借助流式细胞仪检测细胞内RH123的荧光强度，就可以表征RH123在细胞内的含量，反映P-gp泵的活性。Free RH123为空白对照组，维拉帕米(Verapamil)为阳性对照，可以抑制P-gp泵的活性，从而使RH123在细胞内累积无法外排。
在图6中，由于MCF-7/ADR细胞可将RH123排出胞外，胞内可检测到的RH123荧光强度很低，加入维拉帕米后，细胞排出RH123受到抑制，可检测到强的RH123荧光信号。2.5μg/mL的DOX和MCF-7/ADR细胞作用48h后，药物泵活性仍处于较高水平，胞内荧光信号与空白对照组一致。15μg/mL和250μg/mL的HAPNs和MCF-7/ADR细胞作用48h后，RH123在细胞内的累积量分别是空白组的1.3和1.7倍，P-gp的活性水平明显降低，说明HAPNs本身可以抑制P-gp活性，从而降低乳腺癌细胞的多药耐性。当HAPNs与DOX形成载药体系后，RH123在细胞内的累积是空白对照组的3.7倍，DHAPNs对P-gp活性具有强抑制能力。以上结果说明HAPNs不仅仅是作为运输抗肿瘤药物的载体，同时通过抑制P-gp的活性，增加多药耐性肿瘤细胞对药物的摄取，提高药物利用并增强药物作用效果。
实施例8
药物的体内抗肿瘤活性的评价
选用12只移植MCF-7/ADR细胞的雌性裸鼠，随机均分为3组，分别为生理盐水组、DOX组和DHAPNs组，各组的平均体重均在20g左右，平均肿瘤体积约为50mm3。在第三天开始进行第一次给药，之后每隔三天给药一次，给药组的荷瘤鼠尾静脉注射200μL的10mg/kg的DOX和相应浓度的DHAPNs，对照组注射相同体积的生理盐水，共给药6次。每天用游标卡尺测量肿瘤的大小，称量荷瘤鼠的重量，记录荷瘤鼠的生存状态。
从肿瘤的体积变化(图7中A)来看，给药6次以后，DHAPNs组的肿瘤基本不生长，瘤块大小仍在50mm3左右，DOX组的肿瘤生长速度虽然同生理盐水组相比减缓，但平均肿瘤体积仍是DHAPNs组的2.2倍，DHAPNs对肿瘤的生长相比DOX有明显的抑制作用。相较于生理盐水组，DHAPNs的抑瘤率约为71％，DOX的抑瘤率为37％。
从裸鼠重量的变化(图7中B)来看，在给药周期结束后，生理盐水组和DHAPNs组的裸鼠平均体重都维持在20g左右，而DOX组的裸鼠体重降为16.74g，DHAPNs大大降低甚至是消除了DOX的毒副作用。
实施例9
药物的体内心脏毒性评价
在给药6次后，测量心脏重量和血液中乳酸脱氢酶LDH活性，进一步考察不同药物对荷瘤鼠的心脏毒性。
(a)荷瘤鼠心脏重量和体重的比值测定
将荷瘤鼠进行称重，记录荷瘤鼠的体重后，将其心脏取出，立即放在天平上称重，计算荷瘤鼠的心脏重量和体重的比值，将给药组和空白对照组的比值进行对比，大于空白对照组则表示有心脏毒性。
(b)体内乳酸脱氢酶含量
从荷瘤鼠的眼眶取血后，4℃，3000rpm离心15min，取得的上清即为血清。将血清样品稀释50倍后，用于乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)的检测。按照乳酸脱氢酶试剂盒中的说明书，将2μmol/mL的丙酮酸标准品用蒸馏水分别稀释200、100、50、20、10、5和2倍，用不同浓度的丙酮酸标准在波长450nm处检测吸光度值，求出标准曲线。将血清样品与底物作用15min后，检测得到OD450后，用标准曲线求得反应体系中丙酮酸的含量。1000mL血清在37℃与底物作用15min，在反应体系中产生1μmol丙酮酸为1个单位，血清中乳酸脱氢酶含量的计算公式为：
Figure BDA0002292995200000181
将荷瘤鼠的心脏取出并称重，计算心脏重量与体重的比值后可以发现，DHAPNs组和对照组的心脏重量基本一致，约占总体重的0.6％，而DOX组的心脏重量明显升高，为总体重的0.75％(图8中A)。
LDH催化丙酮酸和乳酸之间的转化，广泛存在于体内包括心脏在内的不同组织中，在组织受到损伤时被释放出来，其含量升高与肝脏、心脏等组织的损伤密切相关。从图8中B中可以看出，注射生理盐水和DHAPNs后，荷瘤鼠血液中LDH的含量接近，分别为8.3和8.5U/mL，而游离DOX给药后LDH含量显著升高至9.7U/mL。因此，结合心脏比重和LDH含量的分析，可以进一步证实，游离DOX对荷瘤鼠心脏具有明显的毒副作用，而使用HAPNs负载DOX后，基本可以消除DOX的心脏毒性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，这些等价形式不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种羟基磷灰石纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)分别提供Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4的水溶液作为前驱体，并提供粒子生长抑制剂聚羧基高分子水溶液，其中用氨水将(NH4)2HPO4溶液pH调节为8～12；
(b)将聚羧基高分子水溶液加入Ca(NO3)2水溶液，搅拌混合2～12h，使其形成稳定羧基/钙离子络合物；
(c)将(NH4)2HPO4溶液和步骤b)中获得的溶液迅速混合，继续用氨水调节pH，使其稳定在8～12，调节反应温度为0～40℃，搅拌反应0.5～2h；
(d)将步骤c)得到的反应混合物进行离心，洗涤并收集磷酸钙初级晶核粒子；
(e)将步骤d)得到的磷酸钙初级晶核粒子加入水溶液再分散，通过搅拌与超声得到均匀悬浊液，接着低温陈化，陈化温度为1～10℃，陈化时间为2～48h；
(f)陈化结束后，将得到的混合物进行离心、洗涤、收集沉淀，冻干后高温煅烧得到所述羟基磷灰石纳米粒子，煅烧温度为400～800℃，煅烧时间为12～24h。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述Ca(NO3)2水溶液的浓度为0.1-0.5M，(NH4)2HPO4的水溶液的浓度为0.1-0.5M。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中，聚羧基高分子为聚氨基酸、聚丙烯酸、丙烯醚型聚羧酸盐或酰胺-酰亚胺型聚羧酸盐。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用两步法合成，先合成磷酸钙初级晶核，再经1～10℃低温陈化得到羟基磷灰石纳米粒子，首先，在步骤b)中加入聚羧基高分子，形成羧基/钙离子络合物，再与(NH4)2HPO4溶液通过步骤c)反应生成磷酸钙初级晶核；然后，经步骤d)洗涤和收集磷酸钙初级晶核，进行步骤e)所述低温陈化。
5.一种羟基磷灰石纳米粒子，其特征在于，所述羟基磷灰石纳米粒子采用权利要求1-4任一项所述的制备方法制备。
6.如权利要求5所述的羟基磷灰石纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子为短棒状羟基磷灰石纳米粒子(hydroxyapatite nanoparticles，HAPNs)，长度为20～100nm，宽为5～30nm。
7.如权利要求5所述的羟基磷灰石纳米粒子的用途，用于抑制肿瘤细胞增殖，逆转肿瘤多药耐药性；
用于体外抑制多药耐性肿瘤细胞生长；
用于负载肿瘤化疗药物；
用于体外逆转肿瘤细胞的耐药性；
用于体内抑制多药耐性肿瘤生长；
用于制备逆转肿瘤细胞耐药性的药物；或
用于制备治疗肿瘤的药物。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞选自：乳腺癌细胞、肝癌细胞、骨肉瘤细胞、肺癌细胞、胃癌细胞以及宫颈癌细胞；
所述肿瘤选自：乳腺癌、肝癌、骨肉瘤、肺癌、胃癌以及宫颈癌。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞为多药耐药性肿瘤细胞；
所述肿瘤为多药耐药性肿瘤。
10.一种体外抑制肿瘤细胞生长或体外逆转肿瘤细胞的耐药性的方法，其特征在于，向所述肿瘤细胞中添加权利要求5或6所述的羟基磷灰石纳米粒子。
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